專利名稱：γ－十一烯內(nèi)酯，其制備方法及其在化妝品中和以食品添加劑形式的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的內(nèi)酯，γ-十一烯內(nèi)酯；涉及其通過(guò)生物方法的合成，特別是其(R)或(S)異構(gòu)體每一個(gè)的立體選擇性合成，以及涉及其用途，特別在食品和香料部門中的用途。
“天然”產(chǎn)品日益受到普通大眾的喜愛(ài)，因此，使用芳香化合物或有氣味化合物的行業(yè)關(guān)注于開(kāi)發(fā)“天然”芳香物質(zhì)和制品。只有已在自然界中被鑒別的物質(zhì)能有望獲得該標(biāo)志；因此它們目前由植物或由微生物產(chǎn)生；后者日益得到廣泛應(yīng)用，目前生物技術(shù)方法使以合理的費(fèi)用合成天然分子成為可能。γ-內(nèi)酯正是上述這種情況。
γ-內(nèi)酯是芳香分子，其構(gòu)成了許多天然產(chǎn)品的香氣和香味。例如，γ-庚內(nèi)酯因其榛子或焦糖香氣和味道而眾所周知，γ-壬內(nèi)酯具有油脂、奶油或椰子香氣；γ-癸內(nèi)酯和γ-十一內(nèi)酯具有桃子或杏香氣和味道。
γ-內(nèi)酯以其兩種對(duì)映異構(gòu)體形式(R)和(S)天然存在，但是(R)對(duì)映異構(gòu)體占優(yōu)勢(shì)。
可通過(guò)合成產(chǎn)生或利用微生物通過(guò)生物合成產(chǎn)生γ-內(nèi)酯。于是，EP 371 568描述了利用微生物產(chǎn)生γ-內(nèi)酯的方法，該微生物對(duì)于制備食品是可接受的，例如，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、漢森德巴利酵母(Debaromyceshansenii)或波氏假絲酵母(Candida boidinii)。
US 5,112,803表明γ-辛內(nèi)酯，特別是其(R)和(S)旋光異構(gòu)體可用于形成黃油香氣和香味，并描述了增加可被消費(fèi)物質(zhì)的香氣或香味的方法，其通過(guò)加入顯著量的具有光學(xué)活性的γ-辛內(nèi)酯和多種化合物的混合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，該多種化合物是所述專利中描述的用于獲得γ-辛內(nèi)酯的生物方法的副產(chǎn)物。US 5,112,803中描述的方法表明可采用辛酸利用Syncephalastratum sp.屬或被孢霉屬(Mortierella sp.)通過(guò)生物合成獲得γ-辛內(nèi)酯的兩種(R)和(S)異構(gòu)體；但是，該方法不具有對(duì)映選擇性。
γ-內(nèi)酯在食品調(diào)味品行業(yè)和香料行業(yè)中具有極大價(jià)值，以及實(shí)際的工業(yè)大投資關(guān)注于產(chǎn)生具有不同的感官細(xì)微差別的產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的是提供新的γ-內(nèi)酯，即γ-十一烯內(nèi)酯，其具有與那些公知的γ-內(nèi)酯類似的芳香特性和味覺(jué)特性，但是又不同于后者，特別是其具有菠蘿和西番蓮果香氣和香味。
公知揮發(fā)性分子的手性可引起不同的嗅覺(jué)，以及γ-內(nèi)酯的旋光異構(gòu)體并不是都具有相同的感官香調(diào)因此產(chǎn)生γ-內(nèi)酯的特定旋光異構(gòu)體具有重要優(yōu)勢(shì)，特別是采用與現(xiàn)有技術(shù)相比至少同樣有效或甚至更有效的方法并以有競(jìng)爭(zhēng)性的成本實(shí)現(xiàn)該生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一目的因此是提供生物合成γ-十一烯內(nèi)酯的有效且經(jīng)濟(jì)的方法，特別是提供立體選擇性合成γ-十一烯內(nèi)酯的每一(R)和(S)旋光異構(gòu)體的方法。
本發(fā)明中的γ-十一烯內(nèi)酯對(duì)應(yīng)于式(I) 其中內(nèi)酯環(huán)可在2位碳和3位碳之間具有不飽和，以及其中R1為具有至少一個(gè)不飽和的C7烯基或C7炔基基團(tuán)，包括一個(gè)C10-C11烯不飽和，所述R1基團(tuán)是被任選取代的。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，R1包含一個(gè)不飽和。非常優(yōu)選地，該不飽和是烯不飽和。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，R1包含多個(gè)不飽和，包括一個(gè)C10位的烯不飽和及至少一個(gè)在除C7位外的碳上的其它烯不飽和。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，R1為具有7個(gè)碳原子的在C10-C11位具有單一不飽和的任選取代的烯基基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，R1不被鹵素原子取代，特別是不被溴或氯取代。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，R1為C7H13基團(tuán)，優(yōu)選CH2＝CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-基團(tuán)，且內(nèi)酯環(huán)是飽和的。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，R1包含單一炔不飽和，優(yōu)選在10位碳上。
術(shù)語(yǔ)“取代的烯基或炔基”是指至少一個(gè)碳具有至少一個(gè)取代基基團(tuán)的烯基或炔基。術(shù)語(yǔ)“取代基基團(tuán)”特別是指羥基基團(tuán)、酮基團(tuán)、硫醇基團(tuán)、烷基基團(tuán)或烯基基團(tuán)。
本發(fā)明的γ-十一烯內(nèi)酯在4位含有不對(duì)稱碳，可以是(R)或(S)構(gòu)型。
本發(fā)明涉及(R)-γ-十一烯內(nèi)酯和(S)-γ-十一烯內(nèi)酯以及這兩種旋光異構(gòu)體的任意比例的混合物，特別是外消旋混合物。
本發(fā)明還涉及式(I)所示的γ-十一烯內(nèi)酯的生物制備，尤其是其通過(guò)微生物途徑的生物合成，該生物合成采用菌株的微生物培養(yǎng)物從至少一種底物，特別是十一烯或其酯的一種，優(yōu)選甲酯或乙酯來(lái)實(shí)現(xiàn)，該菌株選自那些能夠羥基化該底物、特別是能夠在C4位羥基化的菌株。
此制備方法包括如下步驟a)選擇合適的菌株，b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株，任選地在所述培養(yǎng)之前存在預(yù)培養(yǎng)所述菌株的步驟，c)加入能被轉(zhuǎn)化為式(I)的γ-十一烯內(nèi)酯的底物，d)將該底物生物轉(zhuǎn)化為式(I)的γ-十一烯內(nèi)酯，e)回收所產(chǎn)生的式(I)的γ-十一烯內(nèi)酯。
旨在生物合成本發(fā)明的γ-十一烯內(nèi)酯的步驟a)中的合適的微生物菌株是那些能夠特異羥基化所述底物、特別是在C4位羥基化的菌株。
當(dāng)由生物合成產(chǎn)生的產(chǎn)物用于食品工業(yè)時(shí)，當(dāng)然優(yōu)選食品級(jí)的菌株。在能夠進(jìn)行立體選擇性羥基化的菌株中，可特別提及曲霉屬(Aspergillus sp.)、青霉屬(Penicillium sp.)、毛霉菌屬(Mucor sp.)、被孢霉屬(Mortierella sp.)的菌株。因?yàn)檫@些菌株均屬于1類微生物，且由于部分菌株是食用菌株，因此它們的應(yīng)用不會(huì)對(duì)內(nèi)酯的工業(yè)生產(chǎn)或?qū)?nèi)酯在食品中的可能應(yīng)用造成任何特殊問(wèn)題。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所用的菌株為曲霉屬，優(yōu)選米曲霉(Aspergillus oryzae)，其中可提及如下菌株的集合米曲霉DSMZ 1861、米曲霉DSMZ 1864、米曲霉DSMZ 1147、米曲霉DSMZ 63303、米曲霉CBS 570.65、米曲霉CBS 819.72、米曲霉CBS 110.27、米曲霉VMF 88093。
其中，優(yōu)選米曲霉DSMZ 1861和米曲霉CBS 110.27。
根據(jù)另一具體實(shí)施方案，所用的菌株為被孢霉屬，其中可提及如下種類的集合深黃被孢霉(Mortierella isabellina)DSMZ1414、深黃被孢霉CBS 100559、深黃被孢霉CBS 221.29、深黃被孢霉CBS 194.28、深黃被孢霉CBS 208.32、深黃被孢霉CBS224.35、深黃被孢霉CBS 560.63、深黃被孢霉CBS 167.80、深黃被孢霉CBS 493.83、深黃被孢霉CBS 309.93、深黃被孢霉CBS250.95、深黃被孢霉CBS 109075、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)CBS 112.08、拉曼被孢霉CBS 219.47、拉曼被孢霉CBS 243.58、拉曼被孢霉CBS 478.63、拉曼被孢霉CBS 852.72、拉曼被孢霉CBS 366.95、拉曼被孢霉CBS 101226。
其中，優(yōu)選深黃被孢霉菌株，特別優(yōu)選深黃被孢霉DSMZ1414、深黃被孢霉CBS 100559和深黃被孢霉CBS 221.29。
事實(shí)上，發(fā)明人驚訝并出乎意料地發(fā)現(xiàn)使用曲霉屬的菌株導(dǎo)致選擇性產(chǎn)生(R)-γ-十一烯內(nèi)酯，使用被孢霉屬的菌株導(dǎo)致選擇性產(chǎn)生(S)-γ-十一烯內(nèi)酯。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，由于其不能在C4位引起羥基化，因此本發(fā)明將解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)菌株排除在外。有利的是，本發(fā)明將不能特異地及立體選擇性地在C4位產(chǎn)生羥基化的所有菌株排除在外。
不被任何理論所束縛，可預(yù)計(jì)培養(yǎng)所述菌株的條件在所觀察到的立體選擇性以及生物轉(zhuǎn)化的數(shù)量方面具有重要性。
本發(fā)明所述方法的步驟b)中進(jìn)行的培養(yǎng)包括在合適的培養(yǎng)基中，例如通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增制備所述菌株的培養(yǎng)物，優(yōu)選半濃縮培養(yǎng)物?？稍谶M(jìn)行該培養(yǎng)之前，使所述菌株在更適于進(jìn)行該菌株增殖的第一步驟的第一培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
在本發(fā)明的立體選擇性方法中使用的培養(yǎng)條件應(yīng)是導(dǎo)致菌絲體產(chǎn)生的條件，該菌絲體顯示有充滿內(nèi)含物的膨脹(特別是有過(guò)氧化物酶體)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所制備的細(xì)胞培養(yǎng)物具有“腫脹的(compoteux)”的菌絲體，該菌絲體由不帶有分生孢子的區(qū)室化的菌絲組成，并顯示出凸起結(jié)構(gòu)，充滿這些內(nèi)容物(過(guò)氧化物酶體)。該培養(yǎng)條件實(shí)際上特別適于防止該菌絲體的孢子形成。
此外，發(fā)明人能夠注意到所述菌絲體的生理狀態(tài)，特別是由于使用本申請(qǐng)所述的培養(yǎng)條件而得到的菌絲體(區(qū)室化的菌絲體含有充滿內(nèi)含物、特別是充滿過(guò)氧化物酶體的膨脹和凸起)的生理狀態(tài)對(duì)反應(yīng)收率具有相當(dāng)大的影響，并使得能獲得比現(xiàn)有技術(shù)更高的收率。菌絲體的生理狀態(tài)還對(duì)反應(yīng)的立體選擇性有影響。
因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明方法中的步驟b)是在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，以便得到包含充滿內(nèi)含物、特別是充滿過(guò)氧化物酶體的膨脹和凸起的區(qū)室化的菌絲體的步驟。有利地，本發(fā)明所用的培養(yǎng)基不含有蛋白胨，優(yōu)選地，本發(fā)明所用的培養(yǎng)基包含麥芽和/或酵母提取物。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，用于步驟c)的菌絲體是濃縮的。優(yōu)選地，用于步驟c)的菌絲體的濃度為5-15g/l，優(yōu)選6-12g/l，非常優(yōu)選7-10g/l。
尤其注意到通過(guò)使用上述的充滿內(nèi)含物的膨脹菌絲體，在立體選擇性和收率方面特別促進(jìn)了由被孢菌霉菌株產(chǎn)生(S)-γ-內(nèi)酯；實(shí)際上，使用這種菌絲體可以得到具有以絕對(duì)值表示的比現(xiàn)有技術(shù)更大的旋光性的反應(yīng)產(chǎn)物；此外，通過(guò)本發(fā)明所述方法得到的收率，特別是通過(guò)使用上述的充滿內(nèi)含物的膨脹菌絲體得到的收率能夠比通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)得到的收率更高。
所述方法的步驟c)為向所述細(xì)胞培養(yǎng)物中加入所述底物。根據(jù)本發(fā)明，γ-十一烯內(nèi)酯的生物合成涉及任何合適的底物，優(yōu)選十一烯酸或其酯的一種。在其它優(yōu)選的底物中，可提及十一烯酸的或其酯的所有取代的衍生物。十一烯酸及十一烯酸的甲酯和乙酯是特別優(yōu)選的底物。無(wú)需聲明所述底物可以是任何合適的底物，或多種合適底物的混合物，特別是十一烯酸與一種或多種其酯的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的有益實(shí)施方案，采用分批發(fā)酵法或分批進(jìn)料法將所述底物加入到所述菌絲體。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，在將十一烯酸與所述菌絲體接觸前，以與輔助材料的混合物形式加入十一烯酸，該輔助材料例如為油，特別是任何常規(guī)的食用油，如大豆油、玉米油、葵花子油等，或諸如miglyol的合成的短鏈脂肪酸甘油三酯，優(yōu)選被氫化的或富含油酸的葵花子油。輔助材料的存在可以尤其極大地減少所述底物的，特別是十一烯酸的腐蝕性或毒性作用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，使用深黃被孢霉菌株的本發(fā)明的合成在不含礦物油的培養(yǎng)基中進(jìn)行。
有利地，以0.3-2.5g/l/h的濃度加入所述底物。有利地，與所述底物混合的油(優(yōu)選植物油)的量為100-500g/l，優(yōu)選150-300g/l。
在加入所述底物的同時(shí)，還向所述培養(yǎng)基中加入糖源，優(yōu)選葡萄糖，以確保提供所述細(xì)胞需要的能量。有利地，加入的葡萄糖的濃度為0.3-0.4g/l/h。
如果需要，在加入所述底物期間以及隨后進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化期間，通過(guò)加入任何合適的堿來(lái)調(diào)節(jié)pH。pH應(yīng)為4.5-8.5，優(yōu)選5.5-8，且優(yōu)選6-7.5。
在生物轉(zhuǎn)化期間，溫度優(yōu)選保持在27℃-30℃。生物轉(zhuǎn)化的持續(xù)期為30-120小時(shí)，優(yōu)選48-72小時(shí)。
在本發(fā)明所述方法的步驟d)中涉及的所述底物向γ-十一烯內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化是由所述菌株進(jìn)行所述底物在C4位的羥基化反應(yīng)，隨后進(jìn)行內(nèi)酯化所構(gòu)成。為了能夠進(jìn)行該羥基化，需要氧源。該氧源優(yōu)選含氧的氣體，非常優(yōu)選空氣或氧氣。將該氣體以相對(duì)大的量溶解于所述反應(yīng)培養(yǎng)基中。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案且是本領(lǐng)域公知的，消泡劑，特別是硅油或用脂肪酸酯化的聚乙二醇的聚合物用于控制在生物轉(zhuǎn)化期間可能形成的泡沫。
一旦完成生物轉(zhuǎn)化，即完成在C4位的特異性和立體選擇性羥基化，之后的內(nèi)酯化后，所述方法的步驟e)為通過(guò)提取回收所述γ-十一烯內(nèi)酯，通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行所述γ-十一烯內(nèi)酯的提取。有利地，通過(guò)水蒸氣蒸餾(hydrodistillation)進(jìn)行所述γ-十一烯內(nèi)酯的提取，任選地然后進(jìn)行酯化，旨在隨后去除未反應(yīng)的所述底物。
或者，在將所述培養(yǎng)基酸化后，通過(guò)溶劑(環(huán)己烷，乙酸乙酯)提取進(jìn)行所述γ-十一烯內(nèi)酯的提取。
根據(jù)本發(fā)明所述方法的變體，可不進(jìn)行所述方法的的步驟e)，改為進(jìn)行步驟e’)，該步驟為在步驟d)結(jié)束時(shí)，在萃取前，通過(guò)將所得到的γ-十一烯內(nèi)酯在原位還原來(lái)繼續(xù)所述方法，以便例如得到對(duì)應(yīng)的γ-十一內(nèi)酯。根據(jù)具體實(shí)施方案，可將所述還原停止，以便獲得與來(lái)源于步驟d)的生物轉(zhuǎn)化的γ-十一烯內(nèi)酯相比，具有較少的不飽和的γ-十一烯內(nèi)酯。根據(jù)此其它實(shí)施方案，在步驟d)結(jié)束時(shí)，通過(guò)停止發(fā)酵罐的pH調(diào)節(jié)，并向所述反應(yīng)器中加入活性干酵母和糖源來(lái)繼續(xù)本發(fā)明所述方法，該干酵母可以為面包酵母、制酒酵母或啤酒酵母，該糖源尤其為葡萄糖。當(dāng)pH值達(dá)到5.5時(shí)，用諸如氫氧化鈉的合適的堿將pH調(diào)節(jié)在5.5。讓所述混合物孵育以便發(fā)生還原，優(yōu)選孵育12-24小時(shí)，然后在步驟e)中描述的條件下提取γ-十一碳內(nèi)酯。根據(jù)另一變體，可使用還原性微生物的新鮮培養(yǎng)物，或使用至少置于還原條件下的微生物來(lái)將γ-十一烯內(nèi)酯還原為γ-十一內(nèi)酯，所述微生物例如為釀酒酵母或Pichia etchelsii、甲醇酵母(Pichiapastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或短乳桿菌(Lactobacillus brevis)。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，步驟e’)中的還原導(dǎo)致γ-十一內(nèi)酯的產(chǎn)生，并且該γ-十一內(nèi)酯對(duì)應(yīng)如下通式 其中R1為任選取代的C7烷基基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“任選取代的烷基”是指至少一個(gè)碳具有至少一個(gè)取代基基團(tuán)的烷基。術(shù)語(yǔ)“取代基基團(tuán)”特別是指羥基基團(tuán)、酮基團(tuán)、硫醇基團(tuán)、烷基基團(tuán)或烯基基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，R1為基團(tuán)C7H13，非常優(yōu)選CH2＝CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-。
本發(fā)明此特定實(shí)施方案得到的γ-十一內(nèi)酯含有在C4位的不對(duì)稱碳，具有與衍生其的γ-十一烯內(nèi)酯分子相同的構(gòu)型，因?yàn)樗鲞€原反應(yīng)不改變所述分子的立體異構(gòu)現(xiàn)象。
還可進(jìn)行步驟e’)，并可以獲得更飽和的(R)-或(S)-十一烯內(nèi)酯或(R)-或(S)-γ-十一內(nèi)酯，這取決于步驟d)中得到的γ-十一烯內(nèi)酯的立體化學(xué)。
這些飽和的內(nèi)酯，(R)-γ-十一內(nèi)酯和(S)-γ-十一內(nèi)酯可與其不飽和的類似物一樣具有相同的應(yīng)用這些內(nèi)酯具有氣味特性和味覺(jué)特性，因此其可用于所有的香料和食品調(diào)味品應(yīng)用中，特別是用于產(chǎn)生香料、有氣味物質(zhì)或化妝品組合物或食品組合物，或用作食品添加劑。
出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“香料”不僅表示該術(shù)語(yǔ)通常意義上的香料，而且表示其它領(lǐng)域，在該領(lǐng)域中產(chǎn)品的氣味是重要的。這可以是該術(shù)語(yǔ)通常意義上的香料組合物，如芳香基質(zhì)和濃縮物、古龍水、香水、香精和類似的產(chǎn)品；局部用組合物-特別是化妝用組合物，如面霜和體霜、滑石粉、發(fā)油、香波、發(fā)乳、浴鹽和沐浴油、淋浴膠和沐浴膠、香皂、止汗劑和身體除臭劑、剃須液和剃須霜、肥皂、霜、牙膏、漱口劑、膏和類似的產(chǎn)品；以及保養(yǎng)產(chǎn)品，如軟化劑、去污劑、洗衣粉、空氣清新劑和類似的產(chǎn)品。
術(shù)語(yǔ)“有氣味的”表示散發(fā)氣味的化合物。
術(shù)語(yǔ)“食品調(diào)味品”是指本發(fā)明所述化合物在任何人用食品或獸用食品、液體食品或固體食品中的調(diào)味品中的任何應(yīng)用，特別是在飲料、乳制品、冰淇淋中的應(yīng)用。
(R)或(S)γ-十一烯內(nèi)酯、或(R)和(S)γ-十一烯內(nèi)酯的混合物，以及(R)或(S)γ-十一內(nèi)酯、或(R)和(S)γ-十一內(nèi)酯的混合物可用作芳香組合物，以便提供外來(lái)的、花的或水果香調(diào)，這使申請(qǐng)人已將γ-十一烯內(nèi)酯注冊(cè)為商標(biāo)“Tropicalone”。根據(jù)本申請(qǐng)，可使用所述(S)對(duì)映異構(gòu)體或所述(R)對(duì)映異構(gòu)體或由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定比例的兩種對(duì)映異構(gòu)體的混合物。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述的產(chǎn)物以相對(duì)于其所在的組合物總重量的0.0025％-10％重量比的量使用。它們可用于構(gòu)成固體或液體組合物，尤其是凝膠組合物、霜組合物、膏組合物和/或噴霧組合物。
本發(fā)明的產(chǎn)物還可用于本身具有氣味的組合物中，或用于其中添味劑是用于掩蓋或中和某些氣味的組合物中。
閱讀下文所述的實(shí)施例之后，將清楚地了解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，所述實(shí)施例是示例性說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1，步驟a-選擇菌株將收集的所有菌株首先接種在MGY瓊脂培養(yǎng)基上，并在27℃下孵育72小時(shí)；隨后將這些菌株接種在含有100ml 1x麥芽培養(yǎng)基的1升錐形瓶?jī)?nèi)，并在27℃下孵育24小時(shí)。然后將所述底物，十一烯酸，加入到該培養(yǎng)基(5g/l，分10份)中，并將該培養(yǎng)物在27℃下再保持48小時(shí)至120小時(shí)。
在嗅氣味和分析所述培養(yǎng)基中的γ-十一烯內(nèi)酯濃度后，選擇最有利的菌株；該最有利的菌株為深黃被孢霉CBS 100559、深黃被孢霉CBS 221.29、米曲霉DSMZ 1861和米曲霉CBS110.27菌株，隨后這些菌株用于發(fā)酵罐優(yōu)化試驗(yàn)。
實(shí)施例1，步驟b-制備細(xì)胞培養(yǎng)物將深黃被孢霉CBS 100559、深黃被孢霉CBS 221.29、米曲霉DSMZ 1861和米曲霉CBS 110.27菌株(起源＝在-80℃下冷凍的試管)接種在MGY瓊脂上并在27℃下孵育30分鐘。
將上述預(yù)培養(yǎng)物接種在6l發(fā)酵罐內(nèi)的5l的1x麥芽培養(yǎng)基中麥芽提取物 165g酵母提取物 25gH2Oqs 5lpH 6.5深黃被孢霉在27℃下，500rpm，3.5l/l/h的空氣，pH自由(pH libre)的條件下孵育30小時(shí)。
米曲霉在20℃，500rpm，0.05vvm的空氣，pH自由的條件下孵育30小時(shí)，然后在25℃，500rpm，0.05vvm的空氣，pH自由的條件下孵育24小時(shí)。在兩種情況下，應(yīng)得到含有許多大的充滿內(nèi)含物(包括過(guò)氧化物酶體)的凸起的菌絲體。
然后在300l發(fā)酵罐中制備125l的1.5x麥芽培養(yǎng)基
麥芽提取物 6.188kg酵母提取物 0.938kgH2Oqs 125l將該培養(yǎng)基在121℃下滅菌40分鐘。發(fā)酵罐及其零件是無(wú)菌和加壓的。溫度是穩(wěn)定的并調(diào)節(jié)在27℃。釋放壓力并保持3.5l/l/h，即約0.6m3/h的空氣流速。將堿(10N NaOH)、酸(85％H3PO4)、消泡劑和用作接種物的6l發(fā)酵罐無(wú)菌地集合在一起。將攪拌速度調(diào)整至325rpm，開(kāi)始加入該消泡劑，然后接種該接種物(5l)，pH自由。將攪拌速度保持在325rpm，并將通氣增加到2.2m3/h(0.3vvm)。讓其繼續(xù)生長(zhǎng)24小時(shí)，以便基于干重有約10g/l的菌絲體該菌絲體應(yīng)是“腫脹的”并由包含多個(gè)凸起和膨脹的沒(méi)有孢子的菌絲組成。
實(shí)施例2，步驟c和d用被孢霉菌株進(jìn)行十一烯酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將十一烯酸以0.3g/l/h的流速給料6小時(shí)，然后以0.53g/l/h的流速給料72小時(shí)即總共為40g/l。該十一烯酸作為與氫化的葵花子油(1/4酸-3/4油)的混合物形式給料；因此該油以0.9g/l/h的流速，然后以1.53g/l/h的流速進(jìn)行給料。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速連續(xù)給料72小時(shí)。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH調(diào)節(jié)在7.5。將速度增加到505rpm并以1vvm，即12m3/h的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行72小時(shí)。
得到6.5g/l(S)立體異構(gòu)的γ-十一烯內(nèi)酯。
實(shí)施例3步驟c和d用曲霉菌株進(jìn)行十一烯酸的轉(zhuǎn)化一旦達(dá)到一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體后，將十一烯酸以0.3g/l/h的流速給料6小時(shí)，然后以0.53g/l/h的流速給料72小時(shí)即總共為40g/l。該十一烯酸作為與氫化的葵花子油(1/4酸-3/4油)的混合物形式給料。將葡萄糖平行地以0.36g/l/h的流速連續(xù)給料72小時(shí)。在整個(gè)發(fā)酵期間，用5N NaOH將pH調(diào)節(jié)在6.5。以0.5vvm，即6m3/h的流速進(jìn)行通氣。轉(zhuǎn)化進(jìn)行80小時(shí)。得到0.5g/l(R)立體異構(gòu)的γ-十一烯內(nèi)酯。
實(shí)施例4，步驟e提取-純化用31的85％磷酸完成在pH 1.5的酸化。在大于100℃加熱30分鐘以便使內(nèi)酯基本上為其環(huán)狀形式，不為其開(kāi)鏈的羥基酸形式。定量測(cè)定所述內(nèi)酯，加入提取溶劑(優(yōu)選環(huán)己烷)，并在環(huán)境溫度下攪拌混合物1小時(shí)。進(jìn)行離心分離并回收有機(jī)相。定量地測(cè)定所述內(nèi)酯。將溶劑濃縮，因此得到油狀的“粗品”。進(jìn)行真空蒸餾。得到“脫膠脂的”內(nèi)酯和廢油。隨后通過(guò)真空分餾該內(nèi)酯來(lái)進(jìn)行純化。得到純度＞99％的產(chǎn)物，如果使用被孢霉菌株，則產(chǎn)物為γ-十一烯內(nèi)酯(＞99％S)，如果使用曲霉菌株，則產(chǎn)物為γ-十一烯內(nèi)酯(＞99％R)。
實(shí)施例5，步驟e’γ-十一烯內(nèi)酯還原為γ-十一內(nèi)酯在實(shí)施例3的生物轉(zhuǎn)化后，不是停止所述反應(yīng)，而是如下繼續(xù)進(jìn)行所述方法停止發(fā)酵罐的pH調(diào)節(jié)。向所述培養(yǎng)基中加入200g/l的來(lái)自商品化面包酵母的活性干酵母(即30kg的酵母)，和100g/l的葡萄糖(即15kg的干葡萄糖或30kg的50％的葡萄糖漿)。一旦pH值達(dá)到5.5，用5N NaOH堿將pH調(diào)節(jié)在pH 5.5。在30℃，325rpm，0.5vvm空氣的條件下孵育12-24小時(shí)。視情況得到(S)-γ-十一內(nèi)酯或(R)-γ-十一內(nèi)酯。然后采用上述實(shí)施例4中的方法，進(jìn)行提取和純化。
實(shí)施例6(S)-γ-十一烯內(nèi)酯在香料中的評(píng)價(jià)在海綿上和溶液(乙醇中含5％)中測(cè)試99％-純的(S)-γ-十一烯內(nèi)酯頭香給予了為γ-十一內(nèi)酯intreleven醛類型(IFF)的內(nèi)酯醛的印象并且是非常強(qiáng)烈的。背景是非常自然的，內(nèi)酯的和非常強(qiáng)烈的菠蘿果肉味。
還在制劑中進(jìn)行了測(cè)試，其中(S)-γ-十一烯內(nèi)酯給予有趣的海洋水果香調(diào)，例如在如下配方中苯乙醇 150gcalone 1g香茅醇 20g二丙二醇50g佳樂(lè)麝香200g二氫茉莉酮酸甲酯150g新洋茉莉醛 15g吲哚2gβ-紫羅蘭酮 15gIsoE super 150g鈴蘭醛 130g芳樟醇 49g甜瓜醛 3gMethylionantheme15gγ-十一烯內(nèi)酯(Tropicalone) 50g實(shí)施例7(S)-γ-十一烯內(nèi)酯在食品調(diào)味料中的評(píng)價(jià)在礦泉水中以10ppm測(cè)試99％-純的(S)-γ-十一烯內(nèi)酯它是木質(zhì)和水果香調(diào)，與迄今為止在制劑中使用的任何其它內(nèi)酯所給予的香調(diào)非常不同；在同一劑量(10ppm)下，與(R)-γ-癸內(nèi)酯、(R)-δ-癸內(nèi)酯和與(R)-δ-十二內(nèi)酯相比，其更具有椰子香味及帶有菠蘿和西番蓮果香調(diào)的更木質(zhì)的香味。
在糖水(10ppm)中，其還具有帶有類似于乳的、非常濃厚的、糖的、甜味特征的香調(diào)。由于其獨(dú)特的乳特征、濃縮乳趨勢(shì)，其在10ppm的效能使其在制劑中具有優(yōu)勢(shì)。
還以0.5ppm和1ppm在奶油香味方面進(jìn)行了測(cè)試在0.5ppm時(shí)其在口中更加顯著突出，這使奶油味更完整并賦予其獨(dú)特的濃縮乳型特征。
實(shí)施例8(S)-γ-十一內(nèi)酯在食品調(diào)味料中的評(píng)價(jià)當(dāng)以99％的純度在海綿上與(R)-γ-十一內(nèi)酯進(jìn)行比較時(shí)，(S)-γ-十一內(nèi)酯給予較少濃厚的、更天然的和更“桃味”的香調(diào)。
當(dāng)以10ppm在礦泉水中進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，其給予特征性的桃味和杏味味道。
實(shí)施例9(S)-γ-十一內(nèi)酯在食品調(diào)味料制劑中的評(píng)價(jià)將γ-十一碳內(nèi)酯加入到外來(lái)水果味調(diào)味品中增加了“外來(lái)的”感覺(jué)，例如在如下配方中玫瑰醚 10.4g苯醚(Phényle Oxyde) 10.4g苯丙醛 20.7g乙酸橙花酯 0.30gγ-十一內(nèi)酯 1gγ-壬內(nèi)酯 1g蘇合香 6.2g乙?；谆状? 10.4gδ-十二內(nèi)酯 10.4gγ-癸內(nèi)酯 10.4g己酸20.7g呋喃酮 21.75g松脂31.1g己醇41.5g丁香烯 51.8g對(duì)異丙基甲苯0.2g丙酸香茅酯 6.2g橙花醇 20.7g己酸己酯20.7g
檸檬醛1，3，順-3-己烯醇 103.6g三醋酸甘油酯599.25gγ-十一烯內(nèi)酯(Tropicalone) 2.5g在西番蓮果調(diào)味料中具有相同的作用丁醇1.00g己醇1.00g2-乙基-1-己醇 1.60g辛醇2.10g大馬酮 3.10g丁酸丁酯4.70gβ-紫羅蘭酮 21g乙酸順-3-己烯酯 52.60g丁酸庚酯78.8gγ-癸內(nèi)酯 79g己酸105g異戊酸丁酯 105.10gδ-壬內(nèi)酯 1.00g己酸己酯42g巴西橙香精 131.4g乙酸丁酯1.00g丁酸1.60g苯甲醛 52.60g丁酸乙酯157.7g順-3-己烯醇 157.7gγ-十一烯內(nèi)酯 2.5g
權(quán)利要求
1.對(duì)應(yīng)于式(I)的γ-十一烯內(nèi)酯 其中內(nèi)酯環(huán)可在2位碳和3位碳之間具有不飽和，以及其中R1為具有至少一個(gè)不飽和的C7烯基或C7炔基基團(tuán)，包括一個(gè)C10-C11烯不飽和，所述R1基團(tuán)被任選地取代。
2.如權(quán)利要求1所述的γ-十一烯內(nèi)酯，其中在4位的不對(duì)稱碳為(R)構(gòu)型。
3.如權(quán)利要求1所述的γ-十一烯內(nèi)酯，其中在4位的不對(duì)稱碳為(S)構(gòu)型。
4.如權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所述的γ-十一烯內(nèi)酯，其中所述內(nèi)酯環(huán)不含有不飽和且R1為C7H13基團(tuán)，優(yōu)選CH2＝CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-。
5.制備權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的γ-十一烯內(nèi)酯的方法，其特征在于所述γ-內(nèi)酯的生物合成是由微生物途徑實(shí)現(xiàn)的，所述生物合成采用菌株的微生物培養(yǎng)物從至少一種底物、特別是從十一烯酸或其酯的一種來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述酯優(yōu)選甲酯或乙酯，所述菌株選自那些能夠在C4位羥基化所述底物的菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于其包括如下步驟a)選擇合適的菌株，選自那些能夠在C4位羥基化所述底物的菌株，b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株，在進(jìn)行所述培養(yǎng)之前任選地存在預(yù)培養(yǎng)所述菌株的步驟，c)加入能被轉(zhuǎn)化為權(quán)利要求1所述的式(I)的γ-十一烯內(nèi)酯的底物，d)將所述底物生物轉(zhuǎn)化為式(I)的γ-十一烯內(nèi)酯，e)回收所產(chǎn)生的式(I)的γ-十一烯內(nèi)酯。
7.如權(quán)利要求5和6中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述底物是以與至少一種生產(chǎn)輔助材料的混合物形式加入到步驟c)中，所述生產(chǎn)輔助材料優(yōu)選地選自油類，特別是被氫化的或富含油酸的葵花子油、mygliol或葡萄糖，或這些成分的混合物。
8.如權(quán)利要求5-7中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于步驟e)是通過(guò)水蒸氣蒸餾來(lái)提取所述γ-十一烯內(nèi)酯，任選地隨后進(jìn)行酯化并除去未反應(yīng)的所述底物。
9.如權(quán)利要求5-7中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于步驟e)是對(duì)步驟d)結(jié)束時(shí)得到的所述γ-十一烯內(nèi)酯進(jìn)行溶劑提取。
10.如權(quán)利要求5-7中任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于在進(jìn)行步驟e)之前，進(jìn)行步驟e’)，所述步驟e’)為將步驟d)結(jié)束時(shí)得到的所述γ-十一烯內(nèi)酯在原位進(jìn)行還原。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于來(lái)源于所述步驟e’)的產(chǎn)物是十一內(nèi)酯。
12.制備權(quán)利要求5-10中任一權(quán)利要求所述的(R)-γ-十一烯內(nèi)酯的立體選擇性方法，其特征在于步驟a)中的微生物菌株選自曲霉屬菌株，優(yōu)選米曲霉，或選自被孢霉屬菌株，優(yōu)選深黃被孢霉。
13.香料組合物，其特征在于其包含權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所定義的十一烯內(nèi)酯。
14.食品組合物，其特征在于其包含權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所定義的十一烯內(nèi)酯。
15.食品添加劑，其特征在于其包含權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所定義的十一烯內(nèi)酯。
16.權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所定義的γ-十一烯內(nèi)酯在制備香料、有氣味物質(zhì)或組合物、或化妝品組合物中、或作為添味劑和/或風(fēng)味食品添加劑的用途。
17.權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所定義的γ-十一烯內(nèi)酯作為食品調(diào)味劑的用途。
18.米曲霉培養(yǎng)物在權(quán)利要求2所定義的(R)-γ-十一烯內(nèi)酯的生物合成中的用途。
19.深黃被孢霉培養(yǎng)物在權(quán)利要求3所定義的(S)-γ-十一烯內(nèi)酯的生物合成中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的γ－十一烯內(nèi)酯，其中內(nèi)酯環(huán)可在2位碳和3位碳之間具有不飽和，并優(yōu)選為飽和的，R1可以為具有至少一個(gè)不飽和的取代的C
文檔編號(hào)C12P17/04GK101056543SQ200580038131
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者約瑟夫·盧卡, 雅內(nèi)·瑪奈 申請(qǐng)人:瑪奈·菲爾薩公司