專利名稱：用脂肪酶水解酯鍵的制作方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及用脂肪酶處理而水解底物中的酯鍵的方法。還涉及用于所述方法的脂肪酶和編碼所述脂肪酶的多核苷酸。
背景技術(shù)：
菌株熱硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)DSM 7021、布氏嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterbrockii)subsp.brockii DSM 1457和Caldanaerobacter subterraneus subsp.tengcongensis DSM 15242是公眾可獲得的。
Thermoanaerobacter tengcongensis的全部基因組序列已經(jīng)公開(Bao etal.，Genome Res.12，689-700，2002(GenBank AE008691))。SWALLQ8R921顯示258個(gè)氨基酸的序列，描述為″hydrolases of the alpha/beta superfamily″(AAM25001.1)。
發(fā)明概述發(fā)明人已鑒定了厭氧嗜熱細(xì)菌中具有脂肪酶活性的多肽。
因此，本發(fā)明提供水解底物中的酯鍵的方法，包括用脂肪酶(具有脂肪酶活性的多肽)處理所述底物。本發(fā)明還提供用于所述方法的脂肪酶和編碼所述脂肪酶的多核苷酸。
所述多肽可以具有序列SEQ ID NO2或4，或者與其中之一具有高度同一性(identity)，或者可以通過取代、缺失、和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生于其中之一。
所述多核苷酸可以具有序列SEQ ID NO1或3，或者與其中之一具有高度同一性或者可以與其雜交，或者可以是存在于菌株DSM 7021、DSM1457、或DSM 15242中的基因組的一部分，其可以用引物對LipCtTb-ForLipCtTb-Rev(SEQ ID NO5-6)或用引物對LipTtg-for和LipTtg-rev(SEQ IDNO7-8)擴(kuò)增。
發(fā)明詳述基因組DNA來源編碼脂肪酶的DNA序列可以從Caldanaerobacter、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、熱厭氧菌屬(Thermoanaerobium)或梭菌屬(Clostridium)的厭氧嗜熱菌株分離。因此，序列表中所示DNA序列和多肽從以下所述生物分離。如以下所指出的，從兩種生物獲得了相同的序列。
所述菌株商業(yè)上可由DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，德國獲得。
序列同一性本發(fā)明的多肽和多核苷酸與SEQ ID NO1-4中任一個(gè)可以具有70％以上、80％以上、90％以上或95％以上的同一性。可以如US 6162628所述完成兩個(gè)序列的比對和氨基酸或核苷酸同一性的計(jì)算。
脂肪酶特性脂肪酶對大量酯，特別是水不溶性底物包括三酰基甘油(甘油三酯)和對硝基苯基棕櫚酸酯是活性的。脂肪酶對甘油三酯中的2-位酯鍵顯示異乎尋常的偏好。
脂肪酶是來自消旋酯的S-對映體選擇性(anantioselective)、構(gòu)成性(S)-醇。
工業(yè)用途脂肪酶可以用作去垢劑的添加劑，如WO 2002062973所述。
脂肪酶可用于從甘油三酯和甘油生產(chǎn)甘油二酯。
脂肪酶可通過水解消旋酯混合物，用于對映體選擇性酯水解。一個(gè)例子是(S)-(-)-3-丁炔-2-醇，其可用作藥物中間體。
可通過將脂肪酶添加到生面團(tuán)用于烘烤制備基于生面團(tuán)的產(chǎn)品，特別是焙烤產(chǎn)品，如WO 9826057、WO 0032758、WO 2003100044、WO2004064537或丹麥專利申請PA 2003 01762中所述。
脂肪酶可用于甘油三酯的酯交換，如WO 9522606或WO 9933964所述。
脂肪酶可用于酯合成例如生物柴油(biodiesel)的生產(chǎn)。
脂肪酶可用于聚合反應(yīng)例如二酸和二醇的縮合。
實(shí)施例實(shí)施例1完整脂肪酶基因的擴(kuò)增用如下所示引物擴(kuò)增來自熱硫化氫熱厭氧桿菌DSM7021和布氏嗜熱厭氧菌subsp.brockii DSM 1457的完整脂肪酶基因
用以下所示引物擴(kuò)增來自Caldanaerobacter subterraneus subsp.tengcongensis DSM 15242的完整脂肪酶基因
實(shí)施例2從熱硫化氫熱厭氧桿菌生產(chǎn)脂肪酶在含有20ml相應(yīng)液體培養(yǎng)基的50ml瓶子中，將菌株DSM 7021于65℃培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)震蕩器(160rpm)上32h。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括(每升)NaCl，3.0g；KH2PO4，2.5g；NaH2PO4，0.8g；MgSO4×7H2O，0.1g；CaCl2×2H2O，0.05；FeCl3×6H2O，0.01g；(NH4)2SO4，1.5g；SrCl2×6H2O，0.03g；H3BO3，0.03g；Na2WO4，0.03g；酵母提取物，1.5g；蛋白胨，1.5g；痕量元素溶液141，1ml，維生素溶液141，1ml；刃天青，0.001g；NaHCO3，1.0g；半胱氨酸，0.3g；pH 7.2。剛要接種前，將1mg Na2S×9H2O注射在20ml容量的瓶子中。此外，將0.05g Na2S2O3添加到帶有培養(yǎng)基的瓶子中。
將所述菌株培養(yǎng)在上述復(fù)合培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)在含有作為碳源和能量來源的0.5％葡萄糖的培養(yǎng)基中，在沒有脂肪酶誘導(dǎo)劑的情況下合成胞外脂肪酶。酶的生產(chǎn)與生長并行，在65℃和pH 7.2下生長32h后達(dá)到其最大值(12U/l)。發(fā)現(xiàn)大約89％的酶分泌到培養(yǎng)液中。在典型脂肪酶誘導(dǎo)劑橄欖油和Tween 80存在下，脂肪酶活性沒有增加。
所述生物被鑒定為以對硝基苯基棕櫚酸酯還有橄欖油為底物的脂肪酶生產(chǎn)菌。
實(shí)施例3從熱硫化氫熱厭氧桿菌純化脂肪酶實(shí)施例1的培養(yǎng)肉湯中的胞外脂肪酶通過三步程序純化。第一步為疏水性相互作用層析。脂肪酶在1-0M KCl梯度內(nèi)沒有從Phenyl-Sepharose柱上解除吸附，但在10-12％二甲亞砜下洗脫，從大批其它蛋白質(zhì)良好地分離。
疏水性相互作用層析后獲得的脂肪酶溶液上樣在所使用的hydroxilapatite柱上，這是第二個(gè)純化步驟。脂肪酶在接近磷酸鈉緩沖液梯度(220至250mM范圍)中點(diǎn)洗脫?；钚约壏诌M(jìn)一步加到凝膠過濾柱。最終的凝膠過濾產(chǎn)生三個(gè)峰值。酶活性存在于第二個(gè)主峰中。脂肪酶相對于粗提物純化大約133.5倍，產(chǎn)率為10.2％。純化脂肪酶的特異活性為12.3U/mg。
在通常的還原性條件下對熱預(yù)處理的純化脂肪酶進(jìn)行SDS-PAG電泳產(chǎn)生一個(gè)相對分子量大約34.2kDa的蛋白質(zhì)條帶。不存在(absence)去垢劑時(shí)，脂肪酶在天然條件下通過天然PAG電泳遷移，顯示69kDa的單一條帶，這與凝膠過濾測定的68.5kDa分子量一致。
測定了所述條帶在天然PAG電泳后的活性，α-乙酸萘酯(naphtyl acetate)活性與考馬斯亮藍(lán)R-250染色的蛋白質(zhì)條帶相符。SDS-PAG電泳后的純化脂肪酶的解脂活性能夠通過用Triton X-100去除SDS恢復(fù)。這表明所述酶也是活性單體。在未經(jīng)Triton X-100處理沖洗的條件下檢測了所有脂肪酶活性。
實(shí)施例4從熱硫化氫梭狀芽孢桿菌、布氏嗜熱厭氧桿菌和Thermoanaerobacter tengcongensis克隆脂肪酶菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用E.coli TOP-10(Invitrogen)或TunerTM(DE3)pLacI(Novagen)實(shí)施細(xì)菌克隆試驗(yàn)。E.coli TOP-10與適于藍(lán)/白測試(blue/white assays)的克隆載體pCR 2.1-TOPO(Invitrogen)組合使用。E.coli TunerTM(DE3)pLacI與包含T7啟動(dòng)子的載體pETBlue-1(Novagen)組合使用，以克隆和表達(dá)脂肪酶基因。Lura-Betani培養(yǎng)基用于E.coli細(xì)胞。以下述濃度添加抗生素羧芐青霉素，50μg/ml；四環(huán)素，15μg/ml；氯霉素，34μg/ml；卡那霉素，50μg/ml。
N末端氨基酸序列分析測定了來自熱硫化氫梭狀芽孢桿菌和布氏嗜熱厭氧桿菌的脂肪酶N末端氨基酸序列的達(dá)17個(gè)氨基酸殘基。所述N末端氨基酸序列如SEQ ID NO2的殘基1-17所示，是100％一致的。來自熱硫化氫梭狀芽孢桿菌和布氏嗜熱厭氧菌subsp.brockii的脂肪酶N末端序列與來自Thermoanaerobactertengcongensis(菌株MB4T，Genbank登錄號AE008691)的水解酶N末端序列(AAM25001.1)對比顯示88％的同源性。
數(shù)據(jù)庫檢索和計(jì)算分析脂肪酶基因序列利用Entrez檢索系統(tǒng)在the National Center forBiotechnology Information(NCBI)獲得。用BLASTP于NCBI獲得與脂肪酶基因序列具有同源性的區(qū)域。脂肪酶基因與Thermoanaerobacter tengcongensis水解酶基因的比對利用CLUSTALW在eBioinformatics進(jìn)行。
實(shí)施例5從熱硫化氫熱厭氧桿菌和布氏嗜熱厭氧桿菌PCR擴(kuò)增脂肪酶并在pCR 2.1-TOPO載體中克隆脂肪酶基因片段的PCR擴(kuò)增利用QIAGEN Genomic DNA Kit從熱硫化氫熱厭氧桿菌和布氏嗜熱厭氧桿菌菌株提取DNA，以從細(xì)菌分離基因組DNA。染色體DNA用作模板，利用所有可能的引物(表1)組合擴(kuò)增脂肪酶片段。依照下述條件利用Biometra熱循環(huán)儀(T 3000型熱循環(huán)儀)實(shí)施PCR反應(yīng)模板DNA添加在由1×PCR緩沖液、3mM MgCl2、0.2mM dNTPs、和0.15U μl-1Taq聚合酶組成的緩沖液中，至終濃度1.5ng μl-1。以終濃度3pmol μl-1添加正向和反向引物。實(shí)施如下的二十五個(gè)熱循環(huán)Seq1(94℃，20s)、Seq2(55℃，40s)、Seq3(72℃，1min)。
用于PCR篩選的寡核苷酸
脂肪酶基因片段的克隆采用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)(TA Cloning Kit，Invitrogen)將選擇的PCR擴(kuò)增物連接到載體pCR2.1-TOPO中，并在感受態(tài)TOP-10 E.coli細(xì)胞中轉(zhuǎn)化。按照傳統(tǒng)藍(lán)/白篩選選擇陽性克隆。用NucleoSpin Plasmid Kit(Macherey-Nagel)分離質(zhì)粒。
用于鑒定與脂肪酶有同源性的序列的PCR篩選在NCBI利用BLASTN分析所述序列。用引物F/CRI/GCG和R/CRII/CAA(SEQ ID NO14和18)，來自熱硫化氫梭狀芽孢桿菌的gDNA用作模板，擴(kuò)增與來自Thermoanaerobacter tengcongensis的水解酶α/β超家族核苷酸序列有84％同一性的142-bp片段
TGCGGTGAAAGTGATGGAGACTTTAGTGAAATGACATTTAGCAGTGAATTGGAAGATGCAAGACAAATTTTAAAGTTTGTGAAAGAGCAACCTACGACTGACCCTGAGAGAATAGGACTACTTGGGACTCAGCATGGGAGGA(SEQ ID NO21)用引物F/CRI/GCG和R/CRII/AAG(SEQ ID NO14和19)，來自布氏嗜熱厭氧桿菌的gDNA用作模板，擴(kuò)增與來自Thermoanaerobacter tengcongensis的水解酶α/β超家族核苷酸序列有81％同一性的141-bp片段TGCGGTGAAAGTGATGGAGACTTTAGTGAAATGACATTTAGCAGTGAATTGGAAGATGCAAGACAAATTTTAAAGTTTGTGAAAGAGCAACCTACGACTGACCCTGAGAGAATAGGACTACTTGGCTTCAGCATGGGAGGA(SEQ ID NO22)實(shí)施例6反向PCR用來自熱硫化氫熱厭氧桿菌和布氏嗜熱厭氧桿菌sp.brockii的DNA實(shí)施反向PCR。
用限制酶消化gDNA允許擴(kuò)增已知序列邊界外的DNA片段的反向PCR技術(shù)用于完成脂肪酶基因。在1×RE-緩沖液B中，每個(gè)反應(yīng)分別用20U的限制酶BamHI和HindIII將基因組DNA(～1.4μg)消化為小片段。所述消化反應(yīng)于37℃在300μl總體積中進(jìn)行24h。限制性反應(yīng)液用1/10體積3M NaOAc和2.5體積的純乙醇于-20℃沉淀2h，4℃下，13000rpm離心30min。丸狀沉淀在室溫下風(fēng)干20min，然后重懸在100μl ddH2O中。
DNA片段的自連接將0.5μl(200U)T4連接酶(MBI，BioLabs)、30μl T4連接酶-緩沖液(MBI)和10mM ATP添加到消化過的DNA。所述連接反應(yīng)于4℃實(shí)施48h。連接反應(yīng)液用1/10體積3M NaOAc和2.5體積的純乙醇于-20℃沉淀2h，4℃下，13000rpm離心30min。丸狀沉淀在室溫下風(fēng)干20min，然后重懸在100μl ddH2O中。
用構(gòu)建的引物實(shí)施反向PCR環(huán)狀DNA片段用作模板，用所有可能的引物(表2)組合擴(kuò)增脂肪酶片段。依照下述條件利用Biometra熱循環(huán)儀(T 3000型熱循環(huán)儀)實(shí)施PCR反應(yīng)模板環(huán)狀DNA片段添加在由1×PCR緩沖液、3mM MgCl2、0.2mM dNTPs、和0.15U μl-1Taq聚合酶組成的緩沖液中，至終濃度～1.35ng μl-1。以終濃度3pmol μl-1添加正向和反向引物。如下進(jìn)行三十個(gè)熱循環(huán)Seq1(94℃，20s)、Seq2(55℃，45s)、Seq3(72℃，2min)。
表2.用于反向PCR的寡核苷酸訂正了表2的最后一欄。
程序ContigExpressTM(Vector NTI，InforMax，Inc.，North Bethesda，Maryland針對Mac OS用戶開發(fā)的軟件包)用于分析序列，并完成脂肪酶基因。
實(shí)施例7從熱硫化氫梭狀芽孢桿菌、布氏嗜熱厭氧桿菌和Thermoanaerobacter tengcongensis表達(dá)脂肪酶AccepTor Vector Kit(Novagen)用于pETBlue-1載體中T7lac啟動(dòng)子控制下IPTG可誘導(dǎo)的脂肪酶基因表達(dá)。設(shè)計(jì)所述試劑盒用于利用Taq DNA聚合酶簡化所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的克隆，其在其反應(yīng)產(chǎn)物上留下單一的3’-dA突出端(overhang)。線性化pETBlue-1載體包含單一的3’-dU突出端，其適合于這些產(chǎn)物的直接連接，無需中間反應(yīng)。轉(zhuǎn)化后，細(xì)菌復(fù)制質(zhì)粒時(shí)，dU殘基被dT殘基替換。
NovaBlue宿主用于初始克隆并驗(yàn)證pETBlue-1載體中的構(gòu)建體，然后將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Tuner(DE3)pLacI菌株中，用于在E.coli中表達(dá)。
插入物的制備PCR擴(kuò)增脂肪酶基因。如以上實(shí)施例1所述，染色體DNA用作模板，利用構(gòu)建的引物(對于來自熱硫化氫梭狀芽孢桿菌和布氏嗜熱厭氧桿菌的脂肪酶基因?yàn)镾EQ ID NO5-6；對于來自Thermoanaerobacter tengcongensis的脂肪酶基因?yàn)镾EQ ID NO7-8)擴(kuò)增完整的脂肪酶基因。依照下述條件實(shí)施PCR反應(yīng)將模板DNA添加在由1×PCR-緩沖液、3mM MgCl2、0.2mMdNTPs組成的緩沖液中，至終濃度～1.5ng μl-1。熱啟動(dòng)后添加0.2U μl-1的Hifi-聚合酶。以終濃度3pmol μl-1添加正向和反向引物。如下實(shí)施二十五個(gè)熱循環(huán)Seq1(94℃，15s)、Seq2(50℃，30s)、Seq3(68℃，1min 20s)。用NucleoSpinExtraction Kit(Macherey Nagel)純化PCR產(chǎn)物。
連接在10μl的總體積中將50ng μl-1pETBlue-1載體與～50ng擴(kuò)增產(chǎn)物連接。反應(yīng)物于16℃保溫1h。
NovaBlue SinglesTM感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將1μl的連接反應(yīng)物直接添加到NovaBlue Singles感受態(tài)細(xì)胞。在42℃水浴中用“熱休克”法轉(zhuǎn)化剛好30秒。通過藍(lán)/白篩選選擇羧芐青霉素抗性標(biāo)記的陽性克隆。
用pETBlue-1重組體轉(zhuǎn)化TunerTM(DE3)pLacI感受態(tài)細(xì)胞將從藍(lán)/白篩選宿主NovaBlue鑒定分離的pETBlue-1重組體轉(zhuǎn)化到Tuner(DE3)pLacI表達(dá)宿主中，用于基于IPTG的誘導(dǎo)。該菌株攜帶T7 RNA聚合酶基因的染色體拷貝，設(shè)計(jì)用于在pETBlue-1載體中T7lac啟動(dòng)子的控制下實(shí)施可用IPTG誘導(dǎo)的目標(biāo)基因表達(dá)。將～1ng μl-1的pETBlue-1重組體質(zhì)粒直接添加到感受態(tài)細(xì)胞。在42℃水浴中用“熱休克”法轉(zhuǎn)化剛好30秒。
生長和誘導(dǎo)制備了3ml(DE3)pLacI表達(dá)宿主菌株中pETBlue-1重組體的發(fā)酵劑培養(yǎng)物。生長LB培養(yǎng)基包含羧芐青霉素，50μg ml-1；氯霉素，34μg ml-1和1％葡萄糖。將100ml用發(fā)酵劑培養(yǎng)物接種的培養(yǎng)基孵育至OD600為1.0。然后添加1mM IPTG。培養(yǎng)物于37℃振動(dòng)孵育4h，以充分誘導(dǎo)。
實(shí)施例8熱硫化氫熱厭氧桿菌脂肪酶在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中的表達(dá)。
線性整合載體系統(tǒng)用于所述基因的表達(dá)克隆。所述線性整合構(gòu)建體是PCR融合產(chǎn)物，由兩個(gè)帶有強(qiáng)啟動(dòng)子和氯霉素抗性標(biāo)記的枯草芽孢桿菌同源染色體區(qū)域之間的基因融合而成。所述融合物通過SOE PCR(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.and Pease，L.R.(1989)Engineering hybridgenes without the use of restriction enzymes，gene splicing by overlap extensionGene 7761-68)制得。SOE PCR法也描述于專利申請WO 2003095658)。所述基因在三重啟動(dòng)子系統(tǒng)(如WO 99/43835所述)的控制下表達(dá)，所述三重啟動(dòng)子系統(tǒng)由來自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、和包括穩(wěn)定序列的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA啟動(dòng)子組成。編碼氯霉素乙?；?轉(zhuǎn)移酶的基因用作標(biāo)記(Described in eg.Diderichsen，B.；Poulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30312(1993))。在芽孢桿菌染色體上，最終的基因構(gòu)建體通過同源重組整合到果膠酸裂合酶位點(diǎn)中。
用QIAmp Tissue Kit(Qiagen，Hilden，德國)分離熱硫化氫熱厭氧桿菌的染色體DNA。PCR擴(kuò)增前3個(gè)片段用特異性引物oth296(SEQ ID NO.27)和oth297(SEQ ID NO.28)擴(kuò)增來自熱硫化氫熱厭氧桿菌的基因組DNA上的基因片段。從菌株iMB1361(專利申請WO 2003095658中所述)的基因組DNA，用引物260558(SEQ ID NO.29)和iMB1361Uni1(SEQ ID NO.30)擴(kuò)增上游側(cè)翼片段，用引物260559(SEQ ID NO.31)和DwC 1361(SEQ IDNO.32)擴(kuò)增下游側(cè)翼片段。
用校對聚合酶(Proof Start Polymerase(Qiagen))擴(kuò)增所述基因片段。用High Fidelity PCR System”(Boehringer Mannheim，德國)擴(kuò)增兩個(gè)側(cè)翼DNA片段。依照標(biāo)準(zhǔn)程序(按照廠商的推薦)完成PCR反應(yīng)。PCR條件如下94℃2min，然后10個(gè)循環(huán)的(94℃15秒、50℃45秒、68℃4min)，接下來20個(gè)循環(huán)的(94℃15秒、50℃45秒、68℃4min(每個(gè)循環(huán)+20秒延伸))，68℃10min一個(gè)循環(huán)結(jié)束。
將所得的3個(gè)片段等摩爾比混合，在以下條件下實(shí)施新的PCR反應(yīng)最初94℃2min.，然后10個(gè)循環(huán)的(94℃15秒、50℃45秒、68℃5min.)，10個(gè)循環(huán)的(94℃15秒、50℃45秒、68℃8min.)，15個(gè)循環(huán)的(94℃15秒、50℃45秒、68℃8min.，每個(gè)循環(huán)額外加20秒)。第一個(gè)循環(huán)后，添加兩種末端引物260558(SEQ ID NO.29)和260559(SEQ ID NO.31)(每種20pMol)。將2μl的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中，在含氯霉素(6μg/ml培養(yǎng)基)的LB平板上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇包含所述構(gòu)建體的克隆用于在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，所述構(gòu)建體不含導(dǎo)致氨基酸改變的突變。
發(fā)酵、純化和活性測試所述克隆在從-80℃儲存物獲得的含6micro g/ml氯霉素的LB瓊脂板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。將菌落轉(zhuǎn)移到500ml振動(dòng)燒瓶中添加有6micro g/ml氯霉素的100ml LB或PS-1培養(yǎng)基。培養(yǎng)物于30℃ 275rpm振動(dòng)1或3天。用已在實(shí)施例3中描述的方法離心細(xì)胞，從上清純化酶。如實(shí)施例9中所述測定活性。
實(shí)施例9脂肪酶的特性溫度的影響純化的SEQ ID NO2和4的脂肪酶均在75℃(10分鐘反應(yīng))顯示出最佳活性，在85-90℃以上活性很小。
pH的影響純化的SEQ ID NO2的脂肪酶于pH 8.0顯示最佳活性，于pH 6.5-9.0顯示＞80％的活性，低于pH 6.0和高于pH 10.0幾乎沒有活性。SEQ ID NO4的脂肪酶于pH 7.0顯示最佳活性，于pH 6.5-9.0顯示＞60％的活性，低于pH6.0和高于pH 11.0幾乎沒有活性。
金屬離子的影響在存在達(dá)10mM的以下金屬離子時(shí)，脂肪酶活性幾乎沒有改變Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Ag+、Mg2+、Mn2+、Sr2+、Rb+、Co2+、Ni2+和Al3+。以下離子降低所述活性Zn2+、Fe2+、Fe3+和Cr3+。
去垢劑成分的影響30℃下與以重量計(jì)達(dá)10％的多種化合物一起孵育1.5小時(shí)后測試脂肪酶的活性。與CHAPS(3-[(3-膽酰胺丙基)二甲銨基]-1-丙磺酸)、PVA(聚乙烯醇)和EDTA(乙二胺四乙酸)一起孵育后，脂肪酶保留＞75％的活性。與Tween-20和Tween-80或Triton X-100一起孵育降低所述活性。SDS引起完全的酶抑制。
溶劑的影響濃度以體積計(jì)達(dá)50％的下述溶劑對SEQ ID NO2的脂肪酶的活性幾乎沒有影響叔丁醇、乙醇、乙腈、異丙醇、吡啶、DMSO、丙酮、二甲基甲酰胺和甲醇。
抑制劑的影響濃度達(dá)10mM的下述化合物對SEQ ID NO2和4的脂肪酶的活性幾乎沒有影響b-巰基乙醇、尿素、pHMB、鹽酸胍、DTT和碘代-醋酸酯。0.1-1mM的PMSF和Pefablock同時(shí)滅活兩種脂肪酶。
實(shí)施例10來自熱硫化氫熱厭氧桿菌的脂肪酶的底物特異性對pNP-酯的底物特異性通過與作為底物的1mM(pH 8.0)的多種pNP-酯于70℃反應(yīng)10min，測試SEQ ID NO2的脂肪酶。獲得了與SEQ ID NO4的脂肪酶類似的結(jié)果。
pNP-酯 相對活性pNP-醋酸酯(C2:0)9pNP-丁酸酯(C4:0)57pNP-己酸酯(C6:0)81pNP-辛酸酯(C8:0)90pNP-癸酸酯(C10:0) 100pNP-月桂酸酯(C12:0) 84pNP-豆蔻酸酯(C14:0) 68pNP-棕櫚酸酯(C16:0) 32pNP-硬脂酸酯(C18:0) 8發(fā)現(xiàn)所述脂肪酶與鏈長C6-C14的底物一起具有高活性。
對甘油三酯的底物特異性通過與作為底物的10mM(pH 8.0)的多種甘油三酯于70℃反應(yīng)25h，測試SEQ ID NO2的脂肪酶。獲得了與SEQ ID NO4的脂肪酶類似的結(jié)果。
甘油三酯相對活性三乙酸甘油酯(C2:0) 5三丁酸甘油酯(C4:0) 10三己酸甘油酯(C6:0) 74三辛酸甘油酯(C8:0) 100三癸酸甘油酯(C10:0) 15三月桂酸甘油酯(C12:0) 11三肉豆蔻酸甘油酯(C14:0) 8三棕櫚酸甘油酯(C16:0) 22三硬脂酸甘油酯(C18:0) 9三油酸甘油酯(C18:1) 12橄欖油 10
發(fā)現(xiàn)脂肪酶對C6和C8具有良好的活性，但對其它鏈長的活性低。
實(shí)施例11醇解測試了由SEQ ID NO2的脂肪酶催化的多種三酰甘油酯的醇解。所述脂肪酶醇解了所有底物。三硬脂酸甘油酯作為底物時(shí)觀察到最高產(chǎn)率(轉(zhuǎn)化率67％)。對于其它底物，轉(zhuǎn)化率高于40％。所述脂肪酶以最高速率催化從三酰甘油酯合成1，3-二酰甘油酯和1-和3-單酰甘油酯。沒有產(chǎn)生sn2-單酸甘油酯。所述酶顯示出對2-位酯鍵異乎尋常的偏好。所述蛋白質(zhì)的2-位特異性隨酯鍵的長度而增強(qiáng)。
實(shí)施例12對映體選擇性發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO2的脂肪酶對以下四種底物是活性的1-苯基-1-乙基-醋酸酯、1-苯基-2-丙基-醋酸酯、丁炔醇醋酸酯(butynol acetate)和丁炔醇丁酸酯，并且對后兩種是相對S-對映體選擇性的。用這兩種底物顯示了所述脂肪酶的(S)-偏好和可接受的E-值(分別為16.7和9.2)。形成(S)-醇。與丁炔醇醋酸酯相比，脂肪酶對丁炔醇丁酸酯更具對映體選擇性。在24h的反應(yīng)時(shí)間后，隨著時(shí)間推移，對于所有四種底物轉(zhuǎn)化率均提高，達(dá)到20-30％以上。在40h的反應(yīng)時(shí)間后，隨著時(shí)間推移，對照轉(zhuǎn)化率，所述酶針對兩種底物的對映體選擇性均降低，對于丁炔醇丁酸酯，從16.7降到8.06，對于丁炔醇醋酸酯，從9.15降到2.65。脂肪酶顯示出對(S)-對映體更高的偏好，但隨著時(shí)間推移，其區(qū)分對映體的能力下降。對于其它兩種底物，脂肪酶的對映體選擇性(E≥1)隨時(shí)間推移是恒定的。
實(shí)施例13位置特異性對單酸甘油酯(MG)的位置特異性發(fā)現(xiàn)與單棕櫚酰甘油分子中的2-位酯鍵相比，SEQ ID NO2的脂肪酶對1-位酯鍵的水解較弱(小2倍(less than 2 fold))。所述酶顯示出對2-位酯鍵異乎尋常的偏好。
對甘油三酯(TG)的位置特異性針對下述甘油三酯(TG、三酰甘油酯)三月桂酸甘油酯(C12)、三豆蔻酸甘油酯(C14)、三棕櫚酸甘油酯(C16)、三硬脂酸甘油酯(C18)、三油酸甘油酯(C18:1)，測試了來自熱硫化氫熱厭氧桿菌的脂肪酶(SEQ ID NO2)的位置特異性。將每種TG(3mmol)溶解在有機(jī)溶劑(2ml丙酮)中，并于65℃、400rpm預(yù)平衡過15min。添加干燥的乙醇(3mmol)，并將反應(yīng)混合物于65℃、400rpm孵育15min。添加脂肪酶(以TG重量為基礎(chǔ)10％)以啟動(dòng)反應(yīng)。在4-ml帶螺絲帽的管形瓶中進(jìn)行反應(yīng)，并用磁攪拌器混合反應(yīng)混合物(400rpm)。周期性地取出等份量的反應(yīng)混合物(20μl)，并用氯仿(80μl)稀釋為合適的稀釋液，接下來通過Iatroscan分析以測定酰基甘油成分(composition)。
反應(yīng)期間利用Iatroscan分析法(Iatroscan，Iatron Laboratories，Inc.，東京，日本)通過TLC/FID定量測定反應(yīng)介質(zhì)的甘油酯成分變化。分析前掃描空白色譜棒(chromarod)。用硼酸(3％)處理色譜棒并干燥5min后，將0.1ml的反應(yīng)介質(zhì)(在氯仿中稀釋為合適的稀釋液)點(diǎn)樣到色譜棒上，所點(diǎn)的樣在苯∶氯仿∶醋酸(50∶30∶0.5，以體積計(jì))混合物中顯影10cm，35min。干燥后，將色譜棒置于110℃烘箱中5min，在160ml/min的氫氣流速和2.0l/min的風(fēng)速下進(jìn)行掃描，產(chǎn)生色譜。
以下以剩余底物(TG)的％和下述產(chǎn)物的％給出由來自熱硫化氫梭狀芽孢桿菌的脂肪酶于65℃催化反應(yīng)7h后的三酰甘油酯醇解結(jié)果脂肪酸(FA)、甘油二酯(DG，1，3-DG自1，2-和2，3-DG分離)、單酸甘油酯(MG，2-MG自1-和3-MG分離)。
結(jié)果顯示所有底物都被所述脂肪酶醇解。三硬脂酸甘油酯作為底物時(shí)觀察到最高產(chǎn)率(轉(zhuǎn)化率67％)。對于其它底物，轉(zhuǎn)化率高于40％。所述脂肪酶以最高速率催化從三酰甘油酯形成1，3-二酰甘油酯與1-和3-單酰甘油酯。沒有產(chǎn)生sn2-單酸甘油酯。所述酶顯示出對2-位酯鍵異乎尋常的偏好。所述蛋白質(zhì)的2-位特異性隨酯鍵的長度增強(qiáng)。
序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>用脂肪酶水解酯鍵<130>10671-WO<160>32<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>780<212>DNA<213>熱硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(777)<400>1atg caa aag gct gtt gaa att aca tat aac ggc aaa act tta aga gga48Met Gln Lys Ala Val Glu Ile Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Leu Arg Gly1 5 10 15atg atg cat ttg cct gat gat gtt aag ggt aaa gtg cct atg gta ata96Met Met His Leu Pro Asp Asp Val Lys Gly Lys Val Pro Met Val Ile20 25 30atg ttt cac ggt ttt aca ggc aat aaa gta gag tct cac ttt att ttt144Met Phe His Gly Phe Thr Gly Asn Lys Val Glu Ser His Phe Ile Phe35 40 45gtg aag atg tca aga gct tta gaa aaa gta ggt att ggg agt gta agg192Val Lys Met Ser Arg Ala Leu Glu Lys Val Gly Ile Gly Ser Val Arg50 55 60ttt gac ttt tat ggt tct gga gaa agt gat ggg gac ttt agt gaa atg240Phe Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Glu Scr Asp Gly Asp Phe Ser Glu Met65 70 75 80aca ttt agc agt gaa ttg gaa gat gca aga caa att tta aag ttt gtg288Thr Phe Ser Ser Glu Leu Glu Asp Ala Arg Gln Ile Leu Lys Phe Val85 90 95aaa gag caa cct acg act gac cct gag aga ata gga cta ctt ggt ttg336Lys Glu Gln Pro Thr Thr Asp Pro Glu Arg Ile Gly Leu Leu Gly Leu100 105 110agt atg gga gga gct att gca ggg att gta gca agg gaa tat aaa gat384Ser Met Gly Gly Ala Ile Ala Gly Ile Val Ala Arg Glu Tyr Lys Asp115 120 125gaa ata aag gcg ttg gtg cta tgg gct cca gct ttt aat atg cct gag432Glu Ile Lys Ala Leu Val Leu Trp Ala Pro Ala Phe Asn Met Pro Glu130 135 140ctt ata atg aac gaa agt gta aag caa tac gga gct att atg gaa caa480Leu Ile Met Asn Glu Ser Val Lys Gln Tyr Gly Ala Ile Met Glu Gln145 150 155 160ttg ggc ttt gta gac ata gga gga cat aaa ctg agt aaa gat ttt gtt528Leu Gly Phe Val Asp Ile Gly Gly His Lys Leu Ser Lys Asp Phe Val
165 170 175gag gat att tca aaa tta aat ata ttt gag ctg tca aaa gga tac gat576Glu Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ile Phe Glu Leu Ser Lys Gly Tyr Asp180 185 190aaa aaa gtg ctt ata gtt cat ggg aca aat gat gaa gcg gtt gaa tat624Lys Lys Val Leu Ile Val His Gly Thr Asn Asp Glu Ala Val Glu Tyr195 200 205aaa gtt tct gat aga atc tta aaa gag gtt tat ggg gat aac gct aca672Lys Val Ser Asp Arg Ile Leu Lys Glu Val Tyr Gly Asp Asn Ala Thr210 215 220aga gtg aca atc gaa aat gca gac cat act ttt aag agt tta gaa tgg720Arg Val Thr Ile Glu Asn Ala Asp His Thr Phe Lys Ser Leu Glu Trp225 230 235 240gag aaa aag gcg att gag gag tca gta gag ttt ttc aaa aag gaa ttg768Glu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ser Val Glu Phe Phe Lys Lys Glu Leu245 250 255tta aag gga tag780Leu Lys Gly<210>2<211>259<212>PRT<213>熱硫化氫嗜熱厭氧桿菌<400>2Met Gln Lys Ala Val Glu Ile Thr Tyr Asn Gly Lys Thr Leu Arg Gly1 5 10 15Met Met His Leu Pro Asp Asp Val Lys Gly Lys Val Pro Met Val Ile20 25 30Met Phe His Gly Phe Thr Gly Asn Lys Val Glu Ser His Phe Ile Phe35 40 45Val Lys Met Ser Arg Ala Leu Glu Lys Val Gly Ile Gly Ser Val Arg50 55 60Phe Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Glu Ser Asp Gly Asp Phe Ser Glu Met65 70 75 80Thr Phe Ser Ser Glu Leu Glu Asp Ala Arg Gln Ile Leu Lys Phe Val85 90 95Lys Glu Gln Pro Thr Thr Asp Pro Glu Arg Ile Gly Leu Leu Gly Leu100 105 110Ser Met Gly Gly Ala Ile Ala Gly Ile Val Ala Arg Glu Tyr Lys Asp115 120 125Glu Ile Lys Ala Leu Val Leu Trp Ala Pro Ala Phe Asn Met Pro Glu130 135 140Leu Ile Met Asn Glu Ser Val Lys Gln Tyr Gly Ala Ile Met Glu Gln145 150 155 160Leu Gly Phe Val Asp Ile Gly Gly His Lys Leu Ser Lys Asp Phe Val
165 170 175Glu Asp Ile Ser Lys Leu Asn Ile Phe Glu Leu Ser Lys Gly Tyr Asp180 185 190Lys Lys Val Leu Ile Val His Gly Thr Asn Asp Glu Ala Val Glu Tyr195 200 205Lys Val Ser Asp Arg Ile Leu Lys Glu Val Tyr Gly Asp Asn Ala Thr210 215 220Arg Val Thr Ile Glu Asn Ala Asp His Thr Phe Lys Ser Leu Glu Trp225 230 235 240Glu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ser Val Glu Phe Phe Lys Lys Glu Leu245 250 255Leu Lys Gly<210>3<211>777<212>DNA<213>Thermoanaerobacter tencongensis<220>
<221>CDS<222>(1)..(774)<400>3gtg cag aag gct gta gag ttt aca tat aat agg aaa acc tta agg ggg48Val Gln Lys Ala Val Glu Phe Thr Tyr Asn Arg Lys Thr Leu Arg Gly1 5 10 15atg ttg cat ctt cct gaa gga gta tct gaa aag gtt cct atg gta gtt96Met Leu His Leu Pro Glu Gly Val Ser Glu Lys Val Pro Met Val Val20 25 30atg ttt cac ggt ttt aca gga aat aaa gta gag tcc cat ttt att ttt144Met Phe His Gly Phe Thr Gly Asn Lys Val Glu Ser His Phe Ile Phe35 40 45gtt aag atg tca aga gct tta gaa aaa gtg gga ata gga agt gtg agg192Val Lys Met Ser Arg Ala Leu Glu Lys Val Gly Ile Gly Ser Val Arg50 55 60ttt gac ttt tac ggt tca ggc gaa agc gac gga gat ttt agt gaa atg240Phe Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Glu Ser Asp Gly Asp Phe Ser Glu Met65 70 75 80acc ttt agc ggt gaa tta gag gat gca cga cag att tta gat ttc gtt288Thr Phe Ser Gly Glu Leu Glu Asp Ala Arg Gln Ile Leu Asp Phe Val85 90 95aaa agg cag ccg act acg gat gta gaa aga ata ggt ctt ttg gga ctc336Lys Arg Gln Pro Thr Thr Asp Val Glu Arg Ile Gly Leu Leu Gly Leu100 105 110agc atg gga gga gct ata gca gga ata ata gca aga gaa aga aaa gag384Ser Met Gly Gly Ala Ile Ala Gly Ile Ile Ala Arg Glu Arg Lys Glu115 120 125gat gtg aaa gcc tta gtt tta tgg gct ccc gct ttt aat atg ccg gaa432Asp Val Lys Ala Leu Val Leu Trp Ala Pro Ala Phe Asn Met Pro Glu
130 135 140ctc ata atg gga gaa gga gct aga cag tat ggg gca ata atg gaa agc480Leu Ile Met Gly Glu Gly Ala Arg Gln Tyr Gly Ala Ile Met Glu Ser145 150 155 160ttg ggc tat gta gat ata gga ggg cta aaa ctt gac aga gct ttt gtg528Leu Gly Tyr Val Asp Ile Gly Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ala Phe Val165 170 175gag gat ata gcg aag ttt aat att ttt gag ctg tca aga ggt tat gag576Glu Asp Ile Ala Lys Phe Asn Ile Phe Glu Leu Ser Arg Gly Tyr Glu180 185 190ggg aaa gtg ctc ata gtc cac ggt act aac gat gaa gcc gtt gag tac624Gly Lys Val Leu Ile Val His Gly Thr Asn Asp Glu Ala Val Glu Tyr195 200 205agg atc tct gat aga ata ctt caa gaa gta tat ggg gat aat gct ttc672Arg Ile Ser Asp Arg Ile Leu Gln Glu Val Tyr Gly Asp Asn Ala Phe210 215 220cgc gta act ata gaa gga gcg gac cat act ttt aaa aac ctt gaa tgg720Arg Val Thr Ile Glu Gly Ala Asp His Thr Phe Lys Asn Leu Glu Trp225 230 235 240gaa aga aaa gcg ata gaa gaa tct gtg aag ttc ttt gaa aga gaa tta768Glu Arg Lys Ala Ile Glu Glu Ser Val Lys Phe Phe Glu Arg Glu Leu245 250 255aag gga tag777Lys Gly<210>4<211>258<212>PRT<213>Thermoanaerobacter tencongensis<400>4Val Gln Lys Ala Val Glu Phe Thr Tyr Asn Arg Lys Thr Leu Arg Gly1 5 10 15Met Leu His Leu Pro Glu Gly Val Ser Glu Lys Val Pro Met Val Val20 25 30Met Phe His Gly Phe Thr Gly Asn Lys Val Glu Ser His Phe Ile Phe35 40 45Val Lys Met Ser Arg Ala Leu Glu Lys Val Gly Ile Gly Ser Val Arg50 55 60Phe Asp Phe Tyr Gly Ser Gly Glu Ser Asp Gly Asp Phe Ser Glu Met65 70 75 80Thr Phe Ser Gly Glu Leu Glu Asp Ala Arg Gln Ile Leu Asp Phe Val85 90 95Lys Arg Gln Pro Thr Thr Asp Val Glu Arg Ile Gly Leu Leu Gly Leu100 105 110Ser Met Gly Gly Ala Ile Ala Gly Ile Ile Ala Arg Glu Arg Lys Glu115 120 125
Asp Val Lys Ala Leu Val Leu Trp Ala Pro Ala Phe Asn Met Pro Glu130 135 140Leu Ile Met Gly Glu Gly Ala Arg Gln Tyr Gly Ala Ile Met Glu Ser145 150 155 160Leu Gly Tyr Val Asp Ile Gly Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ala Phe Val165 170 175Glu Asp Ile Ala Lys Phe Asn Ile Phe Glu Leu Ser Arg Gly Tyr Glu180 185 190Gly Lys Val Leu Ile Val His Gly Thr Asn Asp Glu Ala Val Glu Tyr195 200 205Arg Ile Ser Asp Arg Ile Leu Gln Glu Val Tyr Gly Asp Asn Ala Phe210 215 220Arg Val Thr Ile Glu Gly Ala Asp His Thr Phe Lys Asn Leu Glu Trp225 230 235 240Glu Arg Lys Ala Ile Glu Glu Ser Val Lys Phe Phe Glu Arg Glu Leu245 250 255Lys Gly<210>5<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LipCtTb-For<400>5atgcaaaagg ctgttgaaat tac 23<210>6<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LipCtTb-Rev<400>6ttatcccttt aacaattcct ttttg25<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LipTtg-for<400>7atgcagaagg ctgtagagtt tac 23<210>8<211>25<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>LipTtg-rev<400>8ttatcccttt aattctcttt caaag25<210>9<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LF/NT/CTT<400>9cttaaggggg atgttgcatc ttc 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LF/NT/ATT<400>10attaaggggg gtactgcatc tg 22<210>11<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LF/0AH/CAT<400>11catgggttta ccggaaataa agtgg25<210>12<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>F/CRI/TTC<400>12ttcaggcgaa agcgacggag 20<210>13<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>F/CRI/GGA<400>13ggaacaggtg aaagtgatgg agaatt 26<210>14
<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>F/CRI/GCG<400>14gcggtgaaag tgatggagac ttt 23<210>15<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>R/CRI/TCC<400>15tccgtcgctt tcgcctgaac 20<210>16<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>R/CRI/AAA<400>16aaattctcca tcactttcac ctgttcc 27<210>17<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>R/CRI/TCT<400>17tctccatcac tttcaccgct g21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>R/CRII/CAA<400>18tcctcccatg ctgagtccca a21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>R/CRII/AAG<400>19tcctcccatg ctgaagccaa g21
<210>20<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>R/CTI/TTT<400>20ttttgtatgg tccgctcctt ctat 24<210>21<211>142<212>DNA<213>人工的<220>
<223>142bp片段<400>21tgcggtgaaa gtgatggaga ctttagtgaa atgacattta gcagtgaatt ggaagatgca 60agacaaattt taaagtttgt gaaagagcaa cctacgactg accctgagag aataggacta 120cttgggactc agcatgggag ga 142<210>22<211>141<212>DNA<213>人工的<220>
<223>141bp片段<400>22tgcggtgaaa gtgatggaga ctttagtgaa atgacattta gcagtgaatt ggaagatgca 60agacaaattt taaagtttgt gaaagagcaa cctacgactg accctgagag aataggacta 120cttggcttca gcatgggagg a141<210>23<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>1F_Inv2CT<400>23gacatttagc agtgaattgg aagatgc 27<210>24<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>2F_Inv2CT<400>24tttgtgaaag agcctacgac tgacc25
<210>25<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>3R_Inv2CT<400>25gcactttacc cttaacatca tcaggc 26<210>26<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>4R_Inv2CT<400>26gactctactt tattgcctgt aaaaccg 27<210>27<211>46<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物oth296<400>27tgaaaaaaag gagaggataa agaatgcaaa aggctgttga aattac 46<210>28<211>46<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物oth297<400>28ggagcggatt gaacatgcga ttatcccttt aacaattcct ttttga 46<210>29<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>260558<400>29gagtatcgcc agtaaggggc g21<210>30<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>iMB1361Uni1<400>30
tctttatcct ctcctttttt tcagagctc29<210>31<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>260559<400>31gcagccctaa aatcgcataa agc 23<210>32<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>DwC 1361<400>32taatcgcatg ttcaatccgc tcc 2權(quán)利要求
1.水解底物中酯鍵的方法，其包括用脂肪酶處理所述底物，所述脂肪酶a)具有與SEQ ID NO2或4具有至少70％同一性的氨基酸序列；b)由中等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO1或3的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼；c)具有能夠自SEQ ID NO2或4通過取代、缺失、和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列；或者d)由存在于菌株DSM 7021、DSM 1457、或DSM 15242中的基因組的脂肪酶編碼部分編碼，并且能夠用SEQ ID NO5和6或用SEQ ID NO7和8擴(kuò)增。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述酯鍵是二級醇酯鍵，特別是甘油三酯2-位的鍵。
3.脂肪酶，其a)具有與SEQ ID NO2具有至少90％同一性的氨基酸序列；b)由中等嚴(yán)緊條件下與核酸序列SEQ ID NO1的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼；c)具有能夠自SEQ ID NO2通過取代、缺失、和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列；或者d)由存在于菌株DSM 7021或DSM 1457中基因組的脂肪酶編碼部分所編碼，并且能夠用SEQ ID NO5和6擴(kuò)增。
4.編碼前述權(quán)利要求的脂肪酶的多核苷酸。
5.包含選自以下序列的多核苷酸a)編碼脂肪酶并與之具有至少90％同一性的多核苷酸；b)編碼脂肪酶并在高嚴(yán)緊條件下與核苷酸SEQ ID NO1的互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸；c)存在于菌株DSM 7021或DSM 1457中的基因組的脂肪酶編碼部分，其能夠用SEQ ID NO5和6擴(kuò)增，或者d)a)、b)或c)的多核苷酸的互補(bǔ)鏈。
6.生產(chǎn)多肽的方法，包括a)獲得編碼多肽的多核苷酸，所述多肽具有來自厭氧細(xì)菌的脂肪酶的活性；b)用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化芽孢桿菌細(xì)胞；c)在有助于生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和d)回收所述多肽。
全文摘要
本發(fā)明人已鑒定了厭氧嗜熱細(xì)菌中具有脂肪酶活性的多肽。因此，本發(fā)明提供水解底物中的酯鍵的方法，包括用特定脂肪酶(具有脂肪酶活性的多肽)處理所述底物。本發(fā)明還提供用于所述方法的脂肪酶和編碼所述脂肪酶的多核苷酸。
文檔編號C12N15/55GK101035894SQ200580034405
公開日2007年9月12日 申請日期2005年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月8日
發(fā)明者托馬斯·謝弗, 加拉貝德·安特拉尼基安, 瑪麗納·羅伊特, 蒂納·霍夫 申請人:諾維信公司