專(zhuān)利名稱：肝炎重癥化的監(jiān)控藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝炎重癥化的監(jiān)控方法和該監(jiān)控藥。
背景技術(shù)：
已知原發(fā)性肝細(xì)胞癌(以下稱為肝癌)，多數(shù)是B型和C型肝炎病毒感染患者在從慢性肝炎發(fā)展為肝硬化后發(fā)病。在病毒感染者中，特別是C型肝炎病毒感染患者向肝癌的轉(zhuǎn)變率高，近年也有發(fā)病增加的趨勢(shì)。作為肝癌的治療方法，進(jìn)行肝切除、經(jīng)皮的局部療法(射頻消融療法、乙醇注入療法等)、肝動(dòng)脈栓塞療法(TAE)、持續(xù)動(dòng)脈注射化學(xué)療法、放射線療法等，但大多不能達(dá)到完全治愈。因此，出于在肝癌轉(zhuǎn)變階段的慢性肝炎和肝硬化時(shí)除去病毒和增強(qiáng)免疫力的目的，近年開(kāi)展通過(guò)各種抗病毒劑和各種干擾素的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用、防止向肝癌轉(zhuǎn)變的治療。
現(xiàn)在，作為肝臟異常的檢查，廣泛使用AST(GOT)、ALT(GPT)和γ-GTP(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)酞酶)，此外，也使用TP(血清總蛋白)、A/G比(白蛋白/球蛋白比)、UA(尿酸)、T-Cho(總膽固醇)、TTT(麝香草酚渾濁試驗(yàn))、ZTT(硫酸鋅渾濁試驗(yàn))、LDH(乳酸脫水酶)、ALP(堿性磷酸酶)、chE(膽堿酯酶)作為肝臟異常的指標(biāo)。如此通過(guò)大量的檢查，診斷肝臟異常，還通過(guò)病毒檢查和活組織檢查診斷向炎癥、纖維化(filamentation)和癌化的發(fā)展程度。
病毒感染、肝炎、慢性肝炎、肝硬化、然后向肝癌的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)狀是由各種標(biāo)示的檢查和活組織檢查診斷向纖維化和癌化的轉(zhuǎn)變。該措施對(duì)患者的負(fù)擔(dān)大，不僅在醫(yī)療經(jīng)濟(jì)上存在問(wèn)題，而且為了得到確實(shí)的醫(yī)療指導(dǎo)，也希望開(kāi)發(fā)能夠簡(jiǎn)便地預(yù)測(cè)肝癌發(fā)病的方法。
作為存在于細(xì)胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfateproteoglycan)的新家族，報(bào)告了磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族的存在。迄今為止，作為磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員，報(bào)告了6種磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5和磷脂酰肌醇蛋白聚糖6)的存在。該家族的成員，具有均勻尺寸(約60kDa)的核蛋白質(zhì)，共同具有特異地保持良好的半胱氨酸序列，由糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定與細(xì)胞膜結(jié)合。
已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)與發(fā)生的細(xì)胞分裂及其圖案的控制深切相關(guān)。已知GPC3在血液中分泌，由非專(zhuān)利文獻(xiàn)1暗示在第358號(hào)氨基酸和第359號(hào)氨基酸之間受到裂解，如果在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE，就會(huì)分成第1～358的斷片(N端)和硫酸乙酰肝素鏈加成、巨大分子化的第359～580的斷片(C端)。
另一方面，大量在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GPC3基因，可知GPC3基因具有能夠作為肝細(xì)胞癌標(biāo)示而利用的可能性。并且，作為由測(cè)定GPC3診斷肝癌的方法，現(xiàn)在已知有專(zhuān)利文獻(xiàn)1～3和非專(zhuān)利文獻(xiàn)2。
在現(xiàn)有的GPC3測(cè)定藥中，在使用識(shí)別GPC3的C端部位的抗體的專(zhuān)利文獻(xiàn)1中，有肝癌的陽(yáng)性率為53％、正常人和慢性肝炎在檢出界限以下、肝硬化為5％的記載，在使用識(shí)別N端C端裂解附近部位的抗體的專(zhuān)利文獻(xiàn)2中，有肝癌的陽(yáng)性率為40％、正常人和慢性肝炎及肝硬化為0％的記載。另一方面，在使用識(shí)別N端部位的抗體的非專(zhuān)利文獻(xiàn)2中，記載了肝癌TAE后的陽(yáng)性率是73％、肝癌手術(shù)例是53％，因?yàn)榕c肝硬化有差別，所以可以有效地作為肝癌的診斷藥。但是，GPC3在肝癌發(fā)病前如何變化則是完全未知的。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1WO 03/10042專(zhuān)利文獻(xiàn)2WO 2004/018667專(zhuān)利文獻(xiàn)3WO 2004/038420非專(zhuān)利文獻(xiàn)1J.Cell.Biol.，163(3)625-35.2003非專(zhuān)利文獻(xiàn)2CANCER RESEARCH 64，1-6，April 1，2004發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種監(jiān)控肝炎重癥化的方法。
本發(fā)明人開(kāi)發(fā)不識(shí)別C端部位和N端C端裂解附近部位、而是識(shí)別N端部位的新抗體，測(cè)定肝癌發(fā)病前階段的肝炎和肝硬化患者血清中的GPC3濃度。測(cè)定該測(cè)定體系的肝臟疾病患者血清中的GPC3濃度，結(jié)果，截?cái)嘀?cutoff value)為0.4的陽(yáng)性率在正常人中是1.5％，但在慢性肝炎患者中顯示36％、在肝硬化患者顯示51.4％的高值。另一方面，肝癌患者是51％的陽(yáng)性率。并且，對(duì)慢性肝炎患者和肝硬化患者的肝臟組織檢查免疫染色，結(jié)果，在增殖肝細(xì)胞中顯示陽(yáng)性。由此發(fā)現(xiàn)，新的本GPC3測(cè)定體系不是肝癌的診斷藥，而是從肝炎和肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變的預(yù)測(cè)藥，即，能夠有效地作為肝炎重癥化的監(jiān)控藥，本發(fā)明得以完成。
即，本發(fā)明提供一種含有抗GPC3抗體的肝炎重癥化監(jiān)控藥。
另外，本發(fā)明是提供一種以使用抗GPC3抗體測(cè)定被檢試樣中的GPC3為特征的肝炎重癥化的監(jiān)控方法。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，是一種監(jiān)控用現(xiàn)有單一的肝臟異常檢測(cè)藥難以預(yù)測(cè)的肝炎重癥化的簡(jiǎn)便方法，能夠盡早擬定新的治療計(jì)劃。


圖1是用于確認(rèn)GPC3抗體識(shí)別部位的免疫印跡(western blotting)圖。
圖2是由識(shí)別C端部位和N端部位的抗體得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明是通過(guò)使用抗GPC3抗體測(cè)定被檢試樣中的GPC3而監(jiān)控肝炎重癥化的方法。
所謂測(cè)定，包括定量或非定量的測(cè)定，例如，作為非定量的測(cè)定，可以列舉簡(jiǎn)單地測(cè)定GPC3是否存在、測(cè)定GPC3是否存在一定量以上、將GPC3的量與其它試樣(例如對(duì)照試樣等)比較的測(cè)定等；作為定量測(cè)定，可以列舉GPC3濃度的測(cè)定、GPC3量的測(cè)定等。
所謂被檢試樣，只要是可能含有GPC3的試樣，沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選從哺乳類(lèi)等生物體采集的試樣，更優(yōu)選從人采集的試樣。作為被檢試樣的具體例子，例如，可以列舉血液、組織間液、血漿、血管外液、腦脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿等，但優(yōu)選為血液、血清、血漿。更優(yōu)選從肝炎特別是從慢性肝炎或肝硬化患者采集的血液、血清、血漿。另外，從生物體采集的細(xì)胞培養(yǎng)液等從被檢試樣得到的試樣也包括在本發(fā)明的被檢試樣中。
作為可以在本發(fā)明中使用的抗GPC3抗體，可以是單克隆抗體、多克隆抗體的任意1種。另外，作為抗GPC3抗體，從將血液、血清、血漿作為被檢試樣的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選針對(duì)分泌型GPC3的抗體、即抗可溶性GPC3抗體。作為多克隆抗體，優(yōu)選使用抗血清的多克隆抗體。更優(yōu)選的是，特別優(yōu)選使用識(shí)別N端部位的抗可溶性GPC3單克隆抗體。以下，對(duì)使用抗GPC3單克隆抗體的情況進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
1.抗GPC3單克隆抗體的制作在本發(fā)明中使用的抗GPC3單克隆抗體，只要特異地與GPC3蛋白質(zhì)結(jié)合即可，不管其來(lái)源和形狀。具體而言，可以使用鳥(niǎo)類(lèi)抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、人類(lèi)抗體、嵌合(chimera)抗體、人源化抗體等公知的單克隆抗體。
另外，固定在支持體上的抗GPC3單克隆抗體和由標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的抗GPC3單克隆抗體，優(yōu)選識(shí)別GPC3分子的不同抗原決定基。識(shí)別部位沒(méi)有特別的限制，但優(yōu)選識(shí)別N端的抗體。
在本發(fā)明中使用的抗GPC3單克隆抗體，可以使用公知的方法制造。作為在本發(fā)明中使用的抗GPC3單克隆抗體，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的單克隆抗體。來(lái)自哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的單克隆抗體，包括在雜交瘤中產(chǎn)生的單克隆抗體，和通過(guò)基因工程方法以包含抗體基因的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生的單克隆抗體。
產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，基本上使用公知技術(shù)，可以如下制作。即，使用GPC3或可溶性GPC3及其肽片段(segment peptide)作為免疫原，按照通常的免疫方法將其進(jìn)行免疫，由通常的細(xì)胞融合法使得到的免疫細(xì)胞與公知的親代細(xì)胞融合，由通常的篩選法，通過(guò)對(duì)單克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行篩選而制作。
具體而言，可以如下制作單克隆抗體。
首先，作為抗體取得的免疫原使用的GPC3，可以通過(guò)培養(yǎng)HuH6、HepG2細(xì)胞株等，精制在其上清中所含的天然GPC3而得到。還可以通過(guò)發(fā)現(xiàn)在Lage，H.et al.，Gene 188(1997)，151-156中公開(kāi)的GPC3(MXR7)基因/氨基酸序列而得到。即，將編碼GPC3的基因序列插入公知的表達(dá)載體體系中，使適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，然后采用公知的方法從該宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清中精制目的重組GPC3蛋白質(zhì)。
然后，將該精制GPC3用作免疫原，但也可以使用GPC3的部分肽作為免疫原。此時(shí)，該部分肽可以由人GPC3的氨基酸序列通過(guò)化學(xué)合成而得到，也可以在表達(dá)載體中組合GPC基因的一部分而得到，還可以由蛋白質(zhì)分解酶分解天然的GPC3而得到。用作部分肽的GPC3的部分和大小沒(méi)有限制。在本發(fā)明中，作為免疫原，優(yōu)選使用天然的GPC3。
作為以免疫原免疫的哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)，沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選考慮與在細(xì)胞融合中使用的親代細(xì)胞的適合性來(lái)選擇，一般使用嚙齒類(lèi)動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠或兔、猴、雞等。
按照公知的方法，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫原的免疫。例如，作為一般的方法，通過(guò)在動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下注射免疫原進(jìn)行。具體而言，用PBS(Phosphate-Buffered Saline磷酸鹽緩沖液)和生理食鹽水等將免疫原稀釋、懸濁為適當(dāng)量，根據(jù)希望向其中適量混合通常的輔助劑，例如弗氏完全輔助劑(Freund’s complete adjuvant)，乳化后，對(duì)動(dòng)物每4～21日給藥數(shù)次。另外，在免疫原免疫時(shí)，可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。特別是使用分子量小的部分肽作為免疫原時(shí)，希望使之與白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)等載體蛋白質(zhì)結(jié)合，進(jìn)行免疫。
這樣，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，確認(rèn)血清中上升到所希望的抗體水平，然后從動(dòng)物采取免疫細(xì)胞，用于細(xì)胞融合，作為優(yōu)選的免疫細(xì)胞，可以特別列舉脾細(xì)胞。
作為與上述免疫細(xì)胞融合的其它親代細(xì)胞，使用動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞。該骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選使用公知的各種細(xì)胞株，例如，P3(P3×63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(CurrentTopics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.etal.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合，基本可以采用公知的方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等進(jìn)行。
進(jìn)一步具體而言，上述細(xì)胞融合，例如在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下在通常的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中實(shí)施。作為融合促進(jìn)劑，例如使用聚乙二醇(PEG)、仙臺(tái)病毒(HVJ)等，還可以根據(jù)希望，為了提高融合效率，添加二甲基亞砜等輔助劑。
免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的使用比例可以任意設(shè)定。例如，優(yōu)選使免疫細(xì)胞為骨髓瘤細(xì)胞1～10倍。作為在上述細(xì)胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如可以使用適合于上述骨髓瘤細(xì)胞株增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、還有用于該種細(xì)胞培養(yǎng)的通常的培養(yǎng)液，還可以并用胎牛血清(FCS)等的血清補(bǔ)液。
細(xì)胞融合，在上述培養(yǎng)液中充分混合規(guī)定量的上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，通常以30～60％(w/v)的濃度添加預(yù)先升溫至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000～6000左右)，混合而形成目的融合細(xì)胞(雜交瘤)。接著，逐漸添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行離心、除去上清的操作，除去在雜交瘤的生育中不理想的細(xì)胞融合劑等。
這樣操作得到的雜交瘤，通過(guò)在通常的選擇培養(yǎng)液，例如HAT培養(yǎng)液(包含次黃嘌呤、喋氨呤和胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)而進(jìn)行選擇。上述HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，為了殺死目的雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)，持續(xù)充分的時(shí)間(通常是數(shù)日～數(shù)周時(shí)間)。接著，實(shí)施通常的有限稀釋法，進(jìn)行產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
目的抗體的篩選和單克隆，可以采用基于公知的抗原抗體反應(yīng)的篩選方法進(jìn)行。例如，使抗原與聚苯乙烯等制成的中空珠和市售的96孔微量滴定板等載體結(jié)合，使之與雜交瘤的培養(yǎng)上清反應(yīng)，洗凈載體，然后使酶標(biāo)記第2次抗體等反應(yīng)，可以決定在培養(yǎng)上清中是否含有以與免疫原反應(yīng)為目的的抗體。通過(guò)有限稀釋法等，能夠克隆產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤。此時(shí)，作為抗原，可以使用在免疫中使用的抗原。
另外，除了在人以外的動(dòng)物中使抗原免疫得到上述雜交瘤以外，使人淋巴球在生物體外(in vitro)與GPC3致敏(sensitizing)，使致敏淋巴球與來(lái)自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤細(xì)胞融合，也可以得到具有與GPC3的結(jié)合活性的所希望的人抗體(參照日本特公平1-59878號(hào)公報(bào))。此外，也可以向具有人抗體基因的全部庫(kù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中給予作為抗原的GPC3，取得抗GPC3單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞，從使其永生化的細(xì)胞取得針對(duì)GPC3的人抗體(參照WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602)。
產(chǎn)生如此制作的單克隆抗體的雜交瘤，可以在通常的培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)，并且可以在液氮中長(zhǎng)期保存。
為了從該雜交瘤取得單克隆抗體中，采用按照通常的方法培養(yǎng)該雜交瘤，作為其培養(yǎng)上清得到的方法；或者將雜交瘤給予與其具有適合性的哺乳動(dòng)物，使其增殖，作為其腹水而得到的方法等。前者方法適合于得到高純度的抗體，而后者方法適合于抗體的大量生產(chǎn)。
在本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用從雜交瘤篩選抗體基因，組合入適當(dāng)?shù)妮d體，將其導(dǎo)入宿主，采用基因重組技術(shù)使之產(chǎn)生的重組型抗體(例如，參照Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。具體而言，從產(chǎn)生抗GPC3單克隆抗體的雜交瘤，離析編碼抗GPC3單克隆抗體的可變(V)區(qū)的mRNA。mRNA的離析，使用公知的方法，例如通過(guò)胍超離心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等進(jìn)行，調(diào)制全RNA，使用mRNA PurificationKit(Pharmacia生產(chǎn))等，調(diào)制目的mRNA。另外，通過(guò)使用QuickPrepmRNA Purification Kit(Pharmacia生產(chǎn))，也可以直接調(diào)制mRNA。
使用逆轉(zhuǎn)錄酶從得到的mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。cDNA的合成，使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(Biochemical Industry Inc.生產(chǎn))等進(jìn)行。另外，為了進(jìn)行cDNA的合成和擴(kuò)增，可以采用使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech生產(chǎn))和PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)等。
從得到的PCR產(chǎn)物精制目的DNA片斷，與載體DNA連接。再由此制作重組載體，導(dǎo)入大腸菌等中，選擇群體(colony)，調(diào)制希望的重組載體。然后，采用公知的方法，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法等確認(rèn)目的DNA的堿基序列。
得到編碼目的抗GPC3單克隆抗體的V區(qū)的DNA后，將其與含有編碼所希望的抗體正常區(qū)(C區(qū))的DNA的表達(dá)載體組合。
為了制造在本發(fā)明中使用的抗GPC3單克隆抗體，在表達(dá)控制區(qū)，例如在增強(qiáng)劑、促進(jìn)劑的控制下進(jìn)行表達(dá)的表達(dá)載體中組合抗體基因。接著，通過(guò)該表達(dá)載體，使宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，使抗體進(jìn)行表達(dá)。
抗體基因的表達(dá)，可以分別將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA組合入表達(dá)載體，使宿主細(xì)胞同時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)化，或者也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA組合入單一表達(dá)載體中，使宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化(參照WO94/11523)。
另外，為了產(chǎn)生重組型抗體，不僅可以使用上述宿主細(xì)胞，還可以使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，在編碼乳汁中固有地產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(山羊β酪蛋白等)的基因的中途，插入抗體基因，作為融合基因進(jìn)行調(diào)制。向山羊的胚胎中注入含有插入抗體基因的融合基因的DNA片段，將該胚胎導(dǎo)入雌山羊。從接受胚胎的山羊產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因山羊或其子孫產(chǎn)生的乳汁中得到所希望的抗體。另外，為了使含有從轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的所希望抗體的乳汁量增加，也可以在轉(zhuǎn)基因山羊中使用適當(dāng)?shù)募に?Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
在本發(fā)明中，除了上述抗體以外，可以使用人為改變的基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化(Humanized)抗體。這些改變抗體，可以使用已知的方法制造。
嵌合抗體，可以通過(guò)使如上述操作得到的編碼抗體V區(qū)的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA連接，將其組合入表達(dá)載體，導(dǎo)入宿主產(chǎn)生而得到。使用該已知的方法，能夠得到本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
人源化抗體也稱為重構(gòu)(reshaped)人抗體，是向人抗體互補(bǔ)性決定區(qū)移植人以外的哺乳動(dòng)物例如小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR，complementarity determining region)的抗體，也已知其一般的基因重組方法(參照EP 125023、WO96/02576)。
具體而言，以連接小鼠抗體的CDR和人抗體的構(gòu)架區(qū)(frameworkregion，F(xiàn)R)的方式設(shè)計(jì)的DNA序列，使用以在CDR和FR兩個(gè)的末端區(qū)具有重疊部分的方式制作的幾個(gè)低聚核苷酸作為引物，采用PCR法而合成(參照WO98/13388中記載的方法)。
通過(guò)CDR連接的人抗體的構(gòu)架區(qū)，選擇互補(bǔ)性決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合部位的區(qū)。根據(jù)需要，可以置換抗體可變區(qū)中的構(gòu)架區(qū)的氨基酸，使得重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗體和人源化抗體的C區(qū)中，使用人抗體的區(qū)，例如，在H鏈中，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，在L鏈中，可以使用Cκ、Cλ。另外，為了改善抗體或其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，也可以修飾人抗體C區(qū)。
嵌合抗體由來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物抗體的可變區(qū)和來(lái)自人抗體的確定區(qū)組成。另一方面，人源化抗體由來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)和來(lái)自人抗體的構(gòu)架區(qū)及C區(qū)組成。
在本發(fā)明中使用的抗體，不限于抗體的全部分子，只要與GPC3結(jié)合，可以是抗體的片段或其修飾物，包括二價(jià)抗體也包含一價(jià)抗體。例如，作為抗體的片段，可以列舉Fab、F(ab′)2、Fv、具有1個(gè)Fab和完全Fc的Fab/c、或用適當(dāng)?shù)倪B接物(inker)使H鏈或L鏈的Fv連接的單鏈Fv(scFv)。具體而言，用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理抗體，生成抗體片段，或者構(gòu)筑編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入表達(dá)載體，然后以適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá)(例如，參照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods inEnzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.、Plueckthun，A.&Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
ScFv通過(guò)連接抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)而得到。在該scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)通過(guò)連接物優(yōu)選通過(guò)肽連接物連接(Huston，J.S.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，可以來(lái)自本說(shuō)明書(shū)中的任意抗體。作為連接V區(qū)的肽連接物，例如可以使用由氨基酸12～19殘基組成的任意單鏈肽。
編碼scFv的DNA通過(guò)下述方法得到在編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA、和編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA中，構(gòu)成編碼這些序列全部或所希望的氨基酸序列編碼的DNA部分，使用規(guī)定其兩端的引物，采用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，接著組合以編碼肽連接物部分的DNA、和其兩端分別與H鏈、L鏈連接的方式規(guī)定的引物對(duì)，進(jìn)行增幅。
另外，一旦制作編碼scFv的DNA，就能夠采用通常方法得到含有這些的表達(dá)載體和由該表達(dá)載體發(fā)生轉(zhuǎn)化的宿主，另外，通過(guò)使用該宿主，能夠采用通常方法得到scFv。
這些抗體的片段，可以和上述同樣操作，取得其基因使其表達(dá)，由宿主產(chǎn)生。本發(fā)明中的“抗體”也包括這些抗體的片段。
作為抗體的修飾物，也可以使用與標(biāo)記物質(zhì)等各種分子結(jié)合的抗GPC3抗體。本發(fā)明中的“抗體”中也包括這些抗體修飾物。這樣的抗體修飾物，可以由對(duì)得到的抗體實(shí)施化學(xué)修飾而得到。另外，抗體的修飾方法在該領(lǐng)域中已經(jīng)確立。
此外，本發(fā)明中使用的抗體還可以是雙特異性抗體(bispecificantibody)。雙特異性抗體可以是具有識(shí)別GPC3分子上的不同抗原決定基的抗原結(jié)合部位的雙特異性抗體，也可以一個(gè)抗原結(jié)合部位識(shí)別GPC3、另一個(gè)抗原結(jié)合部位識(shí)別標(biāo)記物質(zhì)等。雙特異性抗體，可以使2種抗體的HL對(duì)結(jié)合而制作，也可以使產(chǎn)生不同單克隆抗體的雜交瘤融合制作雙特異性抗體產(chǎn)生融合細(xì)胞而得到。還可以采用基因工程的方法制作雙特異性抗體。
如上構(gòu)筑的抗體基因，可以由公知的方法表達(dá)而取得。在為哺乳類(lèi)細(xì)胞的情況下，可以使常用的有用促進(jìn)劑、進(jìn)行表達(dá)的抗體基因、在其3’側(cè)下游使聚A信號(hào)功能性結(jié)合而表達(dá)。例如，作為促進(jìn)劑/強(qiáng)化劑，可以列舉人巨細(xì)胞病毒前期促進(jìn)劑/強(qiáng)化劑(humancytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
另外，作為其它在本發(fā)明中使用的抗體表達(dá)中能夠使用的促進(jìn)劑/強(qiáng)化劑，可以列舉逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等病毒促進(jìn)劑/強(qiáng)化劑、或人延長(zhǎng)因子1a(HEF1a，human elongationfactor 1a)等來(lái)自哺乳類(lèi)細(xì)胞的促進(jìn)劑/強(qiáng)化劑等。
在使用SV40促進(jìn)劑/強(qiáng)化劑的情況下采用Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)，或在使用HEF1a促進(jìn)劑/強(qiáng)化劑的情況下采用Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)，能夠容易地表達(dá)基因。
在為大腸菌的情況下，使常用的有用促進(jìn)劑、用于抗體分泌的信號(hào)序列和發(fā)達(dá)的抗體基因功能地結(jié)合，能夠表達(dá)該基因。作為促進(jìn)劑，例如可以列舉lacz促進(jìn)劑、araB促進(jìn)劑。在使用lacz促進(jìn)劑的情況下，可以采用Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)進(jìn)行表達(dá)，或者在使用araB促進(jìn)劑的情況下，可以采用Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)進(jìn)行表達(dá)。
作為用于抗體分泌的信號(hào)序列，在產(chǎn)生于大腸菌的周質(zhì)的情況下，可以使用pelB信號(hào)序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)。接著，分離產(chǎn)生于周質(zhì)的抗體，然后適當(dāng)重新組成(refold)抗體的結(jié)構(gòu)使用。
作為復(fù)制起點(diǎn)，可以使用來(lái)自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的物質(zhì)，并且，為了宿主細(xì)胞系中基因復(fù)制數(shù)的增幅，表達(dá)載體可以包含氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大腸菌黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)記。
為了制造在本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的表達(dá)體系，例如真核細(xì)胞或原核細(xì)胞體系。作為真核細(xì)胞，例如可以列舉已確定的哺乳類(lèi)細(xì)胞體系、昆蟲(chóng)細(xì)胞體系、真絲狀菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞等；作為原核細(xì)胞，例如可以列舉大腸菌細(xì)胞等細(xì)菌細(xì)胞。
在本發(fā)明中使用的抗體，優(yōu)選在哺乳類(lèi)細(xì)胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、HeLa細(xì)胞中表達(dá)。
然后，在生物體外或活的有機(jī)體內(nèi)(in vivo)培養(yǎng)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生目的抗體。宿主細(xì)胞的培養(yǎng)按照公知的方法進(jìn)行。例如，作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等的血清補(bǔ)液。
如上所述表達(dá)、產(chǎn)生的抗體，可以從細(xì)胞、宿主動(dòng)物分離，精制到均勻。在本發(fā)明中使用的抗體的分離、精制，可以使用親和色譜柱進(jìn)行。例如，作為使用蛋白質(zhì)A柱的柱，可以列舉HyperD、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia生產(chǎn))等。此外，可以使用在通常的蛋白質(zhì)中使用的分離、精制方法，沒(méi)有任何限制。例如，通過(guò)適當(dāng)選擇、組合上述親和色譜柱以外的色譜柱、過(guò)濾器、超濾、鹽析、透析等，能夠分離、精制抗體(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，DavidLane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
在本發(fā)明中使用的抗體的抗原決定基，只要能夠識(shí)別全長(zhǎng)GPC3或其肽片段即可，但優(yōu)選為希望識(shí)別GPC3的N端部位的抗體。
2.GPC3的測(cè)定在本發(fā)明中測(cè)定的GPC3，可以是附加有硫酸乙酰肝素等的GPC3蛋白質(zhì)，也可以是GPC3核蛋白質(zhì)。
被檢試樣中所含GPC3的測(cè)定，通過(guò)使用抗GPC3抗體的免疫學(xué)方法測(cè)定。作為免疫學(xué)的方法，例如可以列舉放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、發(fā)光免疫分析、免疫沉降法、免疫比濁法、免疫印跡法、免疫染色法、免疫擴(kuò)散法等，優(yōu)選酶免疫分析，特別優(yōu)選酶結(jié)合免疫吸附定量法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(例如sandwich ELISA)。ELISA等上述免疫學(xué)方法可以采用從業(yè)人員公知的方法進(jìn)行。
作為使用抗GPC3抗體的一般的測(cè)定方法，例如可以列舉將抗GPC3抗體固定在支持體上，向其中加入被檢試樣，進(jìn)行孵育，使抗GPC3抗體與GPC3蛋白質(zhì)結(jié)合，然后洗凈，測(cè)定通過(guò)抗GPC3抗體與支持體結(jié)合的GPC3蛋白質(zhì)，進(jìn)行被檢試樣中的GPC3蛋白質(zhì)的測(cè)定的方法。
作為在本發(fā)明中使用的支持體，例如可以列舉瓊脂糖、纖維素等的不溶性多糖類(lèi)，硅樹(shù)脂、聚苯乙烯樹(shù)脂、聚丙烯酰胺樹(shù)脂、尼龍樹(shù)脂、聚碳酸酯樹(shù)脂等合成樹(shù)脂，和玻璃等的不溶性支持體。這些支持體能夠以中空珠和板等形狀使用。為中空珠的情況下，可以使用填充有這些的柱等。為板的情況下，可以使用多孔板(96孔多孔板等)或生物傳感器芯片等。抗GPC3抗體與支持體的結(jié)合，可以采用化學(xué)結(jié)合或物理吸附等通常使用的方法結(jié)合。這些支持體可以均使用市售的支持體。
抗GPC3抗體與GPC3蛋白質(zhì)的結(jié)合，通常在緩沖液中進(jìn)行。作為緩沖液，例如可以使用磷酸緩沖液、Tris緩沖液、檸檬酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液等。另外，作為孵育的條件，在經(jīng)常使用的條件下進(jìn)行，例如4℃～室溫下進(jìn)行1小時(shí)～24小時(shí)的孵育。孵育后的洗凈，只要不妨礙GPC3蛋白質(zhì)與抗GPC3抗體的結(jié)合，任意即可，例如，使用含有Tween20等表面活性劑的緩沖液等。
在本發(fā)明的GPC3蛋白質(zhì)測(cè)定方法中，除了欲測(cè)定GPC3蛋白質(zhì)的被檢試樣以外，還可以設(shè)置對(duì)照試樣。作為對(duì)照試樣，有不含GPC3蛋白質(zhì)的陰性對(duì)照試樣和含有GPC3蛋白質(zhì)的陽(yáng)性對(duì)照試樣等。此時(shí)，比較由不含GPC3蛋白質(zhì)的陰性對(duì)照試樣得到的結(jié)果和由含有GPC3蛋白質(zhì)的陽(yáng)性對(duì)照試樣得到的結(jié)果，能夠測(cè)定被檢試樣中的GPC3蛋白質(zhì)。另外，調(diào)制使?jié)舛入A段地變化的一系列對(duì)照試樣，得到作為數(shù)值的相對(duì)各對(duì)照試樣的測(cè)定結(jié)果，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，從被檢試樣的數(shù)值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線也能夠定量地測(cè)定被檢試樣中所含的GPC3蛋白質(zhì)。
作為通過(guò)抗GPC3抗體與支持體結(jié)合的GPC3蛋白質(zhì)測(cè)定的優(yōu)選方式，可以列舉使用由標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的抗GPC3抗體的方法。
例如，使被檢試樣于固定在支持體上的抗GPC3抗體接觸，洗凈后，使用特異地識(shí)別GPC3蛋白質(zhì)的標(biāo)記抗體進(jìn)行測(cè)定。
抗GPC3抗體的標(biāo)記可以采用通常已知的方法進(jìn)行。作為標(biāo)記物質(zhì)，可以使用熒光色素、酶、輔酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)等從業(yè)人員公知的標(biāo)記物質(zhì)。作為具體的例子，可以列舉放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等)、熒光素、羅丹明、丹磺酰氯、傘形酮、熒光素酶、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶(β-gulcosidase)、山葵過(guò)氧化物酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖質(zhì)氧化酶、微過(guò)氧化物酶、生物素(biotin)等。在使用生物素作為標(biāo)記物質(zhì)的情況下，優(yōu)選在添加生物素標(biāo)記抗體后，再添加與堿性磷酸酶等酶結(jié)合的抗生物素蛋白(avidin)。標(biāo)記物質(zhì)與抗GPC3抗體的結(jié)合，可以使用戊二醛法、馬來(lái)酸酐縮亞胺法(malleimide method)、吡啶基二硫化物法、過(guò)碘酸法等公知的方法。
具體而言，在板等支持體上添加含有抗GPC3抗體的溶液，將抗GPC3抗體固定在支持體上。將板洗凈后，為了防止蛋白質(zhì)的非特異結(jié)合，例如，以BSA、明膠、白蛋白等進(jìn)行封閉。再次洗凈，向板上添加被檢試樣。孵育后，進(jìn)行洗凈，加入標(biāo)記抗GPC3抗體。在適當(dāng)?shù)姆跤螅瑢逑磧?，測(cè)定在板上殘留的標(biāo)記抗GPC3抗體。測(cè)定可以采用從業(yè)人員公知的方法進(jìn)行，例如，在由放射性物質(zhì)標(biāo)記的情況下，采用液體閃爍或RIA法進(jìn)行測(cè)定。在由酶標(biāo)記的情況下，加入基質(zhì)(substrate)，由吸光光度計(jì)測(cè)定基質(zhì)的酶的變化，例如發(fā)色。作為基質(zhì)的具體例子，可以列舉2，2-聯(lián)氮二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1，2-苯二胺(鄰苯二胺)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TME)等。
在熒光物質(zhì)的情況下，可以使用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
作為本發(fā)明的GPC3蛋白質(zhì)測(cè)定方法特別優(yōu)選的方式，可以列舉使用由生物素標(biāo)記的抗GPC3抗體和抗生物素蛋白的方法。
具體而言，在板等支持體上添加含有抗GPC3抗體的溶液，固定抗GPC3抗體。將板洗凈后，為了防止蛋白質(zhì)的非特異結(jié)合，例如由BSA等進(jìn)行封閉。再次洗凈，在板上添加被檢試樣。孵育后，進(jìn)行洗凈，添加生物素標(biāo)記抗GPC3抗體。適度的孵育后，將板洗凈，添加與堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶等酶結(jié)合的抗生物素蛋白。孵育后，將板洗凈，添加對(duì)應(yīng)于與抗生物素蛋白結(jié)合的酶對(duì)應(yīng)的基質(zhì)，將基質(zhì)的酶的變化等作為指標(biāo)，測(cè)定GPC3蛋白質(zhì)。
作為本發(fā)明的GPC3蛋白質(zhì)測(cè)定方法的其它方式，可以列舉使用一種以上特異地識(shí)別GPC3蛋白質(zhì)的一次抗體和一種以上特異地識(shí)別該一次抗體的二次抗體的方法。
例如，使被檢試樣與固定在支持體上的一種以上的抗GPC3抗體接觸，孵育后，進(jìn)行洗凈，由一次抗GPC3抗體和特異地識(shí)別該一次抗體的一種以上的二次抗體測(cè)定洗凈后結(jié)合的GPC3蛋白質(zhì)。此時(shí)，優(yōu)選二次抗體由標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。
作為本發(fā)明的GPC3蛋白質(zhì)測(cè)定方法的其它方式，可以列舉利用凝集反應(yīng)的測(cè)定方法。在該方法中，可以使用將抗GPC3抗體敏化后的載體，測(cè)定GPC3。作為敏化抗體的載體，只要是不溶性、不引起非特異反應(yīng)、并且穩(wěn)定，可以使用任意的載體。例如，可以使用乳膠顆粒、膨潤(rùn)土、火棉膠、高嶺土、固定羊紅血球等，優(yōu)選使用乳膠顆粒。作為乳膠顆粒，例如可以使用聚苯乙烯乳膠顆粒、苯乙烯-丁二烯共聚物乳膠顆粒、聚乙烯基甲苯乳膠顆粒等，優(yōu)選使用聚苯乙烯乳膠顆粒。將敏化后的顆粒與試樣混合，攪拌一定時(shí)間。在試樣中抗GPC3抗體的含有濃度越高，顆粒的凝集度越大，所以用肉眼觀察凝集，就能夠測(cè)定GPC3。另外，用分光光度計(jì)等測(cè)定由凝集產(chǎn)生的濁度，也能夠測(cè)定GPC3。
作為本發(fā)明的GPC3蛋白質(zhì)測(cè)定方法的其它方式，例如可以列舉使用利用表面等離子共振(plasmon resonance)現(xiàn)象的生物傳感器的方法。利用表面等離子共振現(xiàn)象的生物傳感器，使用微量蛋白質(zhì)、并且不標(biāo)記蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，能夠?qū)崟r(shí)觀察表面等離子共振信號(hào)。例如，通過(guò)使用BIAcore(Pharmacia生產(chǎn))等的生物傳感器，能夠測(cè)定GPC3蛋白質(zhì)與抗GPC3抗體的結(jié)合。具體而言，使被檢試樣與使抗GPC3抗體固定化后的傳感器芯片接觸，能夠?qū)⑴c抗GPC3抗體結(jié)合的GPC3蛋白質(zhì)作為共鳴信號(hào)的變化進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明的測(cè)定方法，可以使用各種自動(dòng)檢查裝置而自動(dòng)化，還能夠一次對(duì)大量試樣進(jìn)行檢查。
本發(fā)明的目的在于提供一種肝炎重癥化的監(jiān)控藥，例如從肝炎和肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變的預(yù)測(cè)判斷藥，該監(jiān)控藥至少含有抗GPC3抗體。在該監(jiān)控藥基于ELISA法時(shí)，可以含有使抗體固相化的載體，也可以預(yù)先使抗體結(jié)合在載體中。在該監(jiān)控藥基于使用乳膠等載體的凝集法時(shí)，可以含有吸附有抗體的載體。另外，該監(jiān)控藥也可以適當(dāng)制成含有封閉溶液、反應(yīng)溶液、反應(yīng)停止液、用于處理試樣的試劑等的試劑盒。
為了預(yù)測(cè)從肝炎和肝硬化向肝癌的轉(zhuǎn)變，可以測(cè)定這些患者血清中的GPC濃度。血清中GPC3濃度越高，向肝癌轉(zhuǎn)變的幾率越高。例如，可以預(yù)測(cè)，在慢性肝炎和肝硬化患者血清中GPC3濃度是0.4ng/mL以上的情況下，向肝癌轉(zhuǎn)變的可能性高；在小于0.4ng/mL的情況下，向肝癌發(fā)轉(zhuǎn)變展的可能性低。
實(shí)施例下面，利用實(shí)施例具體地說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
在本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)所述的實(shí)施例中，使用以下材料。
作為天然的GPC3的產(chǎn)生細(xì)胞，從理研細(xì)胞庫(kù)(Riken Cell Bank)購(gòu)入來(lái)自肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HuH-6，以10％FBS/Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)(SIGMA CAT#D6429)/青霉素、鏈霉素(penicillin·streptomycin)(GIBCO BRL CAT#15140-122)進(jìn)行培養(yǎng)。
雜交瘤以10％FBS/RPMI1640/(SIGMA CAT#R-8578)/慶大霉素(gentacin)(Scheling-plough)進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例1天然型GPC3的取得使用直徑150mm的皿，進(jìn)行HuH6細(xì)胞的大量培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清進(jìn)行精制。在DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham CAT#17-0709-01)中填充培養(yǎng)上清，洗凈后，用含有500mM NaCl的緩沖液洗提。接著，用Centriprep-10(Millipore CAT#4304)濃縮后，通過(guò)Superdex 200HR 10/30(Amersham CAT#17-1088-01)的凝膠過(guò)濾進(jìn)行精制，得到粗精制GPC3。
為了取得高純度的GPC3，使用將粗精制GPC3作為抗原制作的單克隆抗體，制成親和色譜柱，向其中填充HuH-6粗精制GPC3，然后用pH3.5、0.1M的甘氨酸鹽酸洗凈后，在4M的MgCl2·6H2O中洗提，然后，對(duì)50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl進(jìn)行透析。
實(shí)施例2重組GPC3的取得使用含有完全長(zhǎng)的人GPC3 cDNA的質(zhì)粒DNA，構(gòu)筑附加flag可溶型GPC3，即構(gòu)筑表達(dá)重組GPC3cDNA的質(zhì)粒DNA。使用以除去C末端側(cè)的疏水區(qū)(564-580氨基酸)的方式設(shè)計(jì)的下游引物(5’-ATAGAA TTC CAC CAT GGC CGG GAC CGT GCG C-3’(序列編號(hào)1))和加入EcoRI識(shí)別序列、Kozak序列的上游引物(5’-ATA GGA TCC CTTCAG CGG GGA ATG AAC GTT C-3’(序列編號(hào)2))，進(jìn)行PCR。在pCXND2-Flag中克隆得到的PCR片段(1711bp)。將制作的表達(dá)質(zhì)粒DNA導(dǎo)入CHO細(xì)胞DXB11株，通過(guò)以500μg/mL Geneticin的選拔，得到可溶型GPC3高表達(dá)CHO株。
使用1700cm2的轉(zhuǎn)瓶，進(jìn)行附加flag可溶型GPC3高表現(xiàn)CHO株的大量培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清，進(jìn)行精制。在DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham CAT#17-0709-01)中填充培養(yǎng)上清，洗凈后，由含有500mM NaCl的緩沖液洗提。接著，使用Anti-Flag M2 agarose affinity gel(SIGMA CAT#A-2220)進(jìn)行親和精制。由200μg/mL的FLAG肽進(jìn)行洗提。以Centriprep-10(Millipore CAT#4304)濃縮后，進(jìn)行Superdex200HR10/30(Amersham CAT#17-1088-01)的凝膠過(guò)濾，除去FLAG肽。最后，使用DEAE Sepharose Fast Flow柱進(jìn)行濃縮，同時(shí)通過(guò)用不含Tween20的PBS(含有500mM NaCl)進(jìn)行洗提，進(jìn)行緩沖液置換。
實(shí)施例3抗GPC3單克隆抗體的制作對(duì)5只Balb/C小鼠(CRL)進(jìn)行重組GPC3或天然型GPC3的免疫。在重組GPC3的情況下，在初次免疫時(shí)，調(diào)制使得免疫蛋白質(zhì)為100μg/只；在天然型GPC3的情況下，調(diào)制使得為10μg/只。使用FCA(弗氏完全輔助藥(H37Ra)、Difco(3113-60)、Becton Dickison(cat#231131))，將乳化后的藥劑皮下給藥。作為追加免疫，在2周后，在重組GPC3的情況下，調(diào)制使得為50μg/只；在天然型GPC3的情況下，調(diào)制使得為5μg/只。用FIA(弗氏不完全輔助藥、Difco(0639-60)、Becton Dickison(cat#263910))將如上調(diào)制的藥劑乳化，然后將乳化后的藥劑皮下給藥。以后，以1周時(shí)間間隔合計(jì)進(jìn)行5次追加免疫。對(duì)最終免疫，向尾靜脈給藥與追加免疫相同的量。通過(guò)使用涂布有GPC3核蛋白質(zhì)的免疫板(immunoplate)的ELISA，確認(rèn)血清中的抗體效價(jià)相對(duì)于GPC3飽和，然后混合小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3U1和小鼠脾臟細(xì)胞，由PEG1500(Roche Diagnostics，cat#783 641)進(jìn)行細(xì)胞融合。在96孔培養(yǎng)板上播種，從翌日起，用ELISA篩選在HAT培養(yǎng)基中選擇后的培養(yǎng)上清。對(duì)于陽(yáng)性克隆，由有限稀釋法單克隆化后，回收擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)上清。由ELISA的篩選，以與GPC3核蛋白質(zhì)的結(jié)合活性為指標(biāo)進(jìn)行，得到具有強(qiáng)烈結(jié)合能力的抗GPC3單克隆抗體。
抗體的精制使用Hi Trap ProteinG HP(Amersham CAT#17-0404-01)進(jìn)行。在直接柱中填充雜交瘤培養(yǎng)上清，用結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉(pH7.0))洗凈后，用洗提緩沖液(0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7))進(jìn)行洗提。洗提在加入有中和緩沖液(1M Tris-HCl(pH9.0))的管中進(jìn)行，立即進(jìn)行中和。集中抗體斷片，然后用0.05％Tween20/PBS透析一晝夜，置換緩沖液。添加NaN3，使得精制后的抗體為0.02％，然后在4℃下保存。
實(shí)施例4抗GPC3單克隆抗體的同型特異體(Isotyping)定量抗體濃度，進(jìn)行使用山羊抗小鼠IgG(gamma)(ZYMEDCAT#62-6600)和堿性磷酸酶山羊抗小鼠IgG(gamma)(ZYMEDCAT#62-6622)的小鼠IgG夾心ELISA，以市售的精制小鼠IgG1抗體(ZYMED CAT#02-6100)作為標(biāo)準(zhǔn)。
抗可溶性GPC3單克隆抗體的同型特異體，使用ImmunoPureMonoclonal Antibody Isotyping Kit II(PIERCE CAT#37502)，方法按照附上的指南。同型特異體的結(jié)果，全部為IgG1型。
實(shí)施例5抗GPC3單克隆抗體的識(shí)別部位的確認(rèn)免疫印跡大致為，以DMEM+10％FBS培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HuH-6 5天，應(yīng)用5μl/lane的該培養(yǎng)上清，在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。接著，向Hybond P膜(Amersham BioscienceCorporation生產(chǎn))轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，封閉轉(zhuǎn)移膜后，使各抗體反應(yīng)。接著，使HRP標(biāo)記抗小鼠抗體反應(yīng)，對(duì)于添加ECL檢測(cè)試劑(AmershamBioscience Corporation生產(chǎn))后得到的化學(xué)發(fā)光，使X射線薄膜感光而進(jìn)行檢測(cè)。由圖1所示的免疫印記結(jié)果，可以判斷PPMX018是識(shí)別N末端的抗體，PPMX001是識(shí)別C末端的抗體。另外，以同樣方法進(jìn)行研究，結(jié)果，作為識(shí)別N端部位的抗體，可以列舉PPMX013、M18D04(FERM BP-10325)。
這里，產(chǎn)生M18D04的雜交瘤，保藏在日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566)，獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專(zhuān)利生物保藏中心。
實(shí)施例6抗GPC3多克隆抗體的制作使用重組GPC3或天然型GPC3，進(jìn)行豚鼠多克隆抗體的制作。在制作中使用公知的方法。皮下給予使用助劑將GPC3乳化后的藥劑，進(jìn)行免疫。將此反復(fù)幾次，確認(rèn)抗體效價(jià)上升后，進(jìn)行采血，得到血清，然后由硫酸銨沉淀得到多克隆抗體。
實(shí)施例7夾心ELISA體系抗體的構(gòu)筑為了測(cè)定血中的可溶性GPC3，多數(shù)構(gòu)筑GPC3的夾心ELISA體系，選擇靈敏度和特異性優(yōu)異的測(cè)定體系。另外，為了在發(fā)色中達(dá)到高測(cè)定靈敏度，使用Scytek公司的TMB。
在96孔免疫板上涂布用PBS(-)稀釋為10μg/mL的抗GPC3單克隆抗體或多克隆抗體的稀釋物，在4℃下孵育一晚。次日，用300μL/孔的PBS洗凈3次后，加入150μL的ABI公司生產(chǎn)的免疫測(cè)定穩(wěn)定劑(ABI#10-601-001)，進(jìn)行封閉。在室溫下放置數(shù)小時(shí)后或在4℃下保存一晚后，加入用含有動(dòng)物血清等的稀釋緩沖液(50mM Tris-Cl pH8.0，0.15M NaCl)將精制蛋白質(zhì)、人血清等適當(dāng)稀釋的稀釋物，在室溫孵育2小時(shí)。接著，加入用含有動(dòng)物血清等的PBS(-)稀釋為20μg/mL的生物素標(biāo)記的識(shí)別C端部位或N端部位的抗體，在室溫下孵育2小時(shí)。棄去反應(yīng)液，然后，加入用含有適當(dāng)量動(dòng)物血清的Cygnus公司生產(chǎn)的Stab-ELISA-r(Cygnus#I-030)將Vector公司生產(chǎn)的鏈霉親和素(streptavidin)-HRPO(Vector#SA-5004)稀釋為3μg/mL的稀釋物，在室溫下孵育0.5小時(shí)。用300μL/孔的洗凈緩沖液洗凈5次后，按照Scytek公司附加的協(xié)議，使用TMB(Cat#TM4999)使之發(fā)色，用微量閱板器(microplate reader)測(cè)定吸光度。
抗體的生物素化使用Pierce公司生產(chǎn)的Sulfo-NHS-LC-Biotin(CAT#21335)。另外，樣品中的GPC3濃度的換算使用表計(jì)算軟件GlaphPadPRISM(GlaphPad software Inc.ver.3.0)進(jìn)行解析。圖2是由識(shí)別C端部位的抗體PPMX001和PPMX013以及識(shí)別N端部位的PPMX018和PPMX013制作的使用ELISA測(cè)定體系的使用重組GPC3的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在識(shí)別C端部位的測(cè)定體系，能夠得到高于識(shí)別N端部位測(cè)定體系的吸光度。另外，可以預(yù)測(cè)在前者測(cè)定體系中識(shí)別全長(zhǎng)GPC3和C端肽，在后者測(cè)定系中識(shí)別全長(zhǎng)GPC3和N端肽。
實(shí)施例8使用識(shí)別C端部位和N端部位的抗體的測(cè)定體系的HuH6培養(yǎng)液和肝硬化患者血清中GPC3的測(cè)定使用用于制作上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的2個(gè)ELISA測(cè)定體系，測(cè)定由HuH-6的培養(yǎng)上清精制的GPC3和20例肝癌患者血清中的GPC3濃度。結(jié)果得到從標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果不能預(yù)測(cè)的結(jié)果(表1)。即，在使用GPC3的識(shí)別部位不同的測(cè)定體系的情況下，在重組GPC3、來(lái)自HuH6天然型GPC3和患者血清GPC3中，測(cè)定值有很大差異。在識(shí)別C端部位的測(cè)定體系中，作為重組GPC3和患者血清GPC3之間產(chǎn)生很大差異的原因，推測(cè)為由于在GPC3的C端部位中附加的硫酸乙酰肝素含量的差異。
表1使用N端和C端抗體的ELISA體系的來(lái)自HuH-6和肝癌患者血清中的GPC3的測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例9使用識(shí)別N端部位的測(cè)定體系的正常人、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清中GPC3濃度的測(cè)定在識(shí)別N端部位的各種ELISA測(cè)定體系中，在使用靈敏度優(yōu)異的M18D04(FERM BP-10325)單克隆抗體和豚鼠多克隆抗體的測(cè)定體系中測(cè)定正常人、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中的GPC3濃度。結(jié)果，截?cái)嘀禐?.4在正常人中血清中GPC3的陽(yáng)性率是1.5％，慢性肝炎是36％，肝硬化是51.4％，肝癌患者是51％。接著，在因肝癌住院的3例肝癌患者中，測(cè)定在肝癌發(fā)作以前的8年定期地取樣的血清中GPC濃度，可見(jiàn)隨著肝疾病的發(fā)展，有GPC3在血中濃度上升的趨勢(shì)。由上顯示，本測(cè)定體系用于肝炎的重癥化的監(jiān)控比作為肝癌的診斷藥更為有效。
表2使用N端抗體的ELISA體系的肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者和正常人血清中的GPC3的測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例10正常人、慢性肝炎、肝硬化的組織的免疫染色使用由活組織檢查從慢性肝炎和肝硬化患者得到的病理組織標(biāo)本，進(jìn)行抗GPC3單克隆抗體的免疫染色。
各檢體，將固定石蠟包埋標(biāo)本切成為4μm的薄片，將該切片在貼附玻璃載片上，在37℃下放置16小時(shí)，使之充分干燥。在100％二甲苯中以5分鐘浸漬3次，進(jìn)行脫蠟，在100％乙醇(alcohol)浸漬3次，每次5分鐘，用70％乙醇(ethanol)浸漬5分鐘，進(jìn)行親水化。然后，用50mM TBS洗凈5分鐘、3次，然后在檸檬酸緩沖液(10mM，pH6.0)中進(jìn)行120℃、10分鐘的抗原活化。在抗原活化后，用TBS以5分鐘洗凈3次，然后與稀釋為1μg/mL的抗GPC3抗體在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。為了使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活，用0.3％過(guò)氧化氫在室溫下作用15分鐘。再用TBS洗凈3次后，使二次抗體ENVISION+試劑盒(Kit)/HRP(DAKO)作用1小時(shí)。用TBS以5分鐘洗凈3次，然后發(fā)色基質(zhì)使用DAB(3，3′-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽)。另外，核的對(duì)比染色使用蘇木精。
慢性肝炎和肝硬化的免疫組織化學(xué)的結(jié)果，在任意疾病中GPC3都是陽(yáng)性，在細(xì)胞膜中確認(rèn)其染色像。另一方面，在正常肝臟組織中，未確認(rèn)GPC3的染色。
因此，判斷GPC3濃度測(cè)定對(duì)于肝炎重癥化的監(jiān)控是非常有用的。
序列表序列表<110>株式會(huì)社英仙蛋白質(zhì)科學(xué)<120>肝炎重癥化的監(jiān)控藥<130>PER0006<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>Designed DNA based on GPC3 gene<400>1atagaattcc accatggccg ggaccgtgcg c 31<210>2<211>31<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>Designed DNA based on GPC3 gene<400>2ataggatccc ttcagcgggg aatgaacgtt c 3權(quán)利要求
1.一種肝炎重癥化的監(jiān)控藥，其特征在于含有抗GPC3抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的監(jiān)控藥，其特征在于抗GPC3抗體是識(shí)別GPC3的N端部位的抗體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的監(jiān)控藥，其特征在于能夠預(yù)測(cè)從肝炎或肝硬化向肝癌的轉(zhuǎn)變。
4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的監(jiān)控藥，其特征在于使用固定在支持體上的抗GPC3抗體和由標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的抗GPC3抗體。
5.一種肝炎重癥化的監(jiān)控方法，其特征在于使用抗GPC3抗體測(cè)定被檢試樣中的GPC3。
6.如權(quán)利要求5所述的監(jiān)控方法，其特征在于抗GPC3抗體是識(shí)別GPC3的N端部位的抗體。
7.如權(quán)利要求5或6所述的監(jiān)控方法，其特征在于被檢試樣是血液、血清或血漿。
8.如權(quán)利要求5～7中任一項(xiàng)所述的監(jiān)控方法，其特征在于能夠預(yù)測(cè)從肝炎或肝硬化向肝癌的轉(zhuǎn)變。
9.如權(quán)利要求5～8中任一項(xiàng)所述的監(jiān)控方法，其特征在于使用固定在支持體上的抗GPC3抗體和由標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的抗GPC3抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及以使用識(shí)別GPC3的N端部位的抗體測(cè)定GPC3為特征的監(jiān)控肝炎重癥化的方法。根據(jù)本發(fā)明，可以預(yù)測(cè)肝炎的重癥化、即從肝炎或肝硬化向肝癌的轉(zhuǎn)變。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101052878SQ200580034010
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月5日
發(fā)明者中島淳, 油谷浩幸, 巖成宏子, 大口正夫, 佐藤?gòu)V一 申請(qǐng)人:株式會(huì)社英仙蛋白質(zhì)科學(xué), 國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)