專利名稱：凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法及凝集性酒精發(fā)酵酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法及凝集性酒精發(fā)酵酵母。
背景技術(shù)：
采用發(fā)酵法的酒精生產(chǎn)使用作為發(fā)酵酵母的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中酒精生產(chǎn)性特別高的株(以下稱為酒精發(fā)酵酵母)、基于稱作分批發(fā)酵法的方法進行。其中，使用凝集性酵母的反復(fù)分批發(fā)酵法可以使酒精生產(chǎn)中的作業(yè)效率和生產(chǎn)效率提高。
凝集性酵母是指具有各個細胞無性地相互作用形成凝集塊而在靜置狀態(tài)的培養(yǎng)基中沉淀到液底的性質(zhì)(以下，將該性質(zhì)稱為凝集性)的酵母。從自然界獲得的凝集性酵母大多酒精生成能力不足，難以作為工業(yè)用酒精生產(chǎn)中的酵母實用化。因此，本發(fā)明人制成了在非凝集性酒精發(fā)酵酵母396-9-6V株(工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心；日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(郵政編碼305-8566))；保藏編號FERMP-12804)中導(dǎo)入了凝集性基因FL01的自身克隆株FSC27株(保藏日1997年1月7日；保藏編號FERM P-16023)(專利文獻1)。
專利文獻1日本專利第3040959號說明書發(fā)明的揭示FSC27株的生成乙醇濃度與親株396-9-6V株同等，但存在發(fā)酵速度比396-9-6V株慢的問題。該問題是由于在URA3基因位點導(dǎo)入了FL01的FCS27株呈尿嘧啶需要性。通過以添加適量尿嘧啶的培養(yǎng)基培養(yǎng)FSC27株，雖然發(fā)酵速度與396-9-6V株同等，但該方法不實用。
因此，本發(fā)明的目的在于提供在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中顯示出充分的乙醇生成能力和發(fā)酵速度的凝集性酒精發(fā)酵酵母。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法，所述方法具備僅在存在于釀酒酵母FSC27株的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入來自于釀酒酵母的URA3基因的工序。通過在LEU2基因位點上導(dǎo)入URA3基因，可以在維持高酒精生成能力的狀態(tài)下使酵母轉(zhuǎn)化為非尿嘧啶需要性。
本發(fā)明還提供僅在存在于釀酒酵母FSC27株的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入了來自于釀酒酵母的URA3基因的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母。在這里，凝集性酒精發(fā)酵酵母較好是釀酒酵母FSCU-L18株(產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心；保藏日2004年5月20日；保藏編號FERMP-20055)。在LEU2基因位點上導(dǎo)入了URA3基因的酵母兼具高酒精生成能力和非尿嘧啶需要性。特別是FSCU-L18株顯示出高酒精生成能力，因此適合作為工業(yè)用酒精生產(chǎn)中的酵母。
如果采用本發(fā)明，則可以提供具有比FSC27株更好的酒精生成能力和發(fā)酵速度的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精酵母。
附圖的簡單說明

圖1為雙融合PCR的簡圖。
圖2為表示向LEU2基因位點導(dǎo)入URA3的策略的圖。
圖3為表示396-9-6V株的Southern分析結(jié)果的圖。泳道1YRpGL10/BamH I，泳道2EcoR V，泳道3EcoR I，泳道4HindIII，泳道5BamH I，泳道6Pst I。
圖4為FSCU-L株的Southern分析結(jié)果的圖。(a)表示使用URA3ORF作為探針時的結(jié)果，(b)表示使用LEU2 ORF作為探針時的結(jié)果，(c)表示使用pBR332/HindIII作為探針時的結(jié)果。泳道MYRpGL10，泳道1FSC27株，泳道2FSCU-L18株，泳道3FSCU-L20株，泳道4FSCU-L21株。
圖5為表示FSCU-L株的燒瓶發(fā)酵試驗中的二氧化碳產(chǎn)生量的圖。
圖6為表示使用FSCU-L18株的反復(fù)分批發(fā)酵中的二氧化碳產(chǎn)生量的圖。
圖7為表示使用FSC27株的反復(fù)分批發(fā)酵中的二氧化碳產(chǎn)生量的圖。
圖8為表示使用FSCU-L18株和FSC27株的反復(fù)分批發(fā)酵中的發(fā)酵所需時間的圖。
實施發(fā)明的最佳方式以下，對本發(fā)明進行詳細說明。
首先，對本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法進行說明。本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法具備僅在存在于釀酒酵母FSC27株的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入來自于釀酒酵母的URA3基因的工序。
FSC27株中，URA3基因伴隨凝集性基因FL01基因的導(dǎo)入而被破壞，是尿嘧啶需要性的。因此，通過僅在存在于釀酒酵母FSC27株的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入來自于釀酒酵母的URA3基因，可以得到FSC27株的非尿嘧啶需要性的轉(zhuǎn)化體。在這里，導(dǎo)入的URA3基因來自于釀酒酵母，所以該重組為自身克隆。因此，不是重組DNA實驗指南等規(guī)定的對象，適合于實用，例如可以使用采用已知的設(shè)備的酒精生產(chǎn)中得到的轉(zhuǎn)化體等。
來自于釀酒酵母的URA3基因可以從染色體分離制備，也可以使用已分離到質(zhì)粒上的基因。作為所述的質(zhì)粒，可以使用例如YIp5等。此外，可以使用雙融合PCR，制備包括全長URA3基因的LEU2破壞用DNA片段(對于雙融合PCR的詳細說明，參照實施例)。接著，將URA3通過乙酸鋰法等公知的方法導(dǎo)入FSC27株。
接著，使得到的轉(zhuǎn)化體經(jīng)歷在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而對轉(zhuǎn)化體進行篩選的工序，從而可以僅獲得只在1個LEU2基因位點導(dǎo)入了URA3基因的轉(zhuǎn)化體。
對于這樣得到的只在1個LEU2基因位點導(dǎo)入了URA3基因的轉(zhuǎn)化體，進行實施例所記載的酒精發(fā)酵試驗，可以選出酒精生成能力特好的株。此外，得到的轉(zhuǎn)化體的凝集性的確認也可以通過實施例所記載的方法進行。
以下，對本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母進行說明。本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母僅在存在于釀酒酵母FSC27株的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入了來自于釀酒酵母的URA3基因。所述酵母可以通過前述的本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法進行生產(chǎn)。
本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時也表現(xiàn)出比FSC27株酵母更好的發(fā)酵速度和酒精生成量。因此，本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母可以用于工業(yè)的酒精生產(chǎn)。
本發(fā)明的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母中，釀酒酵母FSCU-L18的酒精生成能力特別好，因此適合用于工業(yè)的酒精生產(chǎn)。
實施例以下，例舉實施例，對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
(實驗方法)(1)質(zhì)粒使用了YIp5和YRpGL10這2種質(zhì)粒。YIp5為一般的酵母-大腸桿菌穿梭載體，具有釀酒酵母的URA3序列作為篩選標記，不具有酵母中的自我復(fù)制序列和著絲粒序列。YRpGL10為在一般的酵母-大腸桿菌穿梭載體YIp7中加入了釀酒酵母的LEU2序列和G418藥劑耐性基因序列作為篩選標記的質(zhì)粒。
(2)酵母使用了396-9-6V株和FSC27株。396-9-6V株為非凝集性的酒精發(fā)酵用酵母。FSC27株為在396-9-6V株的染色體上的URA3基因位點導(dǎo)入了凝集性基因FL01的株，為凝集性的酒精發(fā)酵用酵母(參照日本專利第3040959號說明書)。
(3)培養(yǎng)基酵母的培養(yǎng)在YPD培養(yǎng)基、SD培養(yǎng)基(葡萄糖極限培養(yǎng)基)和糖蜜培養(yǎng)基(糖濃度16～24％，發(fā)酵試驗用)中進行。各培養(yǎng)基的組成如下所示。YPD培養(yǎng)基10g/L細菌用酵母抽提物(Difco公司)、20g/L細菌用蛋白胨(Difco公司)、10g/L葡萄糖，pH5.5。YM培養(yǎng)基3g/L細菌用酵母抽提物、3g/L細菌用麥芽抽提物(Difco公司)、3g/L細菌用蛋白胨(Difco公司)、10g/L葡萄糖，pH4.5。SD培養(yǎng)基(葡萄糖極限培養(yǎng)基)6.7g/L無氨基酸酵母氮源(Difco公司)、20g/L葡萄糖，pH5.4。糖蜜培養(yǎng)基將泰國或印度尼西亞產(chǎn)的糖蜜用水稀釋至還原糖濃度為16～24％而得到。
除糖蜜培養(yǎng)基以外的培養(yǎng)基在制備后進行121℃、15分鐘的高壓滅菌鍋處理。通過加入2％的瓊脂制成平板，進行培養(yǎng)基的固體化。在上述培養(yǎng)基中加入氨基酸的情況下，制成適當濃度的氨基酸溶液(無菌)，在經(jīng)高壓滅菌鍋處理的上述培養(yǎng)基冷卻至60～70℃后添加，使其達到20μg/mL的濃度。
平板培養(yǎng)時，用鉑絲劃線或用涂布器涂抹，在30℃下倒置培養(yǎng)2～3天。液體培養(yǎng)時，在中試管中加入2mL培養(yǎng)基或在L形試管中加入10mL培養(yǎng)基，使用經(jīng)滅菌的竹簽或牙簽取平板上的單一菌落進行接種，在30℃振蕩培養(yǎng)1～2天。
(4)酵母的性狀轉(zhuǎn)化通過乙酸鋰法進行酵母的性狀轉(zhuǎn)化。更具體地，將10～100μg通過以下的(6)中所示的PCR法擴增了的PCR產(chǎn)物以乙酸鋰法導(dǎo)入FSC27株，進行性狀轉(zhuǎn)化。性狀轉(zhuǎn)化后，通過將酵母在SD培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，篩選尿嘧啶需要性得到復(fù)原的株。
另外，乙酸鋰法按照H.Ito等(Journal of Bacteriology，vol.153，pp.163-168(1983))的方法實施。具體來說，在加入了10mL的YPD培養(yǎng)基的L形試管中自平板接種1鉑絲的宿主菌體，在30℃培養(yǎng)1晚。將該培養(yǎng)液移入經(jīng)滅菌的離心管，以3000rpm離心5分鐘，懸浮于TE緩沖液(10mM TRIS-HCl，1mM EDTA，pH7.5)，進行清洗。重復(fù)該清洗操作2次，將離心收集得到的菌體懸浮于0.25mL的TE緩沖液和0.25mL的0.2M乙酸鋰，充分攪拌后，在30℃振蕩2小時。將該懸浮液分別分取100μL到經(jīng)滅菌的試管，加入10μL的DNA溶液，平緩地混合，在30℃靜置30分鐘。加入100μL的70％聚乙二醇4000(ナカライテスク公司)，充分攪拌，在30℃靜置1小時。在42℃靜置5分鐘，放置至室溫后，加入1mL的滅菌水進行攪拌，以8000rpm離心1分鐘。除去上清，將沉淀以100μL的滅菌水懸浮，接種于篩選用的平板培養(yǎng)基。平板在30℃培養(yǎng)3～5天。
(5)酵母的全DNA的制備和Southern分析酵母的全DNA的制備按照P.Philippsen等(Methods in Enzymology，vol.194，pp.169-182(1990))的方法進行。在加入了10mL培養(yǎng)基的L形試管中接種500μL培養(yǎng)了1晚的菌液。在30℃振蕩培養(yǎng)1晚，達到穩(wěn)定期后，將培養(yǎng)基移入離心管，以3000rpm離心5分鐘，去上清，將沉淀懸浮于1mL的1.2M山梨糖醇水溶液，移入eppendorf管。以15000rpm離心1分鐘，去上清，將沉淀懸浮于500μL的1.2M山梨糖醇-50mM Tris-HCl溶液(pH7.5)。向該溶液中加入10μL的β-巰基乙醇和50μL的藤黃節(jié)桿菌酶(Zymolyase)溶液(5mg/mL藤黃節(jié)桿菌酶20T，50mM Tris-HCl，pH7.5)進行混合，在30℃靜置1小時，使其原生質(zhì)體化。以5000rpm離心1分鐘，去上清，加入500μL的0.2％SDS-50mM EDTA溶液(pH8.0)進行混合，在70℃靜置15分鐘。加入適量的蛋白酶K進行混合，在37℃放置1小時。再加入100μL的5M乙酸鋰(pH4.8)，平緩地混合，冰冷30分鐘。以8000rpm離心1分鐘，將上清移入其它的試管，加入500μL的TE飽和苯酚，充分懸浮，以4℃、15000rpm離心10分鐘，將上層(水相)移入其它的試管。加入500μL的苯酚-三氯甲烷，充分懸浮，以15000rpm離心5分鐘，將水相移入其它的試管。加入異丙醇至試管口，充分懸浮，放置30分鐘后以15000rpm離心5分鐘，去上清。將沉淀以70％乙醇清洗后，使其干燥，溶解于20μL含50μg/mL的RNA酶A的TE緩沖液。在室溫下放置30分鐘后，加入80μL的TE緩沖液、100μL的5M乙酸銨進行混合，在冰中靜置30分鐘。以4℃、15000rpm離心10分鐘，將上清移入其它的試管，加入1mL的乙醇，在干冰中放置10分鐘。以4℃、15000rpm離心10分鐘，去上清，將沉淀以70％乙醇清洗后，使其干燥，溶解于20μL的TE緩沖液。
Southern分析按照ECL Direct核苷酸標記和檢測系統(tǒng)(nucleic acid labeling and detection system)(Amersham公司)進行。雜交操作和探針的標記中，將作為探針的DNA以100℃處理5分鐘后，在冰中快速冷卻，使其變性，以DNA標記試劑和戊二醛在37℃反應(yīng)10分鐘，以過氧化物酶進行標記。將膜置于金雜交緩沖液(Gold hybridization buffer)中，在42℃進行預(yù)雜交20分鐘以上。在其中加入探針，雜交1晚。將膜在清洗緩沖液(0.5×SSC，6M尿素，0.4％SDS)中以42℃、20分鐘清洗2次。然后，以2×SSC進行2次5分鐘的清洗，加入ECL檢測試劑進行混合。探針中的過氧化物酶和檢測試劑中的過氧化氫反應(yīng)，結(jié)果使檢測試劑中的魯米諾氧化發(fā)光，使其在膠片上感光，從而作為信號檢測出與探針形成了雜交的膜上的DNA。
Southern分析中，印跡操作使用VacuGene XL真空印跡系統(tǒng)(Vaccum Blotting System)(Pharmacia公司)。即，將電泳后的凝膠置于尼龍膜Hybond N+(Amersham公司)上，放置于印跡裝置，在各種溶液中以50毫巴進行吸引印跡。使用的溶液和處理時間如下(1)酸處理溶液0.25M鹽酸，7分鐘；(2)變性溶液含1.5M氯化鈉的0.5M氫氧化鈉水溶液，7分鐘；(3)中和溶液含1.5M氯化鈉的1.0M Tris緩沖液(pH7.5)，7分鐘；(4)轉(zhuǎn)移溶液20×SSC，30分鐘。印跡后，進行膜的堿固定處理。
(6)PCR法PCR使用GeneAmpTMPCR系統(tǒng)9600(PerkinElmer公司)進行。得到的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化后，用于性狀轉(zhuǎn)化等試驗。每種PCR產(chǎn)物的具體PCR條件如下所示。
(6-1)URA3 ORF模板YIp5的Pst I片段(含來自實驗室酵母的URA3)引物URA3P1ATGTCGAAAGCTACATATAAGGA(序列編號1)URA3P2TTAGTTTTGCTGGCCGCATC(序列編號2)DNA聚合酶ExpandTM高保真酶混合物(High Fidelity enzyme mix)(Boehringer Mannheim公司)反應(yīng)液組成(總計50μL)
10mM PCR核苷酸混合物(Boehringer Mannheim)1μL模板DNA(0.1μg/μL)1μL50μM引物URA3P1 1μL50μM引物URA3P2 1μL10×PCR緩沖液5μLDNA聚合酶0.75μL水40.25μL反應(yīng)條件94℃，2分鐘↓(94℃，15秒→60℃，30秒→72℃，90秒)×25循環(huán)↓72℃，7分鐘(6-2)LEU2 ORF模板YRpGL10BamH I片段(含來自實驗室酵母的LEU2)引物L2ORFP1ATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGT(序列編號3)L2ORFP2AAGCAAGGATTTTCTTAACTTCT(序列編號4)DNA聚合物TAKARA Ex Taq(寶酒造公司)反應(yīng)液組成(總計50μL)10mM PCR核苷酸混合物1μL模板DNA(0.1μg/μL)1μL50μM引物L2ORFP1 1μL50μM引物L2ORFP2 1μL10×PCR緩沖液5μLDNA聚合酶0.5μL水40.5μL反應(yīng)條件94℃，2分鐘↓(94℃，15秒→55℃，30秒→72℃，90秒)×25循環(huán)
↓72℃，7分鐘(6-3)396-9-6V株的LEU2模板396-9-6V株的全DNA引物LEU2NP1CGCCTGACGGATATACCTTN(序列編號5)LEU2NP2GCCTACCCTATGAACATATN(序列編號6)DNA聚合物ExpandTM高保真酶混合物反應(yīng)液組成(總計50μL)10mM PCR核苷酸混合物1μL模板DNA(0.1μg/μL)1μL50μM引物LEU2NP1 1μL50μM引物LEU2NP2 1μL10×PCR緩沖液5μLDNA聚合酶0.75μL水40.25μL反應(yīng)條件94℃，2分鐘↓(94℃，15秒→46℃，30秒→68℃，90秒)×25循環(huán)↓72℃，7分鐘(6-4)含URA3全長的LEU2破壞用DNA片段不采用重組DNA技術(shù)，而通過雙融合PCR法(D.C.Amberg等，《酵母(Yeast)》，11卷，1275-1280頁，1995年)，擴增標記DNA片段。PCR用DNA聚合酶使用延伸時不易產(chǎn)生差錯的ExpandTM高保真酶混合物。擴增得到的中間PCR產(chǎn)物根據(jù)需要進行采用瓊脂糖凝膠電泳的分離和自凝膠的DNA回收，進行采用苯酚·三氯甲烷處理和乙醇沉淀的純化。
雙融合PCR的大致內(nèi)容如下(參照圖1)。首先，在步驟1中進行3次常規(guī)的PCR反應(yīng)，步驟2中進行第1次融合PCR，步驟3中進行第2次融合PCR。步驟1中，通過PCR擴增包括LEU2的上游250bp(LEU2的ORF之前的區(qū)域)和作為融合(fusion)的接頭的URA3上游末端20bp的DNA片段(以下稱作片段A)、包括URA3全長的DNA片段(以下稱作片段B)、包括作為融合的接頭的URA3上游末端20bp和LEU2下游250bp(LEU2的ORF內(nèi)的C末端側(cè)的區(qū)域)的DNA片段(以下稱作片段C)這3種DNA片段。步驟2中，將片段B和C作為混合模板進行融合PCR，擴增融合片段BC。步驟3中，將片段A和融合片段BC作為混合模板進行融合PCR，擴增融合片段ABC。
各步驟中所用的模板DNA和引物(相對于URA3的序列以下劃線表示)如下。
步驟1片段A模板YRpGL10 BamH I片段引物P1TTTCAACTGAAAAATTGGGA(序列編號7)P3ATGAATTGAATTGAAAAGCTCATAGGGGCAGACATTAGAA(序列編號8)退火溫度50℃片段B模板YIp5 HindIII片段引物P5AGCTTTTCAATTCAATTCAT(序列編號9)P6AGCTTTTTCTTTCCAATTTT(序列編號10)退火溫度46℃片段C模板YRpGL10 BamH I片段引物P2TTTCAACTGAAAAATTGGGA(序列編號11)P4AAAATTGGAAAGAAAAAGCTTTTGTACGAACCATGCCACG(序列編號12)退火溫度50℃步驟2模板DNA片段B和C引物P2和P5退火溫度50℃步驟3模板DNA片段A和融合DNA片段BC
引物P1和P2退火溫度56℃各步驟的反應(yīng)液組成如下。
步驟1反應(yīng)液組成(總計50μL)10mM PCR核苷酸混合物1μL模板DNA(0.1μg/μL)1μL50μM正向引物1μL50μM反向引物1μL10×PCR緩沖液5μLExpandTM高保真酶混合物0.75μL水40.25μL步驟2和3反應(yīng)液組成(總計50μL)10mM PCR核苷酸混合物1μL模板DNA(將0.5μg/μL各片段混合至等摩爾濃度)5μL50μM正向引物0.5μL50μM反向引物0.5μL10×PCR緩沖液5μLExpandTM高保真酶混合物0.75μL水37.25μL各步驟中，除退火溫度以外的反應(yīng)條件是共通的，如下。
反應(yīng)條件94℃，2分鐘↓(94℃，15秒→退火溫度，30秒→72℃，90秒)×25循環(huán)↓72℃，7分鐘(7)酵母的凝集性的穩(wěn)定性確認試驗將酵母細胞在5mL的YPD培養(yǎng)基(2％葡萄糖)中振蕩培養(yǎng)一晚后，反復(fù)將0.1mL的培養(yǎng)基繼續(xù)接種到新的培養(yǎng)基，考察酵母的凝集性。凝集性的強弱通過肉眼觀察進行評價，將FSC27株表現(xiàn)出的凝集性作為非常強的凝集性(級別5)，以到非凝集性(級別0)為止的6級進行評價。另外，培養(yǎng)分2組進行。
(8)試管發(fā)酵試驗在L形試管中加入10mL的YPD培養(yǎng)基(糖濃度24％)和糖蜜培養(yǎng)基，接種0.5mL培養(yǎng)了一晚的預(yù)培養(yǎng)液，以32℃、80rpm振蕩培養(yǎng)144小時。培養(yǎng)結(jié)束后的乙醇濃度通過氣相色譜法進行測定。
(9)燒瓶發(fā)酵試驗在帶麥氏(マイセル氏)發(fā)酵管的錐形瓶內(nèi)的285mL的24％糖蜜培養(yǎng)基(總糖50.68％)中接種15mL(酒母量5％)全培養(yǎng)液(YM培養(yǎng)基，32℃下培養(yǎng)24小時(僅FSC27株培養(yǎng)48小時))，在32℃進行6天采用攪拌棒的連續(xù)攪拌培養(yǎng)。另外，培養(yǎng)分2組進行。
分析項目及分析方法如下。
酒精濃度氣相色譜法總糖濃度廉-愛農(nóng)(Lane-Eynon)(レ一ン法)法殘?zhí)菨舛人_氏(Somogyi)(ソモギ一)改進法酸度采用0.1N氫氧化鈉水溶液的滴定pH采用pH計的測定酵母濃度采用血球計數(shù)器的計數(shù)發(fā)酵速度采用氣量計的二氧化碳產(chǎn)生量的經(jīng)時變化(重量測定)試餾液中的雜質(zhì)氣相色譜法(10)反復(fù)分批發(fā)酵試驗自斜面培養(yǎng)基接種1鉑絲菌株到20mL的YM培養(yǎng)基中，在32℃振蕩培養(yǎng)24小時(僅FSC27株為48小時)，對其進行前預(yù)培養(yǎng)。將10mL前預(yù)培養(yǎng)液接種到230mL糖液(糖濃度16％)中，在32℃振蕩培養(yǎng)24小時(僅FSC27株為48小時)，對其進行預(yù)培養(yǎng)。接著，使用容量3L的發(fā)酵罐(實際量2L)作為發(fā)酵容器，將全培養(yǎng)液接種到糖蜜培養(yǎng)基(全糖50.68％，僅第10循環(huán)為48.41％)中，以30℃、150rpm進行正式培養(yǎng)。
正式培養(yǎng)如下所示。另外，第1循環(huán)以0.05VVM通氣30小時，第2～10循環(huán)以0.05VVM通氣2小時。
第1循環(huán)在1800mL糖液(糖濃度18％)中接種200mL預(yù)培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時。
第2循環(huán)取20％酒母殘量，添加1600mL糖液(糖濃度18％)，培養(yǎng)24小時。
第3循環(huán)取20％酒母殘量，添加1600mL糖液(糖濃度20％)，培養(yǎng)24小時。
第4～10循環(huán)取20％酒母殘量，添加1600mL糖液(糖濃度22％)，培養(yǎng)24小時。
各循環(huán)中，對以下的項目進行分析。
酒精濃度氣相色譜法，酒精計總糖濃度廉-愛農(nóng)法殘?zhí)菨舛人_氏改進法酸度采用0.1N氫氧化鈉水溶液的滴定pH采用pH計的測定總酵母數(shù)采用血球計數(shù)器的計數(shù)活菌率亞甲藍染色法發(fā)酵速度采用氣量計的二氧化碳產(chǎn)生量的經(jīng)時變化(重量測定)(實施例1向FSC27株的LEU2基因位點的URA3的導(dǎo)入)對向FSC27株的除URA3基因位點以外的位置的含URA3全長的DNA片段的導(dǎo)入進行了研究，選擇LEU2作為靶位點。FSC27株為多倍體，因此被認為具有多個LEU2基因。本實施例中，通過URA3的導(dǎo)入破壞多個LEU2基因中的1個，將FSC27株的尿嘧啶需要性復(fù)原。預(yù)計基因?qū)牒髸l(fā)生基因轉(zhuǎn)化，考慮通過以SD極限培養(yǎng)基保持轉(zhuǎn)化體，從而進行防止。另外，圖2中表示本實施例的策略。
a.396-9-6V株和FSC27株中的多個LEU2基因的存在的確認以及與來自于實驗室酵母的LEU2的同源性的確認基于實驗室酵母的LEU2的堿基序列，設(shè)計用于擴增LEU2 ORF的引物(L2ORFP1和L2ORFP2)。使用該引物以質(zhì)粒YRpGL10上的LEU2(來自于實驗室酵母)為模板進行PCR后，擴增得到約1kb的DNA片段。將該PCR產(chǎn)物用各種限制性酶(EcoRI、EcoR V、Hinf I)進行消化后，得到與目標大致同樣大小的片段，確認該PCR產(chǎn)物為含LEU2 ORF的DNA片段。
將該PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化，將得到的片段作為探針，進行對經(jīng)各種限制性酶消化的396-9-6V株和FSC27株的全DNA的Southern分析。396-9-6V株的分析結(jié)果示于圖3(由于兩株呈同樣的圖案，因此僅表示了396-9-6V株的結(jié)果)。兩株中，發(fā)現(xiàn)與LEU2ORF雜交的信號，確認兩株中存在LEU2同源基因。此外，兩株的信號圖案相同。以在實驗室酵母的LEU2ORF內(nèi)具有1個剪切位點的限制性酶EcoR I(泳道3)和EcoR V(泳道2)進行了消化的情況下，發(fā)現(xiàn)3～4條信號；另一方面，以在實驗室酵母的LEU2ORF內(nèi)不具有剪切位點的限制性酶進行了消化的情況下，發(fā)現(xiàn)1～2條信號。如果396-9-6V株和FSC27株的LEU2為單拷貝，則以EcoR I和EcoR V進行了消化的情況下，應(yīng)該出現(xiàn)1～2條信號，不會出現(xiàn)3條以上的信號。因此，推斷396-9-6V株和FSC27株的LEU2存在2個以上的拷貝。本策略的前提是，F(xiàn)SC27株的LEU2與實驗室酵母的LEU2具有同源性，而且存在2個以上的拷貝。由該結(jié)果確認了實施的可能性，因此進行了后續(xù)的實驗。
b.采用PCR的含URA全長的LEU2破壞用DNA片段的擴增使用雙融合PCR法，構(gòu)建含URA3全長的LEU2破壞用DNA片段。將最終的PCR產(chǎn)物以限制性酶(Pst I、Sma I和兩者的混合物)進行消化后，得到與目標一致的剪切圖案，確認了含URA3全長的LEU2破壞用DNA片段的擴增。
c.FSC27株的性狀轉(zhuǎn)化及所獲得的轉(zhuǎn)化體的篩選使用0、10、50、100μg的b中構(gòu)建的DNA片段，通過乙酸鋰法進行FSC27株的性狀轉(zhuǎn)化。2次的實驗中，獲得共計147株的尿嘧啶需要性得到復(fù)原的轉(zhuǎn)化體(稱作FSCU-L株)。性狀轉(zhuǎn)化的頻度總結(jié)于表1。


將得到的147株中任意選擇的25株在SD培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)所有的株都具有凝集性。凝集性的強弱與親株FSC27株同等，為非常強的凝集性(級別5)。
d.轉(zhuǎn)化體的確認對于確認了凝集性的25株FSCU-L株中的3株，進行了以LEU2 ORF為探針的Southern分析。Southern分析的結(jié)果示于圖4。與FSC27株和396-9-6V株中發(fā)現(xiàn)的信號相同大小的信號強度變?nèi)?，檢測到移動至與之不同大小的信號。這表明多個存在的LEU2中的1個導(dǎo)入了目標基因。此外，以URA3ORF為探針進行了Southern分析，結(jié)果FSCU-L株中檢測出未在FSC27株中發(fā)現(xiàn)的信號。即，表明外源的URA3被導(dǎo)入了。以pBR322為探針進行了Southern分析，結(jié)果在FSCU-L株中未與FSC27株和396-9-6株同樣地檢測出信號。即，表明這些株是未導(dǎo)入來自于大腸桿菌的DNA的自身克隆類株。由以上的結(jié)果可知，F(xiàn)SCU-L株中發(fā)生了與目標一致的基因的整合，而且該整合為自身克隆類。
e.轉(zhuǎn)化體的凝集性保持的確認將確認了凝集性的25株FSCU-L株中任意選擇的3株在SD培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，重復(fù)繼代20次，考察了繼代前后的酵母的凝集性。結(jié)果示于表2。


在任一種培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的情況下，20次的繼代后，酵母的凝集性也都依然保持。
(試驗例1FSCU-L株的發(fā)酵性能評價試驗)試驗糖濃度24％的YPD培養(yǎng)基，對確認了凝集性的25株FSCU-L株進行試管發(fā)酵試驗，選擇生成酒精濃度高的10株。另外，使用糖濃度24％的糖蜜培養(yǎng)基，對這10株進行試管發(fā)酵試驗，測定了生成酒精濃度。各培養(yǎng)基中，最終選擇總體上生成酒精濃度高的3株(FSCU-L18、20和21株)。
對于這3株，進行使用糖蜜培養(yǎng)基的燒瓶發(fā)酵試驗，評價了具體的發(fā)酵性能。二氧化碳產(chǎn)生量的經(jīng)時變化示于圖5，發(fā)酵粗制酒的分析結(jié)果示于表3，試餾酒中的雜質(zhì)的分析結(jié)果示于表4。



單位ppm(僅乙醇為體積％)，-檢測極限以下由圖5可知，3株FSCU-L株的發(fā)酵速度與396-9-6V株大致同等，尿嘧啶需要性引起的FSC27株的發(fā)酵速度的低下在作為FSC27株的改良株的FSCU-L株中得到了改善。此外，由表3可知，酵母數(shù)在FSCU-L株中也得到了改善。對于生成乙醇濃度，F(xiàn)SCU-L株比FSC27株和396-9-6V株都高，F(xiàn)SCU-L18株最高。對于糖蜜中的凝集性，3株FSCU-L株都顯示出強凝集性。另外，由表4可知，試餾液中的雜質(zhì)在所有的株中為大致相同的組成。由以上結(jié)果可知，F(xiàn)SCU-L株的發(fā)酵性能稍高于396-9-6V株。
(試驗例2FSCU-L株的針對實用化的研究)為了研究FSCU-L18株的實用化，進行了采用發(fā)酵罐的反復(fù)分批發(fā)酵試驗(作為對照使用FSC27株)。二氧化碳產(chǎn)生量示于圖6和圖7，發(fā)酵粗制酒的分析結(jié)果示于表5，發(fā)酵所需時間示于圖8。


TS供給糖濃度(％)，ALC(GC)基于GC分析的乙醇濃度(體積％)，ALC(試)試餾液的基于酒精計分析的乙醇濃度(體積％)RTS殘?zhí)?％)，TY總酵母數(shù)(×10E+8/mL)，LCR活菌率(％)，AV酸度，SR糖消費率(％)FR(GC)由GC分析值算出的發(fā)酵比率(％)，F(xiàn)R(試)由酒精計分析值算出的發(fā)酵比率(％)
FSCU-L18株的生成乙醇濃度、發(fā)酵比率和發(fā)酵速度比親株FSC27株高，確認了尿嘧啶需要性得到復(fù)原的效果。FSCU-L18株的酵母數(shù)和活菌率高，而且凝集性也強(凝集塊的大小直徑0.5～2mm；凝集塊的狀態(tài)結(jié)塊緊密，形成粒)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明可以提供具有良好的酒精生成能力和發(fā)酵速度的非尿嘧啶需要性的凝集性酒精酵母。
序列表<110>札幌啤酒株式會社(sapproro Breweries Limited)<120>凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法及凝集性酒精發(fā)酵酵母<130>FP05-0267-00<150>JP2004-296,638<151>2004-10-08<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>URA3 P1<400>1atgtcgaaag ctacatataa gga23<210>2<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>URA3 P2<400>2ttagttttgc tggccgcatc20<210>3<211>23<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>L2ORF P1<400>3atgtctgccc ctaagaagat cgt23<210>4<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>L2ORF P2<400>4aagcaaggat tttcttaact tct23<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LEU2N P1<220>
<221>misc_feature<222>(20)..(20)<223>n代表任何堿基<400>5cgcctgacgg atataccttn20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>LEU2N P2
<220>
<221>misc_feature<222>(20)..(20)<223>n代表任何堿基<400>6gcctacccta tgaacatatn20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>P1<400>7tttcaactga aaaattggga20<210>8<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>P3<400>8atgaattgaa ttgaaaagct cataggggca gacattagaa 40<210>9<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>P5<400>9
agcttttcaa ttcaattcat20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>P6<400>10agctttttct ttccaatttt20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>P2<400>11tttcaactga aaaattggga20<210>12<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>P4<400>12aaaattggaa agaaaaagct tttgtacgaa ccatgccacg 40
權(quán)利要求
1.非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法，其特征在于，具備僅在存在于釀酒酵母FSC27株(保藏編號FERM P-16023)的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入來自于釀酒酵母的URA3基因的工序。
2.非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母，其特征在于，僅在存在于釀酒酵母FSC27株(保藏編號FERM P-16023)的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入了來自于釀酒酵母的URA3基因。
3.如權(quán)利要求2所述的凝集性酒精發(fā)酵酵母，其特征在于，前述凝集性酒精發(fā)酵酵母是釀酒酵母FSCU-L18株(保藏編號FERM P-20055)。
全文摘要
非尿嘧啶需要性的凝集性酒精發(fā)酵酵母的生產(chǎn)方法，該方法具備僅在存在于釀酒酵母FSC27株(保藏編號FERM P－16023)的染色體上的2個LEU2基因位點中的1個導(dǎo)入來自于釀酒酵母的URA3基因的工序。
文檔編號C12N15/09GK101056978SQ20058003399
公開日2007年10月17日 申請日期2005年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月8日
發(fā)明者藤井桂子, 后藤慎吾 申請人:札幌啤酒株式會社