專利名稱：預(yù)測(cè)患者治療藥物耐受性的體外試驗(yàn)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及體外分析方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)患者對(duì)特定治療藥物，包括免疫治療藥物如IL-2突變蛋白的耐受能力的方法。
背景技術(shù)：
白介素-2(IL-2)是天然殺傷細(xì)胞(NK)和T-細(xì)胞增殖和功能的強(qiáng)效刺激物(Morgan等，(1976)，Science 1931007-1011)。這種天然存在的淋巴因子單獨(dú)或與淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)聯(lián)合(使用)顯示對(duì)各種惡性腫瘤具有抗腫瘤活性(參見(jiàn)，例如Rosenberg等，(1987)，N.Engl.J.Med.，316889-897；Rosenberg，(1988)，Ann.Surg.，208121-135；Topalian等，(1988)，J.Clin.Oncol.6839-853；Rosenberg等，(1988)，N.Engl.J.Med.，3191676-1680；和Weber等，(1992)，J.Clin.Oncol.，1033-40)。在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎細(xì)胞癌患者中，當(dāng)使用Proleukin(一種從Chiron Corporation，Emeryville，CA商品化可購(gòu)得的IL-2制劑)時(shí)，IL-2的抗腫瘤活性得到最充分的描述。其它疾病，包括淋巴瘤也顯示對(duì)IL-2治療有反應(yīng)(Gisselbrecht等，(1994)，Blood，83(8)2020-2022)。
也可使用具有抗腫瘤活性的許多其它治療藥物來(lái)治療癌癥。這些藥物包括白介素如IL-3、IL-4、干擾素(IFN)-α、GM-CSF、抗神經(jīng)節(jié)苷抗體、環(huán)孢素A、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、FK973、野百合堿吡咯和阿糖胞苷；以及許多免疫毒素，例如由蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)、封端的蓖麻毒蛋白(blR)、皂草素(SAP)、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)和假單胞菌外毒素(PE)構(gòu)建的免疫毒素。
然而，許多這些治療劑的治療應(yīng)用受到其差的耐受性和毒性的限制。例如，高劑量IL-2免疫治療常伴隨著嚴(yán)重的毒副作用，最顯著的有血管滲漏綜合征(VLS)、嚴(yán)重的流感樣癥狀(發(fā)熱、寒顫、嘔吐)、低血壓和神經(jīng)變化(參見(jiàn)，例如Duggan等，(1992)，J.Immunotherapy，12115-122；Gisselbrecht等，(1994)，Blood，832081-2085；和Sznol與Parkinson，(1994)，Blood，832020-2022)。采用如上所述的其它化學(xué)治療藥物時(shí)也可觀察到VLS。VLS的機(jī)制可能是由于活化的PBMC與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用所介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷。細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)或藥物固有的結(jié)構(gòu)基序的產(chǎn)生(Baluna和Vitetta(1997)Immunopharmacology 37117-132；Baluna等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 963957-3962)。雖然尚不清楚毒性和VLS的確切機(jī)制，但累積的數(shù)據(jù)提示，由于激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的致炎細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β和IL-6的過(guò)度產(chǎn)生，IL-2-誘導(dǎo)的天然殺傷(NK)細(xì)胞觸發(fā)了劑量限制性毒性(DLT)，誘導(dǎo)一氧化氮(NO)產(chǎn)生，導(dǎo)致后續(xù)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷(Dubinett等，1994；Samlowski等，1995)。
已開(kāi)發(fā)了幾種IL-2突變蛋白用來(lái)克服天然分子所顯示的毒性。這些突變蛋白的例子參見(jiàn)2004年3月5日提交的共同擁有、共同待批的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/550,868。
已開(kāi)發(fā)了體外模型，用來(lái)檢測(cè)VLS的機(jī)制。例如，Damle和Doyle在J.Bacteriol.(1989)1422660-2669中描述了一種體外試驗(yàn)系統(tǒng)，用來(lái)檢測(cè)IL-2-活化的殺傷(IAK)淋巴細(xì)胞和許多細(xì)胞因子對(duì)穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞單層的經(jīng)內(nèi)皮大分子通量的作用。該系統(tǒng)測(cè)定穿過(guò)人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的FITC-白蛋白通量。Kotasek等，Cancer Res.(1988)485528-5532描述了一種體外試驗(yàn)，用來(lái)測(cè)定淋巴因子活化的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒機(jī)制，也采用內(nèi)皮細(xì)胞單層。Lindstrom等，Blood(1997)902323-2334，描述了一種用于毒素介導(dǎo)的VLS的體外模型，采用生長(zhǎng)在微孔支持物上，并在存在或不存在蓖麻毒蛋白毒素A鏈的情況下，低壓下培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞。
雖然采用了這些試驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)研究VLS的機(jī)制，但迄今尚未采用這些系統(tǒng)來(lái)預(yù)測(cè)患者對(duì)各種治療，例如采用修飾的淋巴因子和化學(xué)治療免疫毒素的免疫治療的耐受性。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于預(yù)測(cè)患者對(duì)特定治療藥物如免疫治療藥物的耐受能力的簡(jiǎn)單有效的體外分析方法，從而預(yù)測(cè)這種分子的治療應(yīng)用。該方法利用檢測(cè)蛋白質(zhì)通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞單層的滲漏的分析系統(tǒng)，作為受試治療耐受性的預(yù)測(cè)因子。這種分析尤其適合在人體中預(yù)測(cè)各種免疫治療的耐受性，因?yàn)槿说腄LT(發(fā)熱/寒顫，VLS和低血壓)都與致炎細(xì)胞因子和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生具有衍生相關(guān)性。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)患者對(duì)選定治療藥物耐受或不耐受的體外方法。該方法包括(a)提供貼附于粘附基質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞的融合單層；(b)使該單層與以下成分接觸(i)選定的治療藥物或淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞制劑，其中，通過(guò)用治療藥物或LAK細(xì)胞的上清液激活外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生LAK細(xì)胞；和(ii)可檢測(cè)的標(biāo)記大分子，其中，當(dāng)融合單層保持完整時(shí)，所述融合單層可基本上保留該可檢測(cè)的標(biāo)記大分子；(c)在該單層的完整性受損時(shí)，可檢測(cè)的標(biāo)記大分子能通過(guò)該融合單層和粘附基質(zhì)的條件下，孵育步驟(b)的單層一段時(shí)間；和(d)檢測(cè)穿過(guò)融合單層和粘附基質(zhì)的大分子，作為患者對(duì)特定治療藥物耐受或不耐受的指標(biāo)。
在該方法的某些實(shí)施方式中，治療藥物是免疫治療劑如IL-2突變蛋白，或免疫毒素，或小分子化學(xué)治療劑。
在其它實(shí)施方式中，本方法中使用的粘附基質(zhì)包括膠原基質(zhì)。
在又一些實(shí)施方式中，本方法中使用的內(nèi)皮細(xì)胞是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
在其它實(shí)施方式中，本方法中使用的可檢測(cè)的標(biāo)記大分子是可檢測(cè)的標(biāo)記白蛋白，例如標(biāo)記的牛血清白蛋白(BSA)。BSA可被熒光標(biāo)記，例如用FITC標(biāo)記。
在又一些其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)患者對(duì)IL-2突變蛋白耐受或不耐受的體外方法。該方法包括(a)提供貼附于粘附基質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞融合單層；(b)使該單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞制劑，其中，通過(guò)用IL-2突變蛋白激活外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生LAK細(xì)胞，和(ii)可檢測(cè)的標(biāo)記大分子，其中，融合單層保持完整時(shí)，所述融合單層可基本上保留該可檢測(cè)的標(biāo)記大分子；(c)在該單層的完整性受損時(shí)，可檢測(cè)的標(biāo)記大分子能通過(guò)該融合單層和粘附基質(zhì)的條件下，孵育步驟(b)的單層一段時(shí)間；和(d)檢測(cè)穿過(guò)融合單層和粘附基質(zhì)的大分子，作為患者對(duì)IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標(biāo)。
在某些實(shí)施方式中，本方法中使用的粘附基質(zhì)包括膠原基質(zhì)。
在另一些實(shí)施方式中，本方法中使用的內(nèi)皮細(xì)胞是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
在其它實(shí)施方式中，本方法中使用的可檢測(cè)的標(biāo)記大分子是可檢測(cè)的標(biāo)記白蛋白，例如標(biāo)記的BSA。BSA可被熒光標(biāo)記，例如用FITC標(biāo)記。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)患者對(duì)IL-2突變蛋白耐受或不耐受的體外方法。該方法包括(a)提供貼附于粘附基質(zhì)如膠原基質(zhì)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的融合單層；(b)使該單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞制劑，其中，通過(guò)用IL-2突變蛋白激活外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生LAK細(xì)胞，和(ii)熒光標(biāo)記的白蛋白；(c)在該單層的完整性受損時(shí)，標(biāo)記熒光白蛋白能通過(guò)該融合單層和粘附基質(zhì)的條件下，孵育步驟(b)的單層一段時(shí)間；和(d)檢測(cè)穿過(guò)融合單層的熒光標(biāo)記的白蛋白，作為患者對(duì)IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標(biāo)。
在其它實(shí)施方式中，熒光標(biāo)記的白蛋白是BSA。BSA可被熒光標(biāo)記，例如用FITC標(biāo)記。
參考本說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明白本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方式。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A-1C描述了在分別來(lái)自三位不同對(duì)象的刺激培養(yǎng)物上清液的存在下，采用25nM IL-2突變蛋白-刺激的LAK細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用熒光強(qiáng)度作為與LAK細(xì)胞和上清液孵育22小時(shí)后，F(xiàn)ITC-BSA穿過(guò)HUVEC單層的遷移測(cè)定指標(biāo)。*與培養(yǎng)液對(duì)照相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；&與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)。
圖2A-2C描述了采用分別來(lái)自三位不同對(duì)象的25nM IL-2突變蛋白-刺激的LAK細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用熒光強(qiáng)度作為與不含上清液的LAK細(xì)胞孵育22小時(shí)后，F(xiàn)ITC-BSA穿過(guò)HUVEC單層的遷移測(cè)定指標(biāo)。*與培養(yǎng)液對(duì)照相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；&與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)。
圖3A-3C顯示了采用分別來(lái)自三位不同對(duì)象的25nM IL-2突變蛋白-刺激的LAK細(xì)胞的上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用熒光強(qiáng)度作為與上清液孵育22小時(shí)后，F(xiàn)ITC-BSA穿過(guò)HUVEC單層的遷移測(cè)定指標(biāo)。*與培養(yǎng)液對(duì)照相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；&與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)。
圖4A-4C顯示了采用25nM IL-2突變蛋白進(jìn)行三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用熒光強(qiáng)度作為與IL-2孵育22小時(shí)后，F(xiàn)ITC-BSA穿過(guò)HUVEC單層的遷移測(cè)定指標(biāo)。*與培養(yǎng)液對(duì)照相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；$與Proleukin相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；&與F42E相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)；@與rIL-2相比，P值＜0.1，t檢驗(yàn)配對(duì)比較兩樣品的平均值(n＝5)。
發(fā)明詳述除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施采用本領(lǐng)域內(nèi)藥理學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)、免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。文獻(xiàn)中詳細(xì)解釋了這些技術(shù)。例如，參見(jiàn)《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，目前的附刊)；Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)。
I.定義為了描述本發(fā)明，將采用以下術(shù)語(yǔ)，其定義如下所述。
應(yīng)當(dāng)注意，如說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)所述，除非內(nèi)容中清楚地另行指出，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。因此，例如，“一細(xì)胞”包括兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，等等。
術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋了“由……組成”和“含有”，例如，組合物“包含”X可以是只由X構(gòu)成，或是包含一些其它成分，例如X+Y。
術(shù)語(yǔ)“基本上”不排除“完全”，例如，組合物“基本上不含”Y可以是完全不含Y。必要時(shí)，本發(fā)明定義中可省略“基本上”。
術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”在這里指分子的來(lái)源，而不限于分子制備的方法(例如，化學(xué)合成或重組方法)。
術(shù)語(yǔ)“免疫治療劑”在這里指可用于治療癌癥的免疫促進(jìn)劑或免疫抑制劑。這些藥劑包括但不限于各種細(xì)胞因子和淋巴因子，例如各種白介素，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-12和這些分子的突變蛋白；干擾素，包括但不限于IIFN-α、IFN-β、IFN-γ及其突變蛋白；集落刺激因子如GM-CSF和GM-CSF的突變蛋白；腫瘤壞死因子，例如TNF-α和TNF-β及這些分子的突變蛋白。術(shù)語(yǔ)“免疫治療劑”還包括免疫毒素。“免疫毒素”指抗體-毒素偶合物，用于破壞具有與該抗體同源的抗原的特定靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞)。與這種抗體偶合毒素的例子包括但不限于蓖麻毒蛋白A鏈(RTA)、封端的蓖麻毒蛋白(blR)、皂草素(SAP)、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)和假單胞菌外毒素(PE)，以及其它毒性化合物，例如放射性同位素和其它化學(xué)治療藥物。
術(shù)語(yǔ)“IL-2”在這里指來(lái)源于淋巴因子的蛋白質(zhì)，淋巴因子由正常外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，體內(nèi)低濃度存在。IL-2首先由Morgan等，(1976)，Science，1931007-1008描述，由于它能誘導(dǎo)激活的T淋巴細(xì)胞增殖而最初稱為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子。這是一種報(bào)道分子量為13,000-17,000的蛋白質(zhì)(Gillis和Watson，(1980)，J.Exp.Med.，1591709)，其等電點(diǎn)為6-8.5。該定義包括全長(zhǎng)度IL-2蛋白及其生物學(xué)活性片段，該術(shù)語(yǔ)還包括IL-2的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。
術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”在這里指包括修飾的蛋白質(zhì)，例如，對(duì)原有序列的刪除、去頭、添加和取代。一般，該蛋白質(zhì)保持生物學(xué)活性，即抗腫瘤活性。這些修飾可以是精心設(shè)計(jì)的，例如通過(guò)定向誘變，或是意外的，例如通過(guò)產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的宿主的突變或由于PCR擴(kuò)增的誤差。術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”可與術(shù)語(yǔ)“變體”和“類似物”互換使用。這些突變蛋白的氨基酸序列與參比序列具有高度序列同源性，例如，當(dāng)兩個(gè)序列比對(duì)時(shí)，氨基酸序列同源性大于50％，通常大于60-70％，甚至大于80-85％或以上，例如至少90-95％或以上。常常，類似物包括相同數(shù)量的氨基酸但包括取代物，如本文所述。制備多肽突變蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的，如下所述。
突變蛋白包括性質(zhì)上保守性或非保守性的取代。保守性取代指發(fā)生在與其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族中的取代。具體地說(shuō)，氨基酸通常分為四個(gè)家族(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性--賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性--丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)不帶電荷的極性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)也可歸類為芳香族氨基酸。例如，可合理地預(yù)測(cè)，用異亮氨酸或纈氨酸獨(dú)立地取代亮氨酸，用谷氨酸獨(dú)立地取代天冬氨酸，用絲氨酸獨(dú)立地取代蘇氨酸，或用結(jié)構(gòu)上相關(guān)的氨基酸類似地保守性取代一個(gè)氨基酸，將不會(huì)對(duì)生物學(xué)活性有重大影響。例如，感興趣的蛋白質(zhì)可包括多達(dá)約5-10個(gè)保守性或非保守性氨基酸取代，或甚至多達(dá)約15-25個(gè)、50個(gè)或75個(gè)保守性或非保守性氨基酸取代，或5-75之間的任何整數(shù)，只要不影響該分子的所需功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定感興趣的蛋白質(zhì)耐受改變的區(qū)域。
術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”也指天然分子的衍生物?！把苌铩敝父信d趣天然多肽、天然多肽片段或它們各自的類似物的任何合適的修飾，例如糖基化、磷酸化、聚合物偶聯(lián)(如與聚乙二醇偶聯(lián))或加入其它外來(lái)成分的類似物，只要保留天然多肽所需的生物學(xué)活性。制備多肽片段、類似物和衍生物的方法是本領(lǐng)域公知的。
“片段”指僅由完整全長(zhǎng)序列和結(jié)構(gòu)的一部分所形成的分子。片段包括天然多肽的C-端刪除、N-端刪除和/或中間刪除。特定蛋白質(zhì)的活性片段通常包括至少約5-10個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基，優(yōu)選至少約15-25個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少約20-50或更多個(gè)全長(zhǎng)分子的連續(xù)氨基酸殘基，或5個(gè)氨基酸與全長(zhǎng)序列之間的任何整數(shù)，只要感興趣片段保留生物學(xué)活性，例如抗腫瘤活性，如本文所述。
當(dāng)指多肽時(shí)，“分離的”表示所指的分子與完整生物體(該分子在自然界中在該生物體中被發(fā)現(xiàn))離析并分開(kāi)，或該分子以基本上不存在相同類型的其它生物大分子的狀態(tài)存在。指多核苷酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”指全部或部分地缺少天然狀態(tài)下與其正常相關(guān)的序列的核酸分子；或自然存在，但具有與其相關(guān)的異源序列的序列；或從染色體解離的分子。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)”和“組織培養(yǎng)”可互換使用，指在液體介質(zhì)的懸浮培養(yǎng)液中，或在具有液體介質(zhì)的表面如玻璃、塑料、瓊脂或其它合適的基質(zhì)上，體外維持細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，“細(xì)胞培養(yǎng)”需要緩沖以維持恒定適當(dāng)pH的介質(zhì)。通常配制細(xì)胞培養(yǎng)中使用的介質(zhì)，以包含足夠的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且滲透壓調(diào)節(jié)到適合需維持的特定細(xì)胞，溫度和氣體也控制在合適的范圍內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。例如，參見(jiàn)Morgan等，Animal Cell Culture，BIOS Scientific Publishers，Oxford，UK(1993)，和Adams，R.L.P.Cell Culture for Biochemists，第2版，Elsevier(I990)。
術(shù)語(yǔ)“內(nèi)皮細(xì)胞”在這里指來(lái)源于心臟空腔和血管和淋巴管細(xì)胞最內(nèi)層的分化的扁平細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源于中胚層胚胎細(xì)胞層。
內(nèi)皮細(xì)胞的例子如下所述。
“外周血單核細(xì)胞”或“PBMC”指采用例如密度離心，從哺乳動(dòng)物如人的外周血分離的細(xì)胞群。通常，PBMC群包括大多數(shù)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，不包括血紅細(xì)胞和大多數(shù)多形核白細(xì)胞和粒細(xì)胞。
“代”指?jìng)鞔囵B(yǎng)細(xì)胞群的行為?！皞鞔囵B(yǎng)”指用上一次培養(yǎng)的樣品接種新鮮無(wú)菌培養(yǎng)液建立的細(xì)胞培養(yǎng)。每次重復(fù)的傳代培養(yǎng)計(jì)為一次傳代。
本發(fā)明分析中使用的合適的“大分子”是足夠大的大分子，除非單層破裂，融合單層可基本上保留該大分子，從而提高大分子通過(guò)融合單層的滲透性?！疤岣摺钡臐B透性指與不存在破裂試劑(即用導(dǎo)致血管滲漏綜合征的免疫治療劑刺激LSK細(xì)胞)條件下轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)單層相比，轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)單層的大分子的量更大，速率更快。尤其有用的大分子包括血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀球蛋白及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它蛋白質(zhì)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”和“可檢測(cè)的標(biāo)記”指能夠檢測(cè)的分子，包括但不限于，放射性同位素、熒光劑、半導(dǎo)體納米結(jié)晶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、發(fā)色團(tuán)、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、金屬溶膠、配基(例如，生物素、抗生蛋白鏈菌素或半抗原)等。術(shù)語(yǔ)“熒光劑”指在檢測(cè)范圍內(nèi)能夠顯示熒光的物質(zhì)或其一部分。本發(fā)明中可使用的標(biāo)記的具體例子包括但不限于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，熒光素化合物如稱為“FITC”的熒光素5(6)-異氰酸酯或熒光素異氰酸酯異構(gòu)體I，羅丹明、丹酰、羥基香豆素、二甲基吖啶鎓酯(DMAE)、德克薩斯紅、魯米諾、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
II.實(shí)施本發(fā)明的方式在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于這些具體制劑或方法參數(shù)，這些制劑或方法參數(shù)可變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，而不是限制性的。
雖然可采用許多與本發(fā)明所述類似或等價(jià)的方法和材料來(lái)實(shí)施本發(fā)明，本文描述了優(yōu)選的材料和方法。
如上所述，采用免疫療法如IL-2療法來(lái)治療各種癌癥，例如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和淋巴瘤。但是，與免疫療法相關(guān)的嚴(yán)重毒性限制了這些治療方法，例如血管滲漏綜合征(VLS)、嚴(yán)重的流感樣癥狀(發(fā)熱、寒顫、嘔吐)、低血壓、神經(jīng)變化、一氧化氮(NO)產(chǎn)生，導(dǎo)致后續(xù)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。因此，制備了許多免疫治療劑的突變蛋白，如淋巴因子突變蛋白，希望能夠克服上述副作用。本發(fā)明提供了試驗(yàn)這些突變蛋白，和其它治療劑的體外方法，來(lái)預(yù)測(cè)毒性。
具體地說(shuō)，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)體外方法可用于精確和有效地預(yù)測(cè)患者對(duì)采用特定IL-2突變蛋白的耐受能力，而不發(fā)生當(dāng)患者經(jīng)歷IL-2免疫療法時(shí)所產(chǎn)生的常見(jiàn)副作用。該分析方法利用體外內(nèi)皮滲透性模型來(lái)監(jiān)測(cè)大分子通過(guò)融合內(nèi)皮細(xì)胞單層的滲漏。該分析中使用的大分子一般被融合單層保留，或僅少量泄漏。然而，當(dāng)細(xì)胞單層的完整性受到損傷時(shí)，例如，暴露于可引起血管滲漏綜合征的治療藥物，或暴露于由引起血管滲漏綜合征等的治療藥物刺激產(chǎn)生的LAK細(xì)胞(或其上清液)，大分子的內(nèi)皮滲透性增加。
本分析方法尤其適用于預(yù)測(cè)人對(duì)各種基于淋巴因子的免疫療法如IL-2免疫療法的耐受性，因?yàn)槿说腄LT(發(fā)熱/寒顫，VLS和低血壓)都與致炎細(xì)胞因子和NO具有衍生相關(guān)性。
本領(lǐng)域已知許多滲透性試驗(yàn)，可用于檢測(cè)治療藥物如IL-2突變蛋白。例如，參見(jiàn)Damle和Doyle，J.Bacteriol.(1989)1422660-2669；Kotasek等，Cancer Res.(1988)485528-5532；Stone-Wolff等，J Exp.Med.(1984)159828；Lindstrom等，Blood(1997)902323-2334。
一般來(lái)說(shuō)，這些試驗(yàn)采用具有融合單層的粘附基質(zhì)，它通常允許可溶性營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和激素因子通過(guò)，但基本上阻止細(xì)胞遷移通過(guò)，除非融合單層的完整性受損。本發(fā)明試驗(yàn)中采用的融合單層通常來(lái)自內(nèi)皮細(xì)胞，例如血管和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞的例子包括但不限于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，可根據(jù)例如Jaffe等，J.Clin.Invest.(1973)522745；Stroncek等，Arteriosclerosis(1986)1371735-1742所述的方法獲得，購(gòu)自各供應(yīng)商如美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)菌種庫(kù)(ATCC)，Manassas，VA(例如商品目錄CRL-1730)和Cascade Biologics，Poland，OR；WB572細(xì)胞(自發(fā)轉(zhuǎn)化的人隱靜脈平滑肌細(xì)胞)；SV-E6細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E6病毒癌基因的人隱靜脈細(xì)胞)；A7R5細(xì)胞(自發(fā)轉(zhuǎn)化的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；ATCC)；GH3B6細(xì)胞(大鼠腦垂體細(xì)胞；ATCC，Bethesda，Md.)；PVEC細(xì)胞(大鼠肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；J.Tissue CultureRes.(1986)109)；CPA47(牛內(nèi)皮細(xì)胞；ATCC CRL 1733)；CPAE細(xì)胞(牛內(nèi)皮細(xì)胞；ATCC CCL 209)；EJG細(xì)胞(牛內(nèi)皮細(xì)胞；ATCC CRL 8659)；FBHE(牛內(nèi)皮細(xì)胞；ATCC CRL 1395)；HW-EC-C細(xì)胞(人內(nèi)皮細(xì)胞；ATCC CRL 1730)；和T/GHA-VSMC細(xì)胞(人血管平滑肌細(xì)胞；ATCC CRL 1999)。
在使用本發(fā)明試驗(yàn)之前，在合適的培養(yǎng)液中常規(guī)傳代細(xì)胞并培養(yǎng)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如，可在市售培養(yǎng)液，例如實(shí)施例所述的RPMI-10AB培養(yǎng)液；如Damel和Doyle，J.Bacteriol.(1989)1422660-2669所述的RPMI1640補(bǔ)給性培養(yǎng)液；如Lindstrom等，Blood(1997)902323-2334所述的M199補(bǔ)給性培養(yǎng)液；得自Cambrex，Baltimore，MD，含2％胎牛血清的內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)液以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組織培養(yǎng)介質(zhì)中，培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。可使用其它因子，如內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)、肝素等。例如，參見(jiàn)Thornton等，Science(1983)222623。使用前合適的代數(shù)可變化，取決于所用細(xì)胞系的期望壽命。通常，本發(fā)明中使用的HUVEC的代數(shù)為2-20代，優(yōu)選3-10代，甚至更優(yōu)選，少于5代，例如2、3、4代。
經(jīng)過(guò)所需次數(shù)的傳代之后，將大約1×103-1×107，有效1×104-1×107，例如1×105-1×106的細(xì)胞加入到合適的粘附基質(zhì)中。根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，得到融合單層。例如，HUVAC一般培養(yǎng)約1-7天，通常2-5天，例如1、2、3、4、5、6或7天，直到形成融合單層?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)評(píng)價(jià)融合度，例如用結(jié)晶紫檢測(cè)。
本發(fā)明試驗(yàn)中試驗(yàn)的合適的基質(zhì)包括膜支持物，例如用于組織培養(yǎng)的滲透性微孔薄膜，通常允許物質(zhì)如可溶性營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和激素因子自由通過(guò)該膜，同時(shí)阻止細(xì)胞遷移通過(guò)該膜。例如，粘附支持物包括葡聚糖聚合物、聚氯乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物(polylactic coglycolic acids)和/或硅。通常，基質(zhì)還可包括膠原、纖維蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和/或透明質(zhì)酸。這些支持物是本領(lǐng)域所公知的，例如，可購(gòu)自Costar(Cambridge，MA)。一個(gè)例子是TrranswellTM支持物(例如，TRANSWELL-COL PTFE膜，膜厚度25-50μm，孔徑0.4-3.0μm，用來(lái)自牛胎盤(pán)的I型和II型膠原處理)。這些支持物允許物質(zhì)從上室通過(guò)單層進(jìn)入下室，在下室中收集和測(cè)定物質(zhì)。然而，本發(fā)明方法可使用任何合適的滲透膜支持物，只要可監(jiān)測(cè)通過(guò)單層的遷移。
融合單層一旦建立，在不存在試驗(yàn)物質(zhì)的情況下，將可檢測(cè)的標(biāo)記大分子加入到單層(例如轉(zhuǎn)移孔支持物的上室)，以提供背景測(cè)定。可檢測(cè)的標(biāo)記大分子的尺寸大到足以被融合單層保留，除非由于可使單層破裂的分子的存在而導(dǎo)致單層滲漏。如上所述，本發(fā)明方法中一般使用的大分子包括血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀球蛋白及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它蛋白質(zhì)。加入標(biāo)記大分子之后，試驗(yàn)進(jìn)行15分鐘到幾個(gè)小時(shí)，例如，30分鐘到48小時(shí)，優(yōu)選1小時(shí)到24小時(shí)，更優(yōu)選2小時(shí)到12小時(shí)，例如1...2...3...4...5...6...7...8...12...20...24...40...48或更多個(gè)小時(shí)。例如，采用分光光度計(jì)，可檢測(cè)通過(guò)單層進(jìn)入(例如)底室的標(biāo)記分子，以提供基線測(cè)定。如果采用熒光標(biāo)記，可使用熒光光度計(jì)測(cè)定熒光，表示為相對(duì)熒光單位。測(cè)定可以是定性或定量的。例如，可采用以下公式計(jì)算白蛋白清除白蛋白清除(μl)＝VL×A/L，其中，VL是取樣時(shí)的底室體積，A是取樣時(shí)每微升底室中的熒光單位，L是試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，每微升頂室中的熒光單位。通過(guò)線性回歸分析計(jì)算白蛋白的清除率(μl/分鐘)。例如，可測(cè)定清除(μl±SEM/分鐘)。
進(jìn)行適當(dāng)測(cè)定之后，除去任何殘留的標(biāo)記大分子，將試驗(yàn)化合物以及含標(biāo)記大分子的培養(yǎng)液加入到頂孔中。例如，加入感興趣的治療藥物，或已用治療藥物刺激活化的LAK細(xì)胞(或其上清液)，以及對(duì)照，如下所述。采用選定的治療藥物以激活PBMC，通過(guò)活化外周血單核細(xì)胞(PBMC)，產(chǎn)生LAK細(xì)胞?？刹捎帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)，例如采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心，從全血分離用于激活的PBMC。離心后，通過(guò)在37℃下，粘附塑料的相繼循環(huán)持續(xù)45分鐘，粘附的單核細(xì)胞可與(但不必需)非粘附單核細(xì)胞(NAMNC)分離。為了制備活化細(xì)胞，聯(lián)合(使用)治療藥物和PBMC。加入的藥物量取決于特定的受試物質(zhì)。因此，例如，當(dāng)分析淋巴因子如IL-2突變蛋白時(shí)，突變蛋白的加入濃度為10-500nM，通常濃度為25-250nM，甚至更優(yōu)選濃度為35-100nM。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適的使用濃度。例如，參見(jiàn)Damle和Doyle，J.Bacteriol.(1989)1422660-2669；Damle等，J.Immunol.(1987)1381779；Damle和Doyle，Int.J.Cancer(1987)40519；Damle等，J.Immunol.(1986)1372814。
參考如上所述基線測(cè)定，進(jìn)行試驗(yàn)?？稍诙鄠€(gè)時(shí)間點(diǎn)從底室取樣，測(cè)定存在的標(biāo)記大分子?？蛇M(jìn)行各種對(duì)照，如下所述。具體地說(shuō)，可使用具有改善的耐受性的治療藥物作為陰性對(duì)照，以建立不存在引起VLS的治療藥物時(shí)發(fā)生的基線滲漏。例如，IL-2突變蛋白F42E和Y107R是耐受性提高的取代突變蛋白。參見(jiàn)，2005年3月5日提交的共同擁有、共同待批的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/550,868。體內(nèi)外模型中，就NK和T細(xì)胞增殖，以及NK/LAK/ADCC活性方面而言，這些突變蛋白也維持效應(yīng)子作用。此外，可采用陽(yáng)性對(duì)照，例如去污劑和已知可破壞細(xì)胞單層的物質(zhì)等，例如皂苷。還可使用培養(yǎng)液對(duì)照。
如上所述，使用本發(fā)明方法測(cè)定治療劑如IL-2突變蛋白的患者耐受性。已知許多IL-2突變蛋白，如下所述。然而，本發(fā)明方法也可應(yīng)用于本文未具體描述的其它IL-2突變蛋白。這些IL-2突變蛋白可來(lái)源于任何種類的IL-2。這些變體應(yīng)保留天然多肽所需的生物學(xué)活性，使得給予患者時(shí)，含變體多肽的藥物組合物具有與含天然多肽的藥物組合物相同的治療效果。即，變體多肽可以類似于天然多肽的方式，用作藥物組合物中的治療活性成分。本領(lǐng)域已知測(cè)定變體多肽是否保留所需的生物學(xué)活性的方法，因而可用作藥物組合物中的治療活性成分?？刹捎锰貏e用于測(cè)定天然多肽或蛋白質(zhì)活性的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定生物學(xué)活性。天然或天然來(lái)源的IL-2的合適的生物學(xué)活性突變蛋白可以是該多肽的片段、類似物以及衍生物，如上所述。
例如，可通過(guò)在編碼感興趣天然多肽的克隆DNA序列中產(chǎn)生突變來(lái)制備多肽的氨基酸序列變體。誘變和改變核苷酸序列的方法是本領(lǐng)域所所熟知的。例如，參見(jiàn)以下文獻(xiàn)Walker和Gaastra編，(1983)，《分子生物學(xué)技術(shù)》(Techniques in Molecular Biology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82488-492；Kunkel等，(1987)，Methods Enzymol.，154367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，Plainview，New York)；美國(guó)專利號(hào)4,873,192；和本文引用的參考文獻(xiàn)。不影響感興趣的多肽的生物學(xué)活性的合適氨基酸取代的指南可參見(jiàn)Dayhoff等，(1978)，在《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖》(Atlas of Protein Sequence andStructure)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中所述的模型。優(yōu)選保守性取代，例如用具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸替換一種氨基酸。保守性取代的例子包括但不限于GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
可在專業(yè)文獻(xiàn)中找到殘基取代、刪除或插入來(lái)改變IL-2蛋白質(zhì)諸區(qū)域的指導(dǎo)。例如，參見(jiàn)以下文獻(xiàn)所述的結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系和/或結(jié)合研究Bazan，(1992)，Science，257410-412；McKay，(1992)，Science，257412；Theze等，(1996)，Immunol.Today，17481-486；Buchli和Ciardelli，(1993)，Arch.Biochem.Biophys.，307411-415；Collins等，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 857709-7713；Kuziel等，(1993)，J.Immunol.，1505731；Eckenberg等，(1997)，Cytokine，9488-498。
在構(gòu)建感興趣IL-2多肽的變體的過(guò)程中，進(jìn)行的修飾應(yīng)使變體繼續(xù)具有所需活性。顯然，在編碼變體多肽的DNA中產(chǎn)生的任何突變不能將該序列置于讀碼框外，并且優(yōu)選不會(huì)產(chǎn)生可能產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。參見(jiàn)，歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?5,444。
IL-2的生物學(xué)活性變體一般與用作比較基準(zhǔn)的參比IL-2多肽分子，例如天然的人IL-2具有至少約70％、優(yōu)選至少約80％、更優(yōu)選至少約90％-95％或更高、最優(yōu)選至少約98％、99％或更高的氨基酸序列相同性。序列相同性百分比可用Smith-Waterman同源性檢索算法，以親族缺口(affine gap)檢索測(cè)定，所用參數(shù)為缺口開(kāi)放罰分12、缺口延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說(shuō)明見(jiàn)Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2482-489。例如，變體可有少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)氨基酸殘基，如6-10，少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)、甚至1個(gè)氨基酸殘基不同。
就兩條氨基酸序列的最佳比對(duì)而言，與參比氨基酸序列相比，變體氨基酸序列的連續(xù)區(qū)段可具有相同的氨基酸數(shù)、加入的氨基酸殘基或刪除的氨基酸殘基。用于和參比氨基酸序列比較的連續(xù)區(qū)段包含至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，可以是30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基?？蓪?duì)與保守性殘基取代或缺口相關(guān)的序列相同性進(jìn)行校正(參見(jiàn)Smith-Waterman同源性檢索算法)。感興趣的天然IL-2多肽的生物學(xué)活性變體與天然多肽相比有少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)氨基酸殘基，如6-10，少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)、甚至1個(gè)氨基酸殘基的不同。
具有IL-2活性的多肽的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)取決于許多因素。由于分子中存在可電離的氨基和羧基，獲得的特定多肽可以是酸性鹽或堿性鹽，或中性形式。在合適的環(huán)境中可保留它們的生物學(xué)活性的所有這些制劑包括在本文所用具有IL-2活性的多肽的定義中。此外，可通過(guò)利用糖分子衍生化(糖基化)或其它補(bǔ)充分子，例如脂質(zhì)、磷酸、乙酰基團(tuán)等增加該多肽的一級(jí)氨基酸序列。也可通過(guò)和糖偶聯(lián)來(lái)增加該多肽的一級(jí)氨基酸序列。這種增加的某些方面可通過(guò)生產(chǎn)宿主的翻譯后加工系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)；其它這種修飾可在體外引入。在任何情況中，只要多肽的IL-2活性未遭破壞，這種修飾就包括在本文所用的IL-2多肽的定義中。在各種試驗(yàn)中，期望這種修飾可通過(guò)提高或降低該多肽的活性來(lái)定量或定性地影響其活性。此外，可通過(guò)氧化、還原或其它衍生化方式來(lái)修飾鏈中的單個(gè)氨基酸殘基，可切割該多肽而得到保留活性的片段。這種不破壞活性的改變不將這種多肽序列排除在本文所用感興趣的IL-2多肽的定義之外。
本領(lǐng)域?yàn)槎嚯淖凅w的制備和使用提供了基本指導(dǎo)。在制備IL-2變異蛋白過(guò)程中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不難確定對(duì)天然蛋白質(zhì)的核苷酸或氨基酸序列的哪種修飾將導(dǎo)致產(chǎn)生適合用作本發(fā)明方法藥物組合物中治療活性組分的變體。
用于本發(fā)明方法中的IL-2或其變異蛋白可以是任何來(lái)源，但優(yōu)選重組產(chǎn)生?！爸亟MIL-2”或“重組IL-2變異蛋白”指具有與天然序列IL-2相當(dāng)生物學(xué)活性并通過(guò)例如Taniguchi等，(1983)，Nature，302305-310和Devos，(1983)，NucleicAcids Research，114307-4323所述重組DNA技術(shù)制備的白介素-2或其變體；或者如Wang等，(1984)，Science，2241431-1433所述經(jīng)突變而改變的IL-2。大體上，克隆編碼IL-2的基因，然后在轉(zhuǎn)化的生物，優(yōu)選微生物中表達(dá)。宿主生物能在表達(dá)條件下表達(dá)外來(lái)基因而產(chǎn)生IL-2。生長(zhǎng)、收集、破裂(disrupt)或自細(xì)胞者中提取IL-2的方法的基本描述見(jiàn)，例如全文納入本文作為參考的美國(guó)專利號(hào)4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234。
例如IL-2突變蛋白，參見(jiàn)歐洲專利(EP)公布號(hào)EP 136,489(公開(kāi)了天然存在的IL-2的氨基酸序列中的一種或多種以下改變Asn26-Gln26；Trp121-Phe121；Cys58-Ser58或Ala58；Cys105-Ser105或Ala105；Cys125-Ser125或Ala125；刪除Arg 120之后的所有殘基；和它們的Met-1形式)；1983年10月13日提交的歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?3306221.9所述的重組IL-2突變蛋白(1984年5月30日以公布號(hào)EP 109,748公布)，該專利是比利時(shí)專利號(hào)893,016和共有的美國(guó)專利4,518,584的等同專利(這兩份專利公開(kāi)了重組的人IL-2突變蛋白，其中天然人IL-2編號(hào)的125位半胱氨酸被刪除或被中性氨基酸所取代；丙氨酰-ser125-IL-2；和脫-丙氨酰-ser125-IL-2)。也參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,752,585(該專利公開(kāi)了以下IL-2突變蛋白ala104 ser125 IL-2、ala104 IL-2、ala104 ala125 IL-2、val104 ser125IL-2、val104 IL-2、val104 ala125 IL-2、脫-ala1 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1 ala104IL-2、脫-ala1 ala104 ala125 IL-2、脫-ala1 val104 ser125 IL-2、脫-ala1 val104 IL-2、脫-ala1 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2 ala104 ser0125 IL-2、脫-ala1脫-pro2ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2 ala104 ala125IL-2、脫-ala1脫-pro2 val104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 ala104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 val104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3 val104 ala125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 ala104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 val104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 val104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 val104 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 val104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6ala104 ala125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104 ser125 IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 val104 ser125IL-2、脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 val104 IL-2和脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 val104 ala125IL-2)和美國(guó)專利號(hào)4,931、543(該專利公開(kāi)了用于本文實(shí)施例的IL-2突變蛋白脫-丙氨酰-1，絲氨酸-125人IL-2以及其它IL-2突變蛋白)。
也參見(jiàn)歐洲專利公布號(hào)EP 200,280(1986年12月10日公布)，該專利公開(kāi)了重組IL-2突變蛋白，其中104位的甲硫氨酸被保守性氨基酸取代。例子包括以下突變蛋白ser4脫-ser5 ala104 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 ala104 ala125 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 glu104 ser125IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 glu104 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5 glu104 ala125IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104 ala125 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 ala104ser125 IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 glu104 ser125IL-2；脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 glu104 IL-2和脫-ala1脫-pro2脫-thr3脫-ser4脫-ser5脫-ser6 glu104 ala125 IL-2。也參見(jiàn)歐洲專利申請(qǐng)?zhí)朎P 118,617和美國(guó)專利號(hào)5,700,913，該兩份專利公開(kāi)了以丙氨酸取代天然IL-2的甲硫氨酸作為N-末端氨基酸的未糖基化人IL-2變體；刪除了起始甲硫氨酸從而使脯氨酸是N-末端氨基酸的未糖基化人IL-2；和在N-末端甲硫氨酸和脯氨酸之間插入丙氨酸的未糖基化人IL-2。
其它IL-2突變蛋白包括公開(kāi)于WO 99/60128的(用組氨酸或異亮氨酸取代20位的天冬氨酸，用精氨酸、甘氨酸或異亮氨酸取代88位的天冬酰胺，或者用亮氨酸或谷氨酸取代126位的谷氨酰胺)，據(jù)報(bào)道這些突變蛋白對(duì)T細(xì)胞受體表達(dá)細(xì)胞所表達(dá)的高親和力IL-2受體具有優(yōu)于NK細(xì)胞所表達(dá)受體的選擇性活性并且IL-2毒性降低；美國(guó)專利號(hào)5,229,109所公開(kāi)的突變蛋白(用丙氨酸取代38位的精氨酸，或者用賴氨酸取代42位的苯丙氨酸)，與天然IL-2相比這些突變蛋白顯示與高親和力IL-2受體結(jié)合(能力)降低但仍能激活LAK細(xì)胞；國(guó)際公布號(hào)WO 00/58456所公開(kāi)的突變蛋白(改變或刪除天然IL-2中天然存在的(x)D(y)序列，其中D是天冬氨酸，(x)是亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸或纈氨酸，(y)是纈氨酸、亮氨酸或絲氨酸)；公開(kāi)于國(guó)際公布號(hào)WO 00/04048中的IL-2 p1-30肽(對(duì)應(yīng)于IL-2的前30個(gè)氨基酸，該肽含有IL-2的整個(gè)α-螺旋A并能與IL-2受體的b鏈相互作用)；和公開(kāi)于WO 00/04048的IL-2 p1-30肽的突變形式(用賴氨酸取代20位的天冬氨酸)。
具有預(yù)計(jì)的毒性降低的IL-2突變蛋白的其它例子公開(kāi)于2004年3月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/550,868中。這些突變蛋白包括在成熟人IL-2序列的125位用絲氨酸取代半胱氨酸的成熟人IL-2氨基酸序列，并且在該成熟人IL-2序列中具有至少一處額外的氨基酸取代從而使該突變蛋白具有以下功能特征在可比試驗(yàn)條件下與類似量的脫-丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，1)能維持或提高天然殺傷(NK)細(xì)胞的增殖，和2)誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生的致炎細(xì)胞因子水平降低。在一些實(shí)施方式中，此額外取代選自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L，K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S，T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中氨基酸殘基位置相對(duì)于成熟人IL-2氨基酸序列編號(hào)。在其它實(shí)施方案中，這些突變蛋白包括在成熟人IL-2序列的125位用丙氨酸取代半胱氨酸的成熟人IL-2氨基酸序列，并且在該成熟人IL-2序列中具有至少一處額外的氨基酸取代從而使該突變蛋白具有相同的功能特征。在一些實(shí)施方案中，此額外取代選自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、MOD、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中氨基酸殘基位置相對(duì)于成熟人IL-2氨基酸序列編號(hào)。在其它實(shí)施方案中，這些突變蛋白包括在成熟人IL-2序列內(nèi)至少一處額外的氨基酸取代的成熟人IL-2氨基酸序列，從而使該突變蛋白具有相同的功能特征。在一些實(shí)施方案中，此額外取代選自T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中氨基酸殘基位置相對(duì)于成熟人IL-2氨基酸序列編號(hào)。除了在成熟人IL-2序列1位刪除了起始丙氨酸殘基之外，美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/550,868中描述的其它突變蛋白包括上述突變蛋白。
IL-2突變蛋白也可以是IL-2融合物或偶聯(lián)物，所述融合物或偶聯(lián)物包括與第二蛋白融合或與聚脯氨酸或水溶性聚合物共價(jià)偶聯(lián)的IL-2，以降低給藥頻率或提高IL-2耐受性。例如，可采用本領(lǐng)域已知的方法(參見(jiàn)，WO 01/79258)，使IL-2突變蛋白與人白蛋白或白蛋白片段融合。或者，可采用本領(lǐng)域已知的方法(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)4,766,106；5,206,344和4,894,226)，使IL-2突變蛋白與聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇共價(jià)偶聯(lián)，其中所述均聚物未取代或一端被烷基取代，所述多元醇未取代。
本發(fā)明分析方法也可由于檢測(cè)其它治療藥物，例如其它免疫治療劑、細(xì)胞因子和淋巴因子突變蛋白，以及免疫毒素和小分子化學(xué)治療劑。這些藥物包括但不限于白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4，IL-5、IL-12和這些分子的突變蛋白；干擾素，例如但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ及其突變蛋白；GM-CSF和GM-CSF的突變蛋白；腫瘤壞死因子，例如TNF-α和TNF-β及這些分子的突變蛋白；抗神經(jīng)節(jié)苷抗體、環(huán)孢素A、環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C、FK973、野百合堿吡咯(monocrotalinepyrrole)和阿糖胞苷及這些分子的突變蛋白；以及各種免疫毒素。
III.實(shí)驗(yàn)下面是進(jìn)行本發(fā)明的具體實(shí)施方式
的例子。提供這些實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明目的，而不是為了以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
為確保使用的各種數(shù)值的準(zhǔn)確性(例如，量、溫度等)，進(jìn)行了研究，但應(yīng)當(dāng)允許一定的實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。
材料和方法A.培養(yǎng)液和試劑-PBS(不含Ca/Mg)，冰冷；-培養(yǎng)液200(Cascade Biologics，Portland，OR)；-培養(yǎng)液200PRF(Cascade Biologics，Portland，OR)；-LSGS低血清生長(zhǎng)添加劑(50×)。(Cascade Biologics，Portland，OR)。補(bǔ)給性培養(yǎng)液中這些組分的最終濃度為2％v/v胎牛血清；1μg/ml氫化可的松；10ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子；10ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子；3ng/ml基本的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和10g/ml肝素；-PSA溶液(Cascade Biologics，Portland，OR)完全培養(yǎng)液中的最終濃度含有100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸鏈霉素和0.25μg/ml兩性霉素B；-胰蛋白酶(0.25％)/EDTA(0.1％)(Cellgro，Hemdon，VA)；-FITC-白蛋白(50mg)(Sigma，St.Louis，MO)；-FITC-BSA儲(chǔ)備液(20×)。FITC-BSA懸浮在2.5ml完全培養(yǎng)液200中。
-人AB血清(SeraCare Life Sciences，Oceanside，CA)-人AB培養(yǎng)液(500mL)RPMI(不含酚紅)............................................426.5ml人AB-加熱滅活*............................................50ml
青霉素/鏈霉素(終濃度100μg/ml).................................5mlHEPES(1M儲(chǔ)備液，終濃度25mM)....................................12.5mlL-谷氨酰胺(100×儲(chǔ)備液，終濃度2mM).............................5ml兩性霉素B(250μg/ml儲(chǔ)備液，終濃度0.5μg/ml)....................1ml4℃下，儲(chǔ)存培養(yǎng)液至多4周。
*4℃下過(guò)夜解凍血清，56℃加熱滅活45分鐘-RPMI冰冷，不含血清-PBS/EDTA5.7ml 0.5M EDTA加入到500ml PBS(不含Ca/Mg)中，最終pH7.2；-臺(tái)盼藍(lán)染料(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，或等價(jià)的0.4％溶液)；-10％皂苷儲(chǔ)備液2.5g皂苷在25ml PBS中，4℃下儲(chǔ)存；-完全培養(yǎng)液200培養(yǎng)液200/培養(yǎng)液200PRF..........................................500mlLSGS............................................................10mlPSA溶液.........................................................1mlB.細(xì)胞培養(yǎng)HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)得自Cascade Biologics，Portland，OR。每小管含有≥5×105個(gè)細(xì)胞。通過(guò)浸入37℃的水，解凍小管。用完全培養(yǎng)液200將細(xì)胞稀釋至10ml，采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)確定每毫升中的活細(xì)胞數(shù)。然后，再用完全培養(yǎng)液200將小管內(nèi)容物稀釋至1.25×104活細(xì)胞/毫升。將5ml或15ml細(xì)胞懸浮液分別加入到25cm2或75cm2培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)瓶中渦旋培養(yǎng)液以分散細(xì)胞。在濕潤(rùn)的5％CO2孵育箱中，37℃下孵育培養(yǎng)物。24-36小時(shí)后，將培養(yǎng)液換成新鮮補(bǔ)給性培養(yǎng)液200，以后每天換液，直到培養(yǎng)物達(dá)到約80％融合。這大概需要5-6天。
然后如下所述傳代培養(yǎng)HUVEC。除去培養(yǎng)液，將胰蛋白酶/EDTA溶液加入到培養(yǎng)瓶中，通過(guò)輕拍和吸取并加入完全培養(yǎng)液200取出細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15ml無(wú)菌錐形試管中。細(xì)胞在1000rpm下離心10分鐘，計(jì)數(shù)，并以2.5×103活細(xì)胞/平方厘米接種。
2或3代期間的細(xì)胞在凍存培養(yǎng)液(90％FBS，10％DMSO)中冷凍保存，儲(chǔ)存在液氮中備用。
實(shí)施例1篩選IL-2突變蛋白的體外試驗(yàn)為了試驗(yàn)預(yù)測(cè)IL-2突變蛋白患者耐受性的能力，進(jìn)行了以下試驗(yàn)。試驗(yàn)中使用兩種耐受性提高的IL-2突變蛋白，作為原理證據(jù)。這兩種突變蛋白是F42E和Y107R取代突變蛋白。參見(jiàn)2005年3月5日提交的共同擁有、共同待批的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/550,868。體內(nèi)外模型中，在NK和T細(xì)胞增殖，以及NK/LAK/ADCC活性方面，這些突變蛋白也保持了效應(yīng)子功能。此外，使用由Emeryville，CA的Chiron Corporation生產(chǎn)的Proleukin作為引起VLS的代表性IL-2分子。該制劑中的IL-2是重組產(chǎn)生的，未糖基化的人IL-2突變蛋白，稱為aldesleukin，其刪除了起始丙氨酸殘基并用絲氨酸殘基取代125位半胱氨酸殘基(稱為脫-丙氨酰-1，絲氨酸-125人白介素-2)而與天然人IL-2氨基酸序列不同。該IL-2突變蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，然后如美國(guó)專利號(hào)4,931543所述經(jīng)滲濾和離子交換層析純化。IL-2制劑以Proleukin商品名提供，為無(wú)菌、白色至灰白色無(wú)防腐劑的凍干粉，每小管含有1.3mg蛋白質(zhì)(22MIU)。
如下制備本試驗(yàn)中使用的淋巴因子-活化的殺傷(LAK)細(xì)胞。從正常供體收集全血，置于Vacutainer CPT管(ACDA，Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中。根據(jù)CPT生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)分離PBMC。簡(jiǎn)言之，倒置試管以混合，1500-1800×g下離心20分鐘，除去血沉棕黃層，置于錐形管中，用PBS 2％FBS洗(最多300×g，15分鐘)。除去上清液，洗滌細(xì)胞2次。將PBMC懸浮在RPMI-10AB培養(yǎng)液中，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)計(jì)數(shù)。將PBMC以1.5×106細(xì)胞/毫升懸浮在RPMI-10AB中(不含酚紅)。24孔組織培養(yǎng)板的每孔中加入1ml PBMC懸浮液，并加入含50nm所需IL-2突變蛋白的1ml/孔37℃RPMI-10AB培養(yǎng)液。蓋上培養(yǎng)板，在濕潤(rùn)的37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育3天，然后將培養(yǎng)板置于冰上約30分鐘，除去上清液，4℃，300×g下離心5分鐘，收集在冰上的50ml錐形試管中。每孔中加入1ml冰冷的PBS/EDTA，孵育20分鐘。取出粘附細(xì)胞，加入到冰上的試管中。每孔中加入1ml冷的PBS。4℃，將50ml錐形試管在300×g下離心5分鐘。同時(shí)，洗滌各孔，將洗滌液收集在冰上50ml錐形試管中。倒出上清液，細(xì)胞團(tuán)懸浮在12ml冷RPMI中，加入到PBS洗滌液中。4℃，300×g下再次離心5分鐘。再次倒出上清液，懸浮細(xì)胞團(tuán)，離心，如上所述。將洗滌的細(xì)胞懸浮在冷的完全RPMI中，臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)計(jì)數(shù)。
將600μl完全培養(yǎng)液200PRF加入到膠原涂覆轉(zhuǎn)移孔(Transwell-COLTM，膠原涂覆PTFE膜，Costar(Corning，Inc.，Coming，NY)的下室中，從培養(yǎng)瓶中取出代系小于5的HUVEC，以1.0×106細(xì)胞/毫升懸浮在完全培養(yǎng)液200PRF中。將100μlHUVEC懸浮液加入到轉(zhuǎn)移孔的上室中。設(shè)立含培養(yǎng)液但無(wú)細(xì)胞的對(duì)照轉(zhuǎn)移孔，以測(cè)定FITC-BSA穿過(guò)膠原膜的最大轉(zhuǎn)移。將轉(zhuǎn)移孔在濕潤(rùn)的5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃孵育3天，以建立融合單層。第4天，用結(jié)晶紫(Sigma，St.Louis，MO；2.3％w/v，草酸銨0.1％w/v，乙醇，SD3A 20％v/v)染色單層，檢查融合。當(dāng)單層達(dá)到90％融合時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。
從轉(zhuǎn)移孔的上室中全部取出完全培養(yǎng)液200，將100μl含F(xiàn)ITC-BSA(1mg/ml)的完全培養(yǎng)液200加入到試驗(yàn)和對(duì)照轉(zhuǎn)移孔中。用鋁箔覆蓋培養(yǎng)板，30分鐘時(shí)，從轉(zhuǎn)移孔的下室中取出10μl樣品，置于具有透明底部的黑色96-孔板中。然后，補(bǔ)充10μl完全培養(yǎng)液至下室中。將40μl完全培養(yǎng)液200加入到黑色96-孔板中，混合。利用IL-2突變蛋白-熒光素(485/575nm，1.0s)進(jìn)行，樣品讀數(shù)?；跓晒鈴?qiáng)度讀數(shù)，再次分配轉(zhuǎn)移孔，對(duì)于90％融合或更高的融合單層，讀數(shù)應(yīng)低于6,000。孵育3小時(shí)后，培養(yǎng)板再次取樣，讀數(shù)，如上所述。3小時(shí)強(qiáng)度讀數(shù)作為基線或時(shí)間0時(shí)的讀數(shù)。
FITC-BSA從上室除去，將100μl含F(xiàn)ITC-BSA(1mg/ml)的試驗(yàn)化合物加入到上室中(1)IL-2突變蛋白F42E、Y107R或Proleukin(25nM)；(2)3天25nM IL-2-突變蛋白-刺激的PBMC上清液；(3)3天25nM IL-2-突變蛋白-刺激的LAK細(xì)胞；和(4)3天25nM IL-2-突變蛋白-刺激的LAK細(xì)胞的上清液。另外，采用0.05％皂苷作為陽(yáng)性對(duì)照(皂苷能破壞單層)，完全培養(yǎng)液200用作培養(yǎng)液對(duì)照。用鋁箔覆蓋培養(yǎng)板，37℃孵育。與試驗(yàn)化合物孵育3小時(shí)后收集樣品，熒光讀數(shù)，如上所述。
結(jié)果如圖1-4所示。所示數(shù)據(jù)例子為3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每種試驗(yàn)條件n＝5或6，圖中數(shù)據(jù)來(lái)自3位不同的正常人供體。如圖1A-1C所示，Proleukin-刺激的PBMC(LAK)和上清液導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞單層明顯損傷。在3位受試供體的2位中，與Proleukin相比，F(xiàn)42E和Y107R突變蛋白的VLS顯著降低。如圖2A-2C所示，3位受試供體的2位中，僅Proleukin-誘導(dǎo)的LAK細(xì)胞顯示超過(guò)培養(yǎng)液對(duì)照樣品的VLS顯著增加，但培養(yǎng)液對(duì)照與F42E或Y107R之間沒(méi)有顯著性差異。如圖3A-3C所示，僅來(lái)自IL-2-誘導(dǎo)的PBMC培養(yǎng)物上清液不足以在體外明顯誘導(dǎo)VLS綜合征。如圖4A-4C所示，僅Proleukine或F42E和Y107R都不能直接引起EC單層損傷。如圖1-4所示，單獨(dú)用F42E和Y107R之間，F(xiàn)42E-和Y107R-刺激的上清液之間，單獨(dú)用F42E-和Y107R-刺激的LAK細(xì)胞與培養(yǎng)液對(duì)照之間沒(méi)有顯著性差異。
因此，測(cè)定FITC-BSA穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞融合單層的滲透性的VLS的體外模型有效且一致。
因此，描述了用于預(yù)測(cè)IL-2突變蛋白患者耐受性的新型體外試驗(yàn)系統(tǒng)。雖然詳細(xì)描述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，但應(yīng)理解，不背離權(quán)利要求書(shū)所述的本發(fā)明精神和范圍，可進(jìn)行各種明顯改變。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)患者對(duì)選定的治療藥物耐受或不耐受的體外方法，所述方法包括(a)提供貼附于粘附基質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞融合單層；(b)使所述單層與以下成分接觸(i)所述選定的治療藥物或淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞制劑，其中，通過(guò)用所述治療藥物或所述LAK細(xì)胞的上清液激活外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生所述LAK細(xì)胞，和(ii)可檢測(cè)標(biāo)記的大分子，其中，當(dāng)所述單層保持完整時(shí)，所述融合單層可基本上保留所述可檢測(cè)標(biāo)記的大分子；(c)在所述單層的完整性受損時(shí)，在所述可檢測(cè)標(biāo)記的大分子能穿過(guò)所述融合單層和所述粘附基質(zhì)的條件下，孵育步驟(b)的所述單層一段時(shí)間；和(d)檢測(cè)穿過(guò)所述融合單層和所述粘附基質(zhì)的大分子，作為患者對(duì)所述治療藥物耐受或不耐受的指標(biāo)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療藥物是免疫治療劑、免疫毒素或小分子化學(xué)治療劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫治療劑是白介素-2(IL-2)突變蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述粘附基質(zhì)包括膠原基質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)皮細(xì)胞是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記的大分子是可檢測(cè)標(biāo)記的白蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記的白蛋白是標(biāo)記的牛血清白蛋白(BSA)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述BSA是熒光標(biāo)記的。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記是FITC。
10.一種預(yù)測(cè)患者對(duì)白介素-2(IL-2)突變蛋白耐受或不耐受的體外方法，所述方法包括(a)提供貼附于粘附基質(zhì)的內(nèi)皮細(xì)胞融合單層；(b)使所述單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞制劑，其中，通過(guò)用所述IL-2突變蛋白激活外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生所述LAK細(xì)胞，和(ii)可檢測(cè)標(biāo)記的大分子，其中，當(dāng)所述單層保持完整時(shí)，所述融合單層可基本上保留所述可檢測(cè)標(biāo)記的大分子；(c)在所述單層的完整性受損時(shí)，在所述可檢測(cè)標(biāo)記的大分子能穿過(guò)所述融合單層和所述粘附基質(zhì)的條件下，孵育步驟(b)的所述單層一段時(shí)間；和(d)檢測(cè)穿過(guò)所述融合單層和所述粘附基質(zhì)的大分子，作為患者對(duì)IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標(biāo)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述粘附基質(zhì)包括膠原基質(zhì)。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)皮細(xì)胞是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記的大分子是可檢測(cè)標(biāo)記的白蛋白。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記的白蛋白是標(biāo)記的牛血清白蛋白(BSA)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述BSA是熒光標(biāo)記的。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記是FITC。
17.一種涉及預(yù)測(cè)患者對(duì)白介素-2(IL-2)突變蛋白耐受或不耐受的體外方法，所述方法包括(a)提供貼附于粘附基質(zhì)如膠原基質(zhì)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的融合單層；(b)使所述單層與以下成分接觸(i)淋巴因子活化的殺傷(LAK)細(xì)胞制劑，其中，通過(guò)用所述IL-2突變蛋白激活外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生所述LAK細(xì)胞，和(ii)熒光標(biāo)記的白蛋白；(c)在所述單層的完整性受損時(shí)，在所述熒光標(biāo)記的白蛋白能穿過(guò)所述融合單層和所述粘附機(jī)制的條件下，孵育步驟(b)的所述單層一段時(shí)間；和(d)檢測(cè)穿過(guò)所述融合單層的熒光標(biāo)記的白蛋白，作為患者對(duì)所述IL-2突變蛋白耐受或不耐受的指標(biāo)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記的白蛋白是標(biāo)記的牛血清白蛋白(BSA)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記是FITC。
全文摘要
描述了預(yù)測(cè)患者對(duì)治療藥物如細(xì)胞因子、淋巴因子和免疫毒素的耐受性的方法。該方法利用血管滲透綜合征(VLS)體外模型來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)大分子蛋白質(zhì)通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)融合單層的作用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1930300SQ200580007070
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者曹穎, K·德尼斯-米澤, S·E·威爾森 申請(qǐng)人:希龍公司