專利名稱：葡萄白腐病生物芯片的制取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于葡萄白腐病早期診斷的生物芯片。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計算機科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。生物芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(CCD)對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程模擬計算機芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片技術(shù)。
生物芯片技術(shù)可以將極其大量的探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量的生物分子進行檢測分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量等不足。而且，通過設(shè)計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等，為“后基因組計劃”時期基因功能的研究及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供了強有力的工具，將會使新基因的發(fā)現(xiàn)、基因診斷、藥物篩選、給藥個性化等方面取得重大突破，為整個人類社會帶來深刻廣泛的變革。
生物芯片可應(yīng)用于基因表達水平的檢測、基因診斷、藥物篩選、個體化醫(yī)療、測序、生物信息學(xué)研究，目前生物芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物基因組圖譜、藥物篩選、中藥物種鑒定、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防等許多領(lǐng)域。它將為人類認(rèn)識生命的起源、遺傳、發(fā)育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設(shè)計和藥物開發(fā)中先導(dǎo)化合物的快速篩選和藥物基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐平臺。
隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，基因芯片在人類醫(yī)學(xué)傳染性疾病和遺傳病診斷上有廣泛應(yīng)用。疾病基因芯片診斷原理是從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。例如Affymetrix公司，把P53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。又如，Heller等構(gòu)建了96個基因的cDNA微陣，用于檢測分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用?，F(xiàn)在，肝炎病毒檢測診斷芯片、結(jié)核桿菌耐藥性檢測芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開始進入市場。診斷芯片因為具有對各類致病基因片段檢測效率高、早期診斷且待測樣品用量較少、極高的靈敏度、特異性、可靠性以及自動化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用等特點，備受關(guān)注。在疾病診斷方面，美國Affymetrix公司已利用基因芯片進行愛滋病(HIV)的研究工作，并有商業(yè)化的GeneChip HIV PRT診斷芯片上市，用于愛滋病的早期診斷。
然而，對葡萄白腐病基因芯片研究尚未見到。葡萄白腐病是葡萄生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害之一，每年葡萄白腐病造成的產(chǎn)量損失極大。由于不能做好前期病害診斷，導(dǎo)致后期大量化學(xué)農(nóng)藥使用，果品污染嚴(yán)重。研制葡萄白腐病生物芯片對該病早期診斷與防治，減少化學(xué)農(nóng)藥污染，生產(chǎn)出葡萄無公害產(chǎn)品非常有意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，提供可準(zhǔn)確地診斷早期白腐病的生物芯片。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案首先對葡萄白腐病菌進行基因序列測序，然后根據(jù)測序結(jié)果(GenBank DQ002875)，利用引物設(shè)計軟件(Primer Premeier)，測得葡萄白腐病菌探針5’-AAGACAGTGAACTATGCTTGTAT-3’，再經(jīng)過基片處理、芯片點制，封閉即成。
本發(fā)明的主要優(yōu)點有檢測樣品為葡萄白腐病菌基因片段，可提高檢測效率；能早期診斷病害，且待測樣品用量較少；具有極高的靈敏度、特異性和可靠性；自動化程度高，利于推廣應(yīng)用，對該病防治有直接的指導(dǎo)作用，應(yīng)用前景廣闊。


圖1是生物芯片的制備與樣品檢測流程；圖2是本發(fā)明實施生物芯片微陣列設(shè)計圖；
圖3是本發(fā)明實施生物芯片檢測葡萄白腐病菌樣品雜交掃描結(jié)果；圖4是本發(fā)明實施葡萄白腐病菌目標(biāo)基茵檢測點的雜交信號曲線。
具體實施例方式1、供試材料菌株葡萄白腐病菌，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。
試劑消化液(0.01M Tris·Cl，0.005M EDTA，0.5％SDS，50μg/ml蛋白酶K)，酚，氯仿，異戊醇，蛋白酶K，瓊脂糖，PCR試劑盒(Promega公司)手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(SIGMA)，dNTP(上海生工生物工程公司)，點樣液，洗脫液，雜交液。
儀器設(shè)備PCR擴增儀(Biometra Personal PCR system，USA)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(BIO-RAD Mini II，USA)，低溫離心機(SIGMA，USA)，生物芯片點樣儀(MG II600，BioRobotics Ltd，England)、激光掃描儀(Gene TACTMLS IV，GenomicSolutions Inc.USA)，數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(202-0，上海陽光實驗儀器有限公司)2、基因組DNA提取與定量刮取培養(yǎng)基上的葡萄白腐病菌菌落，置于2ml EP管中，加入消化液1ml，振蕩混合，37℃水浴30min。加入等體積酚—氯仿混合液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)，混勻，16000r/min離心5min，棄有機相，取上清。重復(fù)酚提取步驟，至兩相間無蛋白層。加入等體積氯仿，混勻，16000r/min離心5min，棄有機相，取上清。加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，顛倒搖動數(shù)次，于-20℃靜置1小時。16000r/min離心10min，70％乙醇洗滌，常溫干燥。加適量無菌去離子水溶解DNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用紫外分光光度法定量測定基因組DNA含量。在波長260nm及280nm處測定DNA樣品的吸光值，初步估計DNA樣品的純度。當(dāng)OD260/OD280≥1.8表示純度比較高。否則，表示純度不夠，必須重新抽提。根據(jù)1 OD260相當(dāng)于50μg/mldsDNA，估計各樣品濃度，加適量無菌菌去離子水調(diào)整各樣品濃度至約1μg/μl。
3、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增采用Primer Premeier軟件合成引物P1，P2，且引物P2進行5’端cy-5修飾，以便在PCR擴增的同時加入熒光標(biāo)記。擴增樣品。
P15’-ACGACCCGTCTTGAAACACG-3’ (20bases)P2-cy55’-GCCTCCACCAGAGTTTCCTCT-3’ (21bases)4、基因芯片的制備與樣品檢測基因芯片的制備與樣品檢測按流程進行。
5、基片處理和制備取20×20蓋玻片，于鉻酸溶液中浸泡12小時以上，蒸餾水洗凈，1N NaOH浸泡1小時，丙酮化3min。浸入手臂分子溶液(2％氨基丙基三乙氧基硅烷，以5％丙酮溶解)10min，丙酮清洗，烘烤固定，5％戊二醛中浸泡過夜。
6、探針設(shè)計根據(jù)葡萄白腐病菌樣品的測序結(jié)果(GenBank DQ002875)設(shè)計白腐探針，同時以無標(biāo)記引物的互補鏈作為陽性對照，以同等濃度探針緩沖液作為空白對照，以同等濃度的無關(guān)探針(指與靶序列無同源性或同源性很低的寡核苷酸序列)作為陰性對照。序列如下白腐探針5’-AAGACAGTGAACTATGCTTGTAT-3’ (23bases)陽性對照5’-TGCTGGGCAGAACTTTGTGC-3’ (20bases)陰性對照5’-ATGCTTACCGAATCCTTAGC-3’ (20bases)Tm值59.4-61℃。探針及引物合成均在英俊生物技術(shù)有限公司進行。
7、芯片點制將冷凍干燥的探針用0.2M碳酸鹽緩沖液稀釋至100μM。4℃保存?zhèn)溆谩?br> 將制備好的寡核苷酸探針分別加入384孔板，使用生物芯片點樣儀，制成預(yù)先設(shè)計好的微陣列。點樣中注意保持濕度70-80％，點樣后37℃水化過夜，80℃烤干固定，備用。
8、封閉與核酸雜交取制備好的生物芯片，用前以0.1％SDS洗去多余的未共價結(jié)合的探針。浸入5％二乙胺(0.01MPB，PH9)，室溫封閉30min，充分洗凈吹干。PCR產(chǎn)物加雜交液(10μl鮭魚精DNA溶于1ml 10×Denhart液)按1∶1稀釋混勻，取15μl覆蓋于各微陣列，加放經(jīng)疏水處理的蓋片。置入雜交艙中55℃保溫30min。
9、洗滌與檢測取出雜交芯片，除去蓋片。用預(yù)熱至60℃的洗液(濃度分別為1×SSC/0.1％SDS，0.5×SSC/0.1％SDS，0.1×SSC)進行梯度洗滌，各振蕩3min，ddH2O洗凈吹干。激光掃描儀掃描檢測雜交結(jié)果，用信噪比進行結(jié)果判斷。
10、不同菌種檢測分析采集葡萄白腐病菌樣品，經(jīng)過基因組DNA提取、PCR擴增(熒光標(biāo)記)，PCR產(chǎn)物加雜交液(10μl鮭魚精DNA溶于1ml 10×Denhart液)按1∶1稀釋混勻，取15μl覆蓋于各微陣列，加放經(jīng)疏水處理的蓋片。置入雜交艙中55℃保溫30min。洗滌吹干，分別在激光掃描儀掃描檢測雜交結(jié)果，觀察樣品的敏感性，并用信噪比對結(jié)果進行判斷。
權(quán)利要求
1.葡萄白腐病生物芯片的制取方法，其特征在于對葡萄白腐病菌進行基因序列測序，然后根據(jù)測序結(jié)果，利用引物設(shè)計軟件，測得葡萄白腐病菌探針5’-AAGACAGTGAACTATGCTTGTAT-3’，再經(jīng)過基片處理、芯片點制，封閉即成。
全文摘要
葡萄白腐病生物芯片的制取方法屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于葡萄白腐病早期診斷的生物芯片。本發(fā)明就是提供一種可準(zhǔn)確地診斷早期白腐病的生物芯片。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案首先對葡萄白腐病菌進行基因序列測序，然后根據(jù)測序結(jié)果(GenBank DQ002875)，利用引物設(shè)計軟件(PrimerPremeier)，測得葡萄白腐病菌探針5'－AAGACAGTGAACTATGCTTGTAT－3'，再經(jīng)過基片處理、芯片點制，封閉即成。
文檔編號C12Q1/04GK1978662SQ20051004787
公開日2007年6月13日 申請日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者劉長遠, 趙奎華, 趙雨杰, 馬佳明, 苗則彥, 梁春浩, 陳彥 申請人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所