專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用人角膜建立角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
高等動(dòng)物的角膜內(nèi)皮細(xì)胞層由單層六角形枝狀細(xì)胞鑲嵌而成，但這層細(xì)胞到成年后便失去分裂能力，受到輕度損傷時(shí)只有依靠鄰近細(xì)胞擴(kuò)張和移行來(lái)填補(bǔ)缺損區(qū)。一旦角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度低于維持內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的臨界密度，角膜將出現(xiàn)不可逆之病變。目前，我國(guó)約有近百萬(wàn)角膜內(nèi)皮盲患者，盡管他們絕大多數(shù)可以通過(guò)角膜移植來(lái)治愈，但由于捐獻(xiàn)角膜的數(shù)量極其有限而致使全國(guó)每年完成的角膜移植手術(shù)僅有2000～2500例，絕大多數(shù)患者因得不到移植角膜而無(wú)法重見(jiàn)光明。近年來(lái)興起的角膜組織工程，為人造眼角膜帶來(lái)了新的希望，但如何在體外獲得可用于人工角膜內(nèi)皮構(gòu)建的大量角膜內(nèi)皮細(xì)胞，一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和主攻方向之一。
對(duì)哺乳動(dòng)物角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究開(kāi)始于20世紀(jì)60年代，Slick WC等首次利用酶消化法獲得了家兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞并成功啟動(dòng)了其體外培養(yǎng)。隨后，學(xué)者們先后對(duì)兔、小鼠、大鼠、牛、豬、貓和人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)進(jìn)行了研究。后來(lái)，學(xué)者們又對(duì)不同哺乳動(dòng)物角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)一些生長(zhǎng)因子對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的促分裂作用，但離細(xì)胞系的建立還相距甚遠(yuǎn)。20世紀(jì)90年代，許多學(xué)者紛紛利用猿猴紅皰疹病毒、淋巴瘤病毒、猿猴紅皰疹病毒T抗原和不同癌基因等對(duì)人、兔和小鼠的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染研究，獲得了可傳代培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，甚至獲得了幾個(gè)不死的細(xì)胞系，但由于細(xì)胞攜帶腫瘤病毒基因或癌基因而具有潛在的致瘤性，而無(wú)法用于人工角膜的構(gòu)建和臨床角膜移植手術(shù)。因此，盡早建立起一種不經(jīng)過(guò)病毒或癌基因轉(zhuǎn)染的、可直接用于人工角膜構(gòu)建和臨床角膜移植手術(shù)的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系，已成為全世界眼科專(zhuān)家和細(xì)胞生物學(xué)家的主攻目標(biāo)，也是人工角膜構(gòu)建成功、臨床應(yīng)用以及造福全世界角膜盲患者的關(guān)鍵之所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是利用人角膜，提供一種建立人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的技術(shù)——一種人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
從眼庫(kù)中取出人角膜，分別用氯化汞溶液和慶大霉素消毒15～35分鐘；于超凈工作臺(tái)中，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，向凹陷區(qū)加入胰蛋白酶溶液消化數(shù)分鐘后；把角膜平均剪成4片角膜片，按內(nèi)皮面朝下的方向貼入24孔培養(yǎng)板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃下進(jìn)行貼板培養(yǎng)；再采用時(shí)間梯度連續(xù)揭膜培養(yǎng)法獲得人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，收集所得細(xì)胞后集中于2個(gè)培養(yǎng)孔中，于培養(yǎng)箱中放置12～24小時(shí)，將每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1毫升的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液，置5％二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)；每間隔3～5天更換上述專(zhuān)用培養(yǎng)液1次，以去除未貼壁的死細(xì)胞。待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成細(xì)胞懸液，按1瓶傳2瓶的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng)；待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以相同方法進(jìn)行傳代。
本發(fā)明采用的時(shí)間梯度連續(xù)揭膜培養(yǎng)法的具體操作為當(dāng)角膜片培養(yǎng)18～48小時(shí)后，取出角膜片轉(zhuǎn)貼于另一新培養(yǎng)孔中，加入同樣培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；于培養(yǎng)箱中12～24小時(shí)后，取出角膜片再轉(zhuǎn)貼于另一新培養(yǎng)孔中，加入同樣培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；6～12小時(shí)后，取出角膜片，于倒置光學(xué)顯微鏡下挑選出只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔。
所用人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液的配方為DMEM/F12培養(yǎng)液，20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸軟骨素，0.05‰～0.15‰羧甲基殼多糖；為了促進(jìn)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和快速增殖，本發(fā)明又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.01‰～0.02‰的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和0.01‰～0.02‰的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；為了獲得細(xì)胞的最佳增殖效果，本發(fā)明又在上述專(zhuān)用培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
經(jīng)這種方法所獲得的傳代細(xì)胞可傳60代以上，本發(fā)明所構(gòu)建的角膜內(nèi)皮細(xì)胞系現(xiàn)已傳至第106代。該細(xì)胞建系技術(shù)的主要特點(diǎn)是細(xì)胞系可以連續(xù)傳代，能提供出大量的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞系細(xì)胞未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染，沒(méi)有致瘤性，可直接應(yīng)用于人工角膜的研制和臨床應(yīng)用；應(yīng)用于人工角膜生產(chǎn)和臨床治療的成本低。
具體實(shí)施例方式
1、角膜片貼板培養(yǎng)的啟動(dòng)從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10～30毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗5～9分鐘；吸出生理鹽水后，加入10～30毫升的濃度為1/2000～1/6000的氯化汞溶液浸泡10～20分鐘，進(jìn)行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入10～30毫升的濃度為20％～70％的慶大霉素，浸泡15～35分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行二次消毒；以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，所有用品均是無(wú)菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，向凹陷區(qū)加入0.2～0.5％胰蛋白酶0.5～1毫升消化3～6分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把每個(gè)角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內(nèi)皮面朝下貼入24孔培養(yǎng)板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養(yǎng)孔中加入0.1～0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板放入5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃進(jìn)行培養(yǎng)；2、然后以時(shí)間梯度連續(xù)揭膜培養(yǎng)貼板培養(yǎng)24～48小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，加入0.1～0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)；12～24小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，再6～12小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各培養(yǎng)孔的細(xì)胞，挑選出只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔；3、人角膜內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)用滴管輕輕吹下上述只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，收集后集中放入2～4個(gè)培養(yǎng)孔中，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃放置12～24小時(shí)；4、人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液的配制取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液3.0毫升，然后依次加入硫酸軟骨素1～4毫克和羧甲基殼多糖0.2～0.6毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過(guò)濾除菌，加入0.8毫升胎牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液至4.0毫升，即為本發(fā)明的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液。
為了促進(jìn)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和快速增殖，在上述專(zhuān)用培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.01‰～0.02‰的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和0.01‰～0.02‰的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；為了建立人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的最佳增殖條件，本發(fā)明在上述專(zhuān)用培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上又添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
5、將每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專(zhuān)用培養(yǎng)液，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃培養(yǎng)；每間隔3～5天，除去舊培養(yǎng)液，以去除未貼壁的死細(xì)胞，加入1毫升新鮮的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液；6、人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.1～0.5毫升濃度為0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液，靜置消化3～5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專(zhuān)用培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底3～5分鐘制成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液；從每培養(yǎng)孔中分別取出0.5毫升角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每個(gè)培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述專(zhuān)用培養(yǎng)液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
實(shí)施例1從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗5分鐘；吸出生理鹽水后，加入10毫升的濃度為1/6000的氯化汞溶液浸泡10分鐘，進(jìn)行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入10毫升的濃度為20％的慶大霉素，浸泡15分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行二次消毒；以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，所有用品均是無(wú)菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，向凹陷區(qū)加入0.2％胰蛋白酶0.5毫升消化3分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把每個(gè)角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內(nèi)皮面朝下貼入24孔培養(yǎng)板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養(yǎng)孔中加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板放入5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃進(jìn)行培養(yǎng)。貼板培養(yǎng)24小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)；12小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)；6小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各培養(yǎng)孔的細(xì)胞，挑選出只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔。用滴管輕輕吹下只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，收集后集中放入2個(gè)培養(yǎng)孔中，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃放置12小時(shí)。取常規(guī)配制的DMEM/F12培養(yǎng)液3.0毫升，然后依次加入硫酸軟骨素1毫克和羧甲基殼多糖0.2毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過(guò)濾除菌，加入0.8毫升胎牛血清，補(bǔ)加常規(guī)配制的DMEM/F 12培養(yǎng)液至4.0毫升，即為人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液。將每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專(zhuān)用培養(yǎng)液，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃培養(yǎng)；每間隔3天，除去舊培養(yǎng)液，以去除未貼壁的死細(xì)胞，加入1毫升新鮮的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液。待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.1毫升濃度為0.2％的胰蛋白酶溶液，靜置消化3分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述專(zhuān)用培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底3分鐘制成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液；從每個(gè)培養(yǎng)孔中分別取出0.5毫升角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述專(zhuān)用培養(yǎng)液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
實(shí)施例2從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入30毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗9分鐘；吸出生理鹽水后，加入30毫升的濃度為1/2000的氯化汞溶液浸泡20分鐘，進(jìn)行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入30毫升的濃度為70％的慶大霉素，浸泡35分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行二次消毒；以下操作均均為無(wú)菌狀態(tài)；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，向凹陷區(qū)加入0.5％胰蛋白酶1毫升消化6分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把每個(gè)角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內(nèi)皮面朝下貼入24孔培養(yǎng)板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養(yǎng)孔中加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板放入5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃進(jìn)行培養(yǎng)。貼板培養(yǎng)48小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)；24小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)；12小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各培養(yǎng)孔的細(xì)胞，挑選出只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔。用滴管輕輕吹下只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，收集后集中放入4個(gè)培養(yǎng)孔中，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃放置24小時(shí)。在人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液中，又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.02‰的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和0.02‰的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，更有利于人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和快速增殖。將每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述培養(yǎng)液，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃培養(yǎng)；每間隔5天，除去舊培養(yǎng)液，以去除未貼壁的死細(xì)胞，加入1毫升新鮮的上述培養(yǎng)液。待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.5毫升濃度為0.5％的胰蛋白酶溶液，靜置消化5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底5分鐘制成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液；從每培養(yǎng)孔中分別取出0.5毫升角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述培養(yǎng)液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
實(shí)施例3從眼庫(kù)中取出2個(gè)完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入20毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗7分鐘；吸出生理鹽水后，加入20毫升的濃度為1/4000的氯化汞溶液浸泡15分鐘，進(jìn)行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入20毫升的濃度為50％的慶大霉素，浸泡20分鐘，于超凈工作臺(tái)中進(jìn)行二次消毒；以下操作均為無(wú)菌狀態(tài)；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，向凹陷區(qū)加入0.4％胰蛋白酶0.7毫升消化5分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點(diǎn)把每個(gè)角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內(nèi)皮面朝下貼入24孔培養(yǎng)板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養(yǎng)孔中加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；將培養(yǎng)板放入5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃進(jìn)行培養(yǎng)。貼板培養(yǎng)36小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)；18小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，再轉(zhuǎn)貼于同一塊24孔培養(yǎng)板的另一個(gè)新培養(yǎng)孔中，加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)；9小時(shí)后，用眼科鑷取出培養(yǎng)孔中的角膜片，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各培養(yǎng)孔的細(xì)胞，挑選出只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔。用滴管輕輕吹下只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，收集后集中放入3個(gè)培養(yǎng)孔中，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃放置18小時(shí)。在上述人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液中，又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.02‰的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0.02‰的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和0.005‰的牛眼生素，以滿(mǎn)足人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的最佳增殖條件。將每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述培養(yǎng)液，于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃培養(yǎng)；每間隔4天，除去舊培養(yǎng)液，以去除未貼壁的死細(xì)胞，加入1毫升新鮮的上述培養(yǎng)液。待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入0.3毫升濃度為0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液，靜置消化4分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養(yǎng)孔中加入1毫升的上述培養(yǎng)液，用滴管吹打培養(yǎng)孔底4分鐘制成人角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液；從每培養(yǎng)孔中分別取出0.5毫升角膜內(nèi)皮細(xì)胞懸液，分別加入到新的培養(yǎng)孔中，每培養(yǎng)孔補(bǔ)加上述培養(yǎng)液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，首先從眼庫(kù)中取出人角膜，分別用氯化汞溶液和慶大霉素消毒后置于超凈工作臺(tái)中，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，向凹陷區(qū)加入胰蛋白酶溶液消化數(shù)分鐘后；再把角膜平均剪成4片，按內(nèi)皮面朝下的方向貼入24孔培養(yǎng)板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃進(jìn)行貼板培養(yǎng)，并以時(shí)間梯度連續(xù)揭膜的培養(yǎng)方法將獲得的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中放置12～24小時(shí)，在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1毫升的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液，然后置5％二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)；每間隔3～5天更換人角膜內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液1次，待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成細(xì)胞懸液，按1瓶傳2瓶的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng)；待人角膜內(nèi)皮細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以相同方法進(jìn)行傳代。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是上述時(shí)間梯度連續(xù)揭膜的培養(yǎng)方法是將角膜片培養(yǎng)24～48小時(shí)后，取出角膜片轉(zhuǎn)貼于另一新培養(yǎng)孔中，加入同樣培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；于培養(yǎng)箱中12～24小時(shí)后，取出角膜片再轉(zhuǎn)貼于另一新培養(yǎng)孔中，再加入同樣培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；6～12小時(shí)后，取出角膜片，于倒置光學(xué)顯微鏡下挑選出只含有人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔中的角膜內(nèi)皮細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是所述人內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液配方為DMEM/F12培養(yǎng)液，以及20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸軟骨素和0.05‰～0.15‰羧甲基殼多糖。
4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征是上述人內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液中又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.01‰～0.02‰的人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和0.01‰～0.02‰的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征是在4中所述內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中還添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
全文摘要
一種人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，它是以角膜內(nèi)皮為材料，先將角膜內(nèi)皮面朝下進(jìn)行貼板培養(yǎng)，采用時(shí)間梯度連續(xù)貼膜法獲得純凈角膜內(nèi)皮細(xì)胞，在含20％胎牛血清、硫酸軟骨素氧化降解物、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、牛眼生素的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)；采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。該技術(shù)工藝科學(xué)合理，經(jīng)這種方法所獲得的傳代細(xì)胞目前已傳至第106代。本發(fā)明的角膜內(nèi)皮細(xì)胞未經(jīng)任何病毒或癌基因轉(zhuǎn)染，因此獲得的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有任何致瘤性，可望直接用于人工角膜生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1749393SQ20051004414
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者樊廷俊, 付永鋒, 叢日山, 湯志宏, 孫文杰, 于秋濤, 王晶, 趙君 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)