專利名稱：從嗜冷菌分離的低溫脂肪酶基因序列及其表達(dá)重組菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低溫脂肪酶的改造，具體講是一種從嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因序列及其表達(dá)重組菌株，其屬于酶基因和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明分離的低溫脂肪酶的DNA序列，設(shè)計了含有該低溫脂肪酶酶基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)相應(yīng)脂肪酶的重組菌株。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)的脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一種特殊的水解酶，其分解脂肪，催化分解三酸甘油酯，產(chǎn)生甘油酯，游離脂肪酸和甘油。脂肪酶是水溶性的，其催化反應(yīng)的特點是它們只能在異相系統(tǒng)，即在油(或脂)-水的界面上作用，對均勻分散的或水不溶底物不作用，即使有作用也極緩慢。因此脂肪酶也可以說是專門在異相系統(tǒng)，或水不溶系統(tǒng)的油(或脂)-水的界面上水解酯的酶。這一點在有機(jī)合成中合成手性中間體方面具有很多的優(yōu)越性，例如通常用化學(xué)催化劑金屬鈉或烷基醇鈉來加快?；诟视王シ肿娱g的遷移，但并無位置特異性，如用1，-3，-專一性脂肪酶催化時，?；w移限制在1，-3，-位上，可以生成化學(xué)法不能生產(chǎn)的特殊的甘油三酯混合物。由于具有不需要輔酶就能催化正逆反應(yīng)的優(yōu)點，近些年來，脂肪酶作為酯類化合物合成分解和酯交換的催化劑，已廣泛應(yīng)用于油脂水解、食品風(fēng)味和香味的改進(jìn)、皮革絹紡脫脂、低等油脂的改性及添加于洗滌劑中以提高去污能力。
現(xiàn)有技術(shù)披露，脂肪酶已從多種不同的微生物中分離，如青霉、白地霉、根霉菌、類產(chǎn)堿假單胞菌、假單胞菌[William等。其中多數(shù)脂肪酶的最適作用溫度在50℃左右，在低溫時酶活力很低。而低溫酶在低溫條件下具有極高的催化常數(shù)(Kcat)，較低和較穩(wěn)定的米氏常數(shù)(Km)，并以較低的活化能和低溫下的酶活力為主要特征。在某些領(lǐng)域低溫酶有著中溫酶所不可比擬的優(yōu)越性，種類多，來源不同的脂肪酶具有多方面不同性質(zhì)，從而導(dǎo)致微生物的脂肪酶各具特色的應(yīng)用范圍，因此低溫酶的應(yīng)用前景廣闊。因而需要持續(xù)不斷地開發(fā)新特性脂肪酶以更好地滿足工業(yè)需要。
關(guān)于脂肪酶基因已有專利和文獻(xiàn)報道，如Rey等報道了Fusarium venenatum的脂肪酶基因(美國專利US Patent 6,432,898，2002)；Lin等報道了Pseudomonaspseudoalcaligens的脂肪酶(美國專利US Patent 5,766,913，1998)；Claudia等報道了Candida rugosa的脂肪酶基因(歐洲專利，WO991438，1999)；Harumi等報道了Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(歐洲專利，EP0812910，1997)；Yuji等報道了Geotrichum candidum的脂肪酶基因(日本專利，JP2174680，1990)。薛燕芬等報道了嗜熱菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的高溫脂肪酶、其編碼基因序列及其用途的專利(CN 1500868A)是涉及一種編碼嗜熱厭氧菌MB4脂肪酶的DNA序列，還涉及含有該酶基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)相應(yīng)酶的重組菌株。該酶基因是高溫脂肪酶的基因；是采用Sanger雙脫氧法對高溫脂肪酶DNA片斷進(jìn)行了測序，測序結(jié)果顯示插入片斷含有一個長1209bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個由403個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的從嗜冷菌分離的低溫脂肪酶及其結(jié)構(gòu)基因、重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化重組菌體及其應(yīng)用，該基因表達(dá)產(chǎn)物脂肪酶在低溫條件下顯示活性，可應(yīng)用在洗滌業(yè)、食品加工、生物制藥、環(huán)境生物技術(shù)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。同時本發(fā)明提供了一種方法，即通過分子生物學(xué)手段，將本發(fā)明涉及的酶基因克隆到其他受體菌，由其他菌株或在其他培養(yǎng)條件下產(chǎn)生本發(fā)明涉及的脂肪酶。
本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，研制了一種從嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因。該基因具有序列表中SEQ N0.1所示的核苷酸序列，該核苷酸序列是由834bp組成的DNA片斷，在該核苷酸序列中有H-G與G-X1-S-X2-G兩個活性中心，該DNA片斷測序結(jié)果顯示插入片斷含有一個長834bp的開放閱讀框架。
所述的嗜冷菌(Moritella sp.)，其為采自于南極深海的嗜冷菌(Moritella sp.)，采集地點66°00′S，70°30′E，采集溫度0.113℃，采集深度1500m，深海水鹽度34.64‰。
一種從南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)分離的重組低溫脂肪酶。該重組脂肪酶的氨基酸序列與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少80-100％的同源性，該氨基酸序列是一個由278個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在該核苷酸序列中的H-G與G-X1-S-X2-G兩個活性中心周圍的所對應(yīng)氨基酸位點保守性很強，而對酶活的影響不大的其他氨基酸位點，可進(jìn)行氨基酸位點的替換，插入或缺失；該重組酶的分子量為32000道爾頓，該重組酶的反應(yīng)溫度為0-30℃，反應(yīng)pH值6-9。
一種轉(zhuǎn)化從南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因的重組大腸桿菌DH5αLIP。該重組大腸桿菌DH5αLIP的保藏號為CGMCC No.1287，分類命名大腸埃希氏菌，保藏日期2005.01.07；該重組菌含重組質(zhì)粒pLIP，插入的該質(zhì)粒DNA片斷的大小為3.5kb，該質(zhì)粒pLIP中含有序列表中SEQ NO.1所示的834bp的DNA片斷序列。
一種從南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因的轉(zhuǎn)化重組大腸桿菌DH5αLIP的制備方法；所述的方法步驟如下一、南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因組DNA的提取(1)按十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)，將培養(yǎng)好的南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)培養(yǎng)液按每管1ml～5ml分裝于1.5ml～10ml離心管中；(2)以8000rpm離心5～10min，取沉淀；(3)每管加入567μl pH8.0的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重懸；(4)然后每管加入30μl的10％SDS混勻，再3μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，于37℃溫育2～3小時；(5)每管加入100μl的5mol/L NaCl混勻，再每管加入80μl的十六烷基三甲基溴化銨/NaCl混勻，65℃水浴溫育10～20min；(6)每管加入等體積的、體積比為24∶1的氯仿/異戊醇，混合后，再12000rpm離心15～20min，將上清液轉(zhuǎn)入新管中；(7)每管加入等體積的、體積比為25∶24∶1的酚/氯仿/異戊醇，混合后離心；重復(fù)上述步驟直至界面無白色沉淀為止；(8)轉(zhuǎn)移上清液于另一新管中，加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃過夜，再置于4℃，12000rpm離心15min～25min。以預(yù)冷的70％的乙醇洗滌DNA沉淀，取沉淀；(10)取沉淀溶于含RNA酶的pH 8.0的TE緩沖液中，制成的南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因總DNA溶液，-20℃放置備用；二、脂肪酶基因的克隆(1)取上述一、(10)步的南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因總DNA溶液10～20μl，用限制酶Sau3AI部分酶切；(2)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫回收2～10kbDNA片斷；
(3)取2～4μl的經(jīng)Sau3AI酶解的DNA片斷；(4)取1～2μl經(jīng)BamHI酶解并脫磷酸化的質(zhì)粒pBluescript DNA；(該pBluescript載體的供應(yīng)商為Stratagene)。
(5)在20μl連接體系內(nèi)進(jìn)行連接反應(yīng)，該連接體系中含2μl的10×連接緩沖液，1μl的T4DNA連接酶，重蒸水補足20μl；該連接體系在16℃反應(yīng)10～16h，即連接到pBluescript載體上，得到重組質(zhì)粒pLIP；三、轉(zhuǎn)化含重組質(zhì)粒pLIP的大腸桿菌DH5αLIP(1)取-80℃保存的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞一管置冰上融化，同時將1.5ml離心管和電轉(zhuǎn)杯事先置冰上預(yù)冷30～60min；(2)用預(yù)冷的移液管槍尖轉(zhuǎn)移40μl感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞于預(yù)冷的1.5ml離心管中，小心加入1μl重組質(zhì)粒pLIP的DNA，于冰上靜置1～2min；(3)轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，輕輕拍擊該電轉(zhuǎn)杯杯壁并確認(rèn)沒有氣泡產(chǎn)生；(4)采用高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法設(shè)置伯樂電轉(zhuǎn)化儀的參數(shù)值DNA濃度50-100ng，按脈沖鍵一次；其中0.1cm杯對應(yīng)電轉(zhuǎn)化程序Ec1的電轉(zhuǎn)條件電壓1.8kV，電容強度18kV/cm，脈沖時間5毫秒；0.2cm杯對應(yīng)電轉(zhuǎn)化程序Ec2的電轉(zhuǎn)條件電壓2.5kV，電容強度12.5kV/cm，脈沖時間5毫秒；(5)迅速將電轉(zhuǎn)杯內(nèi)的轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，加入預(yù)冷的1ml LB培養(yǎng)液，于37℃，180～220rpm，培養(yǎng)1小時后準(zhǔn)備涂布平板；(6)將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，涂于含50μg/ml的氨芐青霉素Amp和三丁酸甘油酯的LB固體培養(yǎng)基上；(7)在25℃培養(yǎng)至長出肉眼可見的菌落，然后在4℃培養(yǎng)2～4天，菌落周圍有透明圈的即為陽性克隆；(8)取該陽性克隆在Amp-LB培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)2天，培養(yǎng)液經(jīng)活性測試該陽性克隆具有低溫脂肪酶活性；(9)對該陽性克隆菌落采用堿裂解法提取其重組質(zhì)粒，用BamHI水解重組質(zhì)粒；(10)經(jīng)電泳結(jié)果證實，該陽性克隆菌落有DNA片斷插入質(zhì)粒pLIP，含此重組質(zhì)粒pLIP的重組大腸桿菌，即為轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌DH5αLIP，其保藏號為CGMCC No.1287，保藏日期2005.01.07。
本發(fā)明的重組大腸桿菌DH5αLIP經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)后，經(jīng)常規(guī)制備方法獲得重組酶制劑，然后可應(yīng)用于1)食品加工利用本發(fā)明的重組脂肪酶分解油脂釋放出脂肪酸，增加或改進(jìn)食品的風(fēng)味、香味與質(zhì)構(gòu)。2)洗滌劑本發(fā)明的重組脂肪酶作為高活性生物催化劑，避免了三聚磷酸鈉作為助洗劑導(dǎo)致江河湖泊富營養(yǎng)化，給生態(tài)環(huán)境帶來危害的弊病。3)制藥本發(fā)明的重組脂肪酶作為藥物，該重組脂肪酶藥物可以幫助消化、降低血脂并治療局部炎癥；還可以作為臨床診斷的工具。4)制備化工產(chǎn)品和試劑利用本發(fā)明的重組脂肪酶催化的酯水解反應(yīng)、酯合成反應(yīng)或酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)可以制備許多有重要工業(yè)價值的化工產(chǎn)品。5)造紙工業(yè)用本發(fā)明的重組脂肪酶輔以纖維素酶和木質(zhì)素酶處理紙漿可以防止樹脂在干燥轉(zhuǎn)鼓上的沉淀，保證紙的產(chǎn)量和質(zhì)量，并減少處理樹脂化學(xué)品的用量。6)工具酶利用某本發(fā)明的微生物重組脂肪酶對酯鍵位置專一性及脂肪酸種類專一性，可以分析脂肪類的組成和構(gòu)型。7)脫脂利用本發(fā)明的重組脂肪酶對如皮革、皮毛、紡織、明膠等加工中的去脂，提高毛皮質(zhì)量。8)在谷氨酸發(fā)酵工業(yè)中，利用本發(fā)明的重組脂肪酶可以提高酵母細(xì)胞滲透性以提高谷氨酸的產(chǎn)量。9)在紡織印染工業(yè)中，利用本發(fā)明的重組脂肪酶還可以改善紡織品染色效果。10)利用本發(fā)明的重組脂肪酶添加于天然橡膠濃乳中，對提高橡膠的機(jī)械穩(wěn)定性有一定效果。11)利用本發(fā)明的重組脂肪酶該低溫脂肪酶對棕櫚油、豆油、花生油、葵花籽油等均有水解作用。
本發(fā)明的重組脂肪酶是一新型的低溫脂肪酶，屬于脂肪酶Class2家族中的一員。該新的重組脂肪酶的一級結(jié)構(gòu)與已知的脂肪酶的不同，與其他已報道的脂肪酶的氨基酸序列相比，相似性小于40％，與中高溫脂肪酶相比，作用溫度低。


及其
具體實施例方式
本發(fā)明的實施例結(jié)合附圖進(jìn)一步詳細(xì)描述如下圖1為本發(fā)明重組質(zhì)粒pLIP的構(gòu)建圖。
圖2為本發(fā)明重組低溫脂肪酶的活性與pH值的關(guān)系曲線。
圖3為本發(fā)明重組低溫脂肪酶的活性與作用溫度的關(guān)系曲線。
本發(fā)明的實施例體現(xiàn)了如下技術(shù)方案研制的一種從嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因。該基因具有序列表中SEQ NO.1所示的核苷酸序列，該核苷酸序列是由834bp組成的DNA片斷，在該核苷酸序列中有H-G與G-X1-S-X2-G兩個活性中心，該DNA片斷測序結(jié)果顯示插入片斷含有一個長834bp的開放閱讀框架。
所述的嗜冷菌(Moriteila sp.)，其為采自于南極深海的嗜冷菌(Moritella sp.)，采集地點66°00′S，70°30′E，采集溫度0.113℃，采集深度1500m，深海水鹽度34.64‰。
一種從南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)分離的重組低溫脂肪酶。該重組脂肪酶的氨基酸序列與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少80-100％的同源性，該氨基酸序列是一個由278個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在該核苷酸序列中的H-G與G-X1-S-X2-G兩個活性中心周圍的所對應(yīng)氨基酸位點保守性很強，而對酶活的影響不大的其他氨基酸位點，可進(jìn)行氨基酸位點的替換，插入或缺失；該重組酶的分子量為32000道爾頓，該重組酶的反應(yīng)溫度為0-30℃，反應(yīng)pH值6-9。
一種轉(zhuǎn)化從南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因的重組大腸桿菌DH5αLIP。該重組大腸桿菌DH5αLIP的保藏號為CGMCC No.1287，分類命名大腸埃希氏菌，保藏日期2005.01.07；該重組菌含重組質(zhì)粒pLIP，插入的該質(zhì)粒DNA片斷的大小為3.5kb，該質(zhì)粒pLIP中含有序列表中SEQ NO.1所示的834bp的DNA片斷序列。
實施例1.
(一)南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因組DNA的提取按Ausubel等描述的方法(CTAB法)，將培養(yǎng)好的嗜冷菌培養(yǎng)液1.5ml每管分裝于離心管中，8000rpm離心5分鐘，每管加入567μl TE緩沖液(pH8.0)，反復(fù)吹打使之重懸，然后加入30μl 10％SDS混勻，再加入3μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，于37℃溫育2小時。加入100μl 5M NaCl混勻，80μl CTAB/NaCl混勻，65℃水浴溫育10分鐘。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混合后，12000rpm離心15分鐘。轉(zhuǎn)移上清液于一新管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，混合后離心。重復(fù)上述步驟直至界面無白色沉淀為止。加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃沉淀DNA過夜。再置于4℃，12000rpm離心15min。以70％的乙醇(預(yù)冷)洗滌DNA沉淀。溶于含RNA酶的pH 8.0的TE中，-20℃放置備用。
(二)脂肪酶基因的克隆取前面所述的總DNA溶液10μl(約50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫回收2～10kbDNA片斷。取2μl(約5μgDNA)Sau3AI酶解DNA片斷與1μl(1μg)經(jīng)BamHI酶解并脫磷酸化的質(zhì)粒pBluescript DNA在20μl連接體系內(nèi)進(jìn)行連接反應(yīng)，其中含2μl(10×連接緩沖液)，1μ1T4DNA連接酶，14μl重蒸水。即連接到pBluescript載體上，得到重組質(zhì)粒pLIP；(三)轉(zhuǎn)化含重組質(zhì)粒pLIP的大腸桿菌DH5αLIP取-80℃保存的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞一管置冰上融化，同時將1.5ml離心管和電轉(zhuǎn)杯事先置冰上預(yù)冷30～60min；用預(yù)冷的移液管槍尖轉(zhuǎn)移40μl感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞于預(yù)冷的1.5ml離心管中，小心加入1μl重組質(zhì)粒pLIP的DNA，于冰上靜置1～2min；轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，輕輕拍擊該電轉(zhuǎn)杯杯壁并確認(rèn)沒有氣泡產(chǎn)生；采用高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法設(shè)置伯樂電轉(zhuǎn)化儀的參數(shù)值DNA濃度50-100ng，按脈沖鍵一次；其中0.1cm杯對應(yīng)電轉(zhuǎn)化程序Ec1的電轉(zhuǎn)條件電壓1.8kV，電容強度18kV/cm，脈沖時間5毫秒；0.2cm杯對應(yīng)電轉(zhuǎn)化程序Ec2的電轉(zhuǎn)條件電壓2.5kV，電容強度12.5kV/cm，脈沖時間5毫秒；迅速將電轉(zhuǎn)杯內(nèi)的轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，加入預(yù)冷的1ml LB培養(yǎng)液，于37℃，180～220rpm，培養(yǎng)1小時后準(zhǔn)備涂布平板；將轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，涂于含50μg/mlAmp(氨芐青霉素)，橄欖油與聚乙烯醇(PVA)的LB固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)至長出肉眼可見的菌落，然后在4℃培養(yǎng)4天，菌落周圍有透明圈的即為陽性克隆。陽性克隆在Amp-LB培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)2天，經(jīng)活性測試具有低溫脂肪酶活性。對陽性菌落采用堿法提取重組質(zhì)粒，用各種限制酶水解重組質(zhì)粒，根據(jù)電泳結(jié)果證實有DNA片斷插入質(zhì)粒，其大小約為4kb。含該DNA片斷的重組質(zhì)粒稱為pLIP，含此重組質(zhì)粒的重組大腸桿菌稱為大腸桿菌DH5αLIP。
此重組質(zhì)?？筛哳l轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)脂肪酶活性和抗氨芐性能。將重組質(zhì)粒中的DNA插入片斷用地高辛DNA標(biāo)記檢測試劑盒標(biāo)記，與嗜冷菌(Moritella sp.)的染色體DNA進(jìn)行Southern blot DNA雜交實驗，證實重組質(zhì)粒pLIP中插入的DNA片斷來自嗜冷菌(Moritella sp.)的染色體DNA。
采用Sanger雙脫氧法對此DNA片斷進(jìn)行了測序。測序結(jié)果顯示插入片斷含有一個長834bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個由278個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
實施例2.
本發(fā)明的重組大腸桿菌DH5αLIP表達(dá)的條件為25℃培養(yǎng)；獲得的重組菌E coli DH5αLIP的菌體懸于的菌體懸于磷酸緩沖液(pH7)中，利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為重組脂肪酶的粗酶液。此上清液70℃加熱15min，離心去除變性蛋白，上清酶液經(jīng)離子交換柱層析，羥基磷灰石吸附柱層析和PAGE制備電泳等步驟進(jìn)行純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測定此重組脂肪酶的基本特性。用SDS-PAGE測得的重組酶的分子量為32000道爾頓，與理論上推測的分子量(32800道爾頓)相似。獲得的重組酶經(jīng)活性測定，參照《生物化學(xué)實驗原理和方法》中脂肪酶的測定方法。該重組大腸桿菌DH5αLIP的酶蛋白具有低溫脂肪酶活性，反應(yīng)的作用溫度為0℃-30℃，最適作用溫度為30℃，在0℃仍可保持37％的相對酶活；該重組酶作用pH6～9的性質(zhì)，如附圖中的圖2，圖3所示。
實施例3.
應(yīng)用本發(fā)明的重組大腸桿菌DH5αLIP表達(dá)的重組脂肪酶水解橄欖油向50％的橄欖油溶液(用pH 7，0.2M的磷酸緩沖液配制)，加適量重組脂肪酶液，在30℃保溫，以每分鐘200轉(zhuǎn)攪拌16h。色譜法測得油相含有脂肪酸，水相含有甘油，說明重組脂肪酶可水解橄欖油產(chǎn)生甘油和脂肪酸。
實施例4.
對本發(fā)明的重組低溫脂肪酶提交ExPASy服務(wù)器執(zhí)行BLAST進(jìn)行同源性搜索，最終篩選到13條脂肪酶的氨基酸序列作為作為同源性分析的原始數(shù)據(jù)，序列相關(guān)信息見表1。
表1 同源性檢索搜索到的相關(guān)脂肪酶序列Table 1 lipase sequences by Blast searching

對上述13條氨基酸序列利用Bioedit軟件進(jìn)行比對分析結(jié)果如附后所示氨基酸序列。
從同源性分析比對的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的重組低溫脂肪酶基因序列之間的保守性較低，但活性位點的保守性很強，在這些活性位點周圍的氨基酸序列保守性也比較大，如圖中H-G與G-X1-S-X2-G兩個活性中心為所有脂肪酶所共有，且其周圍的氨基酸保守性也很強。其他位點的氨基酸對酶活的影響不大，可進(jìn)行替換，插入或缺失。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對于上述實施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的低溫脂肪酶基因的序列表SEQ NO.1<110>國家海洋局第一海洋研究所<120>從南極深海嗜冷菌分離的低溫脂肪酶基因序列及其表達(dá)重組菌株<130>DNA<140>Moritella sp.
ATG TCA GAA GTC TTC GCC ACA AAA ATT AAA AGT GTA AGC CAC CAC 45ACA GAG TTA CAT GTC GAT ATT GTC GGT GAC GGC CCA GAC TTA GTG 90TTA TTA CAT GGC TGG GGA TTA AAT AGC GCG TGC TGG CAA TCT ATT135GTT CCG TCA CTA TCT GCG CAT TAT CGA TTA CAT TTA GTT GAT CTA180CCT GGT TTT GGT TTT AGT CAT GAT AGT TAT TTT GCG AGT CGG TCG225CTG GCT GAT ATT ACT GAT GCA TTA GTT AAA GTT GTA CCT GAC AAT270GCC GTT TGG TTG GGT TGG TCG TTG GGT GGG TTG TGC GCT ACT CAT315TTT GCG CTA GTG CAT CCC CAA CGA GTT TCT GCA TTG GTG ACA GTC360
GCC AGT TCA CCT AAA TTC ATG GCT ACA TCA CAA GTG AAT GAA TCA405GCA GCT TGG CCT GGT ATT GCT GGA AAA GTA TTA GCG CAA TTC CAA450CAA CAG CTA AAA CAG AAT CTA TCA CAA ACT ATT AAT CGT TTT TTA495GCC ATT CAA GCG ATG GGC AGT GAA ACG GCT AAA CAA GAC ATT AAA540CAA TTA AAG TCT TTA TTA GCG GCA CGT CCG CAG CCG CAT GAA CAA585GCA TTA AGT AAC GGT TTA CGA TTA TTA GAG ACG GTG GAC TTA CGC630GGG CAG TTA GCT TCG TTA ACA ATG CCA TTT TAT CGC TGC TAT GGT675CGG TTA GAT TCG CTG GTG CCG CAA GCT ACA GTG GTG TGG ATG GAC720CGT TAT CTA CCG CAA TCA CCG AGT CTT ATA TTT AAA GCT TCT TCT765CAT GCG CCT TTT ATT TCA GAA CCG ATA CTT TTT GTT AAT AAA CTG810CAG GCA TTT ATT AA 834本發(fā)明的低溫脂肪酶氨基酸的序列表SEQ NO.2<210>2<211>PRT<212>Moritella sp.2-5-10-1Met Ser Glu Val Phe Ala Thr Lys Ile Lys Ser Val Ser His His 15Thr Glu Leu His Val Asp Ile Val Gly Asp Gly Pro Asp Leu Val 30Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ser Ala Cys Trp Gln Ser Ile 45Val Pro Ser Leu Ser Ala His Tyr Arg Leu His Leu Val Asp Leu 60Pro Gly Phe Gly Phe Ser His Asp Ser Tyr Phe Ala Ser Arg Ser 75Leu Ala Asp Ile Thr Asp Ala Leu Val Lys Val Val Pro Asp Asn 90Ala Val Trp Leu Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Cys Ala Thr His105Phe Ala Leu Val His Pro Gln Arg Val Ser Ala Leu Val Thr Val120Ala Ser Ser Pro Lys Phe Met Ala Thr Ser Gln Val Asn Glu Ser135Ala Ala Trp Pro Gly Ile Ala Gly Lys Val Leu Ala Gln Phe Gln150Gln Gln Leu Lys Gln Asn Leu Ser Gln Thr Ile Asn Arg Phe Leu165Ala Ile Gln Ala Met Gly Ser Glu Thr Ala Lys Gln Asp Ile Lys180Gln Leu Lys Ser Leu Leu Ala Ala Arg Pro Gln Pro His Glu Gln195
Ala Leu Ser Asn Gly Leu Arg Leu Leu Glu Thr Val Asp Leu Arg210Gly Gln Leu Ala Ser Leu Thr Met Pro Phe Tyr Arg Cys Tyr Gly225Arg Leu Asp Ser Leu Val Pro Gln Ala Thr Val Val Trp Met Asp240Arg Tyr Leu Pro Gln Ser Pro Ser Leu Ile Phe Lys Ala Ser Ser255His Ala Pro Phe Ile Ser Glu Pro Ile Leu Phe Val Asn Lys Leu270Gln Ala Phe Ile Asn Asn Ser Leu ***278本發(fā)明的重組低溫脂肪酶的氨基酸序列同源性分析比對結(jié)果
Fig Alignment of amino acid sequences from different mieroorganisms(各序號所代表的氨基酸序列為0-132-5-10-1；Chlorobium tepidum；Sulfolobusacidocaldarius；Psychrobac ter immobilis；Vibrio cholerae；Haemophilus influenzae；unculturedproteobacterium；unculturedbacterium 442；Streptococcussp.；Salmonellatyphi；Methanosarcina acetivorans；Mycoplasma pulmonis；Mycoplasma gallisepticum；Thermotoga maritime.Co保守域)。
權(quán)利要求
1.一種從嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因，其特征在于該基因具有序列表中SEQ NO.1所示的核苷酸序列，該核苷酸序列是由834bp組成的DNA片斷，在該核苷酸序列中有H-G與G-X1-S-X2-G兩個活性中心，該DNA片斷測序結(jié)果顯示插入片斷含有一個長834bp的開放閱讀框架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因，其特征在于所述的嗜冷菌(Moritella sp.)，其為采自于南極深海的嗜冷菌(Moritella sp.)，采集地點66°00′S，70°30′E，采集溫度0.113℃，采集深度1500m，深海水鹽度34.64‰。
3.一種從南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)分離的重組低溫脂肪酶，其特征在于該重組脂肪酶的氨基酸序列與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少80-100％的同源性，該氨基酸序列是一個由278個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在該核苷酸序列中的H-G與G-X1-S-X2-G兩個活性中心周圍的所對應(yīng)氨基酸位點保守性很強，而對酶活的影響不大的其他氨基酸位點，可進(jìn)行氨基酸位點的替換，插入或缺失；該重組酶的分子量為32000道爾頓，該重組酶的反應(yīng)溫度為0-30℃，反應(yīng)pH值6-9。
4.一種轉(zhuǎn)化從南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)分離的低溫脂肪酶基因的重組大腸桿菌DH5αLIP，其特征在于該重組大腸桿菌DH5αLIP的保藏號為CGMCC No.1287，分類命名大腸埃希氏菌，保藏日期2005.01.07；該重組菌含重組質(zhì)粒pLIP，插入的該質(zhì)粒DNA片斷的大小為3.5kb，該質(zhì)粒pLIP中含有序列表中SEQ NO.1所示的834bp的DNA片斷序列。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌DH5αLIP的制備方法，其特征在于所述的方法步驟如下一、南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因組DNA的提取(1)按十六烷基三甲基溴化銨法，將培養(yǎng)好的南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)培養(yǎng)液按每管1ml～5ml分裝于1.5ml～10ml離心管中；(2)以8000rpm離心5～10min，取沉淀；(3)每管加入567μl pH8.0的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重懸；(4)然后每管加入30μl的10％SDS混勻，再3μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，于37℃溫育2～3小時；(5)每管加入100μl的5mol/L NaCl混勻，再每管加入80μl的十六烷基三甲基溴化銨/NaCl混勻，65℃水浴溫育10～20min；(6)每管加入等體積的、體積比為24∶1的氯仿/異戊醇，混合后，再12000rpm離心15～20min，將上清液轉(zhuǎn)入新管中；(7)每管加入等體積的、體積比為25∶24∶1的酚/氯仿/異戊醇，混合后離心；重復(fù)上述步驟直至界面無白色沉淀為止；(8)轉(zhuǎn)移上清液于另一新管中，加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃過夜，再置于4℃，12000rpm離心15min～25min。以預(yù)冷的70％的乙醇洗滌DNA沉淀，取沉淀；(10)取沉淀溶于含RNA酶的pH 8.0的TE緩沖液中，制成的南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因總DNA溶液，-20℃放置備用；二、脂肪酶基因的克隆(1)取上述一、(10)步的南極深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因總DNA溶液10～20μl，用限制酶Sau3AI部分酶切；(2)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫回收2～10kbDNA片斷；(3)取2～4μl的經(jīng)Sau3AI酶解的DNA片斷；(4)取1～2μl經(jīng)BamHI酶解并脫磷酸化的質(zhì)粒pBluescript DNA；(5)在20μl連接體系內(nèi)進(jìn)行連接反應(yīng)，該連接體系中含2μl的10×連接緩沖液，1μl的T4DNA連接酶，重蒸水補足20μl；該連接體系在16℃反應(yīng)10～16h，即連接到pBluescript載體上，得到重組質(zhì)粒pLIP；三、轉(zhuǎn)化含重組質(zhì)粒pLIP的大腸桿菌DH5αLIP(1)取-80℃保存的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞一管置冰上融化，同時將1.5ml離心管和電轉(zhuǎn)杯事先置冰上預(yù)冷30～60min；(2)用預(yù)冷的移液管槍尖轉(zhuǎn)移40μl感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞于預(yù)冷的1.5ml離心管中，小心加入1μl重組質(zhì)粒pLIP的DNA，于冰上靜置1～2min；(3)轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，輕輕拍擊該電轉(zhuǎn)杯杯壁并確認(rèn)沒有氣泡產(chǎn)生；(4)采用高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法設(shè)置伯樂電轉(zhuǎn)化儀的參數(shù)值DNA濃度50-100ng，按脈沖鍵一次；其中0.1cm杯對應(yīng)電轉(zhuǎn)化程序Ec1的電轉(zhuǎn)條件電壓1.8kV，電容強度18kV/cm，脈沖時間5毫秒；0.2cm杯對應(yīng)電轉(zhuǎn)化程序Ec2的電轉(zhuǎn)條件電壓2.5kV，電容強度12.5kV/cm，脈沖時間5毫秒；(5)迅速將電轉(zhuǎn)杯內(nèi)的轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，加入預(yù)冷的1ml LB培養(yǎng)液，于37℃，180～220rpm，培養(yǎng)1小時后準(zhǔn)備涂布平板；(6)將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，涂于含50μg/ml的氨芐青霉素Amp和三丁酸甘油酯的LB固體培養(yǎng)基上；(7)在25℃培養(yǎng)至長出肉眼可見的菌落，然后在4℃培養(yǎng)2～4天，菌落周圍有透明圈的即為陽性克隆；(8)取該陽性克隆在Amp-LB培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)2天，培養(yǎng)液經(jīng)活性測試該陽性克隆具有低溫脂肪酶活性；(9)對該陽性克隆菌落采用堿裂解法提取其重組質(zhì)粒，用BamHI水解重組質(zhì)粒；(10)經(jīng)電泳結(jié)果證實，該陽性克隆菌落有DNA片斷插入質(zhì)粒pLIP，含此重組質(zhì)粒pLIP的重組大腸桿菌，即為轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌DH5αLIP，其保藏號為CGMCC No.1287，保藏日期2005.01.07。
全文摘要
本發(fā)明采自南極深海的嗜冷菌(Moritella sp.)分離的重組低溫脂肪酶基因。該基因核苷酸序列是由834bp組成的DNA片斷，該DNA片斷測序結(jié)果顯示插入片斷含有長834bp的開放閱讀框架。該重組低溫脂肪酶的氨基酸序列具有至少80－100％的同源性，是由278個氨基酸組成的蛋白質(zhì)；該重組低溫脂肪酶基因的重組大腸桿菌DH5αLIP的保藏號為CGMCC No.1287，保藏日期2005.01.07。該基因表達(dá)產(chǎn)物脂肪酶與中高溫脂肪酶相比作用溫度低，在低溫條件下顯示活性，該脂肪酶作為酯類化合物合成分解和酯交換的催化劑，可以廣泛應(yīng)用于油脂水解、食品風(fēng)味和香味的改進(jìn)、皮革絹紡脫脂、低等油脂的改性及添加于洗滌劑中以提高去污能力，因此可應(yīng)用在洗滌業(yè)、食品加工、生物制藥、環(huán)境生物技術(shù)等領(lǐng)域，并有著廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK1807641SQ200510043508
公開日2006年7月26日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者林學(xué)政, 黃曉航, 楊秀霞, 陳靠山 申請人:國家海洋局第一海洋研究所