專利名稱：一種l－亮氨酸高產菌及用其發(fā)酵法生產l－亮氨酸的制作方法
技術領域：
一種L-亮氨酸高產菌及用其發(fā)酵法生產L-亮氨酸，涉及一種抗磺胺胍和支鏈氨基酸結構類似物的L-亮氨酸高產菌及其選育方法和用該菌株發(fā)酵法生產L-亮氨酸，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
L-亮氨酸是常見18種氨基酸中的一種，也是人體8種必需氨基酸之一，在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)具有重要的用途。目前國內L-亮氨酸生產方法以蛋白水解提取法為主，如CN1056830C所公開的技術，其采用毛發(fā)水解制備胱氨酸，再從廢液中制備L-亮氨酸。由于天然蛋白質原料氨基酸組成復雜，提取工藝復雜，污染嚴重，收率較低，產品安全性差，極大的刺激了生物發(fā)酵法生產L-亮氨酸工藝技術的研究熱情。小野由紀子(小野由紀子，CN1072721C)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)埃希氏菌屬和棒桿菌屬，使所產生的細胞在反應液中同糖和醋酸或其鹽反應生成并積累L-亮氨酸27g/L。中野哲郎(中野哲郎，CN1100146C)利用對5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的埃希氏菌屬發(fā)酵生產L-亮氨酸，產酸率為3.9g/L。馬科維奇(馬科維奇，CN1222576A)選育出埃希氏菌屬的突變株(Valr，Alr，Hleur，Leur)的L-亮氨酸的產量為1.5～1.7g/L。張素珍(微生物學通報，1989，16(5)264～267)等選育的鈍齒棒狀桿菌突變株，產酸20g/L。宮錦薌(微生物學雜志，1988，8(1)22～25)利用亞硝基胍誘變處理黃色短桿菌，搖瓶發(fā)酵產酸達13.5g/L。齊秀蘭等(沈陽藥學院學報，1993，10(4)，279～285)利用紫外線、利福平、氯化鋰誘變黃色短桿菌的原生質體，篩選得到L-亮氨酸產生菌株，搖瓶產酸可達24.5g/L。劉黨生(沈陽藥學院學報，1993，10(1)41～44)篩選到一株α-氨基β-羥基戊酸和利福平抗性菌株，16升發(fā)酵罐中產酸可達21.8g/L。宋超先等(食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(3)61-65)選育的黃色短桿菌的突變株TK0303的搖瓶產酸可達28.3g/L。以上報道的L-亮氨酸的生產菌的產酸水平距工業(yè)化生產還有一定的距離，目前我國的氨基酸生產廠家尚無用發(fā)酵法生產的L-亮氨酸產品，國內市場銷售的L-亮氨酸全部是用提取法生產的。因此選育優(yōu)良的L-亮氨酸生產菌仍然是L-亮氨酸發(fā)酵的研究重點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提出一種磺胺胍和支鏈氨基酸結構類似物抗性的L-亮氨酸高產菌極其選育方法和用該菌發(fā)酵法生產L-亮氨酸。
本發(fā)明技術方案本發(fā)明提出生產L-亮氨酸的菌株，其名稱為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)JH-27，本菌株是以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032為出發(fā)菌株，分別經硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)和紫外(UV)誘變處理，在基本培養(yǎng)基中添加支鏈氨基酸的結構類似物，在完全培養(yǎng)基中添加磺胺胍，經培養(yǎng)篩選和復篩而得。對其進行抗性驗證，確證本菌株具有以下遺傳特性亮氨酸氧肟酸鹽抗性(LeuHxr)，抗性濃度為5～10g/L；2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)，抗性濃度為5～10g/L；α-氨基丁酸抗性(α-ABr)，抗性濃度為20～40g/L；、β-羥基亮氨酸抗性(β-HLr)，抗性濃度為10～15g/L；磺胺胍抗性(SGr)，抗性濃度為15～25g/L。
出發(fā)菌株出發(fā)菌株為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
誘變處理和篩選過程中所用的各種培養(yǎng)基組成為斜面和種子培養(yǎng)基葡萄糖1g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，NaCl2.5g，瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1L，pH7.0～7.2。
完全培養(yǎng)基葡萄糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，NaCl2.5g，瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1L，pH7.0～7.2。
基本培養(yǎng)基(MM)葡萄糖20g，硫酸銨10g，KH2PO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O0.4g，FeSO4·7H2O0.01g，MnSO4·H2O0.01g，VH200μg，VB1200μg，瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1L，pH7.0～7.2。
篩選培養(yǎng)基(CM)在MM培養(yǎng)基加支鏈氨基酸的結構類似物；在完全培養(yǎng)基的基礎上加磺胺胍。
發(fā)酵法生產L-亮氨酸所用的培養(yǎng)基組成為種子培養(yǎng)基葡萄糖20g，玉米漿25ml，硫酸銨2g，KH2PO4·3H2O1.5g，VH200μg，VB1300μg用自來水定容至1L。pH7.0～7.2。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖130～170g，玉米漿20～40ml，硫酸銨20～40g，KH2PO4·3H2O0.5～1.5g，MgSO4·7H2O0.2～0.6g，MnSO4·H2O0.05～0.15g，VH25～75μg，VB1250～350μg，CaCO320～40g，用自來水定容至1L，pH7.0～7.2。
將菌株以10～15％(W/W)接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在通氣條件下，以搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐通風培養(yǎng)，pH6～8；培養(yǎng)溫度30～35℃，培養(yǎng)時間為50～65小時，搖瓶培養(yǎng)轉速為200rpm，或發(fā)酵罐培養(yǎng)通氣量為3L/min，攪拌轉速為600rpm，L-亮氨酸在發(fā)酵罐中積累。
本發(fā)明的有益效果從谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032選育的磺胺胍和支鏈氨基酸結構類似物的抗性突變株谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)JH-27，表現出積累高水平L-亮氨酸的能力，這是由于相對于出發(fā)菌株來說解除了三支鏈氨基酸的反饋阻遏。用該菌已通過搖瓶水平和5L發(fā)酵罐水平的發(fā)酵法生產L-亮氨酸的試驗，L-亮氨酸的產量分別達到30～32g/L、40g/L，具有工業(yè)實用性價值。


圖1選育譜系圖。
生物材料樣品保藏一種生產L-亮氨酸的菌株，該菌株為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)JH-27，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC NO.1378，保藏日期為2005年5月24日。
具體實施例方式
實施例1 制備對亮氨酸氧肟酸鹽有抗性的突變株。
將出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032用硫酸二乙酯(1％，30℃，30分鐘)進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含5-10g/L的亮氨酸氧肟酸鹽的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對亮氨酸氧肟酸鹽有抗性的突變株，然后進行L-亮氨酸的發(fā)酵試驗，在這些突變株中，L-亮氨酸產量最高的突變株稱為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)L1-68，其L-亮氨酸的產量為8.9g/L。
實施例2 制備對2-噻唑丙氨酸有抗性的突變株。
將實施例1獲得的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)L1-68用硫酸二乙酯(1％，30℃，25分鐘)進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含5-10g/L的2-噻唑丙氨酸的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對2-噻唑丙氨酸有抗性的突變株，然后進行L-亮氨酸的發(fā)酵試驗，在這些突變株中，L-亮氨酸產量最高的突變株稱為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)L2-132，其L-亮氨酸的產量為13g/L。
實施例3 制備對α-氨基丁酸有抗性的突變株。
將實施例2獲得的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)L2-132用亞硝基胍(0.3％，30℃，45分鐘)進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含20-40g/L的α-氨基丁酸的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對α-氨基丁酸有抗性的突變株，然后進行L-亮氨酸的發(fā)酵試驗，在這些突變株中，L-亮氨酸產量最高的突變株稱為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)L3-206，其L-亮氨酸的產量為18g/L。
實施例4 制備對β-羥基亮氨酸有抗性的突變株。
將實施例3獲得的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)L3-206用亞硝基胍(0.3％，30℃，30分鐘)進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含10-15g/L的β-羥基亮氨酸的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對β-羥基亮氨酸有抗性的突變株，然后進行L-亮氨酸的發(fā)酵試驗，在這些突變株中，L-亮氨酸產量最高的突變株稱為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)L4-89，其L-亮氨酸的產量為25g/L。
實施例5 制備對磺胺胍有抗性的突變株。
將實施例4獲得的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)L4-89先用紫外(15W，30cm，6分鐘)進行常規(guī)誘變處理，再用亞硝基胍(0.2％，30℃，20分鐘)進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含15-25g/L的磺胺胍的完全培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對磺胺胍有抗性的突變株，然后進行L-亮氨酸的發(fā)酵試驗，在這些突變株中，L-亮氨酸產量最高的突變株稱為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)JH-27，其L-亮氨酸的為量為30～32g/L。
實施例6 以JH-27發(fā)酵法生產L-亮氨酸。
從新鮮斜面上接種一環(huán)JH-27菌種入種子培養(yǎng)基(25ml/500ml三角瓶)，在30℃，200rpm下培養(yǎng)14小時后，以10-15％接種量(V/V)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成如本說明書所述。
搖瓶培養(yǎng)500ml三角瓶內發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為20ml，轉速200rpm，發(fā)酵時間為60小時，L-亮氨酸的產量為30～32g/L。
實施例7 以JH-27在5L發(fā)酵罐合成L-亮氨酸。
斜面種子培養(yǎng)和發(fā)酵接種條件均同實施例6，5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L。通氣量為3L/min，攪拌轉速為600rpm，發(fā)酵溫度為30-35℃，發(fā)酵時間為50-55小時。L-亮氨酸產量為40g/L。
權利要求
1.一種生產L-亮氨酸的菌株，其分類命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)JH-27，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC NO.1378。
2.一種生產L-亮氨酸的菌株的選育方法，其特征是由谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032為出發(fā)菌株，分別經硫酸二乙酯、亞硝基胍和紫外誘變處理，再分別在基本培養(yǎng)基中添加支鏈氨基酸的結構類似物和在完全培養(yǎng)基中添加磺胺胍選育得到，(1)制備對亮氨酸氧肟酸鹽有抗性的突變株將出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032用1％硫酸二乙酯30℃，30分鐘進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含5-10g/L的亮氨酸氧肟酸鹽的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對亮氨酸氧肟酸鹽有抗性的突變株；(2)制備對2-噻唑丙氨酸有抗性的突變株將步驟(1)所獲突變株再用1％硫酸二乙酯30℃，25分鐘進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含5-10g/L的2-噻唑丙氨酸的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對2-噻唑丙氨酸有抗性的突變株；(3)制備對α-氨基丁酸有抗性的突變株將步驟(2)所獲突變株用0.3％亞硝基胍30℃，45分鐘進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含20-40g/L的α-氨基丁酸的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對α-氨基丁酸有抗性的突變株；(4)制備對β-羥基亮氨酸有抗性的突變株將步驟(3)所獲突變株用0.3％亞硝基胍30℃，30分鐘進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含10-15g/L的β-羥基亮氨酸的基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對β-羥基亮氨酸有抗性的突變株；(5)制備對磺胺胍有抗性的突變株將步驟(4)所獲突變株先用紫外15W，30cm，6分鐘進行常規(guī)誘變處理，再用0.2％亞硝基胍30℃，20分鐘進行常規(guī)誘變處理，然后涂布在含15-25g/L的磺胺胍的完全培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4天，挑取在此培養(yǎng)基上生長的菌落，作為對磺胺胍有抗性的突變株；在誘變處理和篩選過程中所用的培養(yǎng)基組成為完全培養(yǎng)基葡萄糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，NaCl2.5g，瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1L，pH7.0～7.2；基本培養(yǎng)基(MM)葡萄糖20g，硫酸銨10g，KH2PO4·3H2O1g，MgSO4·7H2O0.4g，FeSO4·7H2O0.01g，MnSO4·H2O0.01g，VH200μg，VB1200μg，瓊脂粉20g，用蒸餾水定容至1L，pH7.0～7.2。
3.一種用權利要求1所述方法培養(yǎng)得到的生產L-亮氨酸的菌株，其特征是該項菌株具有以下遺傳特性亮氨酸氧肟酸鹽抗性，抗性濃度為5～10g/L；2-噻唑丙氨酸抗性，抗性濃度為5～10g/L；α-氨基丁酸抗性，抗性濃度為20～40g/L；β-羥基亮氨酸抗性，抗性濃度為10～15g/L；磺胺胍抗性，抗性濃度為15～25g/L。
4.一種用權利要求1所述方法培養(yǎng)得到的生產L-亮氨酸的菌株發(fā)酵法生產L-亮氨酸的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖130～170g，玉米漿20～40ml，硫酸銨20～40g，KH2PO4·3H2O 0.5～1.5g，MgSO4·7H2O 0.2～0.6g，MnSO4·H2O0.05～0.15g，VH25～75μg，VB1250～350μg，CaCO320～40g，用自來水定容至1L，pH7.0～7.2；將菌株以10～15％接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在通氣條件下，以搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵通風培養(yǎng)，pH6～8；培養(yǎng)溫度30～35℃，培養(yǎng)時間為50～65小時，搖瓶培養(yǎng)轉速為200rpm，或發(fā)酵罐培養(yǎng)通氣量為3L/min，攪拌轉速為600rpm，L-精氨酸在發(fā)酵液中積累。
全文摘要
一種L－亮氨酸高產菌及用其發(fā)酵法生產L－亮氨酸，屬于生物工程技術領域。本發(fā)明的菌種為一種谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)JH－27，它由谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032為出發(fā)菌株，分別經硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)和紫外(UV)誘變處理，再分別在基本培養(yǎng)基中添加支鏈氨基酸的結構類似物和在完全培養(yǎng)基中添加磺胺胍選育得到，是一株抗磺胺胍和支鏈氨基酸結構類似物的L－亮氨酸高產菌，用該菌株發(fā)酵法生產L－亮氨酸，與出發(fā)菌株相比較，表現出積累高水平L－亮氨酸的能力。JH－27搖瓶培養(yǎng)60h，L－亮氨酸產量為30～32g/L。5L發(fā)酵罐發(fā)酵55小時，L－亮氨酸產量為40g/L。
文檔編號C12N1/20GK1702168SQ20051004043
公開日2005年11月30日 申請日期2005年6月6日 優(yōu)先權日2005年6月6日
發(fā)明者蔡立明, 寧健飛 申請人:無錫晶海氨基酸有限公司