專利名稱：五指山小型豬的一種分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及五指山小型豬的一種分子標記及其應用，特別涉及利用該分子標記鑒定五指山小型豬的方法。
背景技術：
五指山小型豬(WZSP)是我國特有的著名珍稀、瀕危豬種，該品種原產(chǎn)于海南省中部偏南的五指山區(qū)。到80年代僅存10余頭，瀕臨滅絕，后歷經(jīng)艱辛，在中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所異地保種成功，并被成功培育成近交系。由于豬和人在生理解剖、營養(yǎng)代謝、生化指標等特征上有較大的相似性，尤其是心血管系統(tǒng)結構與人更為相似(Peter J.M et al.Xenotransplantation.[J]British Medical Bulletin，1999，55(2)446-459，且WZSP具有體型小，遺傳穩(wěn)定，性成熟早，抗逆性強等特征，已成為人類理想的動物疾病模型及新藥療效、疫苗生產(chǎn)檢測的理想對象，尤其是人類異種器官移植的理想器官供體來源。目前，WZSP已被列為禁止出口品種和國家二類重點保護動物之一(Feng shu-tang.Chinese Wuzhishan Pig，1998.馮書堂.中國五指山豬，1998)。
當前利用微衛(wèi)星做種群鑒定的方法主要有最小距離法和最大似然法，用這兩種方法，可以計算某個體屬于某一種群的概率。Bjrnstad et al.對挪威馬進行個體聚類研究，其結果顯示當微衛(wèi)星座位在20個時，使用最大似然法，準確率可達98％以上(Bjrnstad et al.，Gunby E& Red K.H.Genetic structure of Norwegian horsebreeds.Journal of Animal Breeding and Genetics.2000，117，307-317。楊述林利用27個微衛(wèi)星DNA標記研究十八個中國地方豬品種遺傳多樣性時發(fā)現(xiàn)當選取最大似然法時，判別的準確率為98.45％-99.91％；而選取遺傳距離法時，判別的準確率為96.82％-99.30％(楊述林.十八個中國地方豬品種遺傳多樣性分析[博士學位論文].華中農(nóng)業(yè)大學，2004)。用以上兩種方法，都可以很好地對物種進行種群鑒定，但它們都存在所需微衛(wèi)星DNA標記多、實驗步驟繁瑣等方面的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供五指山小型豬的一種分子標記。
本發(fā)明所提供的五指山小型豬的分子標記，名稱為Sw936-88，具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中的序列1由88個堿基組成。
可利用由具有序列表中序列2的核苷酸序列和具有序列表中序列3的核苷酸序列組成的一對引物，以WZSP的基因組DNA為模板獲得該88bp的分子標記。
序列表中的序列2由21個堿基組成，序列表中的序列3由20個堿基組成。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種鑒定WZSP的方法。
本發(fā)明所提供的鑒定五指山小型豬的方法，是以待測豬的基因組DNA為模板，利用由具有序列表中序列2的核苷酸序列和具有序列表中序列3的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物中是否有一條88bp的條帶。
所述88bp條帶具有序列表中序列1的核苷酸序列。
如果擴增產(chǎn)物中有該88bp的條帶，則待測豬為WZSP。
所述擴增產(chǎn)物可通過15％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測。
姜盛花等人利用18個微衛(wèi)星DNA標記，對五指山小型豬(22頭)、香豬(28頭)、民豬(12頭)、大白豬(32頭)、長白豬(31頭)、杜洛克(32頭)、韓國民豬(31頭)、韓國大白豬(30頭)等8個品種218頭群體的進行研究，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星座位S0070的264、SW2的103、SW936的85僅在五指山小型豬中出現(xiàn)。本發(fā)明是在此基礎上，進一步以WZSP近交系及通城豬為材料，利用微衛(wèi)星座位S0070、SW2、Sw936進行檢測，結果得到一個新的WZSP近交系微衛(wèi)星特異性等位基因Sw936-88。該WZSP近交系是中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所由兩頭種豬(一公一母)通過高度近交的方式培育成的第17代近交系。根據(jù)微衛(wèi)星座位的突變頻率范圍(1.2×10-4-1.5×10-2)，經(jīng)過17代近親繁殖的WZSP近交系，其發(fā)生突變的概率基本上可以忽略不計。因此，認為WZSP近交系在微衛(wèi)星座位Sw936上的等位基因是它們的原始祖先(一公一母)所擁有的，并且世代相傳。實驗結果證明110頭WZSP近交系有70.9％個體中攜帶有分子標記Sw936-88，而其它10個品種(通城豬，杜洛克豬，長白豬，大白豬，大長通豬，長大通豬，香豬，民豬，韓國民豬和韓國大白豬)中均不攜帶分子標記Sw936-88，說明Sw936-88是WZSP種群鑒定的一個重要分子標記。本發(fā)明為更好地開發(fā)利用五指山小型豬和五指山小型豬近交系奠定了基礎。


圖1為WZSP近交系在微衛(wèi)星座位Sw936的部分電泳結果圖2為通城豬在微衛(wèi)星座位Sw936的部分電泳結果圖3為Sw936-88克隆測序結果及比較具體實施方式
下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、本發(fā)明的分子標記Sw936-88的獲得材料研究對象WZSP近交系是中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所由兩頭種豬(一公一母)通過高度近交的方式培育成的第17代近交系。WZSP近交系(110頭)的耳組織樣采自中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所五指山豬保種廠，通城豬(100頭)的血樣采自于湖北省通城縣畜牧局種豬廠。
引物擴增微衛(wèi)星座位Sw936的引物由上海博亞生物技術有限公司合成，其序列為正向引物5’TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC 3’(序列2)反向引物5’GTGCAAGTACACATGCAGGG 3’(序列3)按照文獻Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning.ALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York.1989的方法分別提取上述豬的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，在上述引物的引導下，分別進行PCR擴增，反應體系為20μl。其中模板DNA為30-50ng，10×緩沖液2μl，Mg2+2μl(15mMol/L)，dNTP 0.4μl(10mMol/L)，上下游引物各5pM，Tag酶1U。其中，10×緩沖液來自于TaKaRa Taq試劑盒(TaKaRa公司，CodeNo.DR100A)。反應條件為先95℃，5min；再94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，35個循環(huán)后，72℃延伸5min。擴增的產(chǎn)物經(jīng)3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取4μl在15％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上140V電壓電泳14-16h，銀染顯色。Fotodyne凝膠成像系統(tǒng)掃描并保存，Gel Analyzer軟件分析目的片段大小，以確認WZSP近交系特異性等位基因。WZSP近交系和通城豬的微衛(wèi)星電泳分型的比較結果表明微衛(wèi)星座位Sw936在WZSP近交系中具有特異性等位基因，大小為88bp。微衛(wèi)星座位Sw936在兩個群體中的部分電泳結果如圖1和圖2所示。圖1和圖2中，M為DNA分子量標記PBR322DNA/Hae III Markers。通過15％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，F(xiàn)otodyne凝膠成像系統(tǒng)掃描，Gel Analyzer軟件分析，在110頭WZSP近交系中，有77個個體在微衛(wèi)星座位Sw936含88bp的等位基因，所占比例為70.9％。
群體遺傳多樣性用POPGENE VERSION 1.31及PPAP 3.0軟件包分析。在WZSP近交系(110頭)中，計算含特異性等位基因的個體在群體中所占的比例。WZSP近交系在微衛(wèi)星座位Sw936的等位基因及頻率，與通城豬群體在微衛(wèi)星座位Sw936的固定指數(shù)(Fis，F(xiàn)it，F(xiàn)st)及均值分別如表1-2所示表1 WZSP近交系在微衛(wèi)星座位Sw936的等位基因及基因頻率

表2 WZSP近交系，通城豬在微衛(wèi)星座位Sw936的固定指數(shù)(Fis，F(xiàn)it，F(xiàn)st)

結果表明微衛(wèi)星座位Sw936上88bp大小的等位基因由于基因頻率(0.5)較高(表1)，與其它等位基因片段大小差距較大(圖1)，且在通城豬群體中進行驗證時，可以很清楚地看出其對應片段大小區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)此等位基因(圖2)，因而初步確認該88bp大小的等位基因為WZSP近交系的特異性等位基因。兩群體在微衛(wèi)星座位Sw936的固定指數(shù)Fst均值為0.3014(表2)，比太湖豬類群(0.182)(樊斌.微衛(wèi)星標記評估中國豬遺傳多樣性與標記輔助選擇效率若干制約因素的研究[碩士學位論文].華中農(nóng)業(yè)大學，1999，35)及歐洲11個品種(0.27)(Laval G.N，et al.Genetic diversity of eleven european pig breeds.Genet.Sel.Evol.2000，32187-203)都大，這說明兩群體在微衛(wèi)星座位Sw936的品種間分化程度很大。這個結果與兩群體間存在較大的地理位置分布及繁殖方式方面的差異密切相關，WZSP原產(chǎn)于海南省五指山區(qū)，在北京異地保種并被成功育成近交系，而通城豬產(chǎn)于湖北省通城縣且隨機交配。
為了進一步確認WZSP近交系特異性等位基因，使結果更具有嚴謹性。對此特異性等位基因進行了克隆測序。
用TaKara公司的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(瓊脂糖凝膠回收試劑盒)從凝膠中回收擴增產(chǎn)物，與pGEM-T Easy載體4℃連接12小時后，轉化大腸桿菌(DH5α)，挑取陽性克隆質(zhì)粒，菌落PCR檢測，菌液送上海博亞生物技術有限公司測序，測序結果與GenBank中的豬相應微衛(wèi)星座位的序列進行比較分析。結果如圖3所示，表明微衛(wèi)星座位Sw936上88bp等位基因比GenBank中(GenBankAccession NumberAF225107)微衛(wèi)星座位Sw936的等位基因(110bp)少11個重復單位(GT)(這11個重復單位(GT)在圖3中用下劃線表示。圖3中，A微衛(wèi)星座位Sw936上88bp等位基因克隆測序結果；BGenBank中微衛(wèi)星座位Sw936的序列(110bp))。GenBank公布的微衛(wèi)星座位Sw936的序列長度范圍為92-112bp，而本序列經(jīng)15％的非變性聚丙烯酰胺檢測、Gel Analyzer軟件分析、最后克隆測序證實為88bp。因此，此特異性等位基因是微衛(wèi)星座位Sw936的一個新等位基因。這說明在已研究的群體中，在微衛(wèi)星座位Sw936都沒有發(fā)現(xiàn)此88bp的等位基因，這給WZSP近交系在微衛(wèi)星座位Sw936上特異性等位基因的確認提供了有力的補充。
實施例2、分子標記Sw936-88的特異性按照實施例1的方法提取五指山小型豬(100頭)，杜洛克豬(50頭)，大白豬(50頭)，長白豬(50頭)，大長通豬(50頭)，長大通豬(50頭)，香豬(50頭)、民豬(50頭)、韓國民豬(50頭)和韓國大白豬(50頭)耳組織樣的基因組DNA，利用引物5’TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC 3’(序列2)和5’GTGCAAGTACACATGCAGGG 3’(序列3)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行15％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果表明在所檢測的100頭五指山小型豬中，有71頭含有88bp的特異條帶，而50頭杜洛克豬，50頭大白豬，50頭長白豬，50頭大長通豬，50頭長大通豬，50頭香豬，50頭民豬，50頭韓國民豬和50頭韓國大白豬中均無此條帶。按照實施例1的方法，對得到的所有88bp特異條帶進行測序，結果表明上述所有88條帶均具有序列表中序列1的核苷酸序列，均與分子標記Sw936-88的序列一致。
序列表<160>3<210>1<211>88<212>DNA<213>野豬屬豬(Sus scrofa domestica Brisson)<400>1tctggagcta gcataagtgc catcctctgg aaatacagaa gagcctgtgt gtgtgtgtgt60gtgtgtgtcc ctgcatgtgt acttgcac 88<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2tctggagcta gcataagtgc c 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gtgcaagtac acatgcaggg20
權利要求
1.五指山小型豬的一種分子標記，具有序列表中序列1的核苷酸序列。
2.一種鑒定五指山小型豬的方法，是以待測豬的基因組DNA為模板，利用由具有序列表中序列2的核苷酸序列和具有序列表中序列3的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物中是否有一條88bp的條帶。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述88bp條帶具有序列表中序列1的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述擴增產(chǎn)物通過15％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測。
5.獲得權利要求1所述的分子標記的引物，是由具有序列表中序列2的核苷酸序列和具有序列表中序列3的核苷酸序列組成的一對引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了五指山小型豬的一種分子標記及其應用，其目的是提供該分子標記和利用該分子標記鑒定五指山小型豬的方法。本發(fā)明所提供的五指山小型豬的分子標記具有序列表中序列1的核苷酸序列。利用該分子標記鑒定五指山小型豬的方法，是以待測豬的基因組DNA為模板，利用由具有序列表中序列2的核苷酸序列和具有序列表中序列3的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物中是否有一條88bp的條帶。本發(fā)明為更好地開發(fā)利用五指山小型豬和五指山小型豬近交系奠定了基礎。
文檔編號C12N15/11GK1827774SQ20051000899
公開日2006年9月6日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權日2005年2月28日
發(fā)明者馮書堂, 牟玉蓮, 李奎, 張莉, 顧茂松, 李贊東, 姜盛花 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所