專利名稱：源自甘薯的多重脅迫誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多重脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，更具體地，涉及源自甘薯(Ipomoea batatas)的多重脅迫誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子，用于生產(chǎn)包含所述啟動(dòng)子并具有增強(qiáng)的多重脅迫耐受性的轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)載體，由所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系和植物，以及用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景當(dāng)植物受到包括環(huán)境或來(lái)自病原菌、有害昆蟲、或病毒的生物脅迫時(shí)，作為生命的基本組分的內(nèi)部的氧變成諸如超氧陰離子自由基(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥基自由基等的活性氧類別(ROS)，引起嚴(yán)重的紊亂。為了減少所述活性氧，生命體具有諸如超氧化物歧化酶(SODEC 1.15.1.1)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的大分子抗氧化劑酶，和諸如維生素C、維生素E、谷胱甘肽等的低分子量抗氧化劑物質(zhì)。
過(guò)氧化物酶是一種在電子供體存在下還原過(guò)氧化氫的酶，并且大量地在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。由于它對(duì)酶反應(yīng)的高敏感性，過(guò)氧化物酶已被用作用于許多臨床測(cè)試的試劑。除了在工業(yè)上的重要性，由于它在植物抗外界脅迫的反應(yīng)中起著重要作用，過(guò)氧化物酶還引起科學(xué)家們的關(guān)注。一般而言，植物過(guò)氧化物酶的活性由各種環(huán)境脅迫增加。具體地，由于在巨大的氧化壓力下培養(yǎng)細(xì)胞，植物培養(yǎng)細(xì)胞表現(xiàn)出高過(guò)氧化物酶活性。按照早先的報(bào)道，過(guò)氧化物酶在甘薯培養(yǎng)細(xì)胞中大量產(chǎn)生，其多于在任何其它植物培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生(Phytochemistry，39，981-984，1995)。
到現(xiàn)在，編碼包含在一些具體的植物中的過(guò)氧化物酶的基因已在大約20種不同的植物物種中發(fā)現(xiàn)，諸如辣根屬(horseradish)、大麥屬、小麥屬、油菜屬、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草、菠菜屬、稻屬植物、等等。近來(lái)，已經(jīng)鑒定了擬南芥屬(Arabidopsis)的全堿基序列，其中73個(gè)過(guò)氧化物酶基因已被確定(Gene，288，129-138，2002)。然而，每一種單獨(dú)的過(guò)氧化物酶的功能還沒有得到解釋。本發(fā)明人首次報(bào)道了甘薯的過(guò)氧化物酶基因。具體地，本發(fā)明人已經(jīng)從甘薯培養(yǎng)細(xì)胞中分離了3種酸性過(guò)氧化物酶基因(swpa1，swpa2，swpa3)和一種中性過(guò)氧化物酶基因(swpn1)，并且報(bào)道了那些基因在甘薯培養(yǎng)細(xì)胞中特異性地表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)其在基因組中的多樣性，并且還確定過(guò)氧化物酶可以由具有一些部分或完整的過(guò)氧化物酶基因的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或植物穩(wěn)定地大量產(chǎn)生(Mol.Gen.Genet.，255，382-391，1997；Mol.Genet.Genet.，261，941-947，1999)。
在早先的研究中，本發(fā)明人分離了新的酸性過(guò)氧化物酶基因‘swpa4、‘swpa5、和‘swpa6’以及堿性過(guò)氧化物酶基因‘swpb1’、‘swpb2’和‘swpb3’，其堿基序列全部被公開(韓國(guó)專利申請(qǐng)#2003-28811；Mol.Genet.Genomics，261，941-947，2003)。Swpa4在甘薯培養(yǎng)細(xì)胞中強(qiáng)烈地表達(dá)，但是在正常植物組織中卻沒有表達(dá)。Swpa4不僅通過(guò)如病原菌(菊歐文氏菌(Pectobacterium chrysanhemi，KCTC 2569)的生物脅迫而且通過(guò)非生物脅迫進(jìn)行高度表達(dá)，其中所述非生物脅迫諸如創(chuàng)傷、通過(guò)產(chǎn)生活性氧而具有除草活性的甲基木精和過(guò)氧化氫、NaCl、茉莉酮酸甲酯、脫落酸、15℃的低溫和37℃的高溫、等等。
因此，本發(fā)明人已經(jīng)從甘薯分離了基因組DNA，其編碼不僅通過(guò)生物脅迫而且通過(guò)許多其它物理或化學(xué)脅迫而活躍地表達(dá)的過(guò)氧化物酶，并且通過(guò)確定所述過(guò)氧化物酶的啟動(dòng)子在工業(yè)中相當(dāng)有價(jià)值而完成了該發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種多重脅迫抗性的啟動(dòng)子序列，其包括由SEQ.ID.No 2代表的堿基序列。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于生產(chǎn)多重脅迫抗性的轉(zhuǎn)化子的表達(dá)載體，其包括上述啟動(dòng)子序列、靶物質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供多重脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其通過(guò)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物細(xì)胞而制備。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供多重脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物，其通過(guò)使用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物而制備。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于上述多重脅迫抗性轉(zhuǎn)基因植物的制備方法。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供包含SEQ.ID.No 2代表的堿基序列的多重脅迫抗性啟動(dòng)子序列。
本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生多重脅迫抗性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)載體，其包括上述啟動(dòng)子序列、靶物質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列。
本發(fā)明還提供多重脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其通過(guò)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物細(xì)胞而制備。
本發(fā)明還提供多重脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物，其通過(guò)使用農(nóng)桿菌用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物而制備。
本發(fā)明還提供用于上述多重脅迫抗性轉(zhuǎn)基因植物的制備方法。
“SWPA4啟動(dòng)子”是位于具有SEQ.ID.No 11代表的堿基序列的啟動(dòng)子的-1～-2433區(qū)域的堿基序列，并且在需要的條件下誘導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。
“SWPA4啟動(dòng)子的活性片段”是含有一些位于SEQ.ID.No 1代表的swpa4基因組基因序列的-1～-2433區(qū)的堿基序列的堿基序列，并且賦予基因與SWPA4啟動(dòng)子正確連接的活性。
“轉(zhuǎn)化子”意指用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的植物培養(yǎng)細(xì)胞系或植物，其中DNA構(gòu)建體由SWPA4啟動(dòng)子和編碼相關(guān)物質(zhì)的正確連接的DNA序列。
“多重脅迫”包含生物的或非生物的脅迫，例如，創(chuàng)傷、活性氧類別、熱、濕度、溫度、鹽、空氣污染、UV、重金屬、化學(xué)除草劑、病原菌、等等。
在下文中，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。
本發(fā)明提供多重脅迫抗性的啟動(dòng)子序列，其包括由SEQ.ID.No 2代表的堿基序列。
本發(fā)明的啟動(dòng)子序列優(yōu)選地選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組。由SEQ.ID.No 11代表的啟動(dòng)子序列是完整的啟動(dòng)子序列，其位于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(ATG)前，包含在源于甘薯的由SEQ.ID.No 1代表的過(guò)氧化物酶SWPA4基因組基因中。SEQ.ID.No 2，SEQ.ID.No 3，SEQ.ID.No 4，SEQ.ID.No 5，SEQ.ID.No 6，SEQ.ID.No 7，SEQ.ID.No 8，SEQ.ID.No 9和SEQ.ID.No 10都是片段序列，分別位于-110th，-177th，-306th，-366th，-433rd，-818th，-1199th，-1467th和-1934th位點(diǎn)，每個(gè)自完整SWPA4啟動(dòng)子序列的末端(恰好位于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)前)。
具有SEQ.ID.No 11代表的堿基序列的全長(zhǎng)SWPA4啟動(dòng)子包含各種真核啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件的特異區(qū)域，并且用于轉(zhuǎn)錄起始的TATA框(TATTTAA)位于-92nd～-86th位點(diǎn)。RSTGACTMANA，AP-1的共有序列，位于-431st和-421st之間，其中AP-1已知為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的附著位點(diǎn)和與活性氧類別反應(yīng)的主要元件(Lucibello，F(xiàn)C.等.，Oncogene，8，1667-1672，1993)。ELRE的共有序列，TTGACC(Rushton，PJ.等.，EMBO J，15，5690-5700，1996)，其表達(dá)通過(guò)由植物抗病原菌感染或創(chuàng)傷的防御機(jī)制產(chǎn)生的誘導(dǎo)子(elicitor)強(qiáng)烈地誘導(dǎo)，作為反向重復(fù)序列位于-2227和-2232之間以及-1329和-1334之間的區(qū)域。TAACGTA，GARE的共有序列，其表達(dá)由植物激素‘赤霉素’(GA)調(diào)節(jié)，位于-382和-376之間的區(qū)域(Sutoh，K.等.，Plant J，34，636-645，2003)。AWTTCAAA，ERE的共有序列，其表達(dá)由與果實(shí)成熟和老化相關(guān)的植物激素‘乙烯’調(diào)節(jié)，位于-192和-185之間的區(qū)域(Itzhaki，H.等.，Proc Natl Acad Sci USA，91，8925-8929，1994)。W-框，在其上附著了WRKY蛋白，該蛋白在通過(guò)水楊酸(SA)表達(dá)后在抵抗疾病中起著重要作用，以TTGAC重復(fù)位于-1993～-1989之間、和-1032～-1028之間的區(qū)域，并且還位于-2227～-2231之間和-1329～-1333之間的區(qū)域，這次作為反向重復(fù)(Yu，D.等.，Plant Cell，13，1527-1540，2001)。AGAAN，其為熱激元件(HSE)的共有序列，位于-182和-178之間的啟動(dòng)子區(qū)域(Fernandes，M.等.，Nucleic Acids Res，22，167-173，1994)(見

圖1a)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明人從包含在甘薯中由SEQ.ID.No 1代表的過(guò)氧化物酶SWPA4基因組基因制備由SEQ.ID.No 2～No 11代表的啟動(dòng)子序列，并制備了含有上述啟動(dòng)子的表達(dá)載體。通過(guò)用上述制備的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染煙草培養(yǎng)細(xì)胞還生產(chǎn)了含有各種大小的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞。通過(guò)使用煙草細(xì)胞的原生質(zhì)體研究啟動(dòng)子的活性。結(jié)果，由SEQ.ID.No 2～No 11代表的具有不同大小的缺失啟動(dòng)子片段，表現(xiàn)出與對(duì)照組的CaMV35S啟動(dòng)子相似的或高出4.5倍(但低于8.5倍)的更高啟動(dòng)子活性(見圖3a和3b)。通過(guò)使用農(nóng)桿菌將含有各種大小的缺失啟動(dòng)子片段的表達(dá)載體插入煙草葉片切口而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因煙草植物。然后，在切口處誘導(dǎo)脅迫。在誘導(dǎo)脅迫后研究啟動(dòng)子活性。結(jié)果，GUS的活性(包含在表達(dá)載體中的靶基因)在經(jīng)過(guò)病原菌、甲基紫精或引起創(chuàng)傷處理后增加了，至少為處理前的2倍(見表1)。因此，證明本發(fā)明由SEQ.ID.No2～No 11代表的啟動(dòng)子序列具有高于任一常規(guī)啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性，并且其活性由脅迫強(qiáng)烈地增強(qiáng)。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可以有效地用于開發(fā)環(huán)境脅迫抗性植物和通過(guò)利用由此獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞生產(chǎn)有價(jià)值的物質(zhì)。
本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)多重脅迫抗性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)載體，其包括上述啟動(dòng)子序列、靶物質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列。
包含在本發(fā)明的表達(dá)載體中的啟動(dòng)子序列優(yōu)選地選自由SEQ.ID.No2～No 11代表的堿基序列。
對(duì)于本發(fā)明的靶物質(zhì)，還優(yōu)選地包含具有藥用作用的各種蛋白或肽以及賦予轉(zhuǎn)化子脅迫抗性的任何其它物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將由SEQ.ID.No 2～No 11代表的啟動(dòng)子的每一序列克隆到由Clontech，Co.提供的質(zhì)粒載體pBI1221(CaMV35S啟動(dòng)子，包括GUS編碼序列和NOS轉(zhuǎn)錄終止子序列)構(gòu)建具有各種大小的缺失啟動(dòng)子的表達(dá)載體。按照啟動(dòng)子序列的長(zhǎng)度，將上述制備的每一個(gè)表達(dá)載體命名為‘p2433’、‘p1934’、‘p1467’、‘p1199’、‘p818’、‘p433’、‘p366’、‘p306’、‘p177’和‘p110’。GUS用作用于本發(fā)明的表達(dá)載體的靶基因。然而，GUS可以被任何其它目標(biāo)有價(jià)值物質(zhì)編碼序列取代，以構(gòu)建產(chǎn)生保持脅迫抗性的目標(biāo)有價(jià)值物質(zhì)的表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供通過(guò)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物細(xì)胞而制備的多重脅迫抗性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，以及通過(guò)使用農(nóng)桿菌用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物而制備的多重脅迫抗性轉(zhuǎn)基因植物。
為了制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物，所述表達(dá)載體優(yōu)選地包含選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的序列組成的組的啟動(dòng)子序列。為了生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，宿主細(xì)胞優(yōu)選地選自由煙草屬、諸如稻屬、甘薯等的主要農(nóng)作物、和包括人參屬的藥用植物組成的組。為了生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，宿主植物優(yōu)選地選自由煙草屬(tobacco)、諸如稻屬、甘薯等的主要農(nóng)作物、和包括人參屬的藥用植物組成的組。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用農(nóng)桿菌，將煙草(Nicotiana tabacum)的細(xì)胞用表達(dá)載體p110、p177、p306、p366、p433、p818、p1199、p1467、p1934和p2433轉(zhuǎn)染，每一個(gè)表達(dá)載體包含選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的序列組成的組的啟動(dòng)子序列，導(dǎo)致制成分別表達(dá)上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞。在這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，用表達(dá)載體p1467轉(zhuǎn)染的一個(gè)細(xì)胞系表現(xiàn)出最高的啟動(dòng)子活性，因此將其命名為‘p1467(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)細(xì)胞系’，并于2004年2月10日保藏在KRIBB(韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所)的KCTC(韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)(保藏號(hào)KCTC10594BP)。
本發(fā)明還提供多重脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，其包括下述步驟1)構(gòu)建表達(dá)載體，其含有選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組的每一啟動(dòng)子序列、目標(biāo)有價(jià)值物質(zhì)編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列；和2)使用農(nóng)桿菌用上述步驟1)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的應(yīng)用通過(guò)參考附圖而被最好地理解，其中圖1a和1b(圖1a的繼續(xù))顯示本發(fā)明源于甘薯的基因組基因SWPA4編碼過(guò)氧化物酶的堿基序列和從其翻譯的氨基酸序列。用(-)標(biāo)記的堿基序列部分是啟動(dòng)子序列(圖1a)，用堿基序列和氨基酸序列一起標(biāo)記的部分是外顯子以及只用堿基序列標(biāo)記的部分為內(nèi)含子(圖1b)。
圖2是顯示本發(fā)明的基因組基因SWPA4編碼過(guò)氧化物酶和用于產(chǎn)生包含缺失啟動(dòng)子的缺失突變體的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)的示意圖。E1、E2和E3是外顯子，以及I1和I2是內(nèi)含子。
圖3a是顯示使用缺失不同的啟動(dòng)子區(qū)域的缺失突變體(p2433，p1934，p1467，p1199，p818，p433)對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行研究的結(jié)果的圖表。
圖3b是顯示使用缺失不同的啟動(dòng)子區(qū)域的缺失突變體(p433，p366，p306，p177，p110)對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行研究的結(jié)果的圖表。測(cè)量CsMV 35S的啟動(dòng)子活性在圖3a和圖3b中作為對(duì)照。
實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)用的和目前優(yōu)選的實(shí)施方案如下述實(shí)施例中所示進(jìn)行舉例說(shuō)明。
然而，應(yīng)該理解，考慮到該公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行修飾和改進(jìn)。
實(shí)施例1甘薯源性的過(guò)氧化物酶基因組DNA SWPA4的分離和對(duì)其堿基序列的分析通過(guò)使用GenomWalker試劑盒(Clontech)按照制造者的用法說(shuō)明分離甘薯源性的過(guò)氧化物酶基因SWPA4的基因組DNA。將通過(guò)常規(guī)方法提取的2.5μg的甘薯基因組DNA用限制性內(nèi)切酶EcoRV、DraI、PvuII、SspI等進(jìn)行消化。將消化的基因組DNA用酚/氯仿/乙醇進(jìn)行純化。通過(guò)使用連接酶將純化的基因組DNA與試劑盒提供的銜接子連接構(gòu)建GenomWalker文庫(kù)?；谠撐膸?kù)，通過(guò)PCR獲得SWPA4基因組DNA。PCR用SEQ.ID.No 12代表的GSP1引物和SEQ.ID.No 13代表的銜接子引物AP1，通過(guò)使用上述基因組DNA作模板而進(jìn)行，其中GSP1引物是基于關(guān)于SWPA4 cDNA的5’-端堿基序列的信息而建立的，銜接子引物AP1由上述試劑盒提供。PCR反應(yīng)在94℃25秒和72℃4分鐘進(jìn)行誘導(dǎo)，重復(fù)7次，并且進(jìn)一步在94℃25秒和67℃4分鐘，重復(fù)32次。PCR后，進(jìn)行電泳以確定一些產(chǎn)物。將初級(jí)PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，PCR用SEQ.ID.No 14代表的GSP2引物和SEQ.ID.No 15代表的銜接子引物AP2而再一次進(jìn)行，其中GSP2引物基于關(guān)于甘薯源性的過(guò)氧化物酶SWPA4 cDNA的5’-端堿基序列的信息而制備(韓國(guó)專利申請(qǐng)#2003-28811)，銜接子引物AP2由試劑盒提供。PCR條件如下在94℃25秒和在72℃4分鐘(5個(gè)循環(huán))，在94℃25秒和67℃4分鐘(22個(gè)循環(huán))。然后，進(jìn)行電泳以確定PCR產(chǎn)物。將所述PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega)，并且研究堿基序列。SWPA4基因的外顯子區(qū)通過(guò)使用SEQ.ID.No 16代表的引物和SEQ.ID.No 13代表的銜接子引物AP1進(jìn)行擴(kuò)增，同樣地，SWPA4基因的內(nèi)含子區(qū)通過(guò)使用SEQ.ID.No 17代表的引物和SEQ.ID.No 15代表的銜接子引物AP2進(jìn)行擴(kuò)增。
按照如上所述相同的方法，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy載體，并且確定堿基序列，以便獲得由SEQ.ID.No 1代表的基因組基因的序列(圖1a和1b)，并且命名為‘SWPA4’。從甘薯基因組分離的SWPA4全長(zhǎng)為3945bp，并且由3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子和2433bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子組成。確定所述基因組基因的外顯子的堿基序列與SWPA4 cDNA的堿基序列一致(韓國(guó)專利申請(qǐng)#2003-28811)，并且每個(gè)內(nèi)含子的5’起始于GT和其3’終止于AG，表明其遵守GT-AG法則(圖1a，1b和圖2)。
實(shí)施例2過(guò)氧化物酶基因組DNA SWPA4的啟動(dòng)子活性研究野生型SWPA4的啟動(dòng)子由SEQ.ID.No 11代表的堿基序列組成，其在從過(guò)氧化物酶SWPA4基因組DNA的翻譯起始點(diǎn)的上游到-2433bp點(diǎn)的范圍內(nèi)(圖1a和1b)。SWPA4啟動(dòng)子堿基序列的特征通過(guò)使用由計(jì)算生物學(xué)和信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Computational Biology & Informatics Laboratory)提供的PLACE和Transfac進(jìn)行研究。
結(jié)果，確定SWPA4啟動(dòng)子具有各種真核啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)元件，并且用于翻譯起始的TATA-框位于-92～-86之間(Zhu，Q.等.，Plant Cell，14，795-803，2002)。RSTGACTMANA(Lucibello，F(xiàn)C.等.，Oncogene，8，1667-1672，1993)，AP1的共有序列，其已知為與活性氧反應(yīng)的相關(guān)因子并且轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白附著在其上，位于-431～-421之間。TTGACC(Rushton，PJ.等.，EMBO J，15，5690-5700，1996)，ELRE的共有序列，其通過(guò)植物中抗微生物感染或創(chuàng)傷的防御機(jī)制產(chǎn)生的誘導(dǎo)子強(qiáng)烈地誘導(dǎo)基因表達(dá)，被發(fā)現(xiàn)作為反向重復(fù)序列位于-2227～-2232之間，和-1329～-1334之間。TAACGTA(Sutoh，K.等.，Plant J，34，636-645，2003)，GARE的共有序列，其表達(dá)由植物中的一種植物激素赤霉素(GA)調(diào)節(jié)，位于-382～-376之間。AWTTCAAA(Itzhaki，H.等.，Proc Natl Acad Sci USA，91，8925-8929，1994)，ERE的共有序列，其表達(dá)由一種植物激素-乙烯調(diào)節(jié)，位于-192～-185之間，所述植物激素-乙烯與植物的成熟和老化有關(guān)。W-框(Yu，D.等.，PlantCell，13，1527-1540，2001)，在其上附著了WRKY蛋白，該蛋白通過(guò)水楊酸(SA)表達(dá)，在抵抗疾病中起著重要作用，以TTGAC重復(fù)位于-1993和-1989之間與-1032和-1028之間的兩個(gè)區(qū)域，并且作為反向重復(fù)序列位于-2227和-2231之間與-1329和-1333之間的另外兩個(gè)區(qū)域。AGAAN(Fernandes，M.等.，Nucleic Acids Res，22，167-173，1994)，應(yīng)答于熱激反應(yīng)的HSE(熱激元件)的共有序列，位于啟動(dòng)子-182和-178之間(圖1a)。
如上文所解釋，本發(fā)明的SWPA4啟動(dòng)子包含許多識(shí)別包括ROS的各種脅迫的重要因子，以致其可以有效地用于開發(fā)抵抗環(huán)境脅迫的脅迫抗性植物。
實(shí)施例3SWPA4啟動(dòng)子的缺失突變體的制備<3-1>2433bp～433bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子的缺失突變體的制備為了制備本發(fā)明的SWPA4啟動(dòng)子的缺失突變體，將SWPA4啟動(dòng)子區(qū)通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其使用ExTaq聚合酶(Takara)和序列特異性引物。此時(shí)，SEQ.ID.No 18和No 24代表的引物用于擴(kuò)增2433bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子，SEQ.ID.No 19和No 24代表的引物用于擴(kuò)增1934bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子，SEQ.ID.No 20和No 24代表的引物用于擴(kuò)增1467bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子，SEQ.ID.No21和No 24代表的引物用于擴(kuò)增1199bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子，SEQ.ID.No 22和No 24代表的引物用于擴(kuò)增818bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子，以及SEQ.ID.No 23和No 24代表的引物用于擴(kuò)增433bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子。將所有上游引物(SEQ.ID.No 18-No 23)制備成包含HindIII限制性內(nèi)切酶區(qū)域，并且將下游引物(SEQ.ID.No 24)制備成包含XbaI限制性內(nèi)切酶區(qū)域(圖2)。
將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HindIII/XbaI消化后，將DNA片段亞克隆到已經(jīng)用相同的限制性內(nèi)切酶消化的pBI221質(zhì)粒載體中(Clontech，CaMV35S啟動(dòng)子，包括GUS編碼序列和NOS轉(zhuǎn)錄終止子)。最后，制備了不同長(zhǎng)度的缺失突變質(zhì)粒載體，其每一個(gè)都具有SWPA4啟動(dòng)子的不同缺失構(gòu)建體(-2433，-1934，-1467，-1199，-818，和-433)，并且命名為‘p2433’，‘p1934’，‘p1467’，‘p1199’，‘p818’和‘p433’。
<3-2>少于433bp的啟動(dòng)子缺失突變體的制備為了制備具有少于433bp的啟動(dòng)子的缺失突變體，將-433bp長(zhǎng)的DNA片段通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，其使用ExTaq聚合酶(Takara)和序列特異性引物，導(dǎo)致長(zhǎng)度分別為433，366，306，177和110bp的缺失啟動(dòng)子片段。此時(shí)，SEQ.ID.No 25和No 24代表的引物用于擴(kuò)增366bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子，SEQ.ID.No 26和No 24代表的引物用于擴(kuò)增177bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子，SEQ.ID.No 28和No 24代表的引物用于擴(kuò)增110bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子。將所有上游引物(SEQ.ID.No 25-No 28)設(shè)計(jì)成具有PstI限制性內(nèi)切酶區(qū)域。
實(shí)施例4使用煙草原生質(zhì)體研究SWPA4啟動(dòng)子活性(瞬時(shí)測(cè)定)通過(guò)利用SWPA4啟動(dòng)子的缺失突變體，按照缺失啟動(dòng)子的長(zhǎng)度，研究所述啟動(dòng)子的活性。首先，將煙草培養(yǎng)細(xì)胞系BY-2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright yellow 2)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)開始后3天，將細(xì)胞離心，以僅僅獲得細(xì)胞膜，然后將其用酶溶液(30ml，1％纖維素酶R-10，0.25％marcerozyme R-10，60mg MES，30mg BSA，400mM甘露糖醇，1mMCaCl2，蒸餾水28ml)處理3小時(shí)。將原生質(zhì)體通過(guò)離心分離。將分離出的原生質(zhì)體用W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，5mM葡萄糖，1.5mM MES-KOH，pH 5.0)洗滌2次，并且將終細(xì)胞濃度在MaMg溶液中(0.4M甘露糖醇，0.1％MES，15mM MgCl2，pH 5.6)調(diào)節(jié)到2×106個(gè)細(xì)胞/ml。將5μg熒光素酶表達(dá)載體(將Luc編碼區(qū)插入pBI221以作內(nèi)部控制，Clontech)、300μl原生質(zhì)體溶液和300μl PEG溶液(40％PEG 3350，100mM Ca(NO3)2，400mM甘露糖醇)全部與10μg每種<實(shí)施例4>中制備的缺失突變體質(zhì)粒載體DNA混合，將其在室溫放置30分鐘。將所述混合物通過(guò)離心用W5溶液洗滌，并懸浮在300μl W5溶液中，接著在25℃繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。一完成培養(yǎng)，將細(xì)胞收集下來(lái)以研究熒光素酶和GUS的活性。具體地，熒光素酶的活性通過(guò)使用Promega提供的熒光素酶測(cè)定試劑盒進(jìn)行研究，和通過(guò)測(cè)量產(chǎn)生的GUS蛋白的量研究GUS啟動(dòng)子在插入缺失突變體質(zhì)粒載體的原生質(zhì)體中的活性，其按照J(rèn)efferson等使用MUG作為底物檢驗(yàn)熒光的方法(Jefferson等，Plant Mol.Biol.，5，387-405，1987)進(jìn)行。還通過(guò)同時(shí)測(cè)量插入到原生質(zhì)體的熒光素酶的活性研究了質(zhì)粒插入原生質(zhì)體的效率。
結(jié)果，-2433SWPA4啟動(dòng)子表現(xiàn)出比CaMV35S啟動(dòng)子高約5.3倍的活性。與對(duì)照相比，-1934和-1467啟動(dòng)子表現(xiàn)出約8.5倍更高的活性和-1199啟動(dòng)子表現(xiàn)出約7.5倍，-818啟動(dòng)子表現(xiàn)出約5.1倍，和-433啟動(dòng)子表現(xiàn)出約4.8倍更高的活性(圖3a)。基于該結(jié)果，可以設(shè)想抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)位于-2433和-1934之間，并且促進(jìn)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)位于表現(xiàn)出最高活性的-1467和活性開始下降的轉(zhuǎn)折點(diǎn)-818之間。將具有比CaMV35S啟動(dòng)子更高的活性的-433啟動(dòng)子重新制備成更短的缺失結(jié)構(gòu)，然后研究其活性。結(jié)果，所述更短的缺失突變體的活性減少了并且在-177達(dá)到與CaMV35S啟動(dòng)子活性相似的水平。因此，可以保持比CaMV35S更高的SWPA4活性的最小啟動(dòng)子長(zhǎng)度為301bp，并且相信誘導(dǎo)強(qiáng)SWPA4活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)合區(qū)位于-306和-177之間(圖3b)。
實(shí)施例5關(guān)于GUS基因在轉(zhuǎn)基因植物中通過(guò)使用SWPA4啟動(dòng)子的表達(dá)的分析<5-1>轉(zhuǎn)基因植物的制備將煙草植物(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)用作制備轉(zhuǎn)基因植物的材料。只將包含SWPA4啟動(dòng)子缺失突變體的質(zhì)粒載體p2433、p1467和p433的啟動(dòng)子區(qū)用HindIII和XbaI消化，將其插入到預(yù)先用相同的限制性內(nèi)切酶消化而獲得的pBI121(Clontech)中，制成植物表達(dá)載體。將CaMV35S啟動(dòng)子插入作為對(duì)照。通過(guò)使用根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Agrobacteriumtumefaciens LBA4404)(ATCC)將上述制備的每一種載體插入到農(nóng)桿菌中，然后，用其感染煙草葉片片段。將感染的葉片片段在含有200mg/l卡那霉素和300mg/l claforan的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Murashige T和Skoog F，Physiol Plant，15，473-497，1962)。然后，選擇轉(zhuǎn)基因植物，將其通過(guò)生根和發(fā)芽使其適應(yīng)水土。將該植物移植在小花盆中并且可以用作測(cè)試材料。
為了確定SWPA4啟動(dòng)子缺失突變體是否正確地插入到轉(zhuǎn)基因植物中，進(jìn)行了PCR，其使用1對(duì)由SEQ.ID.No 29和No 30代表的NPTII引物以及1對(duì)由SEQ.ID.No 23和No 24代表的用于擴(kuò)增433bp啟動(dòng)子的引物。當(dāng)使用1對(duì)NPTII引物時(shí)，PCR在95℃1分鐘，在65℃1分鐘和在72℃1分鐘(30個(gè)循環(huán))進(jìn)行。當(dāng)使用用于擴(kuò)增433bp啟動(dòng)子的1對(duì)引物時(shí)，PCR在95℃1分鐘，在62℃1分鐘和在72℃1分鐘(30個(gè)循環(huán))進(jìn)行。PCR之后在瓊脂糖上進(jìn)行電泳以確定PCR產(chǎn)物。
結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)到由NPTII引物對(duì)擴(kuò)增的0.7kb DNA片段和由用于擴(kuò)增433bp啟動(dòng)子的引物對(duì)擴(kuò)增的433bp DNA片段。因此，確定外來(lái)基因成功地插入到轉(zhuǎn)基因植物中。
<5-2>通過(guò)脅迫研究GUS存轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)為了研究轉(zhuǎn)基因植物中SWPA4啟動(dòng)子經(jīng)環(huán)境脅迫的表達(dá)，將所述轉(zhuǎn)基因植物用甲基紫精(下文中稱為‘MV’)和病原菌處理，并且還將之損傷以測(cè)量由此誘導(dǎo)的GUS活性。
首先，研究了由創(chuàng)傷引起的SWPA4啟動(dòng)子的表達(dá)。具體地，將轉(zhuǎn)基因植物損傷，然后測(cè)量由此誘導(dǎo)的GUS活性。此時(shí)，認(rèn)為在CaMV35S啟動(dòng)子植物中的GUS活性為100％，在SWP44啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植物中的GUS活性用相對(duì)活性代表。結(jié)果，當(dāng)將其中插入含有CaMV35S啟動(dòng)子-GUS基因的pBI121載體的轉(zhuǎn)基因植物不用任何物質(zhì)處理時(shí)(意為‘對(duì)照’)，GUS活性(pmol/分鐘/mg蛋白)為7,200±135，其幾乎不被如創(chuàng)傷的脅迫改變。在分別插入p2433、p1467和p433載體的轉(zhuǎn)基因植物的情形下，創(chuàng)傷后3天GUS的表達(dá)極大地提高了。GUS在用p1467載體感染的轉(zhuǎn)基因植物中通過(guò)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)，比在CaMV35啟動(dòng)子中的表達(dá)高2.5倍。GUS在用p2433載體感染的轉(zhuǎn)基因植物中通過(guò)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)，不能與CaMV35S啟動(dòng)子中的表達(dá)相競(jìng)爭(zhēng)，但是GUS在用p433感染的轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)同在CaMV35S啟動(dòng)子中的表達(dá)一樣多(表1)。因此，可以確定啟動(dòng)子活性可以被創(chuàng)傷誘導(dǎo)。
還研究了SWPA4啟動(dòng)子通過(guò)MV誘導(dǎo)的表達(dá)。具體地，從成熟的葉片上取直徑為7mm的葉片圓盤。將20個(gè)圓盤分別漂浮在含有3μM MV溶液的培養(yǎng)皿中，將其在25℃在黑暗中培養(yǎng)12小時(shí)，然后又在光照下培養(yǎng)。一完成培養(yǎng)，測(cè)量GUS活性以研究SWPA4啟動(dòng)子通過(guò)MV誘導(dǎo)的表達(dá)。結(jié)果，光照培養(yǎng)12小時(shí)后，所述啟動(dòng)子的表達(dá)在SWPA4缺失啟動(dòng)子植物中受到強(qiáng)烈地誘導(dǎo)。GUS在用p1467載體感染的轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，比在CaMV35S啟動(dòng)子中的表達(dá)高2.5倍。并且，與在CaMV35S啟動(dòng)子中的表達(dá)相比，GUS在用p2433和p433感染的轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)分別提高1.8倍和2.1倍(表1)。
另外，用在煙草植物中引起猛烈的疾病(wild fire disease)的病原菌(Pseudomonas syringae cv.Tabaci)感染轉(zhuǎn)基因煙草植物，該轉(zhuǎn)基因煙草植物中插入過(guò)氧化物酶基因組基因SWPA4啟動(dòng)子的缺失突變體。48小時(shí)后，測(cè)量誘導(dǎo)的GUS活性。結(jié)果，與在CaMV35S啟動(dòng)子中的表達(dá)相比，GUS在用p2433、p1467和p433感染的轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)分別提高2.2倍、2.7倍和2.0倍(表1)。因此，與對(duì)照中的活性相比，在所有3種轉(zhuǎn)基因植物的情形中GUS的活性極大地增加了。
<表1>
在轉(zhuǎn)基因煙草植物中通過(guò)創(chuàng)傷、甲基紫精(MV)處理和病原菌(Pseudomonas syringae cv.tabaci)處理引起的GUS活性變化
考慮上述所有結(jié)果，確定SWPA4啟動(dòng)子的活性由非生物的或生物的脅迫高度誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明的SWPA4啟動(dòng)子可以有效地用于開發(fā)工業(yè)的多重脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施例6通過(guò)使用SWPA4啟動(dòng)子研究GUS在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中的表達(dá)
<6-1>轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)細(xì)胞的制備為了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)細(xì)胞，將其中插入外來(lái)基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(callus-inducing medium)中培養(yǎng)，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過(guò)添加0.1mg/l BAP、2mg/l NAA和30g/l蔗糖到MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中而制備，并且通過(guò)常規(guī)步驟在其上誘導(dǎo)愈傷組織。具體地，使用分別用轉(zhuǎn)化載體p2433、p1934、p1467、p1199、p818、p433、p366、p306、p177和p110感染的轉(zhuǎn)基因煙草葉片誘導(dǎo)愈傷組織。在這些愈傷組織中，用p1467(-1467缺失啟動(dòng)子)載體感染的愈傷組織表現(xiàn)出最高的啟動(dòng)子活性，將其命名為‘p1467(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)細(xì)胞系’，并于2004年2月10日保藏在韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(保藏號(hào)KCTC 10594BP)。
<6-2>轉(zhuǎn)基因愈傷組織中啟動(dòng)子活性的研究為了研究本發(fā)明SWPA4啟動(dòng)子的表達(dá)可以怎樣影響或調(diào)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞增殖，測(cè)量了分別用p2433、p1467、p433和pBI121感染的轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中的GUS活性。GUS活性的測(cè)量按照上述相同的步驟進(jìn)行。
結(jié)果，含有SWPA4啟動(dòng)子的植物培養(yǎng)細(xì)胞的GUS活性(pmol/分鐘/mg蛋白)為12,000±250，該值是相對(duì)含有CaMV 35S啟動(dòng)子的培養(yǎng)細(xì)胞的GUS活性的百分比(％)。所有GUS活性在轉(zhuǎn)基因愈傷組織中都高于在具有CaMV 35S啟動(dòng)子的細(xì)胞中，并且特別地，用p1467感染的愈傷組織表現(xiàn)出比具有CaMV 35S啟動(dòng)子的愈傷組織高約4.7倍的活性。分別用p2433和p433感染的愈傷組織，分別表現(xiàn)出比對(duì)照高3.1倍和2.5倍的活性(表2)。因此，證明SWPA4啟動(dòng)子可以有效用于開發(fā)可用于生產(chǎn)高價(jià)值(high-value)蛋白的工業(yè)轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)細(xì)胞系。
<表2>
轉(zhuǎn)基因煙草培養(yǎng)細(xì)胞(愈傷組織)的GUS活性。
工業(yè)適用性如在上文中所解釋的，過(guò)氧化物酶基因組基因SWPA4的啟動(dòng)子包括許多特異性識(shí)別大量環(huán)境脅迫的區(qū)域，并且具有比CaMV 35S啟動(dòng)子高至少8倍的啟動(dòng)子活性，所述CaMV 35S啟動(dòng)子廣泛地用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物中靶基因的表達(dá)。因此，其中插入了本發(fā)明的啟動(dòng)子的植物或植物培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用促進(jìn)環(huán)境脅迫抗性植物的開發(fā)以及大量生產(chǎn)有價(jià)值的物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因生物體的開發(fā)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解在前述描述中公開的構(gòu)思和具體實(shí)施方案可以容易地被用作用于修飾或設(shè)計(jì)實(shí)施本發(fā)明相同目的的其它實(shí)施方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該理解所述等價(jià)的實(shí)施方案并不背離如在附加權(quán)利要求中提出本發(fā)明的精神和范圍。
用于專利程序的國(guó)際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約國(guó)際表格微生物保藏證明按照細(xì)則Rule 7.1發(fā)行致郭尚洙韓國(guó)生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yuseong-gu，Daejeon，305-333，韓國(guó)
序列表<110>韓國(guó)生命工學(xué)研究院<120>源自甘薯的多重脅迫誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子<130>4fpo-02-03<160>30<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1512<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<400>1atggcttcct ttgtcactcg gctcagcctg gcccttagct tcatcgccct agccctagct 60ggcttctcca tttaccagaa tacccataca gccatgaaag ggcagcttaa gctcacccca 120aagtggctgc tagacaacac tctagagtcg tcagtggccg acgtgctctc actacgccta 180ggcatctcct ccggcaagct ttccgacgaa gactgcatat tctccgccgt taaggaagtg 240gtggacgccg ccattgatgc agaaacccgc atgggtgctt ccctcattcg cctcttcttc 300catgactgct ttgttgatgt acgtacgcta attttgtacg atgatgtttt tttttttttt 360tttttttttc ccactgcatt atattaggaa attaaacaga ttgaaatgtg tgttattaat 420gtattatctg cagggttgtg acgcaggtct tctactaaac gatacaccta ctttcaccgg 480agaacagacc gccggcggca ataataactc agtcagaggt tttgaggtga tacaacaagc 540taaagagaat gtgataacca aatgtcccta catacaagta tcttgtgccg acatcttatc 600cattgctgcc cgtgattctt tccagagagt aagtccattt atttctaaag gttgaaatta 660ataagaacaa gaatccaaac aaataacaga cagtaaaaaa aaaagattta tgtggtttga 720caatatgttg aaattgtttt tatatttaat gactagtatt tatgcattat atttatatgc 780aactctaaac atgcagttta ctggagaaac gtacaccgtg actctgggaa gactcgatgc 840aagaacggcg aaccttaccg gagctaacac ccaactcgtc ggaccaaacg aggaattggc 900atcgcaagtc gagaaatttg cggcgaaagg gttctccgaa acggagctag tcgccttgtt 960aggtgttcac acggttgggt tttcgagatg tccgctttta tgcgttccca ttttcatcaa 1020tcccgcccgg gcctccacgc tgcaatgcaa ctgtccggtg agtcccgacg acaccgggct 1080ggtgggcctg gaccccactc cgttgacgtg ggaccaaagt ttttactccg acgtggctaa 1140
cggacaaggg cttctgttct ccgacaacga gctgatgaat agcaacacca ccagcgccgc 1200cgttaggagg tacagggacg agatggacgc ttttctcgcc gatttcgccg ccgccatggt 1260gaagatgagc ctcctgccgc cgtcccccgg agtggagctc gaaatccgag aggtttgcag 1320cgaggtgaat gccaacacag ttgcatccat gtgaagttcg ttcccatcga catcaataac 1380gtctgtgatt ctgtgaaagt tttactcgga ctgtgaagaa ttttcacttt ctgttgtttc 1440tgaaataaaa aagatttttt ttttatgtcc taacaaaact tgtattactg aataaaattt 1500ataaatttgt ta 1512<210>2<211>110<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(110)<223>-110缺失啟動(dòng)子<400>2tttccctttc aagttctcta tttaaggaag cctgagaagc cattaatcct catcatcagc60tcgaccactc atttcttctt catacttcct ttgctgtgat aatcatcatc 110<210>3<211>177<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(177)<223>-177缺失啟動(dòng)子<400>3aaattaaatc tcagtttgct ttattatatt attatcaaca ataataattt aatactgatc 60gaagaacttt ccctttcaag ttctctattt aaggaagcct gagaagccat taatcctcat 120catcagctcg accactcatt tcttcttcat acttcctttg ctgtgataat catcatc 177<210>4<211>306<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子
<222>(1)..(306)<223>-306缺失啟動(dòng)子<400>4taaggtgttt tatcgtggca gcatgagtgc atgacaaacg catatattat tattaaaaca60aaatagtact ccaatcataa taaattatct tatattatat tgccaacaat taaaaattca120aattagaaca aattaaatct cagtttgctt tattatatta ttatcaacaa taataattta180atactgatcg aagaactttc cctttcaagt tctctattta aggaagcctg agaagccatt240aatcctcatc atcagctcga ccactcattt cttcttcata cttcctttgc tgtgataatc300atcatc 306<210>5<211>366<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(366)<223>-366缺失啟動(dòng)子<400>5tagtataatg aaataaagtt aatcattctc tatatttgat gatggtaatt agtatcatgg60taaggtgttt tatcgtggca gcatgagtgc atgacaaacg catatattat tattaaaaca120aaatagtact ccaatcataa taaattatct tatattatat tgccaacaat taaaaattca180aattagaaca aattaaatct cagtttgctt tattatatta ttatcaacaa taataattta240atactgatcg aagaactttc cctttcaagt tctctattta aggaagcctg agaagccatt300aatcctcatc atcagctcga ccactcattt cttcttcata cttcctttgc tgtgataatc360atcatc 366<210>6<211>433<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(433)<223>-433缺失啟動(dòng)子<400>6atggtgactt aaagggctga atccaacata tattctgaca tttaaaaatg ctaacgtacg 60
gttagattag tataatgaaa taaagttaat cattctctat atttgatgat ggtaattagt120atcatggtaa ggtgttttat cgtggcagca tgagtgcatg acaaacgcat atattattat180taaaacaaaa tagtactcca atcataataa attatcttat attatattgc caacaattaa240aaattcaaat tagaacaaat taaatctcag tttgctttat tatattatta tcaacaataa300taatttaata ctgatcgaag aactttccct ttcaagttct ctatttaagg aagcctgaga360agccattaat cctcatcatc agctcgacca ctcatttctt cttcatactt cctttgctgt420gataatcatc atc 433<210>7<211>818<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(818)<223>-818缺失啟動(dòng)子<400>7gcttcacgca ctcaactagt cacatctttc caggcaaaat ttacttttct atgaatatga60gaagttccat ctatggaaat aacggattat ttatctaatt ttcaaattct atatatatag120tctcgagtgg aacaaaaata gaactaattt gaacaaatca aagtctaaga aaataataca180tgctttagca gcaaaaataa gaatggtact atacttaatc ctcatcatag tcttcaaccc240tgcatatagc acacttaaca ttttatattc aaatatactt taatttagtc atgataatac300aactcaccta ctccattata gccgataata caactcacct agctactcca ttatagtcca360acaatatcaa atgaataaaa tagtaatggt gacttaaagg gctgaatcca acatatattc420tgacatttaa aaatgctaac gtacggttag attagtataa tgaaataaag ttaatcattc480tctatatttg atgatggtaa ttagtatcat ggtaaggtgt tttatcgtgg cagcatgagt540gcatgacaaa cgcatatatt attattaaaa caaaatagta ctccaatcat aataaattat600cttatattat attgccaaca attaaaaatt caaattagaa caaattaaat ctcagtttgc660tttattatat tattatcaac aataataatt taatactgat cgaagaactt tccctttcaa720gttctctatt taaggaagcc tgagaagcca ttaatcctca tcatcagctc gaccactcat780ttcttcttca tacttccttt gctgtgataa tcatcatc818<210>8
<211>1199<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(1199)<223>-1199缺失啟動(dòng)子<400>8atgcagggtg aaagtaagat tgaatatact gatactacaa ttaactaatg ataaagtata60acttttgtaa aaaatttgat tttttttttt gatgaattca tatactccaa agattttcct120catttaatta aatttctatc ctcatgttga acccattaat cgaataattg acatattaga180taaacttagc catcatatga catttgatca tgattgatga tttttaaaaa ataaaaacaa240aattatgaaa gggtaatgaa atattttaaa aaaattatgt aaaccctgta atctagtaat300ctgtacaata ataattttgt ttcaactaag aggatgttgg caaaagtata attaaacttg360tgatcttcgt acaataatta tgcttcacgc actcaactag tcacatcttt ccaggcaaaa420tttacttttc tatgaatatg agaagttcca tctatggaaa taacggatta tttatctaat480tttcaaattc tatatatata gtctcgagtg gaacaaaaat agaactaatt tgaacaaatc540aaagtctaag aaaataatac atgctttagc agcaaaaata agaatggtac tatacttaat600cctcatcata gtcttcaacc ctgcatatag cacacttaac attttatatt caaatatact660ttaatttagt catgataata caactcacct actccattat agccgataat acaactcacc720tagctactcc attatagtcc aacaatatca aatgaataaa atagtaatgg tgacttaaag780ggctgaatcc aacatatatt ctgacattta aaaatgctaa cgtacggtta gattagtata840atgaaataaa gttaatcatt ctctatattt gatgatggta attagtatca tggtaaggtg900ttttatcgtg gcagcatgag tgcatgacaa acgcatatat tattattaaa acaaaatagt960actccaatca taataaatta tcttatatta tattgccaac aattaaaaat tcaaattaga 1020acaaattaaa tctcagtttg ctttattata ttattatcaa caataataat ttaatactga 1080tcgaagaact ttccctttca agttctctat ttaaggaagc ctgagaagcc attaatcctc 1140atcatcagct cgaccactca tttcttcttc atacttcctt tgctgtgata atcatcatc1199<210>9<211>1467<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(1467)<223>-1467缺失啟動(dòng)子<400>9ggctgtccgg aattctgtct ctctggacca gttttggcaa acaattttga aaccacactt60atactactcc aaaaattatg aaatttttat ggtagcttct acacttatag aactacatgt120ataaaaaata ttgggtcaaa ataccttacc gatttttccc aaatattcac ggaacttact180gccagaatct accctgcttt ttcctttcac tattttcaca actataagca tatatgggca240taaatatgac atgaacatgc atgaaccaat gcagggtgaa agtaagattg aatatactga300tactacaatt aactaatgat aaagtataac ttttgtaaaa aatttgattt ttttttttga360tgaattcata tactccaaag attttcctca tttaattaaa tttctatcct catgttgaac420ccattaatcg aataattgac atattagata aacttagcca tcatatgaca tttgatcatg480attgatgatt tttaaaaaat aaaaacaaaa ttatgaaagg gtaatgaaat attttaaaaa540aattatgtaa accctgtaat ctagtaatct gtacaataat aattttgttt caactaagag600gatgttggca aaagtataat taaacttgtg atcttcgtac aataattatg cttcacgcac660tcaactagtc acatctttcc aggcaaaatt tacttttcta tgaatatgag aagttccatc720tatggaaata acggattatt tatctaattt tcaaattcta tatatatagt ctcgagtgga780acaaaaatag aactaatttg aacaaatcaa agtctaagaa aataatacat gctttagcag840caaaaataag aatggtacta tacttaatcc tcatcatagt cttcaaccct gcatatagca900cacttaacat tttatattca aatatacttt aatttagtca tgataataca actcacctac960tccattatag ccgataatac aactcaccta gctactccat tatagtccaa caatatcaaa1020tgaataaaat agtaatggtg acttaaaggg ctgaatccaa catatattct gacatttaaa1080aatgctaacg tacggttaga ttagtataat gaaataaagt taatcattct ctatatttga1140tgatggtaat tagtatcatg gtaaggtgtt ttatcgtggc agcatgagtg catgacaaac1200gcatatatta ttattaaaac aaaatagtac tccaatcata ataaattatc ttatattata1260ttgccaacaa ttaaaaattc aaattagaac aaattaaatc tcagtttgct ttattatatt1320attatcaaca ataataattt aatactgatc gaagaacttt ccctttcaag ttctctattt1380aaggaagcct gagaagccat taatcctcat catcagctcg accactcatt tcttcttcat1440acttcctttg ctgtgataat catcatc1467<210>10
<211>1934<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(1934)<223>-1934缺失啟動(dòng)子<400>10ttgccatctc accacttcgt cttaaacaat ctaggatatt cttagatatt cttcatactc60aagtctcaca cttgaaatca atcaagactc ttacactaac aattcctcaa tatacctcat120aatatcatct ctacttaaac tagagagatt tccaactctc aattaatcac caaaggtaac180tctccaaata tccaaatgga aggtttcaac ttccaaacta ataccaaacc aaccggacta240atcataatca tattcataat cataaattgt ttctaactgc ccctgtccag aaattacagt300tttgcgcagt ccgaaagatt gagccggtaa caatagttcc cgaactcttt ttcacttgaa360atttttatgg tagaacccta acttatagta cttgatatcc ataaaaagtt ttggtcacct420aggttcacga attaacacag aaaattacat ctttgccctt ggcagtgggc tgtccggaat480tctgtctctc tggaccagtt ttggcaaaca attttgaaac cacacttata ctactccaaa540aattatgaaa tttttatggt agcttctaca cttatagaac tacatgtata aaaaatattg600ggtcaaaata ccttaccgat ttttcccaaa tattcacgga acttactgcc agaatctacc660ctgctttttc ctttcactat tttcacaact ataagcatat atgggcataa atatgacatg720aacatgcatg aaccaatgca gggtgaaagt aagattgaat atactgatac tacaattaac780taatgataaa gtataacttt tgtaaaaaat ttgatttttt tttttgatga attcatatac840tccaaagatt ttcctcattt aattaaattt ctatcctcat gttgaaccca ttaatcgaat900aattgacata ttagataaac ttagccatca tatgacattt gatcatgatt gatgattttt960aaaaaataaa aacaaaatta tgaaagggta atgaaatatt ttaaaaaaat tatgtaaacc1020ctgtaatcta gtaatctgta caataataat tttgtttcaa ctaagaggat gttggcaaaa1080gtataattaa acttgtgatc ttcgtacaat aattatgctt cacgcactca actagtcaca1140tctttccagg caaaatttac ttttctatga atatgagaag ttccatctat ggaaataacg1200gattatttat ctaattttca aattctatat atatagtctc gagtggaaca aaaatagaac1260taatttgaac aaatcaaagt ctaagaaaat aatacatgct ttagcagcaa aaataagaat1320ggtactatac ttaatcctca tcatagtctt caaccctgca tatagcacac ttaacatttt1380atattcaaat atactttaat ttagtcatga taatacaact cacctactcc attatagccg1440
ataatacaac tcacctagct actccattat agtccaacaa tatcaaatga ataaaatagt 1500aatggtgact taaagggctg aatccaacat atattctgac atttaaaaat gctaacgtac 1560ggttagatta gtataatgaa ataaagttaa tcattctcta tatttgatga tggtaattag 1620tatcatggta aggtgtttta tcgtggcagc atgagtgcat gacaaacgca tatattatta 1680ttaaaacaaa atagtactcc aatcataata aattatctta tattatattg ccaacaatta 1740aaaattcaaa ttagaacaaa ttaaatctca gtttgcttta ttatattatt atcaacaata 1800ataatttaat actgatcgaa gaactttccc tttcaagttc tctatttaag gaagcctgag 1860aagccattaa tcctcatcat cagctcgacc actcatttct tcttcatact tcctttgctg 1920tgataatcat catc1934<210>11<211>2433<212>DNA<213>甘薯(Ipomoea batatas)<220>
<221>啟動(dòng)子<222>(1)..(2433)<223>-2433啟動(dòng)子<400>11cctcatggag tattctcata actctcttca gtatgaatga atcatacaat acaacgcagc60gacgaataga cttcgccctg aactagacat acgacaacat agccaccata cgggaaaggc120acttcaagct ctttatcccg taggctgcaa caacataacg acataacgac cactgggcaa180gggcatttac agccacccgt gggtcaatca aggtcctcct cactcacttt agaaactaag240ggtttgaaaa catgatcttt ccttcagttt ttcttacaac aaatcattca ctttggacac300atttcacaat tgagtccaat acttaaaccg gctacttcat tagcccctga aggattttaa360aaaaaacttt cactgcccgc aggctcttca aacatctttt cctcattatc aagtgaggca420ttttcctcaa aagtaaggtt ttgacaacct ttatatcaaa atagcatacg tttttcaacg480taagtttcat aacatttact tgccatctca ccacttcgtc ttaaacaatc taggatattc540ttagatattc ttcatactca agtctcacac ttgaaatcaa tcaagactct tacactaaca600attcctcaat atacctcata atatcatctc tacttaaact agagagattt ccaactctca660attaatcacc aaaggtaact ctccaaatat ccaaatggaa ggtttcaact tccaaactaa720taccaaacca accggactaa tcataatcat attcataatc ataaattgtt tctaactgcc780
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<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSP1啟動(dòng)子<400>12ctgagccgag tgacaaagga agccat 26<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AP1啟動(dòng)子<400>13gtaatacgac tcactatagg gc 22<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GSP2啟動(dòng)子<400>14cacagcaaag gaagtatgaa gaagc 25<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AP2啟動(dòng)子<400>15actatagggc acgcgtggt 19<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>外顯子啟動(dòng)子
<400>16atggcttcct ttgtcactcg gctcag 26<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>內(nèi)含子啟動(dòng)子<400>17tcatcagctc gaccactcat ttcttcttca 30<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-2433缺失啟動(dòng)子的上游啟動(dòng)子<400>18gccaagcttg gtcctcatgg agtattctca taact35<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-1934缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>19gccaagcttt tgccatctca ccacttcgtc tta 33<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-1467缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>20gccaagcttg gctgtccgga attctgtctc t31
<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-1199缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>21gccaagctta tgcagggtga aagtaagatt gaa 33<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-818缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>22gccaagcttg cttcacgcac tcaact 26<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-433缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>23gccaagctta tggtgactta aagggctgaa tcc 33<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-2433，1934，1467，1199，818，433，366，306，177和110缺失啟動(dòng)子的下游引物<400>24tcctctagag atgatgatta tcacagcaaa ggaa 34<210>25<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>-366缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>25ttcctgcaga tagtataatg aaataaagtt a31<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-306缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>26tttctgcagt aaggtgtttt atcgtg 26<210>27<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-177缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>27ttcctgcaga aattaaatct cagtt 25<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>-110缺失啟動(dòng)子的上游引物<400>28ttcctgcagt ttccctttca agtt24<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPTII的上游引物<400>29gaggctattc ggctagatg 19
<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPTII的下游引物<400>30atcgggagcg gcgataccgt a2權(quán)利要求
1.一種多重脅迫抗性啟動(dòng)子序列或包含由SEQ.ID.No 2代表的堿基序列的啟動(dòng)子序列，其用于生產(chǎn)可以大量生產(chǎn)有價(jià)值物質(zhì)的轉(zhuǎn)化子。
2.權(quán)利要求1中提出的啟動(dòng)子序列，其中所述啟動(dòng)子序列選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組。
3.一種表達(dá)載體，其用于大量生產(chǎn)多重脅迫抗性物質(zhì)或其它有價(jià)值物質(zhì)，其中依次包含選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組的啟動(dòng)子序列、目標(biāo)有價(jià)值物質(zhì)的編碼序列和終止子序列。
4.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其用于大量生產(chǎn)多重脅迫抗性物質(zhì)或其它有價(jià)值物質(zhì)，其通過(guò)用權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物細(xì)胞而制備。
5.權(quán)利要求4中提出的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述宿主植物細(xì)胞是選自由煙草屬、諸如稻屬、甘薯等主要農(nóng)作物和包括人參屬的藥用植物組成的組的植物的細(xì)胞。
6.權(quán)利要求4或權(quán)利要求5中提出的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述細(xì)胞通過(guò)用含有SEQ.ID.No 9代表的堿基序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染煙草細(xì)胞而制備(保藏號(hào)KCTC 10594BP)。
7.一種轉(zhuǎn)基因植物，其用于大量生產(chǎn)多重脅迫抗性物質(zhì)或其它有價(jià)值物質(zhì)，其通過(guò)使用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)用權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物而制備。
8.權(quán)利要求7中提出的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述脅迫選自由創(chuàng)傷、甲基紫精、過(guò)氧化氫、NaCl、茉莉酮酸甲酯、脫落酸、非生物脅迫(≤15℃或≥37℃)和病原菌(Pectobacterium chrysanhemi)組成的組。
9.一種制備用于大量生產(chǎn)多重脅迫抗性物質(zhì)或其它有價(jià)值物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括下述步驟1)構(gòu)建表達(dá)載體，其含有選自由SEQ.ID.No 2～No 11代表的堿基序列組成的組的每一個(gè)啟動(dòng)子序列、目標(biāo)有價(jià)值物質(zhì)的編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列；和2)使用農(nóng)桿菌用上述步驟1)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及多重脅迫誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，更具體地，涉及源于甘薯(Ipomoea batatas)的多重脅迫誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶啟動(dòng)子，用于生產(chǎn)含有所述啟動(dòng)子并具有增強(qiáng)的多重脅迫耐受性的轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)載體，由所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物，以及用于產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明的啟動(dòng)子將在生物工藝上用于開發(fā)具有增強(qiáng)的多重脅迫耐受性的工業(yè)轉(zhuǎn)基因植物以及植物細(xì)胞系，以生產(chǎn)有用的蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/53GK1922312SQ200480042027
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月24日
發(fā)明者郭尚洙, 權(quán)錫胤, 李幸順, 柳善花 申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院