專利名稱：脂環(huán)酸桿菌屬細菌檢測用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對于脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillus)屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的16S rDNA具特異性的引物；更具體地涉及能夠擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域的脂環(huán)酸桿菌屬細菌檢測用引物或引物組合、以及能夠擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域的酸土脂環(huán)酸桿菌檢測用引物組合；另外，本發(fā)明也涉及將所述細菌檢測用引物或引物組合用于等溫基因擴增法(下稱LAMP法)的脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測·菌株的識別方法。
背景技術(shù)：
脂環(huán)酸桿菌屬細菌是好氣地在高溫·酸性的條件下增殖的有芽胞形成的細菌，可從土壤和溫泉等中分離。已知存在于土壤中的脂環(huán)酸桿菌屬細菌附著在收獲的果實上、在榨汁工序中進入果汁中這樣的情況下，在使用該果汁的飲料和食品的制造中，即使制造工序中進行加熱殺菌，細菌的耐熱性孢子仍然會存活，可能會在制品中出芽·增殖而引起變質(zhì)的事故。尤其，在脂環(huán)酸桿菌屬中，放出稱作愈瘡木酚臭味的惡臭的酸土脂環(huán)酸桿菌被報道為引起污染事故的細菌，被認為是問題。
因此，為了預先防止污染事故，進行微生物檢查來檢測和識別脂環(huán)酸桿菌屬細菌，提出了多個方法。報道了例如將BAM培養(yǎng)基(非專利文獻1)和半合成培養(yǎng)基(非專利文獻2)等作為檢測培養(yǎng)基，但這些培養(yǎng)基的組成復雜，而且得到檢查結(jié)果需要數(shù)天，所以難以用于日常的微生物檢查。
另外，關(guān)于菌種的識別方法，由于生理·生化的性狀在菌種間差別不大、在同種內(nèi)的菌株間性狀不一，所以只通過它們的性狀難以進行種的識別(非專利文獻3)。
因此，提出了使用基因分析方法的識別方法。例如有使用PCR的方法(專利文獻1、非專利文獻4)、使用RAPD法的方法(非專利文獻5)、基于16S rDNA的序列比較的方法(非專利文獻6)等，但都需要昂貴的儀器，而且操作復雜，所以難以用于日常的微生物檢查。
專利文獻1國際專利公開WO 01/68914號小冊子非專利文獻1G.Deinhard等，System.Appl.Microbiol.，10，47-53，1987非專利文獻2B.Hippchen等，Arch.Microbiol.，129，53-55，1981非專利文獻3K.Goto，J.Antibact.Antifung.Agents.，28(8)，499-508，2000非專利文獻4K.Yamazaki等，Lett.Appl.Microbiol.，23，350-354，1996非專利文獻5K.Yamazaki等，Biosei.Biotech.Biochem.，61(6)，1016-1018，1997非專利文獻6K.Goto等，J.Gen.Appl.Microbiol.，48，243-250，2002發(fā)明的揭示發(fā)明要解決的課題鑒于上述的問題，希望從與已有技術(shù)的方法不同的角度，開發(fā)簡便、迅速的脂環(huán)酸桿菌屬細菌(特別是酸土脂環(huán)酸桿菌)的檢測方法和識別方法。因此，本發(fā)明的目的在于提供解決上述課題的、對于飲料和果汁等食品標本中是否有脂環(huán)酸桿菌屬細菌的簡便、迅速的檢測·識別方法。
解決課題的方法本發(fā)明人為了解決所述的課題反復研究后發(fā)現(xiàn)，通過使用作為等溫基因擴增反應的環(huán)介導等溫擴增(LAMP，Loop-mediated isothermal amplification)法(國際專利公開WO 00/28082號小冊子)可以簡便、迅速地進行脂環(huán)酸桿菌屬細菌和酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測、識別。
即，本發(fā)明提供對于脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA具特異性的引物。
此外，根據(jù)本發(fā)明，提供了脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測·識別方法，它是被檢測的脂環(huán)酸桿菌屬細菌(較好是酸土脂環(huán)酸桿菌)的檢測·識別方法，其特征在于，以該細菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用對于16S rDNA具特異性的引物選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
更特定地，本發(fā)明提供下述(1)～(13)所記載的脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測用引物或引物組合，以及使用它們的脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測·識別方法。
(1)引物，其特征在于，能擴增靶區(qū)域的堿基序列，所述靶區(qū)域選自脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA基因序列的81位～934位的核酸序列的一部分或其互補鏈，含有以下片斷
(a)第1片斷，與脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA退火而作為引物起作用的堿基序列；(b)第2片斷，與第1片斷的3’側(cè)的核酸序列互補、位于第1片斷的5’側(cè)的堿基序列。
(2)脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測用引物組合，所述引物組合由序列編號1～4所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成，可以擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域。
(3)酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測用引物組合，所述引物組合由序列編號5～8所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成，可以擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16SrDNA的特定區(qū)域。
(4)酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測用引物組合，所述引物組合由序列編號9～13所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成，可以擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16SrDNA的特定區(qū)域。
(5)脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在脂環(huán)酸桿菌屬細菌的方法，其特征在于，以該脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用上述(1)所記載的引物選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(6)脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在脂環(huán)酸桿菌屬細菌的方法，其特征在于，以該脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用上述(2)所記載的引物組合選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(7)酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在酸土脂環(huán)酸桿菌的方法，其特征在于，以該酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用上述(3)所記載的引物組合選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(8)酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在酸土脂環(huán)酸桿菌的方法，其特征在于，以該酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用上述(4)所記載的引物組合選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(9)脂環(huán)酸桿菌屬細菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用上述(1)所記載的引物通過LAMP法進行擴增反應，擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(10)脂環(huán)酸桿菌屬細菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用上述(2)所記載的引物組合通過LAMP法進行擴增反應，擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(11)酸土脂環(huán)酸桿菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用上述(3)所記載的引物組合通過LAMP法進行擴增反應，擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(12)酸土脂環(huán)酸桿菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用上述(4)所記載的引物組合通過LAMP法進行擴增反應，擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
(13)脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括上述(1)～(4)中的任一項所記載的引物或引物組合、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、反應緩沖液。
如果將上述(1)～(4)所限定的引物或引物組合用于LAMP法，則退火在脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域。如果將其在LAMP法規(guī)定的擴增條件下進行擴增，則可擴增特定的基因區(qū)域。是否有這樣的擴增產(chǎn)物可以通過電泳法或簡易檢測法進行確認。由此，可以檢測脂環(huán)酸桿菌屬細菌。上述的(3)或(4)兩組引物組合是對酸土脂環(huán)酸桿菌(16S rDNA)特異的，所以在脂環(huán)酸桿菌屬細菌中，只特異地檢測酸土脂環(huán)酸桿菌的菌株，因此這些引物組合也可以用于酸土脂環(huán)酸桿菌與其它脂環(huán)酸桿菌屬細菌的識別。
此外，將本發(fā)明的檢測方法適用于特定的標本(例如飲料試樣)時，培養(yǎng)從標本采集的雜菌，分離DNA試樣，使上述(1)～(4)所限定的引物或引物組合與該DNA試樣作用，同樣可以確認是否有DNA擴增產(chǎn)物。由此，可以檢測脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌。
發(fā)明的效果本發(fā)明將由序列編號1～4、5～8或9～13所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成的引物組合用于LAMP法，擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌(較好是酸土脂環(huán)酸桿菌)的16S rDNA的特定區(qū)域，可以檢測脂環(huán)酸桿菌屬細菌。
此外，基于本發(fā)明的脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測方法是使用由序列編號1～4、5～8或9～13所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成的引物組合，對從標本得到的DNA試樣使用LAMP法，從而確認是否存在擴增產(chǎn)物，所以可以簡便、迅速且可靠地進行脂環(huán)酸桿菌屬細菌(特別是有害的酸土脂環(huán)酸桿菌)的檢測·識別。
附圖的簡單說明[

圖1]圖1為顯示用Al引物進行等溫基因擴增的結(jié)果的電泳圖。M標記，Bc凝固芽孢桿菌ID237，Pp多粘類芽孢桿菌ID322-1，B1地衣芽孢桿菌ID354-1，Aat酸土脂環(huán)酸桿菌DSM2498，Ac環(huán)庚基脂環(huán)酸桿菌NBRC15310，Aac酸熱脂環(huán)酸桿菌JCM5260。
圖2為顯示用Alat引物進行等溫基因擴增的結(jié)果的電泳圖。泳道M標記，Ac環(huán)庚基脂環(huán)酸桿菌NBRC15310，Aac1酸熱脂環(huán)酸桿菌JCM5260，Aac2酸熱脂環(huán)酸桿菌ID313-1，Aac3酸熱脂環(huán)酸桿菌ID313-3，Aat1環(huán)庚基脂環(huán)酸桿菌NBRC15310，Aat2酸熱脂環(huán)酸桿菌JCM5260，Aat3酸土脂環(huán)酸桿菌ID313-4，Aat4酸土脂環(huán)酸桿菌ID331-1。
圖3為顯示用rAlat引物進行等溫基因擴增的結(jié)果的電泳圖。AmAlicyclobacillus mali IAM14936，ApAlicyclobacillus pomorumIAM14988，Aap嗜酸脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillus acidiphilus)IAM14983，Aat酸土脂環(huán)酸桿菌DSM2498，Ac環(huán)庚基脂環(huán)酸桿菌NBRC15310，Aac酸熱脂環(huán)酸桿菌JCM5260，Aac酸熱脂環(huán)酸桿菌JCM5260。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明通過基于使用對所述細菌具特異性的寡核苷酸引物的LAMP法的等溫基因擴增，擴增細菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否有擴增產(chǎn)物，并以此為基礎(chǔ)來判定在包括果汁和果汁飲料等(也統(tǒng)稱飲料)的食品中是否存在脂環(huán)酸桿菌屬細菌、特別是酸土脂環(huán)酸桿菌。
在飲料工場，接受果汁時以及果汁飲料的微生物檢查中，進行是否存在脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢查。一般，按照《耐熱性嗜酸細菌統(tǒng)一檢查法》(果汁協(xié)會報，3月號，No.535，4-12，2003)，將飲料標本用濾膜過濾，將捕集到細菌的濾膜放置在脂環(huán)酸桿菌屬用培養(yǎng)基YSG瓊脂培養(yǎng)基(酵母提取物0.2％，葡萄糖0.1％，可溶性淀粉0.2％，瓊脂1.5％，pH4.0)上，在45℃下培養(yǎng)3～5天。對于出現(xiàn)的細菌通過溫度差法(判定需要18～20小時)或過氧化物酶法(判定需要1～3小時)判定該細菌是不是酸土脂環(huán)酸桿菌。
另一方面，標本難以濾膜過濾的情況下，將該標本添加到Y(jié)SG液體培養(yǎng)基中，在45℃下增菌培養(yǎng)3～5天后，將培養(yǎng)液涂布到Y(jié)SG瓊脂培養(yǎng)基上，再在45℃下培養(yǎng)3～5天。對于出現(xiàn)的細菌與上述同樣地通過溫度差法或過氧化物酶法判定該細菌是不是酸土脂環(huán)酸桿菌。
本發(fā)明的檢測·識別方法中可以使用YSG瓊脂培養(yǎng)基中出現(xiàn)的細菌或存在于增菌培養(yǎng)液中的細菌作為樣本。
本說明書所使用的“標本”是指可能含有有害菌酸土脂環(huán)酸桿菌的、作為本發(fā)明的檢測·識別方法的對象的樣本，但沒有特別限定?？梢岳e例如果汁(原料)、含果汁的飲料等。此外，本說明書所使用的“識別”有時特指在存在一種以上的脂環(huán)酸桿菌屬細菌的標本中，區(qū)分酸土脂環(huán)酸桿菌與其它脂環(huán)酸桿菌屬細菌而進行檢測，一般是指在多個菌種中識別作為檢測對象的脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌。此外，本說明書所使用的“判定”是指判定檢測的細菌是不是脂環(huán)酸桿菌屬細菌、或者是不是酸土脂環(huán)酸桿菌，也會用作與檢測相同的含義。
本發(fā)明所使用的LAMP法與PCR法不同，不需要擴增工序中的溫度調(diào)節(jié)(循環(huán))，是使用一種DNA合成酶、在一定的溫度(等溫)下擴增的基因擴增法(國際專利公開WO 00/28082號小冊子，已引述)。
本發(fā)明的對于脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA具特異性的引物設計成以特定區(qū)域為靶的、形成環(huán)的兩種內(nèi)部引物和兩種外部引物共計4種引物的組合(FIP、F3、BIP、B3)。擴增的基因的特定區(qū)域在100～500bp左右。若確定了引物寡核苷酸的核酸序列，則寡核苷酸本身的合成可以用公知的方法、例如Perkin-Elmer公司制的自動DNA合成裝置來進行。
本發(fā)明中，對于脂環(huán)酸桿菌屬細菌特異性的引物組合可以例舉例如下述的1組引物組合(稱作Al引物組合)。其中，對于脂環(huán)酸桿菌屬細菌特異性的引物為可以特異性擴增該細菌的16S rDNA的特定區(qū)域(141bp)的引物。16S rDNA的整個核酸序列如序列表的序列編號14所示。
(Al引物組合)Al-FIP5’-TTGGGTTTCCTTCGGCACTGAGATACCCTGGTAGTCCACG-3’(序列編號1)Al-BIP5’-ATAAGCACTCCGCCTGGGGAGCCCCCGTCAATTCCTTTG-3’(序列編號2)Al-F3
5’-GTGGGGAGCAAACAGGATT-3’(序列編號3)Al-B35’-ACATGCTCCACTGCTTGTG-3’(序列編號4)本發(fā)明中，只對酸土脂環(huán)酸桿菌具特異性的引物組合可以例舉例如下述的兩組引物組合(Alat引物組合、rAlat引物組合)。其中，只對酸土脂環(huán)酸桿菌具特異性的引物可以擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域(139bp或146bp)，但不擴增其它的脂環(huán)酸桿菌屬細菌的基因。
(Alat引物組合)Alat-FIP5’-ACAAGGAGCTTTCCACTCTCCAAGAAGGCCTTCGGGTTGT-3’(序列編號5)Alat-BIP5’-TGAGACGGTACCGAGTGAGGACGCTTGCCCCCTACGTATT-3’(序列編號6)Alat-F35’-CAAGCCTGACGGAGCAA-3’(序列編號7)Alat-B35’-CCCAGTGATTCCGGACAA-3’(序列編號8)(rAl at引物組合)rAlat-FIP5’-AACACAAGTAGATGCCTACCCGCAATCTGCCTTTCAGACTGGA-3’(序列編號9)rAl at-BIP5’-TTGAAAGATGCAACTGCATCGCTCCGTTACCTCACCAACTAGC-3’(序列編號10)rAlat-F35’-CGGACGGGTGAGTAACACG-3’(序列編號11)rAlat-B35’-TACGCATCGTCGCCTTGG-3’(序列編號12)rAlat-LoopF5’-ATTAGCACCCGTTTCCGAGT-3’(序列編號13)標本中存在的脂環(huán)酸桿菌屬細菌和/或酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測使用上述的3組引物組合的至少1組按照LAMP法進行等溫基因擴增(通常在60～65℃下15分鐘～1小時)。即，將從標本采集的菌株或飲料標本本身在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)，用離心分離等集菌后，通過公知的方法分離菌株的DNA，對該DNA使用所述引物組合進行擴增反應。是否有擴增的DNA擴增產(chǎn)物可以通過使用LAMP法的簡易檢測或常規(guī)的電泳進行檢測。前者的簡易檢測包括1)肉眼確認擴增反應液的白色渾濁(國際專利公開WO 01/83817號小冊子)和2)肉眼確認熒光嵌入劑。不論哪一個都可以通過肉眼確認是否有擴增產(chǎn)物(靶基因的存在)。
實施例以下，例舉實施例更具體地對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于這些
(實施例1)已知菌株的16S rDNA基因的擴增(使用的引物組合)脂環(huán)酸桿菌屬細菌用引物組合[Al引物組合Al-FIP(序列編號1)、Al-BIP(序列編號2)、Al-F3(序列編號3)、Al-B3(序列編號4)]擴增16S rDNA的一部分(141bp)。酸土脂環(huán)酸桿菌用引物組合1[Alat引物組合Alat-FIP(序列編號5)、Alat-BIP(序列編號6)、Alat-F3(序列編號7)、Alat-B3(序列編號8)]擴增16S rDNA的一部分(139bp)。此外，酸土脂環(huán)酸桿菌用引物組合2[rAlat引物組合rAlat-FIP(序列編號9)、rAlat-BIP(序列編號10)、rAlat-F3(序列編號11)、rAlat-B3(序列編號12)、rAlat-LoopF(序列編號13)]擴增16S rDNA的一部分(146bp)。對基于這些引物組合的脂環(huán)酸桿菌屬細菌、酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的擴增和近緣菌的16S rDNA的擴增進行了探討。供本實施例試驗的菌株與各菌株的結(jié)果如表1所示。
(基因組DNA的制備)將脂環(huán)酸桿菌屬細菌接種到Y(jié)SG瓊脂培養(yǎng)基(酵母提取物0.2％，葡萄糖0.1％，可溶性淀粉0.2％，瓊脂1.5％，pH4.0)上，在45℃下培養(yǎng)2～5天。其它的受試菌接種在心臟浸出液瓊脂培養(yǎng)基(榮研化學公司制)上，在37℃下培養(yǎng)2～5天。培養(yǎng)后，從各菌體用PrepMan(商標)Ultra(ァプライド·バイオシステム公司制)抽提基因組DNA。
(基于LAMP法的基因擴增)基于LAMP法的基因擴增使用Loopamp DNA擴增試劑盒(榮研化學公司制)進行。在試劑反應液中加入上述DNA提取液和各引物組合，在62℃下進行核酸的擴增反應60分鐘。
(擴增產(chǎn)物的檢測)隨著擴增反應的進行而游離的焦磷酸和反應液中存在的鎂離子形成焦磷酸鎂。因此，只有在發(fā)生核酸的擴增的樣本中反應液出現(xiàn)白色渾濁。通過觀察該白色渾濁判斷是否有擴增產(chǎn)物。此外，對于一部分的菌株，使1μl擴增后的反應液在聚丙烯酰胺凝膠上電泳。用溴化乙錠溶液染色10分鐘后，照射紫外線，確認DNA的條帶(結(jié)果如圖1～3所示)。
與Al引物和Alat引物相關(guān)的擴增結(jié)果一同表示在表1中。


+擴增 -未擴增NBRC日本筑波國家技術(shù)與評價研究所生物技術(shù)中心生物資源中心(Biological Resource Center，Biotechnology Center，National Institute of Technology and Evaluation，Tsukuba，Japan)JCM日本琦玉日本微生物保藏中心AHU日本北海道大學農(nóng)學院IAM日本東京大學分子和細胞生命科學研究所IAM培養(yǎng)保藏中心(IAM Culture Collection，Institute of Molecular andCellular Biosciences，University of Tokyo，Japan)DSM德國微生物和細胞培養(yǎng)保藏中心(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures.Germany)ID札幌啤酒分離株如表1所示，使用Al引物組合時，屬于脂環(huán)酸桿菌屬的所有受試菌株都能夠發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物。另一方面，使用Alat引物組合時，只有屬于酸土脂環(huán)酸桿菌的受試菌株才能夠發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物。但是，兩種引物組合在使用來源于脂環(huán)酸桿菌屬之外的近緣菌的16S rDNA的DNA提取液的情況下都沒有發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物。
(實施例2)從果汁分離的菌株的識別在YSG瓊脂培養(yǎng)基(酵母提取物0.2％，葡萄糖0.1％，可溶性淀粉0.2％，瓊脂1.5％，pH4.0)中加入桔、蘋果、菠蘿、梅等的果汁，在45℃下培養(yǎng)2～5天。從培養(yǎng)基分離菌株，對分離的菌株與實施例1同樣地通過LAMP法進行核酸的擴增和擴增產(chǎn)物的檢測。擴增結(jié)果如表2所示。
(基于基因分析的鑒定)分離菌株的鑒定通過16S rDNA的基因分析進行。以實施例1所示的方法制備基因組DNA后，用MicroSeq 500 16S rDNA試劑盒(アプライド·バイオシステム公司制)進行分離株的鑒定。


+擴增 -未擴增如表2所示，基因分析的結(jié)果表明分離的菌株都是屬于脂環(huán)酸桿菌屬的菌株?；诨蚍治龅蔫b定結(jié)果與使用Al引物的識別結(jié)果非常地一致，而且只有在鑒定為酸土脂環(huán)酸桿菌的No.1株、No.2株和No.5株中觀察到Alat引物產(chǎn)生的擴增。
(實施例3)來自果汁飲料的脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測將1ml(10cfu/ml)添加了酸土脂環(huán)酸桿菌DSM2498的市場上銷售的濃縮蘋果果汁飲料與30ml YSG液體培養(yǎng)基混合，在45℃下靜置培養(yǎng)4～24小時(增菌培養(yǎng))。
將1.0ml經(jīng)不同時間培養(yǎng)的YSG培養(yǎng)液以12000rpm離心5分鐘，回收菌體。將菌體懸浮于200μl TE緩沖液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)后，離心分離，洗凈菌體。將洗凈的菌體懸浮于100μl PrepMan(商標)Ultra中，在99℃下加熱處理15分鐘后，以12000rpm離心5分鐘，取其上清作為LAMP法用的DNA試樣。
對1μl按上述方法制備的DNA試樣溶液與實施例1同樣地使用Alat引物通過LAMP法進行核酸的擴增和擴增產(chǎn)物的檢測。
另一方面，在各培養(yǎng)時間下，將培養(yǎng)液的一部分接種到Y(jié)SG瓊脂培養(yǎng)基，測定活菌數(shù)。擴增的結(jié)果與活菌數(shù)的測定值如表3所示。


活菌數(shù)YSG瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)3天(45℃)后測定(cfu/ml)如表3所示，只進行一夜左右的增菌培養(yǎng)，就可以對初始菌數(shù)1cfu/ml以下(在YSG液體培養(yǎng)基中)的酸土脂環(huán)酸桿菌通過使用Alat引物的LAMP法進行檢測。由此，在進行短時間的增菌培養(yǎng)后(本實施例中為16小時)，通過使用LAMP法檢測靶基因，可以不檢測死菌的基因，而選擇性地檢測活菌。
根據(jù)《耐熱性嗜酸細菌統(tǒng)一檢查法》(果汁協(xié)會報，3月號，No.535，4-12，2003)，增菌培養(yǎng)需要3～5天，判定是不是酸土脂環(huán)酸桿菌還需要3～5天。因此，通過使用本發(fā)明的檢測方法可以大幅縮短細菌的檢測·識別之前的時間。
(實施例4)快速微生物檢查裝置(RMDS-SPS)中出現(xiàn)的細菌的識別利用存在于細胞內(nèi)的ATP進行快速檢測微生物的裝置有RMDS-SPS(商標ミリポア公司-サツポロビ一ル公司制)。對于該裝置所檢測出的菌落(肉眼不可見的極微小菌落)識別是不是脂環(huán)酸桿菌屬細菌的可能性進行了探討。
將1ml(10cfu/ml)添加了酸土脂環(huán)酸桿菌DSM2498的市場上銷售的濃縮蘋果果汁飲料用濾膜過濾。將捕集到細菌的濾膜放在YSG瓊脂培養(yǎng)基上，在45℃下培養(yǎng)5～8小時(增菌培養(yǎng))。培養(yǎng)后，將濾膜上用RMDS-SPS檢測出的有細菌存在的部位切下，將2μl PrepMan(商標)Ultra滴在濾膜上，在99℃下加熱處理15分鐘提取DNA。對該濾膜與實施例1同樣地使用Alat引物通過LAMP法進行核酸的擴增和擴增產(chǎn)物的檢測。結(jié)果如表4所示。


○判定為酸土脂環(huán)酸桿菌 ×無法判定為酸土脂環(huán)酸桿菌如表4所示，通過與快速微生物檢查裝置(RMDS-SPS)組合，只進行數(shù)小時的增菌培養(yǎng)就可以通過使用Alat引物的LAMP法識別酸土脂環(huán)酸桿菌。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性實現(xiàn)了對引起果汁飲料等的變質(zhì)事故的脂環(huán)酸桿菌屬細菌(特別是酸土脂環(huán)酸桿菌)選擇性地、迅速、簡便地進行識別、檢測。
因此，本發(fā)明的引物組合和使用它的脂環(huán)酸桿菌屬細菌等的檢測方法可以在食品、含果汁的飲料等的制造現(xiàn)場用于制品的品質(zhì)管理。
序列表<110>札幌啤酒株式會社(Sapporo Breweries Ltd.)榮研化學株式會社(Eiken Chemical Co.Ltd.)<120>脂環(huán)酸桿菌屬細菌檢測用引物<130>FP04-0384<150>JP 2003-349772<151>2003-10-08<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ttgggtttcc ttcggcactg agataccctg gtagtccacg 40<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2ataagcactc cgcctgggga gcccccgtca attcctttg39<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>3gtggggagca aacaggatt19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4acatgctcca ctgcttgtg19<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5acaaggagct ttccactctc caagaaggcc ttcgggttgt 40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tgagacggta ccgagtgagg acgcttgccc cctacgtatt 40
<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7caagcctgac ggagcaa 17<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8cccagtgatt ccggacaa18<210>9<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9aacacaagta gatgcctacc cgcaatctgc ctttcagact gga43<210>10<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>10ttgaaagatg caactgcatc gctccgttac ctcaccaact agc 43<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11cggacgggtg agtaacacg 19<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12tacgcatcgt cgccttgg 18<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13attagcaccc gtttccgagt 20<210>14<211>1514<212>DNA<213>脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)
<400>14agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60gagcccttcg gggctagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggcaatctg cctttcagac 120tggaataaca ctcggaaacg ggtgctaatg ccggataata cacgggtagg catctacttg 180tgttgaaaga tgcaactgca tcgctgagag aggagcccgc ggcgcattag ctagttggtg 240aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgac cggccacact 300gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360gcgcaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gcgaagaagg ccttcgggtt gtaaagctct 420gttgctcggg gagagcgaca aggagagtgg aaagctcctt gtgagacggt accgagtgag 480gaagccccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggggca agcgttgtcc 540ggaatcactg ggcgtaaagc gtgcgtaggc ggttgtgtaa gtctgaagtg aaagtccaag 600gctcaacctt gggattgctt tggaaactgc atgacttgag tgctggagag gcaaggggaa 660ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tgtggaggaa taccagtggc gaaggcgcct 720tgctggacag tgactgacgc tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 780ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taggtgttgg ggggacacac cccagtgccg 840aaggaaaccc aataagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 900attgacgggg gcccgcacaa gcagtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960ccttaccagg gcttgacatc cctctgaccg gtgcagagat gtaccttccc ttcggggcag1020aggagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc1080gcaacgagcg caacccttga tctgtgttac cagcacgtag aggtggggac tcacaggtga1140ctgccggcgt aagtcggagg aaggcgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ctttatgtcc1200tgggctacac acgtgctaca atgggcggta caacgggaag cgaagccgcg aggtggagca1260
aaacctaaaa agccgttcgt agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg1320aattgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatcc gttcccgggc cttgtacaca1380ccgcccgtca caccacgaga gtcggcaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cgttatggag1440ccagccgccg aaggtggggt tgatgattgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg1500aaggtgcggt tgga 151權(quán)利要求
1.引物，其特征在于，能擴增靶區(qū)域的堿基序列，所述靶區(qū)域選自脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA基因序列的81位～934位的核酸序列的一部分或其互補鏈，含有以下片斷(a)第1片斷，與脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA退火而作為引物起作用的堿基序列；(b)第2片斷，與第1片斷的3’側(cè)的核酸序列互補、位于第1片斷的5’側(cè)的堿基序列。
2.脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測用引物組合，其特征在于，所述引物組合由序列編號1～4所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成，可以擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域。
3.酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測用引物組合，其特征在于，所述引物組合由序列編號5～8所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成，可以擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域。
4.酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測用引物組合，其特征在于，所述引物組合由序列編號9～13所表示的核酸序列構(gòu)成的寡核苷酸組合所組成，可以擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域。
5.脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在脂環(huán)酸桿菌屬細菌的方法，其特征在于，以該脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用權(quán)利要求1所述的引物選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
6.脂環(huán)酸桿菌屬細菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在脂環(huán)酸桿菌屬細菌的方法，其特征在于，以該脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用權(quán)利要求2所述的引物組合選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
7.酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在酸土脂環(huán)酸桿菌的方法，其特征在于，以該酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用權(quán)利要求3所述的引物組合選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
8.酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測方法，它是檢測標本中是否存在酸土脂環(huán)酸桿菌的方法，其特征在于，以該酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域為靶，通過LAMP法用權(quán)利要求4所述的引物組合選擇性地擴增該16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
9.脂環(huán)酸桿菌屬細菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用權(quán)利要求1所述的引物通過LAMP法進行擴增反應，擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
10.脂環(huán)酸桿菌屬細菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用權(quán)利要求2所述的引物組合通過LAMP法進行擴增反應，擴增脂環(huán)酸桿菌屬細菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
11.酸土脂環(huán)酸桿菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用權(quán)利要求3所述的引物組合通過LAMP法進行擴增反應，擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
12.酸土脂環(huán)酸桿菌的識別方法，其特征在于，將標本進行增菌培養(yǎng)，從出現(xiàn)的細菌分離DNA試樣，對于該DNA試樣用權(quán)利要求4所述的引物組合通過LAMP法進行擴增反應，擴增酸土脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA的特定區(qū)域，確認是否存在該擴增產(chǎn)物。
13.脂環(huán)酸桿菌屬細菌或酸土脂環(huán)酸桿菌的檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括權(quán)利要求1～4中的任一項所述的引物或引物組合、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、反應緩沖液。
全文摘要
使用對于脂環(huán)酸桿菌屬細菌具特異性的引物，對該脂環(huán)酸桿菌的16S rDNA基因的特定區(qū)域通過LAMP法進行擴增，確認是否存在該擴增產(chǎn)物，從而檢測脂環(huán)酸桿菌屬細菌(特別是酸土脂環(huán)酸桿菌)。
文檔編號C12Q1/68GK1852992SQ200480027149
公開日2006年10月25日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月8日
發(fā)明者中北保一, 小川雅裕, 土屋陽一 申請人:札幌啤酒株式會社, 榮研化學株式會社