專利名稱：用于測定流體中是否存在抗生素的經(jīng)過改進的檢驗系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)過改進的、新穎的微生物檢驗系統(tǒng)，以及用所述檢驗系統(tǒng)，對流體(例如，奶、肉汁、血清和尿液)中是否存在抗細菌化合物進行測定的新方法。
背景技術(shù)：
用于測定流體(例如，奶、肉汁、血清和尿液)中抗細菌化合物的微生物檢驗方法已為人們所知了很長一段時間，所述抗細菌化合物特別是抗生素(例如頭孢菌素、青霉素、四環(huán)素及其衍生物)殘余物，以及化療藥物殘余物，例如磺胺類(sulfa’s)。此類檢驗的例子已被描述于CA2056581、DE 3613794、EP 0005891、EP 0285792、EP0611001、GB A1467439和US 4,946,777中。這類描述全都涉及即用型檢驗，其中使用了微生物，并通過加入到檢驗系統(tǒng)中的指示劑分子指示的變化來給出結(jié)果。其原理是當(dāng)抗細菌化合物以足以抑制微生物生長的濃度存在于流體中時，指示劑的顏色保持不變，而當(dāng)沒有抑制發(fā)生時，微生物的生長伴隨有酸或代謝產(chǎn)物的形成，或其它現(xiàn)象的發(fā)生，這會誘導(dǎo)出指示劑信號。
上述檢驗系統(tǒng)包括檢驗培養(yǎng)基以及pH指示劑和/或氧化還原指示劑，所述培養(yǎng)基例如是經(jīng)過微生物接種的瓊脂培養(yǎng)基，微生物優(yōu)選為Bacillus、Escherichia coli或Streptococcus的菌株。將微生物和指示劑加入到瓊脂溶液中，可選地，該溶液經(jīng)過緩沖；可選地，將營養(yǎng)物質(zhì)加入到溶液中，以及，可選地，將能改變某些抗微生物化合物靈敏度的物質(zhì)加入到溶液中。最終，使得瓊脂溶液固化，形成檢驗培養(yǎng)基，使微生物保持存活，而不會擴增，這是因為營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏和/或低溫造成的。合適的檢驗應(yīng)具有理想的關(guān)于待檢驗化合物的靈敏度。
目前市場上出現(xiàn)和/或文獻中描述的檢驗系統(tǒng)存在的問題在于，其對于某些抗生素來說靈敏度有限。該問題的后果之一就是對某些應(yīng)用而言，例如，當(dāng)閾值要求改變了的時候，用現(xiàn)有技術(shù)無法獲得足夠應(yīng)用的檢驗系統(tǒng)。因此，人們需要不存在上述問題的經(jīng)過改進的檢驗方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于測定流體中抗生素的經(jīng)過改進的方法。我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)應(yīng)用本發(fā)明的指示劑時，可獲得正面的效果。
通過在微生物檢驗系統(tǒng)中應(yīng)用本發(fā)明的指示劑，可以獲得對抗生素，例如β-內(nèi)酰胺和氨基糖苷的靈敏度方面的優(yōu)勢。通過在用于測定流體中抗生素的方法中應(yīng)用所述的指示劑，可以獲得靈敏度的提高。所述提高可多達25％，甚至可多達100％，這取決于相應(yīng)的抗生素。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用所述的指示劑可獲得下述檢測系統(tǒng)，其中，對陽性和陰性樣品進行比較時，所述檢測系統(tǒng)呈現(xiàn)出提高的視覺對比度。后一現(xiàn)象大大促進了對檢驗結(jié)果的視覺判斷的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明提供了用于測定流體中是否存在抗生素的檢驗系統(tǒng)，其包含檢驗培養(yǎng)基，檢驗培養(yǎng)基包含微生物、提供固體狀態(tài)的物質(zhì)和適于檢測青霉素G的指示劑，其特征在于，所述指示劑是具有如下通式的化合物 其中，R1、R2、R3和R4各自獨立地代表烷基、鹵素或氫，X＝C或S，如果X＝C，n＝1，如果X＝S，n＝0、1或2，R5和R6各自獨立地代表
其中R7、R8和R9各自獨立地代表烷基、帶支鏈的烷基、氫或鹵素，R10是烷基或帶支鏈的烷基，或其鹽。
此外，本發(fā)明提供了用于測定流體中是否存在抗生素的方法，所述方法包括如下步驟(a)將所述流體的樣品與檢驗培養(yǎng)基接觸，所述檢驗培養(yǎng)基包含微生物、至少一種用于提供固體狀態(tài)的物質(zhì)以及指示劑；(b)將所述的微生物培養(yǎng)一段時間，使得假設(shè)在流體樣品中不存在抗生素時使微生物生長；以及(c)用指示劑檢測微生物生長的生長情況或抑制情況，其特征在于，所述的指示劑是具有通式(I)的化合物。
此外，本發(fā)明還提供了適于對流體中抗生素進行檢測的試劑盒，其包含部分裝有檢驗培養(yǎng)基的容器，檢驗培養(yǎng)基包含微生物、膠凝劑和指示劑，其特征在于，所述指示劑是具有通式(I)的化合物。
最后，本發(fā)明提供了具有通式(I)的化合物作為用于抗生素的檢驗系統(tǒng)中指示劑的用途。
發(fā)明詳述下面給出的術(shù)語和縮寫用于本申請文件中，其定義如下。
術(shù)語“CFU”是菌落形成單位(Colony Forming Units)的縮寫，其表示能產(chǎn)生微生物菌落的微生物、微生物芽孢/孢子(spore)、微生物的部分發(fā)育的芽孢或營養(yǎng)細胞的數(shù)目。
術(shù)語“流體”指有流動性或服從其容器形狀的趨勢的(例如液體)物質(zhì)。
術(shù)語“膠凝劑(gelling agent)”指幫助混合物變?yōu)榛虺蔀槟z形式的化合物。
術(shù)語“指示劑”指用于對檢驗培養(yǎng)基關(guān)于是否存在特定物質(zhì)的狀態(tài)，(例如酸、堿、氧化或還原試劑)進行測量(例如，通過顏色或熒光的變化)的物質(zhì)。例如，術(shù)語“指示劑”可以指已知是pH指示劑的一種或多種化合物，也可以是已知是氧化還原指示劑的一種或多種化合物。此外，術(shù)語“指示劑”還指兩種或多種不同類型的指示劑的混合物，例如pH指示劑和氧化還原指示劑的組合。通常，當(dāng)使用兩種或多種指示劑時，這些指示劑共同作用，以使指示劑的效果較之每種指示劑單獨使用有所增加。
術(shù)語“營養(yǎng)物”指本發(fā)明的方法中用到的微生物生長所需要的或能促進其生長的一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)或成分。
術(shù)語“上樣設(shè)備”指可促使流體樣品被加入到檢驗培養(yǎng)基中的設(shè)備。此類設(shè)備可以是容器，可選地，具有體積標(biāo)識。此類容器可以是毛細管、注射器、移液管和自動移液系統(tǒng)。此類注射器或移液管可被設(shè)計為僅有一種操作模式下，可從待分析流體中排出預(yù)定體積。
術(shù)語“靈敏度”指給定系統(tǒng)感知某種狀態(tài)的靈敏程度。更具體地，在本發(fā)明的情況下，“靈敏度”指樣品中抗生素可被檢測到的濃度的程度。
術(shù)語“芽孢/孢子”指微生物產(chǎn)生的、通常為單細胞的、通常對環(huán)境具有抗性的、休眠的或生殖體，其能發(fā)育成新的個體微生物。
術(shù)語“檢驗培養(yǎng)基”指組合物，例如，溶液，固體，或者，優(yōu)選地，以溶膠或凝膠形式存在的，例如包含膠凝劑。合適的膠凝劑的例子是瓊脂、褐藻酸及其鹽、角叉膠、明膠、羥丙基瓜爾膠(hydroxypropylguar)及其衍生物、角豆膠(Carob膠)、經(jīng)加工的麒麟菜屬海藻等。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解，其它類型的固體檢驗培養(yǎng)基可以基于載體物質(zhì)，例如陶瓷、棉花、玻璃、金屬顆粒、紙張、任何形狀或形式的聚合物、硅酸鹽、海綿、羊毛等。通常，檢驗培養(yǎng)基含有一種或多種指示劑，但是，上述化合物還可在檢驗進行之時加入。檢驗培養(yǎng)基包含一種或多種類型的微生物作為檢測劑。可選地，檢驗培養(yǎng)基還可以含有一種或多種緩沖液、營養(yǎng)物、穩(wěn)定劑、以正面或負面方式改變對某種抗微生物化合物的靈敏度的物質(zhì)、和/或增加粘度的試劑。當(dāng)培養(yǎng)基中存在緩沖液時，可在對培養(yǎng)基成分進行混合期間將其加入，或者，培養(yǎng)基成分可溶于和/或懸浮于緩沖液中?？蛇x地，對檢驗培養(yǎng)基進行滅菌，通常將pH調(diào)至需要的值。能改變對某種抗微生物化合物的靈敏度的物質(zhì)的例子是抗葉酸制劑，例如歐美德普(ormethoprim)、四氧普林(tetroxoprim)和三甲氧芐二氨嘧啶(trimethoprim)，其能提高微生物對磺胺類化合物或草酸鹽或氫氟酸鹽的靈敏度，提高對四環(huán)素的靈敏度。增加粘度的試劑的例子是抗壞血酸甲硅烷醇梳狀聚合物(ascorbyl methylsilanol pectinate)、卡波姆(carbomer)、羧甲基纖維素、Cetearyl Alcohol、鯨臘醇(cetylalcohol)、鯨臘酯(cetyl ester)、椰油酰胺DEA、乳化臘、葡萄糖、羥乙基纖維素、羥丙甲基纖維素、月桂酰胺DEA、亞油酰胺DEA、硅酸鋁鎂、麥芽糊精、PEG-8二硬脂酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、PVP/十六烯共聚物、氯化鈉、硫酸鈉、大豆氨基丙基甜菜堿(soyamidopropylbetaine)、黃原膠等?；蛘?，上文提到的檢驗培養(yǎng)基的可選成份可以由外源加入。檢驗培養(yǎng)基可被包含于任何類型的容器中；通常所用的容器是試管、微滴定板和培養(yǎng)皿。
術(shù)語“閾值”指這樣的濃度值，高于該值時，給定的被分析物被認為是存在的，而低于該值時，所述被分析物就被認為是不存在的。通常，對于特定樣品中特定被分析物而言，閾值是由當(dāng)?shù)?、地區(qū)或區(qū)域間的權(quán)威機構(gòu)給出的，但對于某些研究目的而言，也可對其進行預(yù)先設(shè)定。
在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種檢驗系統(tǒng)，其中包含檢驗培養(yǎng)基。該檢驗培養(yǎng)基包含微生物、提供固體狀態(tài)的物質(zhì)和至少一種指示劑，指示劑中至少有一種具有上文給出的通式(I)。所述指示劑的優(yōu)選的例子是溴甲酚綠(Bromocresol Green)、溴百里酚藍(Bromothymol Blue)、氯甲酚綠(Chlorocresol Green)、間甲酚紫(m-Cresol Purple)、麝香草酚藍(Thymol Blue)和二甲酚藍(Xylenol Blue)。最優(yōu)選地，指示劑是溴百里酚藍。
優(yōu)選地，提供固體狀態(tài)的物質(zhì)是膠凝劑和/或載體物質(zhì)。檢驗培養(yǎng)基中膠凝劑的量可在2至100g·l-1之間，優(yōu)選在5至50g·l-1之間，更優(yōu)選在10至20g·l-1之間，最優(yōu)選在12至15g·l-1之間。優(yōu)選地，膠凝劑是瓊脂。
在本發(fā)明的第一個方面的一種實施方式中，微生物是熱穩(wěn)定性的微生物，例如Bacillus的種(優(yōu)選為Bacillus stearothermophilus)、Escherichiacoli種或Streptococcus的種(優(yōu)選為Streptococcus thermophilus)。上述菌種可作為能產(chǎn)生菌落的單位，或菌落形成單位(CFU’s)被引入到檢驗中。所述CFU’s可以是芽孢/孢子、營養(yǎng)細胞或它們的混合物。所述CFU’s的濃度可表達為每ml檢驗培養(yǎng)基中菌落形成單位(CFU·ml-1)的形式，其通常在1×105至1×1012CFU·ml-1之間，優(yōu)選在1×106至1×1010CFU·ml-1之間，更優(yōu)選在2×106至1×109CFU·ml-1之間，最優(yōu)選在5×106至1×108CFU·ml-1之間，或者進一步更優(yōu)選在5×106至2×107CFU·ml-1之間。
在本發(fā)明的第二個方面，提供了一種測定流體中的抗生素的方法，所述方法包括如下步驟在營養(yǎng)物質(zhì)存在時，將所述流體的樣品與根據(jù)本發(fā)明第一個方面的檢驗培養(yǎng)基接觸。有利地，該方法提供了下述條件通過將檢驗培養(yǎng)基保持于能阻止生長的條件下(例如相對低溫和/或缺乏用于生長的必要營養(yǎng)物)，使得在加入流體樣品之前，沒有微生物的生長。加入流體樣品后，通過加入營養(yǎng)物(可選地，在接觸所述流體樣品前)，和/或升高溫度，和/或提供使微生物得以生長的pH值，從而在足夠長的時間段內(nèi)允許微生物生長的進行，假設(shè)沒有抗生素存在的話，該時間段足以令微生物生長；并且，通過對指示劑是否存在變化進行觀察，來檢測微生物的生長情況。本發(fā)明的方法還包括在加入檢驗培養(yǎng)基之前，對樣品進行混合(例如，與其它樣品混合，還可與鹽、緩沖化合物、營養(yǎng)物、穩(wěn)定劑、同位素標(biāo)記的化合物、熒光標(biāo)記的化合物等混合)、濃縮和/或稀釋(例如，用稀釋性液體，例如，水，奶，或來自奶的液體，血液或來自血液的液體、尿液和/或溶劑)。
在本發(fā)明第二個方面的一種實施方式中，抗生素是β-內(nèi)酰胺抗生素，例如頭孢菌素或青霉素衍生物。此類衍生物的例子是阿莫西林、氨芐青霉素(ampicillin)、頭孢羥氨芐(cefadroxil)、頭孢拉定(cefradine)、頭孢噻呋(ceftiofur)、頭孢氨芐(cephalexin)、青霉素G、青霉素V和替卡西林(ticarcillin)，但是，當(dāng)然，很多其它類似的β-內(nèi)酰胺衍生物也是已知的，并可用于本發(fā)明的方法。在另一種實施方式中，抗生素是氨基糖苷(aminoglycoside)，例如新霉素(neomycin)。
有利地，已經(jīng)確定，本發(fā)明的方法展示出對抗生素的選擇性(selectivity)，特別是對β-內(nèi)酰胺抗生素和氨基糖苷的選擇性。
在本發(fā)明的第二個方面的另一種實施方式中，微生物的生長在預(yù)定的時間內(nèi)發(fā)生，優(yōu)選地，在0.5至4小時的時間跨度內(nèi)，更優(yōu)選地，在1至3.5小時的時間跨度內(nèi)，最優(yōu)選地，在2.0至3.25小時的時間跨度內(nèi)。優(yōu)選地，微生物的生長在預(yù)定的溫度下進行，優(yōu)選地，在微生物的最佳生長溫度下進行。例如，當(dāng)使用熱穩(wěn)定微生物時，所述溫度優(yōu)選在40至70℃之間，更優(yōu)選在50至65℃之間，最優(yōu)選在60至64℃之間?？蛇x地，所述反應(yīng)在溫度調(diào)節(jié)設(shè)備的協(xié)助下進行?；蛘?，微生物生長所需要的時間等于不含任何能引起指示劑變化的被分析物的校正樣品需要的時間。
在本發(fā)明的第二個方面的又一種實施方式中，營養(yǎng)物作為單獨的來源加入，例如，作為藥片、圓盤(disc)或紙質(zhì)過濾器(paper filter)。此外，其它化合物，例如指示劑、微生物、穩(wěn)定劑和/或抗葉酸制劑也可作為單獨的來源加入，可選地，被包括進營養(yǎng)培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的第二個方面的另一種實施方式中，提供了一種測定流體樣品中是否存在抗生素的方法，其中，流體樣品與檢驗培養(yǎng)基的比例超過2∶3(0.68∶1)(v/v)。優(yōu)選地，所述比例為至少20∶27(0.74∶1)(v/v)，更優(yōu)選地，所述比例為至少25∶27(0.93∶1)(v/v)，最優(yōu)選地，所述比例為至少2∶1(v/v)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對流體樣品的量的上限而言，沒有技術(shù)原因上的限制。實際操作中，該體積不應(yīng)超過容納檢驗培養(yǎng)基的容器的最大容量。例如，在具有0.2ml檢驗培養(yǎng)基的2ml容器中，應(yīng)當(dāng)加入不超過1.8ml的流體樣品。實際操作中，用于開展本發(fā)明的方法的容器的體積很少超過50ml，因此將被加入的流體樣品的量不應(yīng)超過50ml，優(yōu)選為10ml，更優(yōu)選為5ml，進一步更優(yōu)選為2ml，最優(yōu)選為1ml。因此，通常，流體樣品的體積與檢驗培養(yǎng)基體積比例的上限為250∶1(v/v)，優(yōu)選為50∶1(v/v)，更優(yōu)選為25∶1(v/v)，進一步更優(yōu)選為10∶1(v/v)，最優(yōu)選為5∶1(v/v)。優(yōu)選地，流體樣品的體積大于檢驗培養(yǎng)基的體積。
通過觀察所用的一種或多種指示劑是否存在變化，來測得本發(fā)明方法的結(jié)果。例如，當(dāng)上述變化是顏色變化時，可以通過視覺觀察到所述的顏色變化。但是，在本發(fā)明的一種實施方式中，所述顏色變化可通過如下方法來測定使用能產(chǎn)生數(shù)字圖像數(shù)據(jù)的裝置(arrangement)，或能產(chǎn)生模擬圖像數(shù)據(jù)并能將所述模擬圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像數(shù)據(jù)的裝置，然后通過計算機處理器對所述數(shù)字圖像數(shù)據(jù)進行解讀。此類裝置，可以例如是樣品閱讀設(shè)備，例如與個人計算機偶聯(lián)的掃描儀，被描述于國際專利申請WO 03/033728中，該申請文件通過引用的方式被包括進本文，并在下文中對其進行了簡要概括。
該裝置適用于，例如，對奶中的抗生素殘余物進行檢測。用該裝置，可以對檢驗板中每種樣品的底部進行檢測。用三個變量來記錄被反射的光的顏色和亮度，每個描述一種顏色分量，例如，所謂的L*a*b*模型，在L*a*b*模型中，色譜被分為二維矩陣。用兩個變量“a”和“b”來記錄顏色在矩陣中的位置。變量L表示強度(例如，從淡藍到深藍)?？梢詷?gòu)建出包含a值、b值和L值的標(biāo)準(zhǔn)，來構(gòu)建出如下復(fù)合函數(shù)Z＝wL·L+wa·a+wb·b其中wL、wa和wb分別是L值、a值和b值的權(quán)重因子。上述權(quán)重因子的值可通過“判別分析(discriminent analysis)”來計算，使得組的平均值展示出相對擴展(spreading)而言最大的距離(distance)。通過以預(yù)定的方式(這取決于殘余物和樣品的類型)，對L*a*b*模型的兩種或多種顏色分量進行組合，可能可以獲得精確的檢測。實際操作中，通過實驗來預(yù)先確定作為陽性和陰性結(jié)果之間轉(zhuǎn)化值的某個Z值。
在本發(fā)明的第三個方面，提供了開展本發(fā)明第二個方面的方法的試劑盒。此類試劑盒包含一種或多種容器，容器中裝有本發(fā)明第一個方面所述的檢驗培養(yǎng)基；以及，可選地，包含上樣設(shè)備。容器可以是任何形狀和尺寸的試管，其可來自任何可獲得的材料，只要能夠觀察到指示劑的變化即可。此外，容器還可以是孔(well)，例如，包括于微滴定板中的。
所述上樣設(shè)備是協(xié)助將流體加入到所述檢驗培養(yǎng)基中的設(shè)備。優(yōu)選地，此類設(shè)備可以是容器，可選地，具有體積標(biāo)識。更優(yōu)選地，此類容器是注射器、移液管和自動移液系統(tǒng)。此類注射器或移液管可被設(shè)計為僅有一種操作模式下，可從待分析流體中排出預(yù)定體積?？蛇x地，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的、用單種操作即可操縱多于一支的注射器或移液管的系統(tǒng)。本發(fā)明的第二個方面的目的是提供一種試劑盒，其使得可以很簡單地加入根據(jù)本發(fā)明第一個方面的將被加入的流體的量?？蛇x地，所述試劑盒包含用于在培養(yǎng)期間對裝有檢驗培養(yǎng)基的所述容器進行密封的設(shè)備，和/或用于使用的說明書，和/或用于設(shè)定培養(yǎng)所需要的時間的設(shè)備。
在本發(fā)明的第三個方面的一種實施方式中，所述試劑盒包含營養(yǎng)物。優(yōu)選地，所述營養(yǎng)物被包含于介質(zhì)內(nèi)，例如，藥片、圓盤或紙質(zhì)過濾器。提供被包含于介質(zhì)中的營養(yǎng)物的好處在于，使用者可以很容易地將它們加入到檢驗培養(yǎng)基中，并且加入量可以預(yù)先確定，以避免在加入所需劑量方面的錯誤。此外，其它化合物，例如(多種)指示劑、穩(wěn)定劑和/或抗葉酸制劑也可作為單獨的來源加入，可選地，被包括于營養(yǎng)培養(yǎng)基中。
在本發(fā)明的第三個方面的另一種實施方式中，所述試劑盒包含溫度調(diào)節(jié)設(shè)備，在其協(xié)助下，檢驗樣品可被保持于預(yù)先設(shè)定的溫度下，例如，微生物能展示出充分生長的溫度下。優(yōu)選地，所述溫度調(diào)節(jié)設(shè)備被設(shè)計為其能容納裝有檢驗培養(yǎng)基的所述容器?？蛇x地，溫度調(diào)節(jié)設(shè)備與設(shè)定需要用于培養(yǎng)的時間的裝置偶聯(lián)，使得在預(yù)先設(shè)定的階段結(jié)束之后，加熱和/或冷卻也可停止。
在本發(fā)明的第三個方面的又一種實施方式中，所述試劑盒包含數(shù)據(jù)載體，其上載有計算機程序，該程序適于指導(dǎo)計算機對從樣品閱讀設(shè)備獲得的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)進行分析。所述數(shù)據(jù)載體可以是適于存儲數(shù)字信息的任何載體，例如，CD-ROM、磁盤、DVD、存儲卡、磁帶等。有利地，所述載有計算機程序的數(shù)據(jù)載體提供了獲得適于用于本發(fā)明方法的最新可獲得的計算機程序的簡單途徑。
在本發(fā)明的第四個方面，提供了具有通式(I)的化合物用于在微生物抑制檢驗中提高對抗生素的靈敏度的用途。
實施例實施例1 在對青霉素G的測定中，溴百里酚藍和溴甲酚紫的比較通過用指示劑溴百里酚藍(160mg·l-1)來代替溴甲酚紫，對可根據(jù)EP 0005891所述的方法制備出的、可從商業(yè)途徑獲得的DelvotestMCS進行改造。通過在不同檢驗系統(tǒng)中對含有不同濃度青霉素G的樣品進行研究，來測定對青霉素G的靈敏度。結(jié)果被總結(jié)于下表中(靈敏度的值以ppb表示)。

1.對0、2、4和6ppb的青霉素G濃度進行研究。
2.對0、1、2、3和4ppb的青霉素G濃度進行研究。
實施例2 在對多種抗生素的測定中，溴百里酚藍和溴甲酚紫的比較通過用指示劑溴百里酚藍(160mg·l-1)來代替溴甲酚紫，對可根據(jù)EP 0005891所述的方法制備出的、可從商業(yè)途徑獲得的DelvotestMCS進行改造。通過用平板檢驗或試管檢驗系統(tǒng)，對兩組(每組六個)實驗進行研究，來測定對不同抗生素的靈敏度。在不含抗生素的對照樣品改變顏色的時刻，通過讀取實驗數(shù)據(jù)測定靈敏度。從被總結(jié)于下表中的結(jié)果(靈敏度的值以ppb表示)可以看出，對所有被研究的抗生素而言，溴百里酚藍都比溴甲酚紫(BP)展示出更好的靈敏度，只是除了磺胺嘧啶，這兩種指示劑對磺胺嘧啶的靈敏度相同。


1.BP溴甲酚紫實施例3 溴百里酚藍和溴甲酚紫的濃度效果的比較制備兩套檢驗系統(tǒng)。其區(qū)別僅在于，第一套系統(tǒng)中采用可從商業(yè)途徑獲得的DelvotestMCS，其中溴甲酚紫的濃度為160mg·l-1，而第二套系統(tǒng)中則用溴百里酚藍(160mg·l-1)代替了第一套系統(tǒng)中的溴甲酚紫。在不含抗生素的對照樣品改變顏色的時刻，通過讀取實驗數(shù)據(jù)測定對青霉素G的靈敏度。從展示于下表(靈敏度的值以ppb表示)的結(jié)果可以看出，指示劑濃度相同時，溴百里酚藍的靈敏度優(yōu)于溴甲酚紫。

實施例4 在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的微生物抑制檢驗中溴百里酚藍和溴甲酚紫的比較制備兩套生產(chǎn)規(guī)模的檢驗系統(tǒng)。第一套系統(tǒng)中采用可從商業(yè)途徑獲得的DelvotestMCS，而第二套系統(tǒng)中則用溴百里酚藍(160mg·l-1)代替了第一套系統(tǒng)中的溴甲酚紫。在不含抗生素的對照樣品改變顏色的時刻，通過讀取實驗數(shù)據(jù)測定對不同抗生素的靈敏度。結(jié)果展示于下表中(靈敏度的值以ppb表示)。

1.批次#1，生產(chǎn)后立即使用。
2.批次#1，生產(chǎn)后過三周再使用。
權(quán)利要求
1.用于測定流體中是否存在抗生素的檢驗系統(tǒng)，其包含檢驗培養(yǎng)基，所述檢驗培養(yǎng)基包含微生物、至少一種提供固體狀態(tài)的物質(zhì)和適于檢測青霉素G的指示劑，其特征在于，所述指示劑是具有如下通式的化合物 其中，R1、R2、R3和R4各自獨立地代表烷基、鹵素或氫，X＝C或S，如果X＝C，n＝1，如果X＝S，n＝0、1或2，R5和R6各自獨立地代表 其中R7、R8和R9各自獨立地代表烷基、帶支鏈的烷基、氫或鹵素，R10是烷基或帶支鏈的烷基，或其鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的檢驗系統(tǒng)，其中R10是甲基。
3.如權(quán)利要求2所述的檢驗系統(tǒng)，其中所述指示劑是溴百里酚藍。
4.測定流體中是否存在抗生素的方法，所述方法包括如下步驟(a)將所述流體的樣品與檢驗培養(yǎng)基接觸，所述檢驗培養(yǎng)基包含微生物、至少一種用于提供固體狀態(tài)的物質(zhì)以及指示劑；(b)將所述的微生物培養(yǎng)一段時間，使得假設(shè)在流體樣品中不存在抗生素時使微生物生長；以及(c)用指示劑檢測微生物生長的生長情況或抑制情況，其特征在于，所述檢驗系統(tǒng)是如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的檢驗系統(tǒng)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，待測定的抗生素是β-內(nèi)酰胺抗生素。
6.如權(quán)利要求4至5中任意一項所述的方法，其中，將對其中抗生素進行測定的流體是可從動物或人體中獲得的流體。
7.如權(quán)利要求4至6中任意一項所述的方法，其中，所述流體的體積與檢驗培養(yǎng)基的體積的比例超過0.68∶1。
8.如權(quán)利要求4至7中任意一項所述的方法，其中液體樣品的體積與檢驗培養(yǎng)基的體積的比例超過20∶27(0.74∶1)(v/v)、25∶27(0.93∶1)(v/v)或2∶1(v/v)。
9.如權(quán)利要求4至8中任意一項所述的方法，其中，液體樣品的體積大于檢驗培養(yǎng)基的體積。
10.適于測定流體中抗生素的試劑盒，其包含部分裝有檢驗培養(yǎng)基的容器，所述檢驗培養(yǎng)基包含微生物、膠凝劑和指示劑，其特征在于，所述指示劑是具有通式(I)的化合物。
11.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其還包含適于允許微生物生長的營養(yǎng)物。
12.如權(quán)利要求10至11中任意一項所述的試劑盒，還包含溫度調(diào)節(jié)設(shè)備，在其協(xié)助下檢驗樣品可被保持于預(yù)先設(shè)定的溫度。
13.如權(quán)利要求10至12中任意一項所述的試劑盒，還包含載有計算機程序的數(shù)據(jù)載體，所述程序適于指導(dǎo)計算機對從樣品閱讀設(shè)備獲得的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)進行分析。
14.具有通式(I)的化合物作為抗生素檢驗系統(tǒng)中的指示劑的用途。
15.如權(quán)利要求14所述的用途，其中，所述抗生素是β-內(nèi)酰胺抗生素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢驗系統(tǒng)、檢驗方法和檢驗試劑盒，它們基于一種檢驗培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中包含溴百里酚藍或結(jié)構(gòu)相關(guān)的指示劑。
文檔編號C12Q1/18GK1816633SQ200480018780
公開日2006年8月9日 申請日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月2日
發(fā)明者安吉莉娜·蒂克爾, 科尼利厄斯·雅各布斯·布祖基琴, 范·約翰尼斯·西奧多西婭·阿利亞·皮爾特, 德·安格里克·里克, 雅各布斯·斯塔克, 彼得·克尼里斯·朗蘭 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司