專利名稱：蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的與擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)蛋白酶同源的分離多肽，還涉及編碼該多肽的分離的核酸序列。此外，本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，載體，以及包含這些核酸序列的包括轉(zhuǎn)基因植物和非人動物的宿主細(xì)胞，還涉及生產(chǎn)及使用此蛋白酶的方法，尤其在動物飼料中。
本發(fā)明的蛋白酶具有高度的特異活性。公開了與蛋白酶的高特異活性有關(guān)的特有結(jié)構(gòu)特征，該蛋白酶屬于肽酶家族S2A或S1E。
背景技術(shù)：
WO88/03947中公開了源于擬諾卡氏菌(Nocardiopsis sp.)NRRL 18262和達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的蛋白酶。DK申請no.1996 00013中公開了源于擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列。WO 01/58276公開了與源于擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶有關(guān)的酸穩(wěn)定性蛋白酶，以及源于Nocardiopsis alba DSM 14010的蛋白酶在動物飼料中的應(yīng)用。然而，這些蛋白酶具有低的特異活性。
JP 2-255081-A公開了源于擬諾卡氏菌株系OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，但沒有序列信息。該株系(strain)已不能獲得，因為其保藏已撤消。
DD20043218公開了源于Nocardiopsis dassonvillei株系ZIMET 43647的蛋白水解制劑，然而沒有序列信息。該株系看起來已無法獲得。
公布于本發(fā)明首次申請日之后的JP 2003284571-A公開了源于擬諾卡氏菌TOA-1(FERM P-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA序列。該序列已登錄到GENESEQP，條目號為no.ADF43564。
最為同源的已有非擬諾卡氏菌蛋白酶是SapII_Streptomyces_sp_sptrembl_q55353，其成熟部分與SEQ ID NO2和6的成熟部分分別具有61.5％和63.5％的氨基酸同一性。相應(yīng)的DNA與SEQ ID NO1和5分別具有70.3％和72.7％的同一性。相關(guān)的鏈霉菌(Streptomyces)蛋白酶的成熟部分即SapII_Streptomyces_sp_sptrembl_q55352與SEQ ID NO1的成熟部分具有稍高的同一性百分率，即70.8％。
本發(fā)明的目的是提供具有高特異活性的與擬諾卡氏菌蛋白酶同源的蛋白酶，尤其是具有用于動物飼料和/或洗滌劑潛力的蛋白酶。
發(fā)明概述已分離并鑒定了具有高特異活性的蛋白酶，即源于Nocardiopsis albaDSM 15647(見SEQ ID NO1和2)的蛋白酶，和源于Nocardiopsisdassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43235(見SEQ ID NO5和6)的蛋白酶。
第一個方面，本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，且在pH7.5和25℃下具有至少39AU/g的針對血紅蛋白的特異活性，其中多肽選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO6的1-192位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸雜交的核酸序列所編碼的多肽；(c)由與SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷具有至少74％同一性的核酸序列所編碼的多肽。本發(fā)明還涉及編碼這樣的蛋白酶的分離的核酸序列；核酸構(gòu)建體，載體，和包含此核酸序列的宿主細(xì)胞；還涉及生產(chǎn)此蛋白酶的方法，以及在尤其是動物飼料方面使用此蛋白酶。
第二個方面，本發(fā)明涉及A.肽酶家族S2A和/或肽酶家族S1E具有蛋白酶活性的分離的多肽，且在指定位置具有包含至少一個下述氨基酸的氨基酸序列25S，38T，42P，44S，49Q，54R，62S，89S，91S，92S，95A，99Q，100I，114V，120T，125Q，129Q，131L，135N，147F，151S，165S，166F，171Y，176N，179L，180S，184L，和/或185T；優(yōu)選25S，38T，42P，44S，54R，62S，125Q，131L，165S，171Y，176N，179L，180S，184L，和/或185T；更優(yōu)選同時具有至少一個24A，51V，53E，86A，87T，96I，和/或186L；和/或同時具有(H35+D61+S143)；其中每個位置對應(yīng)于SEQ IDNO2的位置。
B.包含在指定位置具有至少一個下述氨基酸的A所述的多肽38T，92S，120T，125Q，131L，135N，147F，151S，165S，和/或171Y。
C.包含在指定位置具有至少一個下述氨基酸的A所述的多肽25S，42P，44S，49Q，54R，62S，89S，91S，95A，99Q，100I，114V，129Q，166F，176N，179L，180S，184L，和/或185T。
D.A、B、或C中任何一個多肽，其具有用DSC在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉、pH7.0測定時至少78℃的Tm；在pH9及80℃時至少0.40的相對活性；和/或在pH7.5及25℃時對血紅蛋白至少39AU/g的特異活性。
E.A、B、C或D中任何一個多肽，其與SEQ ID NO2的-167至188位氨基酸，優(yōu)選1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO6的-160至192位氨基酸，優(yōu)選1-192位氨基酸具有至少65％的同一性百分?jǐn)?shù)，更優(yōu)選與SEQ IDNO2的1-188位氨基酸，或-167(167)至188位氨基酸具有至少50％的同一性百分?jǐn)?shù)。
F.A、B、C、D或E中任何一個多肽，其是i)細(xì)菌蛋白酶；ii)放線菌(Actinobacteria)門的蛋白酶；iii)放線菌綱的(the class Actinobacteria)；iv)放線菌(Actinomycetales)目的；v)擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)的；vi)擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)的；和/或源于vii)擬諾卡氏菌種如Nocardiopsisalba，南極擬諾卡氏菌(Nocardiopsis antarctica)，Nocardiopsis prasina，Nocardiopsis composta，Nocardiopsis exhalans，Nocardiopsis halophila，Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、Nocardiopsis listeri、Nocardiopsis lucentensis、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsis trehalosi，熱帶擬諾卡氏菌(Nocardiopsistropica)、Nocardiopis umidischolae、新疆?dāng)M諾卡氏菌(Nocardiopsisxinjiangensis)、或Nocardiopsis dassonvillei；和任選地也源于Nocardiopsisalkaliphila，例如源于Nocardiopsis alba的蛋白酶，例如，Nocardiopsis albaDSM 15647、或源于Nocardiopsis dassonvillei的蛋白酶、例如Nocardiopsisdassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43235，例如具有SEQ ID NO2的-167至188，優(yōu)選1-188位氨基酸序列的多肽，和/或具有SEQ ID NO6的-160至192，優(yōu)選1-192位氨基酸序列的多肽。
G.包含編碼A、B、C、D、E或F中任何一個多肽的核酸序列的分離的核酸序列。
H.包含與一個或多個控制序列可操作相連的G的核酸序列的核酸構(gòu)建體，控制序列引導(dǎo)多肽在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中生產(chǎn)。
I.包含H的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
J.包含H的核酸構(gòu)建體或I的載體的重組宿主細(xì)胞。
K.生產(chǎn)A、B、C、D、E或F中任一多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)J的重組宿主細(xì)胞以生產(chǎn)包含該多肽的上清；和(b)回收該多肽。
L.能夠表達(dá)A、B、C、D、E或F中任一多肽的轉(zhuǎn)基因植物、或植物部分。
M.能夠表達(dá)A、B、C、D、E或F中任一多肽的轉(zhuǎn)基因非人動物、或產(chǎn)物、或其部分(element)。
N.A、B、C、D、E或F任一個所定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在制備用于動物飼料的組合物中；(iii)用于提高動物飼料的營養(yǎng)價值；(iv)用于增加動物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用于提高動物食物中蛋白質(zhì)的水解程度；和/或(vi)用于處理蛋白質(zhì)的用途。
O.包含A、B、C、D、E或F中任一個所定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶性維生素，和/或(b)至少一種水溶性維生素，和/或(c)至少一種微量礦質(zhì)元素(mineral)的動物飼料添加劑。
P.粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含A、B、C、D、E或F任一個所定義的至少一種多肽，或包含至少一種O的飼料添加劑。
Q.包含A、B、C、D、E或F中任一個所定義的至少一種多肽的組合物，其還同時包含至少一種選自α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(galactanase)(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)中的至少一種其他酶。
R.A、B、C、D、E或F中任一個所定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
第三個方面，本發(fā)明涉及a.具有蛋白酶活性的分離的多肽，選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位氨基酸有至少86％同一性，和/或與SEQ ID NO6的1-192位氨基酸有至少72％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷中任意一個，(ii)至少100個核苷的序列(i)的子序列；和/或(iii)(i)-(ii)任意一個的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼的多肽；(c)具有SEQ ID NO2的1至188位氨基酸，或SEQ ID NO6的1-192位氨基酸的多肽的變異體，包含一個或多個氨基酸的取代，刪除，延伸，和/或插入；(d)(a)、(b)、或(c)的等位變異體；和(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的片段；b.分離的核酸序列，其為包含(a)編碼a的多肽的核酸序列；(b)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且其在中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷中任意一個，(ii)序列(i)的至少100個核苷；和/或(iii)(i)-(ii)任意一個的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列；和/或(c)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且其與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷具有至少86％的同一性，和/或與SEQ ID NO5的568-1143位核苷具有至少82％的同一性的核酸序列的分離的核酸序列。
c.分離的核酸序列，其為通過(a)在中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下將DNA與(i)SEQID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷中的任意一個；(ii)序列(i)的至少100個核苷；和/或(iii)(i)-(ii)中任一個的互補(bǔ)鏈雜交；和(b)分離核酸序列，來生產(chǎn)分離的核酸序列；d.包含與一個或多個控制序列可操作相連的b或c的核酸序列的核酸構(gòu)建體，控制序列引導(dǎo)多肽在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中生產(chǎn)；e.包含d的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體；f.包含d的核酸構(gòu)建體或e的載體的重組宿主細(xì)胞；g.生產(chǎn)a的多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)f的重組宿主細(xì)胞以生產(chǎn)包含該多肽的上清(supernatant)；和(b)回收該多肽；h.能夠表達(dá)a的多肽的轉(zhuǎn)基因植物、或植物部分；i.能夠表達(dá)a的多肽的轉(zhuǎn)基因非人動物、或產(chǎn)物、或其部分；j.生產(chǎn)a的多肽的方法，該方法包含(a)培養(yǎng)下述株系中的任一個(i)Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM 43235，或Nocardiopsis albaDSM 15647；和(b)回收多肽；k.a中定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在制備用于動物飼料的組合物中；(iii)用于提高動物飼料的營養(yǎng)價值；(iv)用于增加動物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用于提高動物食物中蛋白質(zhì)的水解程度；和/或(vi)用于處理蛋白質(zhì)的用途；
l.包含a中定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶維生素，和/或(b)至少一種水溶維生素，和/或(c)至少一種微量礦質(zhì)元素的動物飼料添加劑；m.粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含a中定義的至少一種多肽，或包含至少一種l的飼料添加劑；n.包含a中定義的至少一種多肽的組合物，其還同時包含至少一種選自α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)中的至少一種其他酶；以及o.a中定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
第四個方面，本發(fā)明涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位氨基酸有至少84％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)具有與SEQ ID NO2的-167至188位氨基酸有至少78％同一性的氨基酸序列的多肽；(c)由在中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)可使用引物SEQID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位核苷；(iii)SEQ ID NO1的1-1065位核苷；(iv)至少100個核苷的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼的多肽；(d)具有SEQ ID NO2的1至188，或-167至188位氨基酸序列的多肽的變異體，其包含一個或多個氨基酸的取代、刪除、延伸、和/或插入；(e)(a)、(b)或(c)的等位變異體；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段。
具有蛋白酶活性的分離的多肽，其在用差示掃描量熱法(DiffrentialScanning Calorimetry，DSC)在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液、pH7.0、掃描速率常數(shù)1.5℃/min的條件下測定時，具有至少78℃的解鏈溫度(Tm)，其中多肽選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位氨基酸有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)具有與SEQ ID NO2的-167至188位氨基酸有所述同一性的氨基酸序列的多肽；(c)由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位核苷；(iii)SEQ IDNO1的1-1065位核苷；(iv)至少100個核苷的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼的多肽；(d)具有SEQ ID NO2的1至188，或-167至188位氨基酸序列的多肽的變異體，其包含一個或多個氨基酸的取代、刪除、延伸、和/或插入；(e)(a)、(b)或(c)的等位變異體；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段。
包含(a)編碼以上定義的多肽的核酸序列；(b)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且在中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位或1-1065位核苷；(iii)至少100個核苷的(i)或(ii)的子序列；和/或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列；(c)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且與SEQ ID NO1的502-1065位核苷有至少86％同一性的核酸序列；(d)編碼具有蛋白酶活性的多肽，且與SEQ ID NO1的1-1065位核苷有至少82％同一性的核酸序列的分離的核酸序列。
包含編碼具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列的分離的核酸序列，其在用差示掃描量熱法(DSC)在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液、pH7.0、掃描速率常數(shù)1.5℃/min的條件下測定時，具有至少78℃的解鏈溫度(Tm)，其中所述核酸序列(a)編碼如上定義的Tm至少為78℃的多肽；(b)在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位或1-1065位核苷；(iii)至少100個核苷的(i)或(ii)的子序列；和/或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；(c)與SEQ ID NO1的502-1065位核苷具有至少50％的同一性；和/或(d)與SEQ ID NO1的1-1065位核苷具有至少50％的同一性。
分離的核酸序列，其通過(a)在中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下將DNA與(i)可使用引物SEQ ID NO.3和4由Nocardiopsis alba DSM 15647基因組DNA獲得的編碼蛋白酶的DNA；(ii)SEQ ID NO1的502-1065位核苷；(iii)至少100個核苷的(i)或(ii)的子序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；和(b)分離核酸序列而生產(chǎn)。
核酸構(gòu)建體，其包含緊接本段的上面三段中任何一段所定義的三條核酸序列之一，其中所述核酸序列與一個或多個引導(dǎo)多肽在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中生產(chǎn)的控制序列可操作相連。
包含所述核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
包含所述核酸構(gòu)建體或載體的重組宿主細(xì)胞。
生產(chǎn)上述定義的多肽的方法，該方法包含(a)培養(yǎng)權(quán)利要求8的重組宿主細(xì)胞以生產(chǎn)包含所述多肽的上清；和(b)回收所述多肽。
能夠表達(dá)上述定義的多肽的轉(zhuǎn)基因植物，或植物部分。
能夠表達(dá)如上定義的多肽的轉(zhuǎn)基因非人動物，或產(chǎn)物，或其部分。
上述定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在制備用于動物飼料的組合物中；(iii)用于改善動物飼料的營養(yǎng)價值；(iv)用于增加動物食物(diet)中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用于提高動物食物中蛋白質(zhì)的水解程度；和/或(vi)用于處理蔬菜蛋白質(zhì)的用途。
包含如上定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶維生素，和/或(b)至少一種水溶維生素，和/或(c)至少一種微量礦質(zhì)元素的動物飼料添加劑。
粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含如上定義的至少一種多肽，或包含如上定義的至少一種飼料添加劑。
包含如上定義的至少一種多肽的組合物，其同時還包含至少一種選自α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)中的至少一種其他酶。
如上定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
上述第二、第三、和第四個方面的實施方案相互獨立，也是本發(fā)明第一個方面的優(yōu)選亞方面，同時也互為優(yōu)選的亞方面。
發(fā)明詳述具有蛋白酶(protease)活性的多肽，或蛋白酶，有時候也稱肽酶、蛋白酶(proteinases)、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可以是從肽的任何一端開始水解肽的外切型，或者是在多肽鏈內(nèi)部起作用的內(nèi)切型(肽內(nèi)切酶)。肽內(nèi)切酶在N和C端阻斷的肽底物上顯示活性，肽底物與所述蛋白酶的特異性相關(guān)。
此處術(shù)語“蛋白酶”定義為水解肽鍵的酶。其包括屬于EC 3.4的酶組酶(包括其13個亞類中的任何一類)中的任何酶。EC編號參考NC-IUBMB，Academic Press，San Diego，California的酶命名法(EnzymeNomenclature)1992，包括分別發(fā)表于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的增刊1-5。該命名法定期補(bǔ)充更新；參見如World Wide Web(WWW)網(wǎng)址http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
以其催化機(jī)制為基礎(chǔ)將蛋白酶分為下述的組絲氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金屬蛋白酶(M)和未知的或未分類的蛋白酶(U)，參見Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(eds)，Academic Press(1998)，尤其是一般介紹部分。
在特定實施方案中，本發(fā)明的蛋白酶和根據(jù)本發(fā)明的用途選自下組(a)屬于EC 3.4.-.-酶組的蛋白酶；(b)屬于上述手冊中S組的絲氨酸蛋白酶；(c)肽酶家族S2A的絲氨酸蛋白酶；和/或(d)Biochem.J.290205-218(1993)和MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫，版本6.20，March 24，2003，(www.merops.ac.uk)中描述的肽酶家族S1E的絲氨酸蛋白酶。Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.& Barrett，A.J.(2002)MEROPStheprotease database.Nucleic Acids Res.30，343-346描述了該數(shù)據(jù)庫。
為了測定給定的蛋白酶是否絲氨酸蛋白酶，及S2A家族蛋白酶，將上述的手冊及其指定的原則作為參考。這樣的測定可用于所有類型的蛋白酶，無論其是天然的還是野生型的蛋白酶；或者是基因工程化或合成的蛋白酶。
可以采用任何的測試方法來測量蛋白酶活性，所述測試方法中使用底物，該底物包括與所討論的蛋白酶的特異性有關(guān)的肽鍵。pH-測試和溫度-測試同樣適合于所討論的蛋白酶。pH值-測試的例子為pH2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12。溫度-測試的例子為30，35，37，40，45，50，55，60，65，70，80，90，或95℃。
非限制性的蛋白酶底物的例子為酪蛋白，例如Azurine-交聯(lián)酪蛋白(AZCL-Casein)，和血紅蛋白。用于測定本發(fā)明蛋白酶的特異活性目的的底物是血紅蛋白，實施方案3公開了適合的測試方法。實施方案2描述了兩個其他的蛋白酶，其中任何一個都可以用于測定大致的蛋白酶活性。所謂的pNA測試是用于除特異活性測定之外的目的的優(yōu)選測試方法。
pH7.5，25℃下，本發(fā)明的蛋白酶顯示了針對血紅蛋白的至少39AU/g的特異活性?？砂磳嵤┓桨?所述測定此特異活性。本發(fā)明的蛋白酶可以顯示出至少40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，或至少54AU/g的特異活性。
特異性測定，包括純化蛋白酶的蛋白質(zhì)含量及蛋白酶活性的測定是大家熟知的。
在特定實施方案中，通過氨基酸分析，例如通過蛋白酶的酸水解，之后分離并量化釋放的氨基酸來測定蛋白質(zhì)含量，優(yōu)選在Biochrom 20Plus氨基酸分析儀上測定。
以下是蛋白酶活性測定中特定的、任選的技術(shù)特征(i)將血紅蛋白底物變性；(ii)以0.65％w/w的量使用血紅蛋白底物；(ii)測試緩沖液是KH2PO4/NaOH緩沖液，pH7.50；(ii)蛋白酶的反應(yīng)時間為10分鐘；(iii)酶反應(yīng)后，用三氟乙酸(TCA)沉淀未消化的血紅蛋白并將其去除，優(yōu)選通過過濾去除；(iv)測定濾液中的TCA-可溶性血紅蛋白降解產(chǎn)物，優(yōu)選用Folin &Ciocalteu′s苯酚試劑測定；(v)參考ALCALASETM酶標(biāo)準(zhǔn)測量并確定活性單位(AU)；(vi)用EB-SM-0349測試，優(yōu)選EB-SM-0349 02/01測量活性單位(AU)；和/或(vii)所用的測試為實施方案3所公開的“蛋白酶活性測試(AU/ml)”。ALCALASETM標(biāo)準(zhǔn)和EM-SM-0349測試可從Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark(分別提供″your ref.Patent10476″和″EB-SM-0349″，或″EB-SM-0349 02/01，″)獲得。
與SEQ ID NO2和6的蛋白酶相關(guān)的高特異活性蛋白酶的篩選可按如下方法進(jìn)行第一步，用SEQ ID NO3，4，7，或8的引物，或者優(yōu)選用SEQID NO1和5的成熟肽編碼部分篩選DNA文庫；在合適的株系例如芽孢桿菌(Bacillus)或大腸桿菌(E.coli.)中表達(dá)雜交克隆。下一步，純化所表達(dá)的與SEQ ID NO2和/或6相關(guān)的蛋白酶，優(yōu)選在微-純化方法中純化(參見，如WO 03/037914)，在下面的步驟，用酶的強(qiáng)抑制劑，以熟知的活性定點滴定方法(active site titration，AST)測定每個候選蛋白酶的活性蛋白酶的量。這樣做是考慮到在接下來的最后步驟中能夠比較同樣摩爾量的每個蛋白酶，所述最后步驟是使用任何適當(dāng)?shù)臏y試方法測定目前已知量的蛋白酶的蛋白酶活性，例如實施方案2所用的pNA測試。該程序的大部分可以是自動化的，如果需要的話可以在機(jī)器人的協(xié)助下進(jìn)行。按照此處實驗部分的描述，通過例如純化蛋白酶及確定特異活性，完成高度特異活性的鑒定。
本發(fā)明蛋白酶的來源和/或其根據(jù)本發(fā)明的用途沒有限制。如此，術(shù)語蛋白酶不僅包括由任何種類的微生物獲得的天然的或野生型的蛋白酶，還包括其顯示蛋白酶活性的任何突變體、變異體、片段等等，還包括合成的蛋白酶，例如改組蛋白酶(shuffled proteases)，共有蛋白酶(consensusproteases)。這樣的基因工程蛋白酶可以按照本領(lǐng)域熟知的方法制備，例如通過定點突變，通過PCR(在PCR反應(yīng)中將包含所需突變的PCR片段用作其中一個引物)，或者通過隨機(jī)突變。例如EP 897985中描述了共有蛋白酶的制備。例如WO95/22625和WO96/00343中簡要描述了基因改組(geneshuffling)?？梢酝ㄟ^如Ness，J.E.等在Nature Biotechnology，Vol.20(12)，pp.1251-1255，2002中所述的合成改組，由親本的特定序列獨立地完成蛋白酶基因的重組。按照參考文獻(xiàn)所述，設(shè)計在其DNA序列中簡并的合成寡核苷酸并組裝基因，在其DNA序列中簡并的合成寡核苷酸提供了在該組親本蛋白酶中發(fā)現(xiàn)所有氨基酸的可能性?？梢詫θL序列進(jìn)行改組，也可以只對該序列的一部分進(jìn)行改組，然后再與基因的剩余部分組合而得到全長序列。具有包含SEQ ID NO2和6任一個的成熟部分的氨基酸序列的蛋白酶是這種可用于上述改組的親本蛋白酶的特定例子，如果需要，還可同時加上源于如擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶以提供本發(fā)明額外的蛋白酶。此處與給定來源連用的術(shù)語“由......獲得的”(obtained from)意思應(yīng)為，核酸序列所編碼的多肽由該來源生產(chǎn)，或者由其中存在該來源的核酸序列的細(xì)胞生產(chǎn)。在一個優(yōu)選實施方案中，該多肽是胞外分泌的。
在特定實施方案中，此蛋白酶為低致敏性變異體，其被設(shè)計用于在接觸動物包括人時激發(fā)降低的免疫反應(yīng)。術(shù)語免疫反應(yīng)應(yīng)理解為由接觸該蛋白酶的動物的免疫系統(tǒng)引起的任何反應(yīng)。免疫反應(yīng)的一種類型為導(dǎo)致被接觸(exposed)動物的IgE水平升高的過敏反應(yīng)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)制備低致敏性變異體。例如，可以將蛋白酶與涉及免疫反應(yīng)的蛋白酶的多聚體部分(moiety)屏蔽部分或者抗原決定簇結(jié)合。與多聚體的結(jié)合可能涉及如WO 96/17929，WO 98/30682，WO 98/35026，和/或WO 99/00489中所描述的多聚體與蛋白酶的體外化學(xué)連接。結(jié)合可以額外地或可選地設(shè)計體內(nèi)多聚體與蛋白酶結(jié)合。這樣的結(jié)合可以通過對編碼該蛋白酶的核苷序列實施基因工程，插入編碼蛋白酶中額外的糖基化位點的共有序列，以及在能夠使蛋白酶糖基化的宿主中表達(dá)該蛋白酶，參見，例如WO 00/26354。另外一種提供低致敏性變異體的方法是對編碼該蛋白酶的核苷序列實施基因工程，以使該蛋白酶自我寡聚化，使蛋白酶單體能夠屏蔽其他蛋白酶單體的抗原決定簇，并因此降低寡聚體的抗原性。例如WO 96/16177中描述了這樣的產(chǎn)物及其制備?？梢酝ㄟ^多種方法例如WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌體展示方法，或者EP 561907中描述的隨機(jī)方法來鑒定免疫反應(yīng)中涉及的抗原決定簇。一旦鑒定了抗原決定簇(epitope)，可以通過已知的基因操作技術(shù)如定點突變(參見，如WO 00/26230，WO 00/26354和/或WO 00/22103)來改變其氨基酸序列，以生產(chǎn)免疫特性被改變的蛋白酶，或者可以使多聚體與抗原決定簇足夠近地結(jié)合以使多聚體屏蔽該抗原決定簇。
根據(jù)本發(fā)明任一方面的多肽，可以包含與SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分，例如SEQ ID NO2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO6的1至192位氨基酸(成熟肽部分)具有例如約65％同一性的氨基酸序列，且其具有蛋白酶活性(以下稱“同源多肽”)。在特定實施方案中，與SEQ IDNO2或6中任一個的成熟肽部分的同一性至少為約66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或者99％。在可選實施方案中，同一性至少為約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，或者64％。
本發(fā)明也涉及包含與SEQ ID NO2的-167至188位氨基酸，和/或與SEQ ID NO6的-160至192位氨基酸具有例如至少約78％同一性的氨基酸序列的分離的多肽，且其具有蛋白酶活性。在特定實施方案中，與SEQ IDNO2的-167至188位氨基酸具有至少約80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或者99％的同一性。在可選實施方案中，同一性至少為約50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，或者84％。
在特定實施方案中，本發(fā)明的多肽i)具有上述提到的任何同一性的氨基酸序列；或者ii)由具有上述提到的任何同一性的氨基酸序列組成。
為達(dá)到本發(fā)明的目的，使用Needleman-Wunsch(例如整體比對)“比對”程序測定兩個氨基酸序列之間以及兩個核酸序列之間的同一性。該程序用于多肽的比對，也同時用于核苷序列比對。用默認(rèn)的計分陣列BLOSUM50進(jìn)行多肽比對，默認(rèn)的一致性陣列用于核苷比對。對多肽來說，空位(gap)的第一個殘基的罰分(penalty)為-12，對核苷來說為-16?？瘴坏钠渌麣埢牧P分，多肽為-2，核苷為-4。
“比對”是版本號為v20u6的FASTA軟件包(參見W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 852444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 18363-98)的一部分。FASTA蛋白質(zhì)比對使用Smith-Waterman運(yùn)算法則，對空位大小沒有限制(參見″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith and M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147195-197)。
在特定實施方案中，將兩個氨基酸序列的成熟肽部分、或者預(yù)期或所希望的成熟肽部分用于比對?？蛇x地，選擇正在測定其與SEQ ID NO2的成熟肽部分的同一性的序列，依據(jù)按照下述方法所作的多序列比對結(jié)果，其與SEQ ID NO2的成熟肽部分，如通過多序列比對所鑒定的相應(yīng)氨基酸殘基最為相似。
在此上下文中，為氨基酸殘基編號(或者指定位置號，參考本發(fā)明的第二個方面)的基礎(chǔ)是SEQ ID NO2，起始于A1結(jié)束于T188。可選地，該基礎(chǔ)是源于擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的1-188位氨基酸(WO 01/58276中公開的SEQ ID NO1，優(yōu)選WO 01/58276中公開的A87被T87取代的SEQID NO1)。
蛋白酶可包含相對于成熟肽部分延伸，即在其N端和/或C端的延伸。如果要給任一延伸的氨基酸編號的話，將依據(jù)本領(lǐng)域的慣例對其編號，例如，對于C端延伸189，190，191等等，對于N端延伸-1，-2，-3等。
對于與參照序列，例如SEQ ID NO2比對的每一個蛋白酶中的每一個氨基酸殘基，如上面解釋的那樣(用于測定同一性目的)，直接無疑義地指定其在參照序列如SEQ ID NO2中對應(yīng)的氨基酸殘基是可能的。參照例如SEQ ID NO2，將相應(yīng)的殘基指定為相同的位置或編號。
對于另一蛋白酶中的每一氨基酸殘基，可以找出參照序列如SEQ ID NO2的相應(yīng)位置，如下將其他蛋白酶的氨基酸序列指定為SEQ X。按如下方法找出相應(yīng)于SEQID NO2的位置N的位置如上所述，將SEQ X與SEQ ID NO2比對。使用下述的原則，可由比對結(jié)果直接無疑義地得出SEQ X中相應(yīng)于SEQ IDNO2的位置N的位置。
SEQ X可以是所討論的蛋白酶的成熟部分，或者也可以包括信號肽部分，或者是具有蛋白酶活性的成熟蛋白酶的片段，例如與SEQ ID NO2長度相同的片段，和/或可以是與此處描述的SEQ ID NO2比對時從A1延伸至T188的片段。
下面插入了三個比對即表I、II和III。通過如上描述的將另一蛋白酶(分別為SEQ X1，SEQ X2和SEQ X3)與SEQ ID NO2比對得到這些比對結(jié)果。其顯示了每個蛋白酶的大約50個氨基酸殘基。
首先看表I的比對，很明顯，SEQ ID NO2的P42對應(yīng)于SEQ X1的Q42，因為在此比對中這些殘基上下對齊。均為其指定編號42，即SEQ ID NO2中相應(yīng)殘基的編號。由此比對，同樣很明顯，例如SEQ X1不包含25S，38T，42P，44S，或49Q的任何一個。
Table IADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQPGF VTAGHCGTVG TPVSIGNGQG SEQ ID NO2ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNAAGQPGF VTAGHCGRVG TQVTIGNGRG SEQ X110 20 30 40 50表II和III是在兩個序列任何一個中產(chǎn)生空位的比對的例子。
在表II的比對中，SEQ X2中產(chǎn)生了空位。為了當(dāng)前的目的，將SEQ X2中突出顯示的氨基酸殘基P指定為P28，盡管這樣的位置在SEQ X中為P25。
Table IIADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQ P GF VTAGHCGTVG TPVSIGNGQG SEQ ID NO2ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNA---PGF VTAGHCGRVG TQVTIGNGRG SEQ X210 20 30 40 50表III的比對中，在SEQ X3中產(chǎn)生了空位。當(dāng)在SEQ ID NO2的位置編號為nn和(nn+1)的氨基酸之間產(chǎn)生空位時，將空位的每個位置指定為前面位置號例如nn的小寫字母或下標(biāo)a，b，c等。相應(yīng)地，空位的每一個位置編號為nna，nnb等。為當(dāng)前的目的，將SEQ X3中突出顯示的氨基酸殘基R指定為R33a，盡管在SEQ X3中這樣的位置為R34。
Table IIIADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQPGF VTA - -GHCGT VGTPVSIGNGQG SEQ ID NO2ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNAAGQPGF VTARSGHCGR VGTQVTIGNGRG SEQ X310 20 30 40 50在本發(fā)明任何方面的另外的特定實施方案中，通過差示掃描量熱法(DSC)測定，本發(fā)明的多肽具有至少75℃，76℃，77℃，78℃，79℃，80℃，81℃，82℃，83℃，84℃，85℃，86℃，87℃，88℃，89℃，90℃，91℃，92℃，93℃，94℃，或者95℃的解鏈溫度Tm。DSC測定在10mM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩沖液、pH7.0的條件下進(jìn)行。掃描速率為常數(shù)，例如1.5℃/min。掃描間隔可以從20至100℃。
Tm沒有上限，但是，目前預(yù)期Tm可能在150℃，145℃，140℃，135℃，130℃，125℃，120℃，115℃，110℃，105℃，或者100℃以下。
在可選實施方案中，選擇另一緩沖液用于掃描，例如pH5.0，5.5，6.0，或pH6.5。
在另外的可選實施方案中，可以使用更高或更低的掃描速率，例如低掃描速率1.4℃/min，1.3℃/min，1.2℃/min，1.1℃/min，1.0℃/min，或0.9℃/min。
有關(guān)掃描程序的更詳細(xì)資料可參見作為參考的實施方案2。
在特定實施方案中，與源于擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶相比，本發(fā)明的蛋白酶顯示了改變的溫度活性譜。例如，pH9及80℃條件下，本發(fā)明的蛋白酶可以顯示出至少0.40，優(yōu)選至少0.45，0.50，0.55，0.60，0.65，0.70，0.75，0.80，0.85，0.90，或者0.95的相對活性，術(shù)語“相對”指相對于測定的所述蛋白酶的最大活性。對于源于擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶，70℃時的活性設(shè)定為1.000(100％)，參見實施方案2。如另一實施方案，pH9及90℃條件下，本發(fā)明的蛋白酶顯示了至少0.10，優(yōu)選至少0.15，0.20，0.25，0.30，或者0.35的相對活性。在特定實施方案中，用實施方案2的ProtazymeAK測試測量蛋白酶活性。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明多肽的動物飼料用途。
也可以用具有同一性表的LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)測定兩個氨基酸序列之間的同一性，多序列比對參數(shù)如下空位罰分為10、空位長度罰分為10。成對比對參數(shù)為Ktuple＝1、空位罰分＝3、窗口＝5、對角線(diagnosis)＝5?？梢杂门c上述相同的運(yùn)算法則和軟件包測定兩個核苷序列之間的同一性，設(shè)定如下空位罰分為10，空位長度罰分為10。成對比對參數(shù)為Ktuple＝3、空位罰分＝3及窗口＝20。
在特定實施方案中，同源肽具有與(a)SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分，或者(b)其前體形式(不包括信號肽部分，包括成熟肽部分)不同的氨基酸序列，所述不同具有(i)不超過50，49，48，47，46，45，44，43，42，41，40，39，38，37，36，35，34，33，32，31，30，29，28，27，26，25，24，23，22，21，或者20個氨基酸；(ii)不超過20，19，18，17，16，15，14，13，12，或者11個氨基酸；(iii)不超過10，9，8，7，6，5，4，3，2，或1個氨基酸；(iv)10，9，8，7，6，5個氨基酸；或者(v)4，3，2，或者1個氨基酸的差異。
在特定實施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分的氨基酸序列，或其等位變異體；或其具有蛋白酶活性的片段。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO2或6中任一個的成熟肽部分，或其等位變異體；或其具有蛋白酶活性的片段組成。
片段是從這些氨基酸序列的氨基和/或羧基端刪除一個或多個氨基酸的多肽。在一個實施方案中，片段包含至少75個氨基酸殘基，或至少100個氨基酸殘基，或至少125個氨基酸殘基，或至少150個氨基酸殘基，或至少160個氨基酸殘基，或至少165個氨基酸殘基，或至少170個氨基酸殘基，或至少175個氨基酸殘基。
等位變異體指占據(jù)相同染色體位點的基因的兩種或多種可選形式中的任何一個。等位變異通過突變自然發(fā)生，可能在群體中導(dǎo)致多態(tài)?；蛲蛔兛梢允浅聊?在所編碼的多肽中沒有變化)或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變異體是由基因的等位變異體編碼的多肽。
本發(fā)明也涉及具有蛋白酶活性的分離的多肽，其由在極低的、或低的、或中等的、或者中等-高的(medium-high)、或高的、或極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸探針雜交的核酸序列編碼，該探針在相同條件下與(a)SEQ ID NO1的1-1065位，優(yōu)選502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的1-1143，優(yōu)選568-1143位核苷；(b)a的子序列，或者(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈(J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbor，New York)雜交。在一個特定的實施方案中，核酸探針選自上述(a)，(b)，或(c)的核酸序列。
上述(a)下面提到的核苷子序列可以為至少100個核苷，或者在另一實施方案中為至少200個核苷。另外，該子序列(subsequence)可以編碼具有蛋白酶活性的多肽片段。
上述(a)的核酸序列，或者其子序列，以及SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的相應(yīng)部分，或其片段，可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，用來設(shè)計核酸探針以鑒定并克隆來自不同種屬株系的編碼具有蛋白酶活性的多肽的DNA。特別地，可以依照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法用這樣的探針與感興趣的種屬的基因組DNA或cDNA雜交，以鑒定并分離其中的相應(yīng)基因。這樣的探針可以比全序列短得多，但至少應(yīng)當(dāng)為15個，優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少35個核苷長度。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針均可使用。典型地，探針被標(biāo)記用于探測相應(yīng)的基因(例如，用32P，3H，35S，生物素或抗生物素蛋白)。本發(fā)明也包含這樣的探針。
如此，可以篩選從這樣的其他生物制備的基因組DNA或cDNA文庫以得到與上述探針雜交的DNA，其編碼具有蛋白酶活性的多肽。可以用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他的分離技術(shù)分離來自這樣的其他生物的基因組DNA或者其他的DNA。可以將來自所述文庫的DNA或者分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定在硝化纖維或其他適當(dāng)?shù)妮d體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1或5中任一個，或其子序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用所述載體材料。為了本發(fā)明的目的，雜交指在極低的至極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下，將核酸序列與相應(yīng)于SEQ ID NO1或5中任一個的核酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其子序列的標(biāo)記的核酸探針雜交。用X-射線膠片探測在這些條件下核酸探針?biāo)s交的分子。
對于至少100個核苷長度的長探針，極低的至極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為42℃下，在5X SSPE，0.3％SDS，200μg/ml經(jīng)剪切的變性鮭精DNA，以及對于極低的和低的嚴(yán)格度為25％的甲酰胺，對于中等的和中等高的嚴(yán)格度為35％的甲酰胺，或者對于極高的嚴(yán)格度為50％的甲酰胺中，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
對于至少100個核苷長度的長探針，最后用0.2×SSC，0.2％SDS，20％甲酰胺沖洗載體材料三次，每次15分鐘，優(yōu)選在至少45℃下沖洗(極低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選在至少50℃下沖洗(低嚴(yán)格度)，更優(yōu)選在至少55℃下沖洗(中等嚴(yán)格度)，更優(yōu)選在至少60℃下沖洗(中等-高嚴(yán)格度)，再優(yōu)選在至少65℃下沖洗(高嚴(yán)格度)，最優(yōu)選在至少70℃下沖洗(極高嚴(yán)格度)。
對于約15個至約70個核苷長度的短探針，嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為，在低于依照Bolton和McCarthy的計算方法(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA481390)所計算的Tm值5℃至10℃條件下，在0.9M NaCI，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM單堿磷酸鈉，0.1mM ATP，以及每毫升0.2mg酵母RNA中，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交，雜交和雜交后沖洗。
對于約15個至約70個核苷長度的短探針，低于所計算的Tm值5℃至10℃條件下，在6X SSC加0.1％SDS中沖洗載體材料一次，15分鐘，用6X SSC沖洗兩次，每次15分鐘。
本發(fā)明還涉及具有SEQ ID NO2和6中任一個的成熟部分氨基酸序列的多肽的變異體，其包含一個或多個氨基酸的取代、刪除、和/或插入。
變異多肽的氨基酸序列可以由于一個或多個氨基酸殘基的插入或刪除和/或用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基，而與SEQ ID NO2和6中任一個的成熟部分的氨基酸序列不同。在特定實施方案中，氨基酸變化是具有較小的屬性變化，也就是沒有明顯影響到蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；是小的刪除，典型地為一個至約30個氨基酸；是小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端的蛋氨酸，直至約20-25個殘基的小肽；或者是小的延伸，此小的延伸通過改變凈電荷或其他屬性以方便純化，如多組氨酸片段，抗原表位或者結(jié)合域。
保守性取代的例子發(fā)生在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，和小氨酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)組內(nèi)。相應(yīng)地，例如，本發(fā)明涉及具有或包含SEQ ID NO2或6中任一個所列出的序列，優(yōu)選其成熟部分的多肽，或其活性片段，其中保守性氨基酸取代包含在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)中、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)中、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)中、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)中、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)中、和小氨酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)中的置換，一個取代另一個，或其任意組合。
通常不改變特異活性的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的，例如H.Neurathand R.L.Hill，1979，在The Proteins，Academic Press，New York中所描述的。最常發(fā)生的改變?yōu)锳la/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/lle，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly以及相反的改變。
在特定實施方案中，本發(fā)明的以及用于本發(fā)明所述用途的多肽是酸穩(wěn)定的。為此目的，術(shù)語酸穩(wěn)定的指在pH2.0、pH2.5或pH3.0及37℃下保溫2小時后，與pH9.0及5℃下保溫2小時后的相應(yīng)樣品相比，其殘余活性至少為50％。在特定實施方案中，殘余活性至少為60％，70％，80％或90％。測定酸穩(wěn)定性的合適的測試方法為實施方案2的pH穩(wěn)定性測試方法。
在特定實施方案中，本發(fā)明的以及用于本發(fā)明所述用途的多肽在pH7.0條件下，具有至少0.10，0.15，0.20，0.25，0.30或0.35的相對活性。實施方案2的pH譜測試方法用于本測定。
在另外的特定實施方案中，本發(fā)明的以及用于本發(fā)明所述用途的多肽具有i)在60℃及pH9的條件下，至少0.05，0.10，0.15或0.20的相對活性；和/或ii)70℃時至少0.40，0.50或0.56的相對活性。實施方案2的溫度譜測試用于這些測定。
在另外的特定實施方案中，本發(fā)明的以及用于本發(fā)明所述用途的多肽在用DSC測定時，具有至少78℃、或者至少79、80、81、82或83℃的Tm。在pH7.0條件下按實施方案2所述測定Tm。
本發(fā)明的以及用于本發(fā)明所述用途的多肽可以是細(xì)菌或真菌多肽。真菌多肽可以源于絲狀真菌或酵母。
在特定實施方案中，本發(fā)明的多肽是i)細(xì)菌蛋白酶；ii)放線菌門的蛋白酶；iii)放線菌綱的；iv)放線菌目的；v)擬諾卡氏菌科的；vi)擬諾卡氏菌屬的；和/或源于vii)擬諾卡氏菌如Nocardiopsis dassonvillei、Nocardiopsisalkaliphila、南極擬諾卡氏菌、Nocardiopsis prasina、Nocardiopsis composta、Nocardiopsis exhalans、Nocardiopsis halophila、Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、Nocardiopsis listeri、Nocardiopsis lucentensis、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsis synnemataformans、Nocardiopsistrehalosi，熱帶擬諾卡氏菌、Nocardiopsis umidischolae、新疆?dāng)M諾卡氏菌、或Nocardiopsis alba的蛋白酶，例如源于Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶，例如具有SEQ ID NO2的1至188或-167至188位氨基酸序列的多肽，或者源于Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 4235的多肽，如具有SEQ ID NO6的1-192或-160至192位氨基酸序列的多肽。在特定實施方案中，蛋白酶源于Nocardiopsis alba。
上述分類法依據(jù)G.M.Garrity&J.G.Holt的Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology，2001，second edition，volume 1，David R.Bone，Richard W.Castenholz中The road map to the Manual一章。
對于前述物種，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明同時包含理想和不理想狀況的、以及其他的分類等同物，例如，變形，而不考慮其已知的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易識別近似等同物的同一性。
公眾可以很容易在幾個培養(yǎng)物保藏中心得到這些物種的株系，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammiung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，DSM)、霉菌培養(yǎng)物中心局(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)和Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center，NRRL)。例如公眾能夠由DSMZ(德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，Braunschweig，德國)獲得Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235。該株系也保藏在其他的保藏機(jī)構(gòu)如ATCC 23219、IMRU 1250、NCTC 10489。
此外，也可以用上述的探針從其他來源包括從自然界(例如，土壤、堆肥(composts)、水等)分離的微生物鑒定并獲得這樣的多肽。從自然的生活環(huán)境分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。然后可以類似地通過篩選另一微生物的基因組或cDNA文庫來得到核酸序列。一旦用探針探測到編碼多肽的核酸序列，就可以利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)(參見，例如，Sambrook等，1989，如上)分離或克隆該序列。
此處定義的“分離的”或“純化的”多肽是基本上獨立于其他多肽的多肽，例如通過SDS-PASE測定為至少約20％純化的，優(yōu)選至少約40％純化的，更優(yōu)選約60％純化的，再優(yōu)選約80％純化的，最優(yōu)選約90％純化的，甚至最優(yōu)選約95％純化的多肽。
本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽也包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中將另一多肽融合于所述多肽或其片段的N端或C端。通過將編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合來生產(chǎn)融合多肽。生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如，PCR，或者將編碼多肽的編碼序列置于框中，并且將融合多肽的表達(dá)置于相同啟動子和終止子的控制之下。
在其他的特定實施方案中，本發(fā)明不包括來自(i)WO 88/03947中公開的Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133；(ii)JP 2-255081-A中公開的擬諾卡氏菌株系OPC-210(FERM P-10508)；(iii)DD 20043218中公開的Nocardiopsisdassonvillei的株系ZIMET 43647；(iv)JP 2003284571中公開的擬諾卡氏菌TOA-1(FERM-P-18676)；和/或(v)相應(yīng)DNA的一種或多種蛋白酶。
核酸序列本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明特定的核酸序列為SEQ ID NO1的502-1065或1-1065位核苷，以及SEQ ID NO5的1-1143，優(yōu)選568-1143核苷，其中SEQ ID NO1的502-1065位核苷相應(yīng)于成熟肽編碼區(qū)。本發(fā)明還包含編碼具有SEQ ID NO2的-167至188，優(yōu)選1-188位，或者SEQ ID NO6的-160至192，優(yōu)選1-192位氨基酸序列的核酸序列，其由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO1的相應(yīng)部分不同。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO1或5的子序列，其分別編碼具有蛋白酶活性的SEQID NO2和6的片段。
SEQ ID NO1或5的子序列包含于SEQ ID NO1或5中任一個，只是5`和/或3`端的一個或多個核苷被刪除。優(yōu)選地，子序列包含至少225個核苷，更優(yōu)選至少300個核苷，更加優(yōu)選至少375、450、500、531、600、700、800、900或1000個核苷。
本發(fā)明還涉及與(i)SEQ ID NO1的502-1065位核苷，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷，或者與(ii)SEQ ID NO1的1-1065位核苷，和/或SEQID NO5的88-1143位核苷具有至少74％同一性的核苷序列。在特定實施方案中，與(i)或(ii)任一個的核苷的同一性為至少74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％。在其他的特定實施方案中，與(i)或(ii)任一個的核苷的同一性為至少60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，或73％。
本發(fā)明還涉及在SEQ ID NO1或5中，優(yōu)選在其成熟肽編碼部分中包含至少一個突變的突變核酸序列，其中突變核酸序列編碼的多肽(i)由SEQID NO2的-167至188，優(yōu)選1-188位，或者SEQ ID NO6的-160至192，優(yōu)選1-192位氨基酸組成；或者(ii)是(i)中任一序列的變異體，其中變異體包含一個或多個氨基酸的取代、刪除、和/或插入；或者(iii)是(i)中任一序列的等位變異體，或者(iv)是(i)中任一序列的片段。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，其包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？梢允褂美缫阎亩嗑勖告?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)或表達(dá)文庫抗體篩選法，從這樣的基因組DNA中克隆本發(fā)明的核酸序列，以探測具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。參見，例如Innis等，1990，PCRA Guide to Methods and Application，Academic Press，New York?？梢允褂闷渌暮怂釘U(kuò)增方法例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(ligasechain reaction，LCR)、ligated activated transcription(LAT)和核酸基礎(chǔ)序列擴(kuò)增法(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)?？梢詮臄M諾卡氏菌株系或另外的或相關(guān)的生物克隆該核酸序列，這可能是，例如，核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位或物種變異體。
此處術(shù)語“分離的核酸序列”指基本上獨立于其他核酸序列的核酸序列，例如通過瓊脂糖凝膠電泳測定為至少約20％純化的，優(yōu)選至少約40％純化的，更優(yōu)選約60％純化的，再優(yōu)選約80％純化的，最優(yōu)選約90％純化的核酸序列。例如，可以使用基因工程中標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法獲得，所述基因工程用于將核酸序列從其天然位置重新定位于其將要被復(fù)制的不同的位置。所述克隆方法可能涉及將包含編碼多肽的核酸序列的所需核酸片段切除并分離，將此片段插入載體分子，將重組載體整合至宿主細(xì)胞中，核酸序列的多拷貝或克隆將在該宿主細(xì)胞中復(fù)制。該核酸序列可以是基因組，cDNA，RNA，半合成的，合成來源的，或其任意組合。
本發(fā)明編碼多肽的核酸序列的修飾對于與所述多肽基本類似的多肽的合成可能是必要的。術(shù)語與所述多肽“基本類似的”是指非天然發(fā)生形式的多肽。這些多肽在某些工程方面可能與從其天然來源分離的多肽不同，例如，在特異活性、熱穩(wěn)定性、最佳pH、致敏性或類似方面有所差異的變異體。所述變異序列可以以作為SEQ ID NO1和/或5的多肽編碼部分形式存在的核酸序列，例如其子序列為基礎(chǔ)來構(gòu)建，和/或通過引入不產(chǎn)生具有其他氨基酸序列的多肽，但與宿主生物傾向于生產(chǎn)蛋白酶的密碼利用相符的核苷取代來構(gòu)建，或者通過引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷取代來構(gòu)建。如需要有關(guān)核苷取代的一般說明，可參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpression and Purification 295-107。例如，可以如上所述制備低致敏性多肽。
這樣的取代可在對分子功能至關(guān)重要的區(qū)域之外進(jìn)行，這樣仍然產(chǎn)生具有活性的多肽，這對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說是很顯然的?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域已知的方法，例如定點突變或丙氨酸掃描突變(參見，例如Cunninghamand Wells，1989，Science 2441081-1085)來鑒定涉及多肽活性的基本氨基酸殘基，并因此優(yōu)選不取代涉及多肽活性的基本氨基酸殘基，所述多肽由本發(fā)明的分離的核酸序列所編碼。在后來的技術(shù)中，將突變引入分子中的每一個帶正電的殘基，測試所得突變分子的蛋白酶活性，以鑒定對于分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。也可以通過使用核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親合標(biāo)記方法(參見，例如，de Vos等，1992，Science 255306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS Letters30959-64)測定三維結(jié)構(gòu)來測定底物-蛋白酶反應(yīng)的位置。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列，其在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選在中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，再優(yōu)選在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，最優(yōu)選在極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與核酸探針雜交，所述核酸探針在相同條件下與SEQ ID NO1和/或5核酸序列，或其互補(bǔ)鏈雜交；或此處定義的其等位變異體和子序列(Sambrook等，1989，如上)。
本發(fā)明還涉及通過(a)在極低、低、中等、中等高、高、或極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下將DNA與(i)SEQ ID NO1的1-1065，優(yōu)選502-1065位核苷，或者SEQID NO5的1-1143，或88-1143，優(yōu)選568-1143位核苷，(ii)(i)的子序列，或者(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈雜交；和(b)分離核酸序列，而生產(chǎn)的分離核酸序列。所述子序列優(yōu)選為具有至少100個核苷的序列，以使這樣的序列所編碼的多肽片段具有蛋白酶活性。
生產(chǎn)突變核酸序列方法本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)突變核酸序列的方法，包括將至少一個突變引入SEQ ID NO1和/或5的成熟多肽編碼序列，或其子序列，其中突變的核酸序列編碼由SEQ ID NO2的-167至188，優(yōu)選1-188位氨基酸，或者SEQID NO6的-160至192，優(yōu)選1-192位氨基酸；或其具有蛋白酶活性的片段所組成的多肽。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，通過定點突變向核酸序列引入突變，用一個核苷交換另一個核苷。利用插入有感興趣序列的超螺旋、雙鏈DNA載體和包含所需突變的兩個合成引物的方法是尤其有用的。與載體的相對鏈分別互補(bǔ)寡核苷酸引物，在溫度循環(huán)期間通過Pfu DNA多聚酶方式進(jìn)行延伸。引物的組合使用產(chǎn)生了包含交叉缺口的質(zhì)粒。溫度循環(huán)之后，用Dpnl處理產(chǎn)物，Dpnl特異于甲基化和半甲基化的DNA，用于消化親本DNA模板并選擇包含突變的合成DNA。也可使用其他本領(lǐng)域已知的方法。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含與一個或多個控制序列可操作相連的本發(fā)明的核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述控制序列在與控制序列相容的條件下引導(dǎo)編碼序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)。表達(dá)應(yīng)被理解為包括涉及多肽生產(chǎn)的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
此處“核酸構(gòu)建體”定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離于天然產(chǎn)生的基因，或者是經(jīng)過修飾而包含了以自然界不存在的方式組合和鄰接(juxtaposed)的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含了所有本發(fā)明的編碼序列表達(dá)所需的控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語表達(dá)盒是同義的。此處術(shù)語“編碼序列”定義為直接特異于其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序列。通過位于mRNA 5`端開放讀碼框正上游的核糖體結(jié)合位置(原核生物)或ATG起始密碼子(真核生物)，以及位于mRNA 3`端開放讀碼框正下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列來確定編碼序列的界限。編碼序列可以包括但不限于DNA、cDNA、以及重組核酸序列。
可以以多種方法操作編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列，以供多肽表達(dá)之用。依據(jù)表達(dá)載體的情況，在核酸序列插入載體之前對其進(jìn)行操作是需要或必要的。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
此處定義的術(shù)語“控制序列”包括表達(dá)本發(fā)明多肽所必須或有利的所有組件。每個控制序列對于編碼多肽的核酸序列來說可以是天然的或者是外源的。這樣的控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列(leader)、聚腺苷酸化(polyadenylation)序列、前導(dǎo)肽(propeptide)序列、啟動子、信號肽序列、和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄凶钌侔▎幼?、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。可以為控制序列提供接頭(linker)，目的是為了引入特定限制性位點以便于控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)連接。此處術(shù)語“可操作相連”定義為一種結(jié)構(gòu)，在這種結(jié)構(gòu)中，將控制序列適當(dāng)?shù)刂糜谂cDNA序列的編碼序列相關(guān)的位置，以使控制序列引導(dǎo)多肽的表達(dá)。
控制序列可以是合適的啟動子序列，由宿主細(xì)胞所識別而使核酸序列表達(dá)的核酸序列。啟動子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截斷的和雜交的啟動子，其可由編碼胞外或胞內(nèi)多肽的，與宿主細(xì)胞同源或異源的基因獲得。
引導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在尤其是細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的例子為由大腸桿菌的lac操縱元、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的瓊膠酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的果聚糖合酶(levansucrase)基因(sacB)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)的麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌的青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌的xylA和xylB基因以及原核生物的β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 753727-3731)所獲得的啟動子，還有tac啟動子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 8021-25)。Scientific American，1980，24274-94，″Useful proteins fromrecombinant bacteria″中和Sambrook等，1989，如上描述了更多的啟動子。
引導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子的例子為由米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、和尖孢鐮刀霉(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶基因獲得的啟動子(WO 96/00787)、還有NA2-tpi啟動子(黑曲霉中性α-淀粉酶與米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)、及其突變、截短以及雜交的啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子由啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、啤酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、啤酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)以及啤酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因獲得。其他有用的醇母宿主細(xì)胞啟動子描述于Romanos等，1992，Yeast 8423-488。
控制序列也可以是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，由宿主細(xì)胞所識別而終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列與編碼多肽的核酸序列3`端可操作相連。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的終止子均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子由米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶(trypsin)樣蛋白酶的基因獲得。
用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子由啤酒酵母烯醇酶、啤酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)和啤酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因獲得。Romanos等，1992，如上描述了其他用于酵母宿主細(xì)胞的有用終止子。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞例如芽孢桿菌的優(yōu)選終止子為來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽胞桿菌的麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、或者解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyQ)的終止子。
控制序列也可以是前導(dǎo)序列，其是mRNA的非翻譯區(qū)，但對宿主細(xì)胞的翻譯是重要的。前導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列5`端可操作相連。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列由米曲霉TAKA淀粉酶、構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因獲得。
用于酵母宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)序列由啤酒酵母烯醇酶(ENO-1)、啤酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、啤酒酵母α-因子、和啤酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)的基因獲得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，其與核酸序列的3`端可操作相連，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時，其作為添加多聚腺苷殘基的信號由宿主細(xì)胞所識別，以轉(zhuǎn)錄mRNA。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的聚腺苷酸化序列均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列由米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、和尖孢鐮刀霉胰蛋白酶樣蛋白酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因獲得。
Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 155983-5990描述了對酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼連接于多肽氨基端的氨基酸序列，引導(dǎo)所編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列5`端可以固有地包含信號肽編碼區(qū)，該信號肽編碼區(qū)在翻譯閱讀框中天然地與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段相連。可選地，編碼區(qū)的5`端可以包含對編碼序列來說為外源的信號肽編碼區(qū)。編碼序列本身不包括信號肽編碼區(qū)時，就需要外源的信號肽編碼區(qū)?？蛇x地，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地替換本身的信號肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，引導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效的信號肽編碼區(qū)由芽孢桿菌NCIB 11837麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽胞桿菌的中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、和枯草芽孢桿菌的prsA的基因獲得。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137中描述了更多的信號肽。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效的信號肽編碼區(qū)為由米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens的纖維素酶和Humicola lanuginosa的脂肪酶基因獲得的信號肽編碼區(qū)。
對酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽由啤酒酵母α-因子和啤酒酵母轉(zhuǎn)化酶基因獲得。Romanos等，1992，如上描述了其他的有用信號肽編碼區(qū)。
控制序列也可以是編碼位于多肽氨基端的氨基酸序列的前導(dǎo)肽編碼區(qū)。已知所得的多肽稱為前體酶(proenzyme)或前體多肽(propolypeptide)(有些時候也叫酶原(zymogen))。前體多肽通常是沒有活性的，可以由前體多肽通過前導(dǎo)肽催化或自體催化裂解轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕钚远嚯摹？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(aprT)、啤酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、嗜熱黃霉(Myceliophthora thermophila)的漆酶(WO 95/33836)基因獲得前導(dǎo)肽編碼區(qū)。
在優(yōu)選實施方案中，前導(dǎo)肽編碼區(qū)為SEQ ID NO1的1-501位核苷，或者SEQ ID NO6的30-189位核苷。
當(dāng)多肽的氨基端同時存在信號肽和前導(dǎo)肽編碼區(qū)時，前導(dǎo)肽區(qū)位于多肽的氨基端，信號肽區(qū)位于前導(dǎo)肽區(qū)的氨基端。
也可能需要添加允許調(diào)控宿主細(xì)胞生長相關(guān)多肽表達(dá)的調(diào)控序列。調(diào)控系統(tǒng)的例子為，因應(yīng)化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)控化合物的存在，而使基因表達(dá)開放或關(guān)閉的調(diào)控系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac，tac和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKA α-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡萄糖淀粉酶啟動子可以作為調(diào)控序列。調(diào)控序列的其他例子為允許基因擴(kuò)增的調(diào)控序列。在真核系統(tǒng)中，其包括存在氨甲蝶呤時擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，以及存在重金屬時擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將與調(diào)控序列可操作相連。
表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸序列、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。上述的各種核酸和控制序列可連接在一起而得到重組表達(dá)載體，其可以包括一個或多個方便的限制性位點，以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列。可選地，可以通過將核酸序列或包括該序列的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體來表達(dá)本發(fā)明的核酸序列。在構(gòu)建表達(dá)載體時，將編碼序列置于載體中，以將編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列可操作相連。
重組表達(dá)載體可以是能夠方便地用于重組DNA方法，并可引發(fā)核酸序列表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。典型地，載體的選擇依賴于載體與其將要被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的兼容性。該載體可以是線性的質(zhì)粒或封閉的環(huán)狀質(zhì)粒。
該載體可以自主復(fù)制載體，例如，以染色體外實體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外成分、微小染色體、或者人工染色體。載體可以包含任何確保自我復(fù)制的方式?？蛇x地，載體可以是這樣的一個載體，當(dāng)其被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時，其整合到基因組中，并與其所整合的染色體一起復(fù)制。另外，也可以使用同時包含將要導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的單一載體或質(zhì)粒，或者兩個或多個載體或質(zhì)粒，或者可以使用轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個或多個可選擇的標(biāo)記，其允許很容易地選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記為基因，其提供生物殺蟲或病毒抗性、抗重金屬、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型及類似的產(chǎn)物。細(xì)菌的可選擇標(biāo)記的例子為來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記為ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)，及其等同物。優(yōu)選用于曲霉菌細(xì)胞的為構(gòu)巢曲霉或者米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許載體穩(wěn)定地整合于宿主細(xì)胞基因組或者允許載體在細(xì)胞中不依賴于基因組而自主復(fù)制的成分。
為了整合于宿主細(xì)胞基因組，載體可能依賴于編碼多肽的核酸序列，或者其他任何用于通過同源和不同源重組將載體穩(wěn)定地整合于基因組的載體成分?？蛇x地，載體可以包含通過同源重組引導(dǎo)向宿主細(xì)胞基因組整合的額外的核酸序列。額外的核酸序列使載體能夠整合于宿主細(xì)胞基因組中精確的染色體位置。為了增加在精確位點整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選包含足夠數(shù)量的核苷酸，例如100至1,500個堿基對，優(yōu)選400至1,500個堿基對，最優(yōu)選800至1,500個堿基對，這些堿基對與相應(yīng)的目標(biāo)序列高度同源，以增加同源重組的概率。整合成分可以是與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源的任何序列。另外，整合成分可以是非編碼或編碼核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合至宿主細(xì)胞基因組。
為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起源。細(xì)菌的復(fù)制起源的例子為允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322，pUC19，pACYC177，和pACYC184，和允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110，pE194，pTA1060，和pAMβ1的復(fù)制起源。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起源的例子為2micron復(fù)制起源，ARS1，ARS4，ARS1與CEN3的組合，和ARS4與CEN6的組合。復(fù)制起源可以是具有突變的復(fù)制起源，該突變使其在宿主細(xì)胞中發(fā)揮溫度敏感性功能(參見，例如，Ehrlich，1978，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 751433)。
可以將超過一個拷貝編碼本發(fā)明的核酸序列插入宿主細(xì)胞以增強(qiáng)基因產(chǎn)物的生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^將至少一個額外的序列拷貝整合于宿主細(xì)胞基因組中以增加核酸序列的拷貝數(shù)，或者通過在包含擴(kuò)增的可選擇標(biāo)記基因拷貝的細(xì)胞中，使核酸序列包含可擴(kuò)增的可選擇標(biāo)記基因，并因此可以在存在適當(dāng)?shù)目蛇x擇試劑的情況下，通過培養(yǎng)細(xì)胞來選擇額外拷貝的核酸序列，以用于增加核酸序列的拷貝數(shù)。
用于連接上述組分以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，如上)。
也可以將蛋白酶與至少一種其他的感興趣的酶共表達(dá)以用于動物飼料，例如淀粉酶，如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
可以從不同的載體，從一個載體，或者兩種技術(shù)的組合來共表達(dá)酶。當(dāng)使用不同的載體時，載體可以具有不同的可選擇標(biāo)記，以及不同的復(fù)制起源。當(dāng)只使用一個載體時，可以從一個或多個啟動子表達(dá)基因。如果在一個啟動子(二或多順反子)的調(diào)控下克隆，所克隆的基因的順序可能影響蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。蛋白酶也可以作為融合蛋白表達(dá)，例如，在讀碼框中，編碼蛋白酶的基因被融合至編碼另一蛋白的基因。該蛋白可能是另一種酶或另一種酶的功能區(qū)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列的重組宿主細(xì)胞，其可方便地用于多肽的重組生產(chǎn)。將包含本發(fā)明核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以使載體作為染色體成分或作為前述的自我復(fù)制的染色體外載體存在。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包含與復(fù)制過程中發(fā)生突變的親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后裔。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上將依賴于編碼多肽的基因及其來源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如，原核生物，或者是非單核微生物，例如，真核生物。
有用的單細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞如革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，或鏈霉菌屬細(xì)胞，或乳酸菌細(xì)胞；或者為革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌和假單胞菌(Pseudomonas)類的乳酸細(xì)菌，包括但不限于乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)的物種。
可以通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或者Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56209-221)、電穿孔法(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)、接合法(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)將載體導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞。
宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如非人動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或者真菌細(xì)胞。
在特定實施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。此處所用“真菌(fungi)”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等，在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定義的)、以及Oomycota(如Hawksworth等，1995，如上，page 171所引用的)和所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等，1995，如上)。
在另一特定實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。此處所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenous)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))，產(chǎn)擔(dān)子孢子囊酵母(basidiosporogenous)，和屬于半知菌(Fungi Imperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類將來可能會有所變化，為了本發(fā)明的目的，應(yīng)該按照Biology and Activities of Yeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述定義酵母。
酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母(Candida)、漢遜酵母(Hansenula)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、畢赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或者亞羅威阿酵母(Yarrowia)細(xì)胞。
真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，以上所定義的)所有絲狀形式的亞類。絲狀真菌以由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)合多糖組成的菌絲體壁為特征。營養(yǎng)生長依靠菌絲的延長，碳分解是需氧的。相反，酵母例如啤酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞十狀體的萌發(fā)進(jìn)行，碳分解可以是發(fā)酵。
絲狀真菌宿主細(xì)胞的例子是但不限于支頂孢霉(Acremonium)，曲霉，鐮刀霉(Fusarium)，腐質(zhì)霉(Humicola)，毛霉(Mucor)，黃霉(Myceliophthora)，脈孢菌(Neurospora)，青霉(Penicillium)，梭孢殼菌(Thielavia)，Tolypocladium，或木霉(Trichoderma)上述屬物種的細(xì)胞。
可以通過涉及原本已知的原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、以及細(xì)胞壁再生等方式的方法轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 811470-1474中描述了轉(zhuǎn)化曲霉宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)姆椒?。Malardier等，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787中描述了轉(zhuǎn)化鐮刀霉物種的適當(dāng)方法?？梢杂肂ecker and Guarente，InAbelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751920中描述的方法轉(zhuǎn)化酵母。
生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包含(a)培養(yǎng)菌株，該菌株的野生型能夠生產(chǎn)所述多肽；和(b)回收多肽。優(yōu)選該菌株屬于擬諾卡氏菌屬，更優(yōu)選為Nocardiopsis prasina，南極擬諾卡氏菌，Nocardiopsis dassonvillei或Nocardiopsis alba，最優(yōu)選為Nocardiopsis alba DSM 15647，或者Nocardiopsisdassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包含(a)在有利于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收多肽。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包含(a)在有利于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞包含突變的核酸序列，該突變的核酸序列在SEQ ID NO1的502-1065或1-1065位核苷，或者在SEQ ID NO5的1-1143、88-1143，優(yōu)選568-1143位核苷包含至少一個突變，其中的突變核酸序列編碼多肽，該多肽(i)由SEQ ID NO2的1至188，或者-167至188，或者SEQ ID NO6的-160至192，優(yōu)選1-192氨基酸組成，或者(ii)是(i)中任一序列的變異體，其中該變異體包含一個或多個氨基酸的取代、刪除、和/或插入，或者(iii)是(i)中任一序列的等位變異體，或者(iv)是(i)中任一序列的片段。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，細(xì)胞培養(yǎng)于適合用本領(lǐng)域已知方法生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如，可以在實驗室或者工業(yè)發(fā)酵罐中，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中以及允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、分批的、補(bǔ)料-分批的、或者固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳源和氮源以及無機(jī)鹽的適當(dāng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中以本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從供應(yīng)商處獲得，或者可以用公布的組合物(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中的)制備。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基回收多肽。如果多肽沒有分泌，則可以通過細(xì)胞裂解來回收。
可以用本領(lǐng)域已知的專門用于所述多肽的方法探測多肽。這些探測方法可能包括使用特異性抗體、形成產(chǎn)物、或者底物的消失。例如，可以用蛋白酶測試來測定此處所述多肽的活性。
可以用本領(lǐng)域已知的方法回收所得多肽。例如，可以通過傳統(tǒng)的方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽。
可以用本領(lǐng)域已知的方法包括但不限于層析(例如，離子交換層析、親合層析、疏水層析、色譜聚焦層析、大小排阻層析)、電泳(例加，制備性等電聚焦電泳)、差別溶解度(differential solubility)(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或者提取(參見，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)來純化本發(fā)明的多肽。
植物本發(fā)明還涉及用編碼本發(fā)明具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或者植物細(xì)胞，其用于表達(dá)生產(chǎn)可回收量的多肽?？梢詮闹参锘蛑参锊糠只厥账龆嚯摹？蛇x地，包含重組多肽的植物或植物部分可用于如改善食物或飼料的質(zhì)量，例如，提高營養(yǎng)價值、改善口味和改善流變性狀，或者用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
在特定實施方案中，所述多肽定位于種子的胚乳存儲液泡中?？梢酝ㄟ^用適當(dāng)?shù)男盘栯囊郧绑w形式合成多肽來達(dá)到這種目的，參見Horvath等，PNAS，F(xiàn)eb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。
轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或者單子葉的(單子葉植物)或其工程變異體。單子葉植物的例子為草，例如早熟禾(meadow grass，bluegrass，Poa)，飼草如羊茅(Festuca)、黑麥草(Lolium)，temperate grass如剪股穎屬(Agrostis)，和谷類例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、黑小麥(triticale)(小麥(Triticum)和黑麥(Secale)的穩(wěn)定化雜種)、和玉米(corn)。雙子葉植物的例子是煙草，豆科植物例如羽扇豆(legume)、馬鈴薯、糖用甜菜、豌豆(pea)、菜豆(bean)和大豆(soybean)，和十字花科植物(family Brassicaceae)例如向日葵(Helianthus)、棉花(Gossypium)、花椰菜、油菜籽、和非常相關(guān)的模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。例如US專利no.5,689,054和US專利no.6,111,168中描述的肌醇六磷酸低含量植物為工程植物的例子。
植物部分的例子是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖，還有包含這些部分的單獨的組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。特定的細(xì)胞區(qū)室例如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體、和細(xì)胞質(zhì)被認(rèn)為是植物部分。另外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣，植物部分例如為方便本發(fā)明利用而分離的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如，胚、胚乳、糊粉(aleurone)、種皮。
這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可以按照本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建表達(dá)本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡單地說，將一個或多個編碼本發(fā)明多肽的表達(dá)構(gòu)建體整合至植物宿主基因組，并將所得的經(jīng)改造的植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，以此來構(gòu)建植物或植物細(xì)胞。
方便地，所述表達(dá)構(gòu)建體為核酸構(gòu)建體，其包含與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列可操作相連的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列，所述調(diào)控序列是在所選植物或植物細(xì)胞中表達(dá)核酸序列所需要的。另外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含可選擇標(biāo)記，該標(biāo)記可用于鑒定整合了表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其序列對于引導(dǎo)所述構(gòu)建體進(jìn)入所述植物是必須的(后者依賴于所使用的DNA導(dǎo)入方法)。
調(diào)控序列，例如啟動子和終止子序列和可選的信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇以例如需要何時、何地及如何表達(dá)所述多肽為基礎(chǔ)來確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成性的或可誘導(dǎo)的，或者可以是發(fā)育、場所或組織特異的，基因產(chǎn)物可以定向至特定的組織或植物部分例如種子或葉子。例如，Tague等，1988，Plant Physiology 86506描述了調(diào)控序列。
對于組成性表達(dá)，可以使用以下的啟動子35S-CaMV啟動子(Franck等，1980，Cell 21285-294)，玉米u(yù)biquitin 1(Christensen AH，Sharrock RA andQuail 1992.Maize polyubiquitin genesstructure，thermal perturbation ofexpression and transcript splicing，and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation)，或者水稻actin 1啟動子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，McElroy D.and Wu R 1991，Analysis of rice Actl 5’regionactivity in transgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特異性啟動子可以是，例如，來自貯藏組織如種子、馬鈴薯塊莖、和果實的啟動子(Edwards& Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)，或者來自代謝組織如分生組織的啟動子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)，可以是種子特異的啟動子如來自水稻的glutelin，prolamin，globulin，和albumin的啟動子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)，來自legumin B4和蠶豆的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等，1998，Plant and CellPhysiology 39935-941)，來自甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)貯藏蛋白napA啟動子，或者本領(lǐng)域已知的任何其他種子特異性啟動子，例如WO 91/14772所描述的。另外，啟動子可以是葉特異性啟動子，例如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra and Higgins，1994，Plant Molecular Biology2685-93)，或者水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，Molecular andGeneral Genetics 248668-674)，或者創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。同樣，啟動子可以是能夠由非生物處理如溫度、干旱、鹽度改變所誘導(dǎo)的，或者是能夠由激活啟動子的外來物質(zhì)如乙醇、雌激素、植物激素像乙烯、脫落酸、赤霉酸、和/或重金屬所誘導(dǎo)的。
也可以使用啟動子增強(qiáng)子組件在植物中獲得更高的蛋白酶表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)子組件可以是位于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu等，1993，以上公開了水稻actin 1基因的第一個內(nèi)含子用于增強(qiáng)表達(dá)的用途。
更進(jìn)一步，可以優(yōu)化密碼子利用率以提升所述的植物物種的表達(dá)(參見，以上Horvath等所述)。
可以選擇本領(lǐng)域可獲得的可選擇標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)技術(shù)將核酸構(gòu)建體整合至植物基因組，包括農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、基因槍法轉(zhuǎn)化、和電穿孔法(Gasser等，1990，Science 2441293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto等，1989，Nature 338274)。
目前，土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法是用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的選擇(for a review，see Hooykas and Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 1915-38)，其也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管其他的轉(zhuǎn)化方法對于這些植物來說一般是優(yōu)選的。目前，選擇用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是對胚胎愈傷組織或發(fā)育中的胚胎(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10667-674)進(jìn)行粒子轟擊(轉(zhuǎn)化DNA包被的顯微金或鎢粒子)，加農(nóng)桿菌方法。用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的可選方法基于Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21415-428所述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇其中整合了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并使其再生為完整的植物。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包含(a)在有利于生產(chǎn)所述多肽的條件下，培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多肽具有蛋白酶活性；和(b)回收所述多肽。
動物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因非人動物及產(chǎn)品，或其部分，其例子為例如奶和血液、器官、肉、以及動物細(xì)胞。在例如哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見，例如the handbook Protein ExpressionA PracticalApproach，Higgins and Hames(eds)，Oxford University Press(1999)，以及涉及基因轉(zhuǎn)錄、RNA處理、翻譯后處理的該系列的三本其他手冊。一般來講，為制備轉(zhuǎn)基因動物，用編碼本發(fā)明具有蛋白酶活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化所選動物的選定細(xì)胞來表達(dá)生產(chǎn)該多肽?？梢詮膭游锢绱菩詣游锏哪讨谢厥斩嚯?，或者多肽的表達(dá)可能對動物自身是有利的，例如幫助動物消化。在下面標(biāo)題為動物飼料的部分提到了動物的例子。
為了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物以從動物的奶中回收蛋白酶，可以將編碼蛋白酶的基因插入所述動物的受精卵，例如通過使用含有適當(dāng)?shù)哪痰鞍讍幼雍途幋a蛋白酶的基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體來實現(xiàn)。將轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體微注射到受精卵，優(yōu)選永久整合至染色體。一旦卵開始生長分裂，就將潛在的胚胎植入代孕母親，并鑒定攜帶有轉(zhuǎn)化基因的動物?？梢酝ㄟ^傳統(tǒng)的飼養(yǎng)方法繁殖所得的動物?？梢詮膭游锏哪讨屑兓嚯模瑓⒁?，例如Meade，H.M.等(1999)Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals，Gene expression systemsUsing nature for the art of expression.J.M.Fernandezand J.P.Hoeffler(eds.)，Academic Press。
在可選方案中，為了生產(chǎn)在其體細(xì)胞和/或生殖細(xì)胞基因組中攜帶包括異源轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的核酸序列的轉(zhuǎn)基因非人動物，所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包括編碼蛋白酶的轉(zhuǎn)基因，可以如WO 2000064247所公開的，將該轉(zhuǎn)基因與用于蛋白酶唾腺特異性表達(dá)的第一個調(diào)控序列可操作相連。
組合物在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多肽的組合物。
可以依照本領(lǐng)域已知的方法制備多肽組合物，該多肽組合物可以是液體形式的或干燥形式的組合物。例如，多肽組合物可以是顆?；蛭⑿☆w粒形式。可以依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法把要包括在該組合物中的多肽穩(wěn)定化。
下面給出了本發(fā)明的多肽或多肽組合物的優(yōu)選用途的例子。
動物飼料本發(fā)明還涉及在動物飼料中使用本發(fā)明多肽的方法，也涉及包含本發(fā)明多肽的飼料組合物和飼料添加劑。
術(shù)語動物包括所有的動物，包括人。動物的例子為非反芻動物和反芻動物。反芻動物包括例如綿羊、山羊、馬、和牛例如肉牛、母牛、小牛犢。在特定實施方案中，動物是非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物例如豬(pigs或swine)(包括但不限于豬仔、生長豬、和大母豬)；家禽例如火雞、鴨、雞(包括但不限于肉雞、蛋雞)；young calves；和魚(包括但不限于鮭魚、鱒魚、羅非魚、鯰魚、鯉魚)；和甲殼類(包括但不限于蝦(shrimp)、對蝦)。
術(shù)語飼料或者飼料組合物指任何適合或者希望動物攝入的化合物、制劑、混合物或者組合物。
在本發(fā)明的用途中，可以在食物之前、之后飼喂動物，或者與食物同時飼喂動物。后者是優(yōu)選的。
在特定的實施方案中，蛋白酶添加到飼料中或者包括于飼料添加劑中的形式是明確的。“明確的”(well-defined)是指通過大小排阻層析測定，蛋白酶制劑的純度至少為50％。在其他的特定實施方案中，以此方法測定的蛋白酶制劑純度至少為60，70，80，85，88，90，92，94，或95％。
明確的蛋白酶制劑是有利的。例如，向飼料中添加正確劑量的蛋白酶而基本不受其他蛋白酶的干擾或污染是非常容易地。術(shù)語添加正確劑量尤其是指獲得一致或恒定結(jié)果的目的，和基于所需效果而優(yōu)化劑量的能力。
然而，用于動物飼料用途時，蛋白酶沒有必要是那樣的純度；例如它可以包括其他的酶，這種情況下其可以稱為蛋白酶制劑。
蛋白酶制劑可以(a)直接添加到飼料中(直接用于蛋白質(zhì)的處理過程)，或者(b)可以用于一種或多種中間組合物如飼料添加劑或者預(yù)混料的生產(chǎn)，隨后添加到飼料中(或者用于處理過程中)。上述的純度指最初的蛋白酶制劑的純度，無論其是用于上述的(a)或是(b)中。
特別是具有這種純度數(shù)量級的蛋白酶制劑是可以使用重組生產(chǎn)的方法獲得的，而使用傳統(tǒng)的發(fā)酵方法生產(chǎn)時，是不能夠如此容易獲得的，并且有非常高的批量(batch-to-batch)變異。
當(dāng)然，這樣的蛋白酶制劑可以與其他的酶混合。
在特定實施方案中，用于本發(fā)明的用途的蛋白酶能夠溶解蛋白質(zhì)。實施方案5中公開了測定溶解蛋白質(zhì)的合適的測試方法。
蛋白質(zhì)可以是動物蛋白質(zhì)，例如肉和骨粉，和/或魚粉；或者可以是植物蛋白質(zhì)。此處所用術(shù)語植物蛋白質(zhì)指包括得自或源于植物的至少一種蛋白質(zhì)的任何化合物、組合物、制劑或混合物，包括改造的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物。在特定實施方案中，植物蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量至少為10，20，30，40，50，或60％(w/w)。
植物蛋白質(zhì)可以得自植物蛋白質(zhì)來源，例如豆類和谷類，例如豆科(Fabaceae，Leguminosae)、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和Poaceae植物家族的原料，例如大豆粉、羽扇豆(lupin)粉和油菜籽粉。
在特定實施方案中，植物蛋白質(zhì)來源是一種或多種豆科植物例如大豆、羽扇豆、豌豆、或豆(bean)的原料。
在另外的特定實施方案中，植物蛋白質(zhì)來源是一種或多種藜科植物例如甜菜、糖用甜菜、菠菜或奎奴亞藜(quinoa)的原料。
其他植物蛋白質(zhì)來源的例子是油菜籽、向日葵籽、棉花籽和甘藍(lán)(cabbage)。
大豆是優(yōu)選的植物蛋白質(zhì)來源。
其他的植物蛋白質(zhì)來源的例子是谷類例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米(corn)、水稻、黑小麥和高粱。
根據(jù)本發(fā)明用至少一種本發(fā)明的蛋白酶對蛋白質(zhì)的處理使蛋白質(zhì)的溶解增強(qiáng)。
下面是在單胃動物體外模型中，能夠用本發(fā)明的蛋白酶得到的溶解蛋白質(zhì)％的例子相對于空白為至少101％、或者至少102％，103％，104％，105％，106％，107％。用實施方案5的單胃動物體外模型測定溶解蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。術(shù)語蛋白質(zhì)的溶解意思基本上指使蛋白質(zhì)成為溶液。這樣的溶解可以歸因于蛋白質(zhì)從常見復(fù)合天然組合物如飼料的其他成分中的釋放，這種釋放由蛋白酶介導(dǎo)。
在另外的特定實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的用途中的蛋白酶能夠增加可消化蛋白質(zhì)的量。下面是在單胃動物體外模型中，能夠用本發(fā)明的蛋白酶得到的已消化的或可消化的蛋白質(zhì)％的例子相對于空白來說，至少為101％，或者至少為102％。用實施方案5的體外模型測定已消化的或可消化的蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。
在其他的特定實施方案中，用于本發(fā)明的用途中的蛋白酶能夠提高蛋白質(zhì)的水解程度(DH)。在特定實施方案中，水解程度相對于空白至少為101％，102％，103％，104％，或者105％。水解程度由實施方案5的體外模型測定。
在本發(fā)明(預(yù))處理方法的特定實施方案中，所述的蛋白酶影響(或作用于、或發(fā)揮其溶解作用)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源。為達(dá)到此目的，典型地，將蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源懸浮于溶劑，例如水溶劑如水，并且根據(jù)所述酶的特征調(diào)整pH和溫度。例如處理可以在當(dāng)前蛋白酶能夠發(fā)揮其至少40％，50％，60％，70％，80％或90％活性的pH值下進(jìn)行。同樣，例如處理可以在當(dāng)前蛋白酶能夠發(fā)揮其至少40％，50％，60％，70％，80％或90％活性的溫度下進(jìn)行。上述的活性百分?jǐn)?shù)是相對于最大活性而言的。使酶反應(yīng)持續(xù)至得到所需結(jié)果為止，此后可以通過將酶滅活，如通過熱處理步驟來終止酶反應(yīng)，也可不終止。
在本發(fā)明處理方法的特定實施方案中，蛋白酶作用是緩釋的，意思是，例如，蛋白酶加進(jìn)了蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源，但其溶解作用可以說直至以后需要時才打開，此時建立了適當(dāng)?shù)娜芙鈼l件，或者滅活了任何的酶抑制劑，或者取消了已用于延遲酶作用的任何其他方式。
在一個實施方案中，所述處理是對動物飼料的或用于動物飼料的蛋白質(zhì)的預(yù)處理。
術(shù)語改善動物飼料的營養(yǎng)價值意思是改善蛋白質(zhì)的可用性和/或可消化性，由此使來自食物成分的蛋白質(zhì)提取物增加，得到更高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，蛋白質(zhì)降解增強(qiáng)和/或蛋白質(zhì)利用率提高。因此提高了飼料的營養(yǎng)價值，動物的性狀如生長率和/或增重量(weight gain)和/或飼料轉(zhuǎn)化率(例如，攝取的飼料與增重量的對比)得到提高。
在特定實施方案中，飼料轉(zhuǎn)化率提高至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％。在另外的特定實施方案中，增重量提高至少2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％或11％。這些數(shù)字相對于沒有添加蛋白酶的對照實驗。
可以如EEC(1986)Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant laméthode de calcul de la valeur énérgetique des aliments composés destinés àlavolaille.Journal Officiel des Communautés Européennes，L130，53-54中所述計算飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)和增重量。
可以將蛋白酶以任何形式加入飼料，可以是相對純的蛋白酶，或者是與其他要添加到動物飼料的成分一起的混合物，例如，以飼料添加劑的形式，例如所謂的動物飼料預(yù)混料。
另一方面，本發(fā)明涉及用于動物飼料的組合物，例如動物飼料，和動物飼料添加劑，例如預(yù)混料。
除了本發(fā)明的蛋白酶，本發(fā)明的動物飼料添加劑還包含至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種微量礦質(zhì)元素。飼料添加劑也可以包含至少一種大量礦質(zhì)元素。
另外，可選地，飼料添加劑成分為色素制劑，例如，類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素、蝦青素(astaxanthin)、葉黃素(lutein)；芳香化合物；穩(wěn)定劑；抗菌肽；多聚不飽和脂肪酸；活性氧生成物質(zhì)(species)；和/或選自淀粉酶，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC 3.2.1.6)的至少一種其他酶。
在特定實施方案中，這些其他酶是明確的(如上述針對蛋白酶制劑所定義的)。
抗菌肽的例子(AMP’s)為CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、死亡肽(Thanstin)、防衛(wèi)肽(Defensin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)、乳鐵蛋白肽(Lactoferricin)、和Ovispirin例如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins、和Statins，包括WO 03/044049和WO 03/048148中公開的化合物和多肽，以及保留抗菌活性的上述肽的變異體或片段。
抗真菌多肽(AFP’s)的例子為WO 94/01459和WO 02/090384中所公開的Aspergillus giganteus和黑曲霉肽，以及其保留抗真菌活性的變異體和片段。
多聚不飽和脂肪酸的例子為C18，C20和C22多聚不飽和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸和γ-亞麻酸。
活性氧生成物質(zhì)的例子是化學(xué)藥品例如過硼酸鹽(perborate)、過硫酸鹽(persulphate)、或者過碳酸鹽(percarbonate)；和酶例如氧化酶、加氧酶或者合酶(syntethase)。
常見脂溶性和水溶性維生素，以及微量礦質(zhì)元素構(gòu)成欲往飼料中添加的所謂預(yù)混料的一部分，而大量礦質(zhì)元素通常單獨添加到飼料中。富含本發(fā)明的蛋白酶的預(yù)混料是本發(fā)明的動物飼料添加劑的例子。
在特定的實施方案中，要添加到動物食物或飼料中的本發(fā)明的動物飼料添加劑在0.01至10.0％水平，更特別地在0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％指g添加劑每100g飼料)。在預(yù)混料中尤其如此。
下面是這些成分實例的非排除性清單脂溶性維生素的例子為維生素A、維生素D3、維生素E、和維生素K、例如維生素K3。
水溶性維生素的例子為維生素B12、生物素和膽堿、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸鹽(panthothenate)例如Ca-D-泛酸。
微量礦質(zhì)元素的例子為錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。
大量礦質(zhì)元素的例子為鈣、磷和鈉。
WO 01/58275的表A列出了對這些成分的營養(yǎng)需求(以家禽和仔豬/豬為例)。營養(yǎng)需求意思是應(yīng)當(dāng)在食物中提供指定濃度的這些成分。
可選地，本發(fā)明的動物飼料添加劑包含WO 01/58275的表A中列出的單一成分中的至少一種。至少一種指兩者之一、一種或多種、一種、或兩種、或三種、或四種等等，直至所有13種，或者直至所有15種單一成分。更特別地，這種至少一種單一成分在本發(fā)明添加劑中的量提供表A第四欄、或第五欄、或第六欄所示范圍之內(nèi)的飼料中濃度。
本發(fā)明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或食物具有相關(guān)高的蛋白質(zhì)含量。家禽和豬食物可以WO 01/58275的表B第2-3欄所示為特征。魚食物可以表B第4欄所示為特征。另外，這樣的魚食物通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO 01/58275相應(yīng)于US 09/77334，此處一并作為參考。
根據(jù)本發(fā)明的動物飼料組合物含有50-800g/kg的粗蛋白，另外還包括至少一種此處所要求的蛋白酶。
此外，或者可選地(對于上述指定的粗蛋白含量)，本發(fā)明的動物飼料組合物含有10-30MJ/kg的可代謝能量；和/或0.1-200g/kg的鈣；和/或0.1-200g/kg的可用磷；和/或0.1-100g/kg甲硫氨酸；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸；和/或0.5-50g/kg的賴氨酸。
在特定實施方案中，可代謝能量、粗蛋白、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或賴氨酸的含量在WO 01/58275(R.2-5)的表B中2，3，4或5中任意一個范圍內(nèi)。
以氮(N)乘以因數(shù)6.25來計算粗蛋白，例如，粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x6.25。以Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis 14th ed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)測定氮含量。
可以以NRC publication Nutrient requirements in swine，ninth revisededition 1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6，and the European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DABeekbergen，The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5為基礎(chǔ)計算可代謝能量。
以飼料表例如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemischesamenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7為基礎(chǔ)計算完全動物食物中鈣、可用磷和氨基酸的含量。
在特定實施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物至少包含一種上述定義的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來源。也可以包含動物蛋白，例如肉和骨粉，和/或魚粉，典型地，用量為0-25％。
在另外的特定實施方案中，本發(fā)明的動物飼料組合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麥；和/或0-70％的大麥；和/或0-30％的燕麥；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的魚粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。
動物食物可以制成例如糊狀飼料(非顆粒狀)或粒狀(pelleted)飼料。典型地，混合磨碎的飼料-原料，按照對所述物種的說明加入足夠量的基本維生素和礦質(zhì)元素。酶可以以固體或液體酶制劑的方式加入。例如，固體酶制劑典型地在混合步驟之前或混合步驟中加入；液體酶制劑典型地以制粒步驟之后加入。也可以將酶加至飼料添加劑或者預(yù)混料中。
食物中的最終酶濃度在0.01-200mg酶蛋白每kg食物的范圍內(nèi)，例如在0.5-25mg酶蛋白每kg動物食物的范圍內(nèi)。當(dāng)然，要以有效量使用蛋白酶，例如，足夠增強(qiáng)飼料的溶解性和/或提高其營養(yǎng)價值的用量。目前考慮以一個或多個下述的用量(劑量范圍)加入酶0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或者0.10-10-所有這些范圍均為mg蛋白酶蛋白每kg飼料(ppm)。
為了測定mg酶蛋白每kg飼料，從飼料組合物中純化蛋白酶，用相關(guān)性測試(參見下面的蛋白酶活性，底物，和測試)測定純化蛋白酶的特異活性。這樣的飼料組合物的蛋白酶活性也用同樣的測試方法測定，以這兩個測定為基礎(chǔ)，來計算以mg酶蛋白每kg飼料計的劑量。
使用同樣的方法來測定飼料添加劑中的mg酶蛋白。當(dāng)然，如果可以獲得用于制備飼料添加劑或者飼料的蛋白酶，就由該樣品測定特異活性(無需從飼料組合物或添加劑中純化蛋白酶)。
下面的實施方案進(jìn)一步描述本發(fā)明，不應(yīng)將其解釋為對本發(fā)明的范圍的限定。
洗滌劑組合物本發(fā)明的蛋白酶可以添加到洗滌劑組合物中，這樣就成為洗滌劑組合物的成分。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以制成例如手洗或機(jī)洗洗滌劑組合物，其包括適合于玷污織物預(yù)處理的洗滌添加劑組合物和漂洗加入的織物軟化劑組合物，或者可以制成用于常規(guī)家用物品硬表面清洗操作的洗滌劑組合物，或者可以制成用于手或機(jī)器洗碗盤操作的洗滌劑組合物。
在特定方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的蛋白酶的洗滌劑添加劑。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包含一種或多種其他的酶，例如另一種蛋白酶，如源于芽孢桿菌的堿性蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過氧化物酶。
一般來講，所選擇的酶的特性應(yīng)與選擇的洗滌劑相容，(例如，最適pH，與其他酶學(xué)和非酶學(xué)組分的相容性等)，并且酶應(yīng)以有效量存在。
合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的脂肪酶。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化變異體。有用的脂肪酶的例子包括來自腐質(zhì)霉(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，例如EP 258068和EP 305216所述的來自胎毛腐質(zhì)霉(H.lanuginosa)(T.lanuginosus)或者WO 96/13580所述的來自H.insolens的脂肪酶，假單胞菌脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或者類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、P.cepacia(EP 331376)、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)(GB 1,372,034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌株系SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或者短小芽孢桿菌(B.pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。其他的例子為例如WO 92/05249，WO 94/01541，EP407225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO94/25578，WO 95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中描述的脂肪酶變異體。商業(yè)上可獲得的優(yōu)選脂肪酶為LipolaseTM和LipolaseUltraTM(Novozymes A/S)。
合適的淀粉酶(α-和/或β-)包括細(xì)菌或真菌來源的淀粉酶。包括化學(xué)修飾的或者蛋白質(zhì)工程化變異體。淀粉酶包括，例如，由芽孢桿菌例如地衣芽孢桿菌的特定株系獲得的α-淀粉酶，GB 1,296,839中有更為詳細(xì)的描述。有用的淀粉酶的例子為WO 94/02597，WO 94/18314，WO 95/26397，WO96/23873，WO 97/43424，WO 00/60060，和WO 01/66712中描述的變異體，尤其是在下述位置具有一個或多個取代的變異體15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408，和444。商業(yè)上可獲得的淀粉酶為NatalaseTM，SupramylTM，StainzymeTM，DuramylTM，TermamylTM，F(xiàn)ungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(來自Genencor International Inc.)。
合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的纖維素酶。包括化學(xué)修飾的或者蛋白質(zhì)工程化變異體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮刀霉屬、梭孢殼屬(Thielavia)、頂孢霉屬的纖維素酶，例如US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259中公開的從Humicola insolens、嗜熱黃霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢鐮刀霉(Fusarium oxysporum)生產(chǎn)的真菌纖維素酶。尤其適合的纖維素酶是具有顏色養(yǎng)護(hù)(care)作用的堿性或中性纖維素酶。EP 0 495257，EP 531372，WO96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中公開了這樣的纖維素酶的例子。其他的例子為纖維素酶變異體，例如WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US 5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和WO 99/01544中所描述的。商業(yè)上可獲得的纖維素酶包括CelluzymeTM，和CarezymeTM(Novozymes A/S)，ClazinaseTM，和Puradax HATM(Genencor Intenational Inc.)，以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶。包括化學(xué)修飾的或者蛋白質(zhì)工程化變異體。有用的過氧化物酶的例子包括WO 93/24618，WO 95/10602，和WO 98/15257中所描述的來自鬼傘(Coprinus)，例如灰蓋鬼傘(C.cinereus)的過氧化物酶及其變異體。商業(yè)上可獲得的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes)。
可以通過添加包含一種或多種酶的單獨的添加劑，或者通過添加包含所有這些酶的組合添加劑將洗滌劑酶加入洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，例如單獨的或組合的添加劑，可以制成例如顆粒、液體、漿等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑(formulations)為顆粒尤其是無粉塵顆粒、液體尤其是穩(wěn)定化液體、或者漿。
可以如US 4,106,991和4,661,452中所述生產(chǎn)無粉塵顆粒，可選地，用本領(lǐng)域已知的方法包被。蠟樣的包被材料的例子為具有1000至20000平均摩爾重量的聚氧化乙烯產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基苯酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12至20個碳原子，且其具有15至80個環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單甘油酯、甘油二酯以及甘油三酸酯。GB 1483591給出了適合于流化床技術(shù)使用的膜形成包被材料?？梢愿鶕?jù)已建立的方法通過例如加入多羥基化合物如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或者硼酸將液態(tài)酶制品穩(wěn)定化?？梢愿鶕?jù)EP 238216中公開的方法制備被保護(hù)的酶。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以為任何方便的形式，例如，條、藥片、粉末、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是水化的，典型地包含直至70％的水以及0-30％的有機(jī)溶劑，或者是非水化的。
洗滌劑組合物包含一種或多種的表面活性劑，其可以是不帶離子的包括半極性的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性離子的。表面活性劑典型地以0.1％至60％的重量水平存在。
當(dāng)其中包含陰離子表面活性劑時，通常洗滌劑將包含約1％至約40％的陰離子表面活性劑，例如烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽(olefinsulfonate)、烷基磺酸鹽(脂肪酸磺酸鹽)、醇乙氧基硫酸酯、二級烷基磺酸(secondaryalkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或鏈烯基琥珀酸或者肥皂。
當(dāng)其中包含不帶離子的表面活性劑時，通常洗滌劑將包含約0.2％至約40％的不帶離子的表面活性劑，例如醇乙氧基酯類化合物、壬基苯酚乙氧基酯類化合物(nonylphenol ethoxylate)、烷基糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氨基氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酸胺、或者葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“glucamides”)。
洗滌劑可以包含0-65％的洗滌劑助洗劑或者復(fù)合試劑如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、烷基或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)訝罟杷猁}(例如，Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可以包含一種或多種多聚體。例子為羰甲基纖維素、多聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡啶N氧化物(poly(vinylpyridine-N-oxide))、聚乙烯基咪唑、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和月桂酸甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。
洗滌劑可以包含漂白系統(tǒng)，漂白系統(tǒng)可以包含H2O2源例如過硼酸鹽或者過碳酸鹽，其可以與過酸形成漂白激活劑例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸鹽(nonanoyloxybenzenesulfonate)組合?？蛇x地，漂白系統(tǒng)可以包含例如氨、亞胺、砜類型的過氧酸。
可以用傳統(tǒng)的穩(wěn)定化試劑來使本發(fā)明的洗滌劑組合物的酶穩(wěn)定化，穩(wěn)定化試劑為例如，多羥基化合物如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸，或者為硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物如4-甲?；交鹚?，可以按照例如WO 92/19709和WO 92/19708所述方法制備組合物。
洗滌劑也可以包含其他的傳統(tǒng)洗滌劑成分，例如織物護(hù)理劑，包括粘土(clays)、增泡劑、抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、防污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、助水溶劑(hydrotropes)、防失澤劑、或香料。
目前，預(yù)期可以以相當(dāng)于0.01-100mg酶蛋白每升洗滌水，優(yōu)選0.05-5mg酶蛋白每升洗滌水，尤其是0.1-1mg酶蛋白每升洗滌水的量向洗滌劑組合物中加入任何的酶，尤其是本發(fā)明的酶。
另外，本發(fā)明的酶可以加至WO 97/07202所公開的洗滌劑配方中。
生物材料的保藏下述由2001年在丹麥?zhǔn)占耐寥罉悠分蟹蛛x的生物材料，已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約的條款保藏于德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，并給出下面的保藏號保藏物 保藏號 保藏日期Nocardiopsis albaDSM 15647May 30，2003該株系的保藏保證了在本專利申請未決期間，由專利與商標(biāo)專員依據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122所授權(quán)的人能夠得到該株系。該保藏物為所保藏株系的基本上純化的培養(yǎng)物。此保藏物可以在提交了這些申請的副本或其后續(xù)文本的國家依據(jù)該外國專利法的要求獲得。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對實施本發(fā)明的許可，實施本發(fā)明將侵犯由政府行為所授予的專利權(quán)。
由于本發(fā)明的實施方案是要作為本發(fā)明幾個方面的示例，因而本發(fā)明此處的描述和權(quán)利要求并不是要以此處公開的特定實施方案來限定其范圍。任何等同的實施方案將被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，對本發(fā)明除此處所列出和描述的之外，通過前面的描述，很多的修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講都將是很明顯的。這種修改也將落在所附的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。對于有沖突的情況，將由本發(fā)明的說明書包括定義來解釋。
此處引用的多個參考文獻(xiàn)，其公開的內(nèi)容整體一并作為參考。
實施例實施例1源于白色擬諾卡菌DSM 15647的蛋白酶的克隆與表達(dá)試劑與培養(yǎng)基LB瓊脂 Ausubel，F(xiàn).M.等(eds.)“Current protocols in MolecularBiology”.John Wiley and Sons，1995中所述LB-PG瓊脂 補(bǔ)充了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸鉀，pH7.0的LB瓊脂PS-1 10％蔗糖，4％大豆粉，1％Na3PO4-12H2O，0.5％CaCO3，和0.01％pluronic acidTE 10mM Tris-HCl，pH7.41mM EDTA，pH8.0TELTE-緩沖液中50mg/ml的Lysozym硫氰酸鹽 5M硫氰酸鈲(guanidium thiocyanate)100mM EDTA0.6％w/v N-月桂醇肌氨酸，鈉鹽60g硫氰酸鹽，20ml 0.5M EDTA，pH8.0，20ml H2O在65℃溶解。冷卻至室溫(RT)，加入0.6g N-月桂醇肌氨酸。加水至100ml，用0.2μ消毒的過濾器過濾。
NH4Ac7.5M CH3COONH4TERTE-buffer緩沖液中1μg/ml的Rnase ACIA氯仿/異戊醇24∶1試驗程序SEQ ID NO1是編碼來自Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶前體形式的DNA序列。502-1065位核苷對應(yīng)于成熟肽編碼部分。
SEQ ID NO2是由SEQ ID NO1推導(dǎo)出來的氨基酸序列。-167至-1位氨基酸是前肽，氨基酸1至188是成熟肽。
SEQ ID NO1克隆野生型在收獲前于下述培養(yǎng)基中30℃生長3天Trypticase 20g酵母提取物 5g氯化鐵 6mg硫酸鎂 15mg蒸餾水加至 1000ml通過加入碳酸鈉將pH調(diào)至9按照以下方法分離Nocardiopsis alba DSM 15647的基因組DNA收獲1.5ml培養(yǎng)物，重懸于100μl TEL。37℃保溫30min。
加入500μl硫氰酸鹽緩沖液于室溫放置10min。
加入250μl NH4Ac置于冰上10min。
加入500ul CIA，混合。
轉(zhuǎn)至微型離心管離心10min。
將上清轉(zhuǎn)至新的Eppendorf管，加入0.54體積的冰凍異丙醇。徹底混合。用70％EtOH旋轉(zhuǎn)沖洗DNA顆粒。
于100μl TER中重懸基因組DNA。
基因組DNA用作PCR擴(kuò)增的模板，以下述的SEQ ID NO.3和4為引物。在0.7％瓊脂糖凝膠上分離PCR片段。
引物14215’-GTT CAT CGA TCG CAT CGG CTG CGA CCG GCC CCC TCCCCC AGT C-3’(SEQ ID NO3)16045’-GCG GAT CCT ATC AGG TGC GCA GGG TCA GAC C-3’(SEQ ID NO4)將消化與純化的PCR片段連接于Cla I和BamH I消化的質(zhì)粒pDG268NeoMCS-PramyQ/PrcryIII/cryIIIAstab/Sav(US Patent No.5,955,310)上。
將連接所得的混合物轉(zhuǎn)化至E.coli TOP10F’(Invitrogen BV，TheNetherlands)，選擇若干克隆用于微量制備(miniprep)(QIAprep spin，QIAGENGmbH，Germany)。轉(zhuǎn)化前，檢查純化的質(zhì)粒，用破壞的apr、npr和pel基因(Diderichsen等，(1990)，J.Bacteriol.，172，4315-4321)將其插入源于枯草芽孢桿菌DN 1885的枯草芽孢桿菌株系?；虻钠茐幕旧习凑铡錌acillus subtilisand other Gram-Positive Bacteria，″American Society for Microbiology，p.618，eds.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch and Richard Losick(1993)所述方法進(jìn)行。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在添加了6μg/ml氯霉素的1％脫脂乳LB-PG瓊脂板上劃平板。劃平板的細(xì)胞于37℃保溫過夜，通過周圍的空白區(qū)(clearing)鑒定包含蛋白酶的克隆。選擇蛋白酶陽性克隆，通過DNA序列分析從表達(dá)構(gòu)建體中確定所表達(dá)的酶的編碼序列。
發(fā)酵將上述轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞置于500ml帶隔板的Erlenmeyer瓶中，Erlenmeyer瓶中含有添加了6μg/ml氯霉素的100ml PS-1培養(yǎng)基，將其放在旋轉(zhuǎn)搖床(250r.p.m.)上，37℃發(fā)酵16小時，再于26℃額外發(fā)酵4天。
實施例2來自Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶的純化與鑒定蛋白酶測試1)pNA測試pNA底物 Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400).
溫度室溫(25℃)測試緩沖液 100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100用HCl或NaOH將pH-值調(diào)整至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，和12.0。
將20μl蛋白酶(稀釋于0.01％Triton X-100中)與100μl測試緩沖液混合。加入100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO，進(jìn)一步用0.01％Triton X-100稀釋45x)以開始測試。監(jiān)測OD405的增強(qiáng)，作為蛋白酶活性的測量值。
2)Protazyme AK測試底物Protazyme AK藥片(交聯(lián)并染色的酪蛋白；來自Megazyme)溫度受控的溫度(測試溫度)
測試緩沖液100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100用HCl或NaOH將pH-值調(diào)整至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0。
輕微攪動，使Protazyme AK藥片懸浮于2.0ml 0.01％Triton X-100中。在Eppendorf管中將500μl的此懸浮液與500μl測試緩沖液混合，置于冰上。加入20μl蛋白酶樣品(稀釋于0.01％Triton X-100中)。將Eppendorf管移至Eppendorf熱混合器以開始測試，其中Eppendorf混合器設(shè)定在測試溫度。在Eppendorf熱混合器的最高搖動速率(1400rpm)將Eppendorf管保溫15分鐘。將Eppendorf管轉(zhuǎn)至冰浴，以終止保溫。然后Eppendorf管在冰凍離心機(jī)中離心幾分鐘，將200μl的上層轉(zhuǎn)至微量滴定盤(microtiter plate)。OD650處讀數(shù)作為蛋白酶活性測量值。測試中包括空白緩沖液(buffer blind)(代替酶)。
離心(20000xg，20min)實施例1中的蛋白酶發(fā)酵物，從沉淀物上小心移走上清。用Seitz EKS盤過濾合并的上清，以除去殘留的擬諾卡氏菌細(xì)胞。將EKS濾液轉(zhuǎn)至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3，5mM琥珀酸，1mMCaCl2，pH為7的溶液，得到混濁的溶液。再次用Seitz EKS盤過濾以除去混濁物。將澄清的濾液置于相同緩沖液平衡過的桿菌肽(bacitracin)硅膠柱。用平衡緩沖液大致沖洗柱子后，用100mM H3BO3，10mM琥珀酸，2mM CaCl2，1M NaCl，25％異丙醇，pH7的溶液逐步洗脫蛋白酶。將桿菌肽洗脫液轉(zhuǎn)至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3，5mM琥珀酸，1mM CaCl2，pH為7的溶液，在配備有5000Da臨界點膜的Amicon濃縮室中超濾濃縮至最小體積。將濃縮的酶置于在100mM H3BO3，10mM琥珀酸，2mM CaCl2，200mM NaCl，pH為7的溶液中平衡過的Superdex 75大小排阻層析柱上，用相同的緩沖液洗脫。用柱子上的組分分析蛋白酶活性(37℃，pH9條件下用Protazyme AK測試分析)，用SDS-PAGE進(jìn)一步分析活性組分。將在考馬斯染色的SDS-PAGE膠上僅看到一個條帶的組分取下來，作為純化的制品，用于進(jìn)一步的鑒定。
pH-活性，pH-穩(wěn)定性，以及溫度-活性用pNA測試獲得pH-活性譜以及pH-穩(wěn)定性譜。對pH-穩(wěn)定性譜，將蛋白酶在測試緩沖液中稀釋10x，于37℃保溫2小時。保溫后，在測試殘余活性之前，將蛋白酶樣品稀釋于pH9的測試緩沖液中，使之轉(zhuǎn)變?yōu)橄嗤膒H-pH9。
Protazyme AK測試用于獲得pH9時的溫度-活性譜。結(jié)果列于下面的表1-3。
表1pH-活性譜

表2pH-穩(wěn)定性譜

表3溫度活性譜

發(fā)現(xiàn)蛋白酶被苯基甲基磺酰氟所抑制。其相對分子量經(jīng)SDS-PAGE測定為Mr＝19kDa。
差示掃描量熱法(DSC)DSC用于測定pH7.0時源于Nocardiopsis alba和Nocardiopsis sp.NRRL18262的蛋白酶的溫度穩(wěn)定性。純化的蛋白酶置于10mM磷酸鈉，50mM氯化鈉，pH7.0的溶液中4℃滲析過夜，在VP-DSC裝置(Micro Cal)上以1.5℃/min的恒定掃描速率從20至100℃測定。用MicroCal Origin軟件處理數(shù)據(jù)。
所得的變性或解鏈溫度Tm為對于本發(fā)明源于Nocardiopsis alba的蛋白酶為78.3℃；對于源于Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶為76.5℃。
實施例3源于Nocardiopsis alba的蛋白酶的特異活性用實施例2所述的純化蛋白酶制品測定特異活性。SDS-PAGE(按照WO01/58275中實施例2A所述方法測定)分析顯示制品的純度在95％以上。將蛋白酶樣品一分為二。一部分通過氨基酸分析來分析其蛋白質(zhì)含量，另一部分用于分析蛋白酶活性。
氨基酸分析(AAA)/(mg/ml)
用酸水解蛋白酶樣品的肽鍵，然后在Biochrom 20 Plus氨基酸分析儀上根據(jù)生產(chǎn)商的說明分離并量化釋放的氨基酸，該分析儀在商業(yè)上可從Bie &Berntsen A/S，Sandbaekvej 5-7，DK-2610 Roedovre，Denmark獲得。將蛋白質(zhì)樣品于真空離心機(jī)中干燥，溶解于18.5％(體積/體積)HCl+0.1％(體積/體積)苯酚中，110℃保溫16小時，用于酸水解。保溫之后，樣品于真空離心機(jī)中再次干燥，溶解于上樣緩沖液(0.2M檸檬酸鈉，pH2.2)，上樣到Biochrom 20Plus氨基酸分析儀。
為了進(jìn)行量化，將水解的樣品上樣到鈉形式的陽離子交換樹脂UltroPacno.8上，該柱子可通過商業(yè)途徑從Bie & Berntsen A/S獲得，商品目錄號為no.80-2104-15。根據(jù)生產(chǎn)商的上述說明，使改變pH(pH1至pH8)和離子強(qiáng)度的緩沖液通過柱子，分離不同的氨基酸。同樣根據(jù)生產(chǎn)商的說明，精確地控制柱子溫度(從53℃到92℃再回到53℃)，以確保所需的分離。將柱子洗脫液與茚三酮試劑(Bie & Berntsen，商品目錄號no.80-2038-07)混合，使所得混合物通過氨基酸分析儀的高溫反應(yīng)盤管。在反應(yīng)盤管中，茚三酮與氨基酸反應(yīng)形成有色化合物，有色化合物的量直接與所存在的氨基酸的量成比例。
蛋白酶活性測試(AU/ml)變性的血紅蛋白(在6.7mM KH2PO4/NaOH緩沖液中占0.65％(w/w)，pH7.50)于25℃用蛋白酶降解10分鐘，用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血紅蛋白，過濾除去。用Folin & Ciocalteu’s苯酚試劑測定濾液中的TCA可溶性血紅蛋白降解產(chǎn)物，有幾種氨基酸會顯示藍(lán)色。參考ALCALASETM標(biāo)準(zhǔn)測量并確定活性單位(AU)，ALCALASETM標(biāo)準(zhǔn)可請求Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark(測試號為no.EB-SM-0349.02/01)提供。
按下述計算特異活性特異活性(AU/g)＝(活性(AU/ml)/AAA(mg/ml))×1000(mg/g)源于Nocardiopsis alba DSM 15647的蛋白酶的特異活性為53.5AU/g，與之對照，源于Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶的特異活性為38.3AU/g。
實施例4蛋白酶L1a如實施例1所述，使Nocardiopsis dassonvillei subsp.dassonvillei DSM43235生長于野生型胰蛋白酶培養(yǎng)基，分離基因組DNA。
用下述引物1424和1485在基因組DNA上擴(kuò)增成熟蛋白酶L1a前體的編碼序列(SEQ ID NO1的88-1143位核苷)引物1485(SEQ ID NO7)5′-gcttttagttcatcgatcgcatcggctgcgaccgtaccggccgagccag-3′引物1424(SEQ ID NO8)5′-ggagcggattgaacatgcgattactaaccggtcaccagggacagcc-3′用PCR手段將L1a多核苷酸在閱讀框中與編碼Sav信號肽(SEQ ID NO9)的異源DNA片段融合。
通過在枯草芽孢桿菌MB 1053宿主細(xì)胞基因組(WO 03/95658)上的同源重組合并基因(包括信號肽編碼部分)，構(gòu)建了定名為Sav-L1a的枯草芽孢桿菌株系。在由地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動子、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)啟動子和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA啟動子包括穩(wěn)定化序列組成的三倍啟動子系統(tǒng)(如WO 99/43835所述)的控制下表達(dá)基因。氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶用作標(biāo)記(如Diderichsen，B.；Poulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for Bacillus subtilis.Plasmid 30312(1993)中所述)。
按實施例1所述檢查了氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體的蛋白酶活性，并選擇轉(zhuǎn)化體用于序列確定，然后同樣按照實施例1的方法發(fā)酵，只是于26℃下發(fā)酵6天。
離心培養(yǎng)物肉湯(20000xg，20min)，小心地將上清從沉淀上轉(zhuǎn)移走。將合并的上清通過Seitz EKS盤過濾，以除去芽孢桿菌宿主細(xì)胞的剩余物質(zhì)。將EKS濾液轉(zhuǎn)至G25 sephadex柱上的50mM H3BO3，5mM琥珀酸，1mMCaCl2，pH為7的溶液。從G25 sephadex柱向酶溶液加入固體硫酸銨，酶溶液中(NH4)2SO4的終濃度為1.6M。加入(NH4)2SO4期間用磁力攪拌器輕輕混合酶溶液，添加完成后繼續(xù)攪動30分鐘，使系統(tǒng)平衡。然后將酶溶液上樣至在100mM H3BO3，10mM琥珀酸，2mM CaCl2，1.6M(NH4)2SO4，pH為7的溶液中平衡過的Butyl Toyopearl柱。用平衡緩沖液徹底沖洗柱子后，在相同的緩沖液中用線性(NH4)2SO4梯度(1.6至0M)洗脫蛋白酶。取出含有蛋白酶的組分，轉(zhuǎn)至G25 sephadex柱上的20mM HEPES，pH為8的溶液，上樣至相同緩沖液平衡過的Q sepharose FF柱。用相同緩沖液徹底沖洗柱子后，在相同緩沖液中用線性NaCl梯度(0至0.5M)洗脫蛋白酶。用從柱子得到的組分分析蛋白酶活性(用Suc-AAPF-pNA測試，pH9)，進(jìn)一步用SDS-PAGE分析活性組分。將僅有一個條帶的組分(用考馬斯染色的SDS-PAGE膠判斷)取下來，作為純化的制品用于進(jìn)一步的鑒定。
L1a蛋白酶是α-裂解蛋白酶樣的酶(S1E肽酶家族，舊符號為S2A)，發(fā)現(xiàn)其被苯基甲基磺酰氟(PMSF)和鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑(SSI)所抑制。通過SDS-PAGE測定的其相對分子量為Mr＝22kDa。
按照實施例3所述方法測定的L1a蛋白酶的特異活性為49.8AU/g。
實施例5單胃動物體外測試結(jié)果在體外模型中測試了實施例2所述的純化蛋白酶刺激單胃動物消化的性能。特別地，測定了蛋白酶提高玉米/-SBM(玉米/-大豆粉)蛋白質(zhì)溶解和消化的能力。體外系統(tǒng)由10個瓶子組成，先將瓶中的玉米/-SBM底物與HCl/胃蛋白酶一起保溫-刺激胃內(nèi)消化-然后再與胰酶一起保溫-刺激腸內(nèi)消化。胃內(nèi)階段起始時在5個瓶子中加入蛋白酶，而其余的五個瓶子作為空白。腸內(nèi)保溫階段結(jié)束時，取出體外消化物樣品用于分析溶解和消化的蛋白質(zhì)。
大致的體外消化程序

條件底物4g SBM，6g玉米(預(yù)混的)pH3.0 胃步驟/6.8-7.0腸步驟HCl0.105M，1.5小時(例如30min HCl-底物預(yù)混合)胃蛋白酶3000U/g食物1小時胰酶8mg/g食物4小時溫度40℃重復(fù)數(shù)n溶液0.39M NaOH0.105M HCl
0.105M HCl，每5ml含有6000U胃蛋白酶1M NaHCO3，每ml含有16mg胰酶125mM NaAc-緩沖液，pH6.0以A280的值和氨基酸序列(氨基酸組合物)為基礎(chǔ)，用S.C.Gill & P.H.vonHippel，Analytical Biochemistry 182，319-326，(1989)中概述的原理計算蛋白酶蛋白(EP)的量。
實驗程序依據(jù)上述的概要。在1、2.5、和5.5小時時測量pH。6小時后終止保溫，取出30ml的樣品先放置在冰上，然后離心(10000xg，10min，4℃)。移出上清，-20℃保存。
通過膠過濾分析所有樣品中溶解的和消化的蛋白質(zhì)的含量，并用OPA方法分析其水解程度(DH)。
用OPA-方法測定DH用基于比色方法的半自動微量滴定盤(Nielsen，PM.；Petersen，D.；Dambmann，C.Improved method for determining food protein degree ofhydrolysis.J.Food Sci.2001，66，642-646)測定不同樣品中蛋白質(zhì)的水解程度。如下制備OPA試劑將7.620g十水四硼酸二鈉和200mg十二烷基硫酸鈉(SDS)溶于150ml去離子水中。試劑完全溶解后再繼續(xù)。將160mg 97％的鄰苯二醛(OPA)溶解于4ml乙醇。將OPA溶液定量轉(zhuǎn)移至上述溶液，用去離子水沖洗。在溶液中加入176mg 99％的二硫蘇糖醇(DTT)，用去離子水加至200ml。將50mg絲氨酸(Merck，Germany)溶解于500ml去離子水中制備絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)(0.9516 meqv/l)。
通過將每個樣品稀釋至吸光值(280nm)約0.5來制備樣品溶液。通常，用自動Tecan稀釋臺(Mnnedorf，Switzerland)稀釋(100×)上清。所有其他的分光光度計讀數(shù)均在340nm進(jìn)行，以去離子水為對照。將25μl樣品、標(biāo)準(zhǔn)和空白分配到微量滴定盤。將微量滴定盤插入iEMS MF讀數(shù)器(Labsystems，F(xiàn)inland)，自動分配200μl OPA試劑。測定吸光值前搖動微量滴定盤(2min；700rpm)。最后，計算DH。所有樣品的測定均進(jìn)行五次。
估算溶解和消化的蛋白質(zhì)通過膠過濾HPLC定量粗蛋白(CP)，以估算體外消化樣品的上清中溶解蛋白的含量。解凍上清，用0.45μm聚碳酸酯過濾器過濾，用H2O稀釋(1∶50，v/v)。稀釋的樣品用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)膠過濾柱(Global)進(jìn)行HPLC層析。用于等度洗脫的洗脫液為含有150mM NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。每次洗脫的洗脫液總體積為26ml，流速為0.4ml/min。在214nm處記錄洗脫曲線，測定洗脫曲線下的總面積。為了由總面積估算蛋白質(zhì)含量，用體外消化的參照玉米/-SBM樣品的系列稀釋制作校準(zhǔn)曲線(R2＝0.9993)，其中玉米/-SBM樣品的總蛋白含量已知。此參照樣品中蛋白質(zhì)的測定用Kjeldahl法(％氮的測定；A.O.A.C.(1984)Official Methods ofAnalysis 14th ed.，Washington DC)進(jìn)行。
累加對應(yīng)于具有1500道爾頓或以下分子量的肽和氨基酸的層析圖面積(Savoie，L.；Gauthier，S.F.Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of ProteinDigestibility.J.Food Sci.1986，51，494-498；Babinszky，L.；Van，D.M.J.M.；Boer，H.；Den，H.L.A.An In-vitro Method for Prediction of The Digestible CrudeProtein Content in Pig Feeds.J.Sci.Food Agr.1990，50，173-178；Boisen，S.；Eggum，B.O.Critical Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibilityin Simple-Stomach Animals.Nutrition Research Reviews 1991，4，141-162)來估算消化的蛋白質(zhì)的含量。為測定1500道爾頓分界線，以細(xì)胞色素C(Boehringer，Germany)、aprotinin、gastrin I、和substance P(Sigma Aldrich.USA)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)膠過濾柱。
以下表4和5列出的結(jié)果顯示，相對于空白而言，蛋白酶顯著地提高了可消化蛋白質(zhì)的水平，以及水解程度。
表4水解程度(DH)

同一欄中的不同字母代表顯著差異(1-way ANOVA，Tukey-Kramer test，P＜0.05)。SD＝標(biāo)準(zhǔn)誤。％CV＝變異系數(shù)＝(SD/平均值)×100％表5溶解和消化的粗蛋白

同一欄中的不同字母代表顯著差異(1-way ANOVA，Tukey-Kramer test，P＜0.05)。SD＝標(biāo)準(zhǔn)誤。％CV＝變異系數(shù)＝(SD/平均值)×100％實施例6動物飼料與動物飼料添加劑按實施例2所述制備含蛋白酶的動物飼料添加劑，維生素與礦質(zhì)元素預(yù)混料形式的動物飼料添加劑由下述表6所示組成。維生素和類胡蘿卜素商業(yè)上可以從DSM Nutritional Products獲得。所有用量均以g/kg計。
表6預(yù)混料組合物

產(chǎn)蛋雞的食物中包括表6的預(yù)混料和下面表7中顯示的組合物。每種成分的量以均為％(w/w)。食物中L2a蛋白酶的含量為100mg蛋白酶蛋白每kg食物。
表7產(chǎn)蛋雞食物

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由受理局填寫

由國際局填寫

序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>蛋白酶<130>10476.204-WO<160>9<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1068<212>DNA<213>Nocardiopsis alba DSM 15647<220>
<221>CDS<222>(1)..(1065)<220>
<221>mat_peptide<222>(502)..(1065)<400>1gcg acc ggc ccc ctc ccc cag tcc ccc acc ccg gat gaa gcc gag45Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu-165-160-155gcc acc acc atg gtc gag gcc ctc cag cgc gac ctc ggc ctg tcc90Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser-150-145-140ccc tct cag gcc gac gag ctc ctc gag gcg cag gcc gag tcc ttc 135Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe-135-130-125gag atc gac gag gcc gcc acc gcg gcc gca gcc gac tcc tac ggc 180Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr Gly-120-115-110ggc tcc atc ttc gac acc gac agc ctc acc ctg acc gtc ctg gtc acc 228Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr-105-100-95gac gcc tcc gcc gtc gag gcg gtc gag gcc gcc ggc gcc gag gcc aag 276Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys-90 -85 -80gtg gtc tcg cac ggc atg gag ggc ctg gag gag atc gtc gcc gac ctg 324Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu-75 -70 -65 -60aac gcg gcc gac gct cag ccc ggc gtc gtg ggc tgg tac ccc gac atc 372Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile-55 -50 -45cac tcc gac acg gtc gtc ctc gag gtc ctc gag ggc tcc ggt gcc gac 420His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp-40 -35 -30gtg gac tcc ctg ctc gcc gac gcc ggt gtg gac acc gcc gac gtc aag 468Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys-25 -20 -15gtg gag agc acc acc gag cag ccc gag ctg tac gcc gac atc atc ggc 516Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly-10 -5 -1 1 5
ggt ctc gcc tac acc atg ggt ggg cgc tgc tcg gtc ggc ttc gcg gcc 564Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala10 15 20acc aac gcc tcc ggc cag ccc ggg ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc 612Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly25 30 35acc gtc ggc acc ccg gtc agc atc ggc aac ggc cag ggc gtc ttc gag 660Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly ASh Gly Gln Gly Val Phe Glu40 45 50cgt tcc gtc ttc ccc ggc aac gac tcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcg 708Arg Ser Val Phe Pro Gly ASh Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser55 60 65aac ttc acc ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggt ggt tac 756Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr70 75 80 85gcg acc gtc tcc ggc tcc tcg cag gcg gcg atc ggc tcg cag atc tgc 804Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys90 95 100cgt tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc gtc cag gcc cgc 852Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg105 110 115ggc cag acg gtg agc tac ccc cag ggc acc gtg cag aac ctg acc cgc 900Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg120 125 130acc aac gtc tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcc ttc atc tcc 948Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser135 140 145ggc agc cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggt ggc tcc ggc aac tgc tcc 996Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser150 155 160 165ttc ggt ggc acc acc tac tac cag gag gtc aac ccg atg ctg agc agc 1044Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser170 175 180tgg ggt ctg acc ctg cgc acc tga 1068Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr185<210>2<211>355<212>PRT<213>Nocardiopsis alba DSM 15647<400>2Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu-165-160-155Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser-150-145-140Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe-135-130-125
Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr Gly-120-115-110Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr-105-100-95Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys-90 -85 -80Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu-75 -70 -65 -60Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile-55 -50 -45His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp-40 -35 -30Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys-25 -20 -15Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly-10 -5 -1 1 5Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala10 15 20Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly25 30 35Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu40 45 50Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser55 60 65Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr70 75 80 85Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys90 95 100Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg105 110 115Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg120 125 130Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser135 140 145Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser
150 155 160 165Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser170 175 180Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr185<210>3<211>43<212>DNA<213>合成的<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3gttcatcgat cgcatcggct gcgaccggcc ccctccccca gtc43<210>4<211>31<212>DNA<213>合成的<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gcggatccta tcaggtgcgc agggtcagacc 31<210>5<211>1146<212>DNA<213>Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235<220>
<221>CDS<222>(1)..(1143)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<220>
<221>mat_peptide<222>(568)..(1143)<400>5atg cga ccc tcc ccc gct atc tcc gct atc ggc acc ggc gca ctc45Met Arg Pro Ser Pro Ala Ile Ser Ala Ile Gly Thr Gly Ala Leu-185-180-175gcg ttc ggt ctg gcg ttc tcc gtg acg ccg ggc gcc agt gcg gcg90Ala Phe Gly Leu Ala Phe Ser Val Thr Pro Gly Ala Ser Ala Ala-170-165-160acc gta ccg gcc gag cca gcg agc gag gcc cag acg atg atg gaa135Thr Val Pro Ala Glu Pro Ala Ser Glu Ala Gln Thr Met Met Glu-155-150-145
gcg ctg cag aga gac ctc ggc ctc acc ccg ctc ggg gcc gag gag180Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Thr Pro Leu Gly Ala Glu Glu-140-135-130ctg ctc tcg gcg cag gaa gag gcg atc gag acc gac gcc gag gcc225Leu Leu Ser Ala Gln Glu Glu Ala Ile Glu Thr Asp Ala Glu Ala-125-120-115acc gag gcc gcg gga gcg tcc tac ggc ggc tcc ctg ttc gac acc270Thr Glu Ala Ala Gly Ala Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Phe Asp Thr-110-105-100gag acc ctc cag ctc acc gtg ctg gtg acc gac gcc tcg gcc gtc gag318Glu Thr Leu Gln Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ser Ala Val Glu-95 -90 -85gcg gtg gag gcc acc ggc gcc gag gcc acc gtg gtc tca cac ggc gca366Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val Ser His Gly Ala-80 -75 -70gag ggc ctg gcc gag gtg gtc gac gcg ctc gac gag acc ggc ggc cgg414Glu Gly Leu Ala Glu Val Val Asp Ala Leu Asp Glu Thr Gly Gly Arg-65 -60 -55gaa ggg gtc gtc ggc tgg tac ccg gac gtg gag agc gac acc gtc gtg462Glu Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu Ser Asp Thr Val Val-50 -45 -40gtc cag gtc gcc gag ggc gcc agc gcc gac ggc ctc atc gag gcc gcg510Val Gln Val Ala Glu Gly Ala Ser Ala Asp Gly Leu Ile Glu Ala Ala-35 -30 -25 -20ggc gtg gac ccc tcc gcc gtc cgg gtg gag gag acc agt gag act ccg558Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Arg Val Glu Glu Thr Ser Glu Thr Pro-15 -10 -5cgc ctg tac gcc gac atc gtc ggc ggc gag gcg tac tac atg ggc ggc606Arg Leu Tyr Ala Asp Ile Val Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly-1 1 5 10gga cgc tgc tcg gtc ggg ttc gcc gtg acc gac ggc tcc ggc gcg ggc654Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Thr Asp Gly Ser Gly Ala Gly15 20 25ggc ttc gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc ggc acc ggc gcc gag702Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Ala Glu30 35 40 45agc tcc gac ggc agc ggc tcc gga acc ttc cag gag tcc gtc ttc ccg750Ser Ser Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Val Phe Pro50 55 60ggc agc gac ggc gcc ttc gtc gcg gcc acc tcc aac tgg aac gtg acc798Gly Ser Asp Gly Ala Phe Val Ala Ala Thr Ser Asn Trp Asn Val Thr65 70 75aac ctg gtc agc cgg tac gac tcc ggc agc ccc cag gcg gtg tcg ggt846Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Gln Ala Val Ser Gly80 85 90tcc agc cag gcc ccg gag ggc tcg gcg gtg tgc cgc tcc ggc tcc acc894Ser Ser Gln Ala Pro Glu Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr95 100 105acc ggc tgg cac tgc ggg acc atc gag gcc cgc ggc cag acg gtg aac942Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Glu Ala Arg Gly Gln Thr Val Asn110 115 120 125
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1.具有蛋白酶活性，且在pH 7.5及25℃時對血紅蛋白具有至少39AU/g特異活性的分離的多肽，其中多肽選自下組(a)具有與SEQ ID NO2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO6的1-192位氨基酸有至少65％同-性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQID NO5的568-1143位核苷酸雜交的核酸序列所編碼的多肽；(c)由與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸具有至少74％同一性的核酸序列所編碼的多肽。
2.包含編碼權(quán)利要求1的多肽的核酸序列的分離的核酸序列。
3.分離的核酸序列，其包含編碼具有蛋白酶活性，且在pH 7.5及25℃時對血紅蛋白具有至少39AU/g特異活性的多肽的核酸序列的，其中該核酸序列(a)在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸中任何一個雜交；(b)與SEQ ID NO1的502-1065位核苷酸，和/或SEQ ID NO5的568-1143位核苷酸中任何一個具有至少74％的同一性；和/或(c)編碼與SEQ ID NO2的1至188位氨基酸，和/或SEQ ID NO6的1-192位氨基酸有至少65％同一性的多肽。
4.包含可操作地連接至一個或多個控制序列的權(quán)利要求2-3中任一個的核酸序列的核酸構(gòu)建體，控制序列引導(dǎo)多肽在適當(dāng)表達(dá)宿主中的生產(chǎn)。
5.包含權(quán)利要求4的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
6.包含權(quán)利要求4的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求5的載體的重組宿主細(xì)胞。
7.生產(chǎn)權(quán)利要求1的多肽的方法，該方法包含(a)培養(yǎng)權(quán)利要求6的重組宿主細(xì)胞以生產(chǎn)包含所述多肽的上清；和(b)回收該多肽。
8.轉(zhuǎn)基因植物，或植物部分，其能夠表達(dá)權(quán)利要求1所述的多肽。
9.轉(zhuǎn)基因非人動物，或者產(chǎn)品，或其部分，其可以表達(dá)權(quán)利要求1的多肽。
10.生產(chǎn)權(quán)利要求1的多肽的方法，該方法包含(a)培養(yǎng)下述株系中任何一個(i)Nocardiopsis dassonvillei亞種dassonvillei DSM 43235，(ii)Nocardiopsis alba DSM 15647；和(b)回收所述多肽。
11.權(quán)利要求1中定義的至少一種多肽(i)在動物飼料中；(ii)在制備用于動物飼料的組合物中；(iii)用于改善動物飼料的營養(yǎng)價值；(iv)用于增加動物食物中的可消化和/或可溶性蛋白；(v)用于提高動物食物中蛋白質(zhì)的水解程度；和/或(vi)用于蛋白質(zhì)處理的用途。
12.動物飼料添加劑，其包含權(quán)利要求1定義的至少一種多肽；和(a)至少一種脂溶性維生素，和/或(b)至少一種水溶性維生素，和/或(c)至少一種微量礦質(zhì)。
13.粗蛋白含量為50至800g/kg的動物飼料組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1定義的多肽，或者至少一種權(quán)利要求12的飼料添加劑。
14.包含權(quán)利要求1定義的至少一種多肽的組合物，其還同時包含至少一種選自淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、和/或β-葡聚糖酶的其他酶。
15.權(quán)利要求1所定義的至少一種多肽在洗滌劑中的用途。
16.Nocardiopsis alba DSM 15647。
全文摘要
與來自擬諾卡氏菌的蛋白酶同源的高特異活性蛋白酶，及其在野生型，和包括轉(zhuǎn)基因植物和非人轉(zhuǎn)基因動物的重組宿主細(xì)胞中的生產(chǎn)。蛋白酶在動物飼料和洗滌劑中是有效的。公開了與蛋白酶的高特異活性有關(guān)的特有結(jié)構(gòu)特征，該蛋白酶屬于肽酶家族S2A或S1E。
文檔編號C12N15/57GK1809634SQ200480017079
公開日2006年7月26日 申請日期2004年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者索倫·F·拉森, 卡斯滕·肖霍姆, 彼得·R·奧斯特加德 申請人:諾維信公司