專利名稱：減小糖化醪的粘性的制作方法
發(fā)明所述領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中應(yīng)用β-葡聚糖酶和木聚糖酶的活性減小糖化醪(mash)的粘性。
背景技術(shù)：
發(fā)酵方法被用來制造大量具有商業(yè)價值的產(chǎn)品。工業(yè)上，發(fā)酵被用來生產(chǎn)簡單的化合物如酒精(尤其是乙醇)；酸，如檸檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、賴氨酸；酮；氨基酸，如谷氨酸，但也用于生產(chǎn)更為復雜的化合物例如抗生素，如青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，例如核黃素、B12，β-胡蘿卜素；難以用合成的方法生產(chǎn)的激素，例如胰島素。發(fā)酵方法也用于釀造(啤酒和酒工業(yè))、乳品、皮革、煙草工業(yè)中。
關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)品例如乙醇的生產(chǎn)有大量的文獻披露，其中包括WO2002038787A2。
需要進一步改進發(fā)酵方法，也需要經(jīng)改進的包括發(fā)酵步驟的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明的目的在于提供經(jīng)改進的用于生產(chǎn)例如乙醇的發(fā)酵方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)改進的生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品尤其是乙醇的方法，此發(fā)酵產(chǎn)品還有例如“發(fā)明背景”部分提到的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明，可以預(yù)期飲品例如啤酒的生產(chǎn)。
第一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述方法包含在β-葡聚糖酶存在下非淀粉多糖的預(yù)液化(preliquefaction)，然后在熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶和木聚糖酶的存在下進行噴射蒸煮(jet cooking)和液化。
第二個方面提供生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述方法包含步驟(a)提供糖化醪，該糖化醪包含含淀粉的物質(zhì)和水；(b)在β-葡聚糖酶存在下將步驟(a)的糖化醪預(yù)液化；(c)使步驟(b)的糖化醪凝膠化；(d)在α-淀粉酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶存在下液化步驟(c)的糖化醪；和(e)糖化并發(fā)酵步驟(d)的糖化醪以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品。
第二個方面提供β-葡聚糖酶和木聚糖酶在生產(chǎn)乙醇的方法中的用途。
本發(fā)明的方法中，應(yīng)用稀釋酶(thinning enzyme)如β-葡聚糖酶和木聚糖酶降解葡聚糖和木聚糖，以此減小糖化醪的粘性。減小的粘性增強了液化糖化醪的流加速率，由此，尤其是通過改善熱轉(zhuǎn)移以及促進液化糖化醪通過糖化醪冷卻器，提高了工廠的生產(chǎn)能力。如此，本發(fā)明的方法有利于發(fā)酵中利用更高的干物質(zhì)百分率，而且仍然確保有效冷卻，確保輸送到發(fā)酵槽中的糖化醪的溫度正確且一致。
類似阿拉伯糖基木聚糖和β-葡聚糖的非淀粉多糖的前期水解對蒸餾過程的作用是使生產(chǎn)量全面增加，以及獲得更好的熱轉(zhuǎn)移和相轉(zhuǎn)移。
非淀粉多糖的前期水解對副產(chǎn)品如蒸餾器干顆粒(distiller｀s dry grain)的作用是使食品轉(zhuǎn)化全面改善，營養(yǎng)物質(zhì)如礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂類和淀粉的消化性更好。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法可用于大量發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)中，所述發(fā)酵產(chǎn)品包括但不限于醇(尤其是乙醇)；酸，如檸檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、賴氨酸；酮；氨基酸，如谷氨酸，也包括更為復雜的化合物如抗生素，如青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，如核黃素、B12、β-胡蘿卜素；激素，如胰島素。優(yōu)選可飲用的乙醇，還有工業(yè)乙醇及燃料用乙醇。
原料任何含淀粉的材料均可用作本發(fā)明方法中的原料。在一個實施例中，含淀粉的材料是從谷物(cereal)中獲得的完整谷粒，優(yōu)選選自玉米、小麥、大麥、燕麥、水稻、木薯(cassava)、高粱、黑麥、買羅高梁(milo)和粟(millet)組成的組中。此外，含淀粉的材料可由馬鈴薯、甘薯(sweet potato)、木薯、木薯粉(tapioca)、西米(sago)、香蕉、糖用甜菜(sugar beet)和/或甘蔗(sugar cane)獲得。甘蔗或糖用甜菜可以如GB 2115820A和US4886672A1所述加以利用。本發(fā)明優(yōu)選谷類，例如小麥、大麥、燕麥、黑小麥(triticale)，尤其是燕麥和大麥，以及源于谷物例如小麥、大麥、燕麥、黑小麥、尤其是燕麥和大麥的麥芽(malt)。由小麥、大麥、燕麥和黑小麥制成的高粘性漿經(jīng)稀釋是有利的。
方法步驟在一個實施例中，本發(fā)明的主要方法步驟可以分為以下主要處理階段描述(a)糖化醪形成；(b)預(yù)液化；(c)凝膠化；(d)液化；和(e)糖化及發(fā)酵，其中步驟(a)，(b)，(c)和(d)以(a)，(b)，(c)，(d)和(e)的順序進行。步驟(e)可以是同時進行糖化及發(fā)酵(SSF)或作為兩個分離的子步驟進行。
酒精生產(chǎn)的單個方法步驟可以一批批地進行或者作為連續(xù)的流程來進行。對于本發(fā)明，所有方法步驟均以批次方式進行，或者所有方法步驟均以連續(xù)的流程方式進行，或者一個或多個方法步驟以批次方式進行而一個或多個方法步驟以連續(xù)的流程方式進行，這些方法都是同等優(yōu)選的。
噴流(cascade)方法是一個或多個方法步驟以連續(xù)的流程方式進行的方法的例子，這樣的方法對于本發(fā)明是優(yōu)選的。更多有關(guān)噴流方法以及其他酒精加工方法的信息參見The Alcohol Textbook。Ethanol production byfermentation and distillation.Eds.T.P.Lyons，D.R.Kesall and J.E.Murtagh.Nottingham University Press 1995。
磨碎(milling)在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例中，含淀粉的材料是磨碎的谷物，優(yōu)選大麥，該方法包含在步驟(a)前的磨碎步驟。換句話說，本發(fā)明也包含本發(fā)明的這些方法，其中含淀粉的材料可以通過包含谷物磨碎，優(yōu)選干燥磨碎的方法來獲得，例如用錘子或滾筒磨粉機。碾磨也理解為磨碎，同樣，任何適合于打開單個谷粒，暴露出胚乳以便進一步處理的方法都視為磨碎。通常有兩種磨碎方法用于酒精生產(chǎn)濕磨碎和干燥磨碎(dry milling)。術(shù)語“干燥磨碎”指整個谷粒的磨碎。在干燥磨碎中被磨碎的整個谷粒用于糖化醪形成方法的剩余部分。
糖化醪形成可以通過形成包含含磨碎淀粉的材料和釀造水的漿來提供糖化醪?？梢栽卺勗焖c含磨碎淀粉的材料結(jié)合之前將釀造水加熱至適當?shù)臏囟纫垣@得45至70℃的糖化醪溫度，優(yōu)選53至66℃，更優(yōu)選55至60℃。典型地，糖化醪在稱為漿桶的容器中形成。
典型地，漿桶(包含磨碎的全部谷粒)中的干燥固體％(干燥固體百分比)在1-60％范圍，特別是10-50％，如20-40％，如25-35％。
預(yù)液化預(yù)液化步驟中，含淀粉的材料(前端糖化醪)保存在有稀釋酶如β-葡聚糖酶或木聚糖酶存在的環(huán)境，稀釋酶優(yōu)選β-葡聚糖酶，溫度在45-70℃，更優(yōu)選53至66℃，最優(yōu)選55至60℃，例如58℃。預(yù)液化步驟的持續(xù)時間優(yōu)選5至60分鐘，更優(yōu)選10至30分鐘，如15分鐘左右。
凝膠化在凝膠化步驟中淀粉被凝膠化?？梢酝ㄟ^將含淀粉的漿加熱至高于所使用的特定淀粉的凝膠化溫度的溫度來達至凝膠化。優(yōu)選在適當條件下通過噴射蒸煮達至凝膠化，例如在95-140℃之間的溫度，優(yōu)選105-125℃，如在120℃條件下完成淀粉的凝膠化。通過非壓力蒸煮達到凝膠化也是優(yōu)選的。凝膠化期間，在預(yù)液化步驟中加入的酶將被置于升高的溫度條件下，可能會全部或部分失活。因此，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在凝膠化步驟之后加入新的稀釋酶。
在一個實施例中，液化處理在pH4.5-6.5的條件下實施，尤其是在5和6之間的pH條件下實施。
噴射蒸煮期間，在預(yù)液化步驟中加入的酶將被置于升高的溫度條件下，可能會全部或部分失活。因此，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在噴射蒸煮步驟之后加入新的稀釋酶。
液化液化步驟中，凝膠化的淀粉(下游糖化醪)被打斷(水解)為麥芽糊精(maltodextrins)(糊精)。為使淀粉水解，需加入適當?shù)拿?，?yōu)選α-淀粉酶。
根據(jù)本發(fā)明，向糖化醪中加入β-葡聚糖酶和木聚糖酶。在一個實施例中，進一步加入內(nèi)切葡聚糖酶(endo-glucanase)。
液化步驟期間的溫度為60-95℃，優(yōu)選80-90℃，優(yōu)選在70-80℃例如85℃，時間為1-120min，優(yōu)選2-60min，例如12min。令人吃驚的是，液化步驟期間，在這樣高的溫度發(fā)揮酶功能。
在一個實施例中，步驟(d)的液化在約4-7的pH范圍內(nèi)進行，優(yōu)選約4.5-6.5的pH。在一個優(yōu)選的實施例中，液化期間的pH至多約為5。漿的pH可以調(diào)整，也可不調(diào)整，其依賴于所用的酶的特性。因此，在一個實施例中，加入如NH3將pH上調(diào)約1個單位。在加入α-淀粉酶時可方便地調(diào)整pH。在另外一個實施例中沒有調(diào)整pH，α-淀粉酶具有相應(yīng)適合的pH-活性譜，例如在pH約為4時具有活性。
在本發(fā)明的一個實施例中，稀釋酶與α-淀粉酶一起加至凝膠化的糖化醪。
糖化與發(fā)酵糖化步驟和發(fā)酵步驟可以作為分離的方法步驟分開進行，或者糖化與發(fā)酵步驟同時進行(SSF)。在存在糖化酶，例如葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶或麥芽糖淀粉酶的情況下進行糖化。任選加入植酸酶(phytase)和/或蛋白酶。
發(fā)酵生物可以是真菌，例如酵母，或者是細菌。合適的細菌可以是例如發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)物種，例如運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和大腸桿菌(E.coli.)。絲狀真菌的例子包括青霉菌屬(Penicillium)菌株。優(yōu)選的乙醇生產(chǎn)生物為酵母，例如畢赤酵母屬(Pichia)或者糖酵母屬(Saccharomyces)酵母。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選酵母為糖酵母屬物種，尤其是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者面包酵母。酵母細胞的加入量可以是每ml發(fā)酵肉湯105至1012，優(yōu)選107-1010，尤其優(yōu)選5×107活酵母數(shù)。在乙醇生產(chǎn)階段酵母細胞數(shù)應(yīng)優(yōu)選在107-1010范圍，尤其優(yōu)選約2×108。有關(guān)使用酵母進行發(fā)酵的進一步指導可以參見例如，″The alcohol Textbook″(Editors K.Jacques，T.P.Lyons and D.R.Kelsall，Nottingham University Press，UnitedKingdom 1999)，此處一并作為參考。
將用于發(fā)酵的微生物加至糖化醪，發(fā)酵過程一直進行到生產(chǎn)出所需的發(fā)酵產(chǎn)品的量；在一個實施例中，將乙醇作為發(fā)酵產(chǎn)品來回收，此時間可能為例如24-96小時，如35-60小時。發(fā)酵期間的溫度和pH處于適合于所討論的微生物的溫度和pH，并且要考慮發(fā)酵產(chǎn)品將來的用途，例如，在一個實施例中，發(fā)酵微生物是酵母，所要回收的發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇，優(yōu)選的溫度在約26-34℃，如約32℃，pH在約3-6范圍，如約4-5的pH。
在另一個實施例中，發(fā)酵微生物是酵母，發(fā)酵的糖化醪將被用作啤酒，糖化醪的溫度優(yōu)選約12-16℃，如約14℃。
在一個優(yōu)選實施例中使用同時糖化與發(fā)酵(SSF)的方法，其中沒有針對糖化的保溫階段，其意思是酵母和糖化酶本質(zhì)上是一起加入的。一個實施例中，當實施SSF時，在剛剛要發(fā)酵前，在高于50℃的溫度條件下增加預(yù)糖化步驟。
蒸餾本發(fā)明的方法可以進一步包含回收發(fā)酵產(chǎn)品如乙醇；因此，酒精可以從發(fā)酵的材料分離純化。
這樣，在一個實施例中，本發(fā)明的方法進一步包含步驟(f)蒸餾以獲得乙醇。
由蒸餾得到的副產(chǎn)品通過例如離心可將蒸餾過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品水溶液(Whole Sillage)分為兩個組分1)Wet Grain(固相)，和2)Thin Stillage(懸浮物)。
將Wet Grain干燥，通常是在轉(zhuǎn)鼓式干燥器中干燥。干燥后的產(chǎn)品稱為“蒸餾器干顆?！?，可用作動物食物。
可以將Thin Stillage組分蒸發(fā)，得到兩個組分-4-6％干燥固體(主要是淀粉、蛋白質(zhì)和細胞壁成分)的冷凝組分，和-漿狀組分，主要由有限糊精和不能發(fā)酵的糖組成，其可以與Wet Grain(來自Whole Stillage分離步驟)一起放入干燥器以獲得稱為“蒸餾器干顆?！钡漠a(chǎn)品，該產(chǎn)品可用作動物食物。
本領(lǐng)域中，術(shù)語“Whole Stillage”用于指來源于發(fā)酵糖化醪蒸餾產(chǎn)生的副產(chǎn)品。
本領(lǐng)域中，術(shù)語“Thin Stillage”用于指Whole Stillage離心所得的懸浮物(上層)。典型地，Thin Stillage包含4-6％的干燥固體(主要是淀粉和蛋白質(zhì))，溫度為約60-90℃。Thin Stillage是粘性的，難以處理。通常Thin Stillage在再循環(huán)至漿桶之前先盛放在存儲桶中至數(shù)小時。再循環(huán)前，可以用適當?shù)拿溉绂?葡聚糖酶和木聚糖酶稀釋stillage。
有關(guān)如何實施液化、糖化、發(fā)酵、蒸餾和回收乙醇的詳細信息是熟練技術(shù)人員所熟知的。
由本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的產(chǎn)品的用途發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇的實施例中，可以從發(fā)酵的糖化醪回收由本發(fā)明的方法所獲得的乙醇，并用作例如燃料乙醇；飲用乙醇，如適于飲用的酒精，或者工業(yè)用乙醇，包括燃料添加劑。
發(fā)酵產(chǎn)品是乙醇，且不從發(fā)酵的糖化醪回收由本發(fā)明的方法所獲得的乙醇的實施例中，包含乙醇的糖化醪可以用作啤酒。所述啤酒可以是包括ales、strong ales、bitters、烈性啤酒(stouts)、porters、lagers、export beers、麥芽酒(malt liquor)、大麥酒(barley wine)、happoushu、high-alcohol beer、low-alcoholbeer、低熱量啤酒(low-calorie beer)和輕淡啤酒(light beer)的任何啤酒。
在發(fā)酵產(chǎn)品并非乙醇的實施例中，產(chǎn)品可以用于任何適當?shù)哪康摹?br> 酶活性β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)β-葡聚糖酶可以是微生物來源的，例如源于細菌(例如芽孢桿菌(Bacillus))或絲狀真菌(例如曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮刀霉屬(Fusarium))的菌株。
用于本發(fā)明方法中的β-葡聚糖酶可以是內(nèi)切葡聚糖酶，例如1，4-β-內(nèi)切葡聚糖酶。從商業(yè)途徑獲得的可以使用的β-葡聚糖酶包括CELLUCLAST、CELLUZYME、CEREFLO和ULTRAFLO(可從NovozymesA/S獲得)、GC880、LAMINEXTM和SPEZYME CP(可從Genencor Int.獲得)和ROHAMENT7069W(可由Rhm，Germany獲得)。優(yōu)選CEREFLO。
可以0.01-5000BGU/kg干燥固體的量加入β-葡聚糖酶，優(yōu)選以0.1-500BGU/kg干燥固體的量，最優(yōu)選以1-50BGU/kg干燥固體的量，在液化步驟(下游糖化醪)中以1.0-5000BGU/kg干燥固體的量，最優(yōu)選以10-500BGU/kg干燥固體的量。
木聚糖酶(EC3.2.1.8和其他)
在有效量的合適的木聚糖酶存在下實施本發(fā)明的方法，該木聚糖酶可源于多種微生物，包括真菌和細菌，例如曲霉、Disporotrichum、青霉、鏈孢霉(Neurospora)、鐮刀霉和木霉。
合適的木聚糖酶的例子包括源于H.insolens(WO 92/17573)；塔賓曲霉(Aspergillus tubigensis)(WO 92/01793)；黑曲霉(A.niger)(Shei等，1985，Biotech.and Bioeng.Vol.XXVII，pp.533-538，和Fournier等，1985，Bio-tech.Bioeng.Vol.XXVII，pp.539-546；WO 91/19782和EP 463706)；棘孢曲霉(A.aculeatus)(WO 94/21785)的木聚糖酶。
木聚糖酶也可以是1，3-β-D-xylan xylanohydrolase(EC.3.2.1.32)。
特定實施例中的木聚糖酶是WO 94/21785公開的木聚糖酶II。
可考慮的商業(yè)上可獲得的包含木聚糖酶的組合物包括SHEARZYMES200L、SHEARZYME500L、BIOFEED WHEAT、PULPZYMETMHC(來自Novozymes)和GC 880、SPEZYMECP(來自Genencor Int)。
可以以1.0-1000FXU/kg干燥固體的量加入木聚糖酶，優(yōu)選以5-500FXU/kg干燥固體的量，再優(yōu)選以5-100FXU/kg的量，最優(yōu)選以10-100FXU/kg干燥固體的量。
α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)優(yōu)選的α-淀粉酶為真菌或細菌來源。
根據(jù)本發(fā)明，芽孢桿菌α-淀粉酶(通常指“Termamyl樣α-淀粉酶”)、其變體和混合物是優(yōu)選的。熟知的Termamyl樣α-淀粉酶包括源于地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(商業(yè)上可獲得，商品名TermamylTM)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)菌株的α-淀粉酶。合適的細菌α-淀粉酶可以是源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，其具有WO99/19467中SEQ.NO4的氨基酸序列。
合適的真菌α-淀粉酶可以源于曲霉屬，例如源于黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶。
商業(yè)α-淀粉酶產(chǎn)品和含有α-淀粉酶的產(chǎn)品包括TERMAMYLTMSC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETMSC和SANTMSUPER，(Novozymes A/S，Denmark)和DEX-LOTM、SPEZYMETMAA、和SPEZYMETMDELTA AA(來自Genencor Int.)。
液化步驟中，可以以0.001-1.0AFAU/g干燥固體的量加入真菌α-淀粉酶，優(yōu)選以0.002-0.5AFAU/g干燥固體的量，優(yōu)選以0.02-0.1AFAU/g干燥固體的量。
可以以本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的有效量加入芽孢桿菌α-淀粉酶。
麥芽糖淀粉酶α-淀粉酶可以是麥芽糖α-淀粉酶。麥芽糖淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麥芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能夠?qū)⒅辨湹矸酆椭ф湹矸鬯鉃棣翗?gòu)型的麥芽糖。此外，麥芽糖淀粉酶還能夠水解麥芽三糖以及環(huán)狀糊精。特別要考慮的麥芽糖淀粉酶包括EP專利no.120,693所公開的來自嗜熱脂肪芽孢桿菌C599的一個麥芽糖淀粉酶。商業(yè)上可獲得的麥芽糖淀粉酶是來自Novozymes A/S的MALTOGENASETM。
葡萄糖淀粉酶可以在葡萄糖淀粉酶存在下實施糖化步驟或同時糖化與發(fā)酵步驟(SSF)。葡萄糖淀粉酶可以是任何來源，例如來源于微生物或植物。選自由黑曲霉葡萄糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡萄糖淀粉酶(Boel etal.(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)或其變體，例如WO92/00381和WO00/04136所公開的；泡盛曲霉(A.awamori)葡萄糖淀粉酶(WO 84/02921)、米曲霉(A.oryzae)葡萄糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)或其變體或片段所組成的組的真菌或細菌來源的葡萄糖淀粉酶是優(yōu)選的。
商業(yè)產(chǎn)品包括SANTMSUPERTM和AMGTME(來自Novozymes A/S)。在一個實施例中，可以在糖化及發(fā)酵步驟(e)以0.02-2AGU/g干燥固體的量加入葡萄糖淀粉酶，優(yōu)選以0.1-1AGU/g干燥固體的量，假如0.2AGU/g干燥固體的量。
蛋白酶在糖化步驟、SSF步驟和/或發(fā)酵步驟，蛋白酶的加入提高FAN(游離氨基酸)水平，增強酵母代謝率，并且可以提高發(fā)酵效率。
合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，例如，以在低于7的酸性pH條件下水解蛋白質(zhì)的能力為特征的蛋白酶。
合適的酸性真菌蛋白酶包括源于曲霉屬、毛霉屬(Mucor)、根霉屬(Rhizopus)、假絲酵母屬(Candida)、革蓋菌屬(Coriolus)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、Enthomophtra、耙齒菌屬(Irpex)、青霉菌屬、小菌核屬(Sclerotium)和球擬酵母菌屬(Torulopsis)的蛋白酶。特別要考慮的是源于黑曲霉(參見，如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、齋騰曲霉(Aspergillus saitoi)(參見，如，Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)、棘孢曲霉(WO95/02044)、或者米曲霉、例如pepA蛋白酶；和來自Mucor pusillus或Mucormiehei的酸性蛋白酶。
ALCALASETM是地衣芽孢桿菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)。根據(jù)本發(fā)明，可以優(yōu)選以10-7至10-3克活性蛋白酶蛋白/g干燥固體的量加入ALCALASETM。尤其以10-6至10-4克活性蛋白酶蛋白/g干燥固體的量加入，或者以0.1-0.0001AU/g干燥固體的量加入，優(yōu)選以0.00025-0.001AU/g干燥固體的量加入。
FLAVOURZYMETM(可由Novozymes A/S獲得)是源于米曲霉的蛋白酶制劑。根據(jù)本發(fā)明，可以優(yōu)選以0.01-1.0LAPU/g干燥固體的量加入FLAVOURZYMETM，優(yōu)選以0.05-0.5LAPU/g干燥固體的量加入。
蛋白酶的合適劑量在10-7至10-3克活性蛋白酶蛋白/g干燥固體的范圍，尤其是10-6至10-4克活性蛋白酶蛋白/g干燥固體的范圍。
植酸酶根據(jù)本發(fā)明，所用的植酸酶可以是能夠從植酸(myo-inositolhexakisphosphate)或其(肌醇六磷酸)任何形式的鹽中釋放無機磷酸的任何酶。
植酸酶的合適劑量在0.005-25FYT/g干燥固體的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.01-10FYT/g干燥固體，例如0.1-1FYT/g干燥固體。
材料與方法方法木聚糖酶活性(FXU)的測定通過測試測定木聚糖內(nèi)切酶的活性，該測試中，將木聚糖酶樣品與remazol木聚糖底物(用Remazol亮藍R染色的4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan，F(xiàn)luka)在pH6.0的條件下一起保溫。50℃保溫30分鐘。用乙醇沉淀未降解的染色底物背景。585nm處以分光光度法測定懸浮物中的剩余藍色物質(zhì)，其與木聚糖內(nèi)切酶活性成比例。與標準酶對照以測定樣品的木聚糖內(nèi)切酶活性。
出版物AF 293.6/1-GB中進一步描述了該測試，其可以從Novo NordiskA/S，Denmark得到。
β-葡聚糖酶活性(BGU)的測定可以用β-葡聚糖酶單位(BGU)的方式測量纖維分解酶活性。β-葡聚糖酶與β-葡聚糖反應(yīng)生成葡萄糖或還原性碳水化合物，將其作為還原性糖，用Somogyi-Nelson方法測定。標準條件下，1個β-葡聚糖酶單位指每分鐘釋放相當于1μmol葡萄糖還原能力的葡萄糖或還原性碳水化合物的酶量。標準條件為0.5％β-葡聚糖作為底物，在pH7.5的條件下，30℃反應(yīng)30分鐘。該分析方法(EB-SM-0070.02/01)的詳細描述可由NovozymesA/S獲得。
內(nèi)切葡聚糖酶活性(EGU)的測定可以用內(nèi)切葡聚糖酶單位(BGU)的方式測量纖維分解酶活性，其在pH6.0條件下以纖維素(CMC)為底物測定。
所制備的底物溶液為pH6.0的0.1M磷酸緩沖液中含有34.0g/lCMC(Hercules 7 LFD)。所要分析的酶樣品溶解于同樣的緩沖液中。將5ml底物溶液和0.15ml酶溶液混合，轉(zhuǎn)至振動粘度計(例如來自Sofraser，F(xiàn)rance的MIVI 3000)，自動調(diào)溫至40℃處理30分鐘。
一個EGU定義為在這些條件下將粘度減小至一半的酶量。需將反應(yīng)混合物中酶樣的量調(diào)至0.01-0.02EGU/ml。arch標準定義為880EGU/g。
葡萄糖淀粉酶活性(AGU)的測定Novo葡萄糖淀粉酶單位(AGU)定義為，37℃及pH4.3條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量。
在使用來自Boehringer Mannheim，124036的Glucose GOD-Perid試劑盒后，用改進的方法(AEL-SM-0131，可由Novozymes獲得)測定以AGU/ml計的活性。標準AMG-standard，7-1195批，195AGU/ml。375microL底物((50mM醋酸鈉中1％的麥芽糖，pH4.3)37℃保溫5分鐘。加入25microL于醋酸鈉中稀釋的酶。10分鐘后加入100microL 0.25M NaOH終止反應(yīng)。將20microL轉(zhuǎn)至96孔微量滴定盤，加入200microL GOD-Perid溶液(124036，Boehringer Mannheim)。室溫30分鐘后，650nm處測吸光值，從AMG-standard計算以AGU/ml計的活性。該分析方法(AEL-SM-0131)的詳細描述可由Novozymes獲得。
α-淀粉酶活性(KNU)的測定可以使用馬鈴薯淀粉作為底物測定淀粉分解活性。該方法以通過酶打斷修飾的馬鈴薯淀粉為基礎(chǔ)，該反應(yīng)之后將淀粉/酶溶液樣品與碘溶液混合。最初，形成藍黑色物質(zhì)，但在淀粉打斷期間，藍色變?nèi)?，并逐漸變成紅褐色，將其與有色玻璃標準對比。
一個Kilo Novoα-淀粉酶單位(KNU)定義為標準條件(即，37℃+/-0.05；0.003M Ca2+；pH5.6)下將5260mg淀粉干物質(zhì)Merck Amylum soluble轉(zhuǎn)化為糊精的酶量。
更為詳細地描述該分析方法的文件EB-SM-0009.02/01可由NovozymesA/S，Denmark獲得，此處該文件作為參考。
蛋白酶(LAPU)的測定1個亮氨酸氨肽酶單位(LAPU)為在下述條件下每分鐘分解1 microM底物的酶量26mM的底物L-亮氨酸-p-硝基苯(nitroanilide)，0.1M Tris緩沖液(pH8.0)，40℃，反應(yīng)時間10分鐘。
實施例實施例中所用的酶包含源于解淀粉芽孢桿菌的β-葡聚糖酶的組合物；1200BGU/g。
包含公開于WO94/21785的木聚糖酶II的組合物；該木聚糖酶II為1-4-β-木聚糖內(nèi)切酶；521FXU/g。
包含內(nèi)切葡聚糖酶活性和一些木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性的源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的組合物；700EGU/g，50FXU/g，和60BGU/g。
可由Genencor Int.獲得的稱為GC 880“工程化纖維素酶復合體”的組合物，至少包含β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性；59BGU/g和222FXU/g。
實施例1在裝有700ml水的1公升瓶中，用300g粉碎的大麥粉制備前端漿。pH調(diào)至5.2，在溫控型水浴中將糖化醪從室溫(25℃)加熱至54-60℃。
依照表1的劑量測試不同的酶組合。用Haake Viscotester VT-02測量粘性。
表1.實施例1中用的酶，每kg粉狀干燥固體的酶活性單位
n.a.未分析表2.13、26、38和60分鐘后，使用不同的減小粘性的酶，用前端(frontend)糖化醪所獲得的粘性減小
β-葡聚糖酶+木聚糖酶II和β-葡聚糖酶+木聚糖酶II+內(nèi)切葡聚糖酶組合與單獨的產(chǎn)品GC 880或β-葡聚糖酶相比，獲得了更高的粘性減小。
實施例2在用細菌α-淀粉酶液化過的漿中，測試了用上述提到的非淀粉降解酶得到的粘性減小。28％干燥固體的漿為DE 16，pH為5.0。將漿分裝到1公升的瓶中，保持在84℃的溫控型水浴中。依照表3的劑量測試了不同的酶組合。用Haake Viscotester VT-02測量了粘性，粘性為時間的函數(shù)，見表4。
β-葡聚糖酶+木聚糖酶II+內(nèi)切葡聚糖酶組合比單獨的產(chǎn)品GC 880或β-葡聚糖酶或木聚糖酶II+內(nèi)切葡聚糖酶更有效地發(fā)揮作用。
表3.實施例2中使用的酶，每kg粉狀干燥固體的酶活性單位
n.a.未分析表4.4分鐘后和10分鐘后，84℃下，使用不同的減小粘性的酶，在液化期間粘性的減小
實施例3將磨碎的黑麥移至相應(yīng)量的溫度為55℃的水中，制得具有30％谷粒干物質(zhì)的1kg漿。用硫酸將pH調(diào)至5.0。漿的最終溫度為50℃。t＝0分鐘時加入酶，攪拌3分鐘使其混合于漿中。
用Haake Viscotester VT-02測量粘性。
表5.實施例3中用的酶，每kg黑麥干燥固體的酶活性單位
或者3G用戶的標識。比如，可以將協(xié)議中Ga接口話單中進一步增加簽約類型(Subscription Tpye)，即表明該用戶是2G用戶還是3G用戶，如表2所示。
表1總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。
表7.實施例4中用的酶(70℃)，每kg黑麥干燥固體的酶活性單位
表8.3、15、30和60分鐘后，使用不同的減小粘性的酶，用20％黑麥干物質(zhì)的高溫糖化醪(下游)(70℃)所獲得的以mPa*S計的粘性
70℃下，β-葡聚糖酶+木聚糖酶II和內(nèi)切葡聚糖酶+木聚糖酶II組合得到較高的粘性減小。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述方法包含在β-葡聚糖酶的存在下，非淀粉多糖的預(yù)液化，然后凝膠化，接下來在熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶和木聚糖酶的存在下液化。
2.生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述方法包含在β-葡聚糖酶的存在下，非淀粉多糖的預(yù)液化，然后在熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶和木聚糖酶的存在下噴射蒸煮及液化。
3.生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，所述方法包含步驟a.提供包含含淀粉的材料和水的糖化醪；b.在β-葡聚糖酶存在下預(yù)液化步驟(a)的糖化醪；c.將步驟(b)的糖化醪凝膠化；d.在α-淀粉酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶的存在下液化步驟(c)的糖化醪；和e.糖化及發(fā)酵步驟(d)的糖化醪以生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品。
4.前述任一項權(quán)利要求的方法，在液化步驟(d)之后和步驟(e)之前進一步包含預(yù)糖化步驟。
5.前述任一項權(quán)利要求的方法，進一步包含發(fā)酵產(chǎn)品的回收。
6.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中發(fā)酵產(chǎn)品是醇(尤其是乙醇)；酸，例如檸檬酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、賴氨酸；酮；氨基酸，例如谷氨酸；抗生素，例如青霉素、四環(huán)素；酶；維生素，例如核黃素、B12、β-胡蘿卜素；激素，例如胰島素。
7.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中木聚糖酶源于曲霉菌菌株，優(yōu)選源于棘孢曲霉菌株。
8.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中β-葡聚糖酶源于芽孢桿菌菌株，優(yōu)選源于解淀粉芽孢桿菌菌株。
9.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中在液化步驟(d)中還存在內(nèi)切葡聚糖酶，所述內(nèi)切葡聚糖酶優(yōu)選源于木霉菌菌株，優(yōu)選源于里氏木霉菌株。
10.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中含淀粉的材料從谷物和/或塊莖獲得。
11.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中含淀粉的材料選自由玉米、小麥、大麥、黑麥、粟、高粱和買羅高粱組成的組。
12.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中含淀粉的材料選自由馬鈴薯、甘薯、木薯、木薯粉、西米、香蕉、糖用甜菜和甘蔗組成的組。
13.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中用微生物，例如細菌和真菌(包括酵母)如發(fā)酵單胞菌屬物種和糖酵母屬物種如啤酒糖酵母實施步驟(e)的發(fā)酵。
14.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中在植酸酶和/或蛋白酶的存在下進行發(fā)酵。
15.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(b)的預(yù)液化在45-70℃，更優(yōu)選在53-66℃，最優(yōu)選在55-60℃，例如58℃的溫度進行5-60分鐘，更優(yōu)選10-30分鐘，例如約15分鐘。
16.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中步驟(d)的液化在60-95℃，優(yōu)選在80-90℃的溫度進行10-120min，更優(yōu)選在83-85℃的溫度進行15-80min。
17.熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶和木聚糖酶在乙醇生產(chǎn)方法中之液化步驟中的應(yīng)用。
18.根據(jù)前一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其中用于乙醇生產(chǎn)方法中的含淀粉的原材料如權(quán)利要求6-8任一項所定義。
19.根據(jù)前一項權(quán)利要求的應(yīng)用，其中乙醇用作飲用酒精、燃料酒精和/或燃料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中通過應(yīng)用β－葡聚糖酶和木聚糖酶的酶活性減小了糖化醪的粘性。
文檔編號C13K1/00GK1798830SQ200480015565
公開日2006年7月5日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月4日
發(fā)明者雷米羅·M·古蒂里茲, 阿蘭·德斯特克西, 漢斯·S·奧爾森, 馬塞爾·米希勒 申請人:諾維信公司