專利名稱：包含特定針對(duì)人原癌基因蛋白的抗體的肝硬化診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)使用特定結(jié)合到自人原癌基因HCCR-2表達(dá)的蛋白的抗體進(jìn)行的抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)存在于血清試樣中的人類HCCR-2蛋白的方法，以及一種用于診斷肝硬化的試劑盒。
背景技術(shù)：
肝硬化在廣義上稱為肝纖維癥，可在患者肝臟產(chǎn)生結(jié)節(jié)。作為末期慢性肝病，肝硬化導(dǎo)致持久性和復(fù)發(fā)性擴(kuò)散肝損傷，在肝細(xì)胞中引起纖維癥和形成結(jié)節(jié)(Ikeda等人，Hepatology 1847-53，1993；Minami H和OkanoueT，Int Med.80646-649，1997；Kiyosawa K，Hepatology Research 24S40-S45，2002)。肝臟炎癥的主要因素包括病毒、藥物成分、酒精、代謝病、慢性膽汁郁積、肝靜脈血流阻塞。肝硬化占肝癌病案的60-90％，并且肝硬化患者中的5-20％將引起肝癌，此表明肝硬化增加了患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，迫切需要早期診斷肝硬化并且消除可導(dǎo)致肝硬化的主要因素(Velazquez等人，Hepatology 37(3)520-527，2003)。除了病毒因素之外，與肝硬化相關(guān)的危險(xiǎn)因素還包括濫用酒精、化學(xué)物質(zhì)、血色素沉著等。因此，對(duì)這些疾病及其危險(xiǎn)因素的早期檢測(cè)、消除、接種和檢疫極為重要。
呈現(xiàn)臨床正常特征而無(wú)并發(fā)癥的肝硬化稱為代償性肝硬化。伴有各種并發(fā)癥的肝硬化稱為失代償性肝硬化。
腹腔鏡檢查和肝臟器官檢查已作為診斷肝硬化的最主要檢驗(yàn)手段而得到推廣。為了直接觀察肝臟內(nèi)部結(jié)構(gòu)，通過(guò)一小切口在腹內(nèi)執(zhí)行腹腔鏡技術(shù)，即，通過(guò)一小進(jìn)入切口將內(nèi)診鏡插入腹腔。當(dāng)通過(guò)腹腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)硬塊狀表面時(shí)，診斷為肝臟器官發(fā)生硬化。而且，當(dāng)通過(guò)肝臟器官檢查發(fā)現(xiàn)肝纖維癥時(shí)，診斷出肝硬化的存在或其嚴(yán)重性。但是，這種檢查可使患者產(chǎn)生心理負(fù)擔(dān)。而且，對(duì)肝硬化的精確診斷通?；诟鞣N方法或技術(shù)的組合，包括醫(yī)囑、血液檢查、超聲波檢查、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)。
在肝硬化病案中，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平(相當(dāng)于常規(guī)GOT或GPT水平)不是很高，而且基本上正常或低于正常水平的兩倍，使其難以用作肝臟炎癥的有效診斷指示。特別是即使在涉及代償性肝硬化的病案中，也存在大量功能正常的肝細(xì)胞。因此，白蛋白或膽紅素的水平降低到基本正常范圍之下。在另一方面，在涉及失代償性肝硬化的病案中，白蛋白的水平可能降低，或者膽紅素的水平可能升高。功能正常的肝細(xì)胞的存在對(duì)于肝硬化或晚期慢性肝病患者而言相當(dāng)重要，但白蛋白或膽紅素僅為存在正常肝細(xì)胞的粗略指示。如果沒(méi)有足夠多的正常肝細(xì)胞，由于正常肝細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生凝血因子，因此可能會(huì)延遲血液凝結(jié)。執(zhí)行凝血酶原時(shí)間(PT)檢查直接對(duì)完全血液凝結(jié)進(jìn)行評(píng)估，其亦充當(dāng)評(píng)估剩余肝功能的指示。肝硬化導(dǎo)致脾變大，脾中截留大量血小板。因此，由于不明起因引起的血小板水平減小被懷疑患有肝硬化。
針對(duì)慢性肝炎中肝炎病毒的血清指標(biāo)檢查亦充當(dāng)肝硬化的重要指示。在韓國(guó)，約60％的肝硬化是由乙型肝炎病毒(HBV)引起，而約20％的肝硬化是由丙型肝炎病毒(HCV)引起。因此可以說(shuō)，陽(yáng)性HBV或HCV指標(biāo)表明存在慢性肝病的高度危險(xiǎn)因素。此外，當(dāng)患者呈現(xiàn)其它表明肝硬化的損傷時(shí)，自然會(huì)將該患者的損傷診斷為肝硬化。
血清甲胎蛋白(AFP)水平是用于肝癌早期檢測(cè)的化驗(yàn)，在一些患有慢性肝炎或硬化但無(wú)HCC損傷的患者中會(huì)觀察到血清甲胎蛋白(APF)水平的非特異性增大。(Adinolfi A等人，J Med Genet.12(2_″138-151，1975；LockAS and Lai CL Hapatology 9(1))。在肝硬化的診斷中，根據(jù)AFP濃度在正常成人血清中幾乎為0而在許多肝硬化患者中急劇增大這一發(fā)現(xiàn)，甲胎蛋白(AFP)水平已被有利地用作對(duì)肝硬化早期檢測(cè)的篩選因素之一。但是，事實(shí)上，在慢性肝炎或肝硬化中AFP濃度都有可能增大。因此，盡管AFP測(cè)試在一定程度上被看作是從慢性肝病患者中篩選HCC患者的基本步驟，但是根據(jù)AFP水平進(jìn)行肝硬化診斷要求考慮諸多因素，這意味著有必要探究新的有效診斷方法。因此，作為此類研究的組成部分，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)肝硬化的早期診斷和有效預(yù)測(cè)，非常有必要研發(fā)出提高敏感性和特異性的新型血清檢查。
因此，為了研發(fā)用于肝硬化有效早期診斷的方法，本發(fā)明人進(jìn)行了不懈的探索和研究，并且確認(rèn)通過(guò)使用特定結(jié)合到自人原癌基因HCCR-2表達(dá)的蛋白的抗體進(jìn)行的抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)可有效檢測(cè)肝硬化，如韓國(guó)專利公開(kāi)案第2002-41550號(hào)中所述，所述人原癌基因HCCR-2以登記號(hào)(Accession No.)AF315598保藏于GenBank(基因庫(kù))。正是此發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)本發(fā)明人完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用血清中的人原癌基因HCCR-2在早期有效檢測(cè)肝硬化的方法以及一種用該方法診斷肝硬化的試?yán)小?br> 為了實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明的目的，提供一種用于診斷肝硬化的方法，該方法通過(guò)使用特定結(jié)合到自人原癌基因HCCR-2表達(dá)的蛋白的抗體進(jìn)行的抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)來(lái)測(cè)量活體內(nèi)試樣中的HCCR-2蛋白表達(dá)水平；以及一種用于診斷肝硬化的試劑盒。


圖1說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明對(duì)HCCR-2重組蛋白進(jìn)行的免疫印跡的結(jié)果，其中該HCCR-2重組蛋白是從轉(zhuǎn)型為pMAL-p2X/HCCR-2載體的大腸埃希氏菌(E.coli)BL21菌株分離且純化；以及圖2說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明使用HCCR-2多克隆抗體對(duì)肝硬化血清和正常血清中的HCCR-2蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)的診斷結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
人原癌基因HCCR-2(GenBank Accession No.AF315598；韓國(guó)專利公開(kāi)案第2002-41550號(hào))位于12號(hào)染色體的長(zhǎng)臂(12q)中并且具有開(kāi)放閱讀框架，當(dāng)其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)過(guò)度表達(dá)時(shí)可充當(dāng)致癌基因，并且自其可衍生具有大小約36kDa蛋白(稱為HCCR-2蛋白)。
HCCR-2蛋白特異抗體較佳為動(dòng)物體內(nèi)的HCCR-2抗原蛋白致免疫所獲得的抗血清經(jīng)純化而獲得的。HCCR-2蛋白特異抗體更佳為兔體內(nèi)HCCR-2抗原蛋白致免疫所獲得的血清經(jīng)純化而獲得的多克隆抗體。
為了合成特定的識(shí)別HCCR-2蛋白的抗體，首先獲得HCCR-2蛋白。HCCR-2蛋白可使用已知的氨基酸序列來(lái)合成，或者通過(guò)基因工程方法以重組蛋白類型來(lái)產(chǎn)生。例如，可通過(guò)以下方法來(lái)制備HCCR-2重組蛋白，該方法包括使用美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究所(NIH)計(jì)劃基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBankdatabase)中列出的HCCR-2基因的堿基順序制備呈重組蛋白形態(tài)的表達(dá)HCCR-2蛋白的表達(dá)載體；通過(guò)使該表達(dá)載體轉(zhuǎn)型為E.coli(大腸埃希氏菌)獲得轉(zhuǎn)化體，從而產(chǎn)生HCCR-2重組蛋白；以及培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體以分離/純化人原癌基因HCCR-2重組蛋白。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，從轉(zhuǎn)型為含有HCCR-2基因氨基酸序列112-304的pMAL-p2X/HCCR-2載體的E.coli BL21產(chǎn)生具有融合到N-末端的麥芽糖的重組蛋白，隨后以適當(dāng)?shù)拿柑幚?，將移除了麥芽糖的HCCR-2112-304蛋白分離/純化后用作抗原蛋白。為了確認(rèn)以此方式產(chǎn)生的蛋白為HCCR-2112-304重組蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析觀察到對(duì)分子量為約66kDa(45kDa的pMAL加16kDa的HCCR-2112-304)的HCCR-2重組蛋白的特異檢測(cè)。
將從E.coli轉(zhuǎn)化體分離且純化的HCCR-2重組蛋白用作一抗原，其用于篩選和分析通過(guò)兔子的免疫和細(xì)胞融合來(lái)產(chǎn)生多克隆抗體的融合細(xì)胞系。
產(chǎn)生多克隆抗體所必須的經(jīng)免疫的兔子是通過(guò)以下方式產(chǎn)生將HCCR-2重組蛋白與當(dāng)量的佛氏完全佐劑(Freund′s complete adjuvant)良好混合直到混合物乳化，并且將該混合物注射入兔子腹膜內(nèi)，接著以加強(qiáng)注射增加兔子的免疫原性。較佳為進(jìn)一步僅將HCCR-2重組蛋白分3次經(jīng)由腹膜內(nèi)路徑注入兔子體內(nèi)，而不使用佐劑。
收集通過(guò)注射HCCR-2重組蛋白抗原而被免疫的兔血清，并且測(cè)量抗體滴度。
通過(guò)測(cè)定此蛋白在取自式樣的活體內(nèi)試樣中的表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)使用以此方式產(chǎn)生的HCCR-2特異抗體蛋白所進(jìn)行的抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)來(lái)診斷癌癥。可使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)來(lái)檢測(cè)表達(dá)水平，包括酶鏈接免疫吸收劑化驗(yàn)(ELISA)、放射免疫化驗(yàn)(RIA)、夾心法化驗(yàn)以及在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)或免疫印跡分析。
作為活體內(nèi)試樣(樣本)，較佳為使用組織、血清或血小板，最佳為使用血清。
在優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)下列步驟執(zhí)行使用HCCR-2蛋白特異抗體的ELISA技術(shù)1)將HCCR-2特異抗體放入涂布有試樣和對(duì)照組的反應(yīng)器中以誘發(fā)抗原-抗體反應(yīng)；2)使用次級(jí)抗體-標(biāo)記共軛物和標(biāo)記物的顯色基質(zhì)溶液來(lái)檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)產(chǎn)物；以及3)將試樣的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
使用例如ELISA、生物微切片或自動(dòng)微陣列系統(tǒng)等已知技術(shù)可分析大量試樣。通過(guò)將HCCR-2特異抗體蛋白固定在生物微切片上并使其與從個(gè)體收集的活體內(nèi)試樣進(jìn)行反應(yīng)，可檢測(cè)HCCR-2特異抗體蛋白的抗原。
而且，本發(fā)明還提供一種用于診斷肝硬化的試劑盒，其包括特定與HCCR-2反應(yīng)的抗體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肝硬化的早期診斷。
本發(fā)明提供的診斷試劑盒包含1)針對(duì)HCCR-2的特異抗體；2)含有HCCR-2標(biāo)準(zhǔn)抗原的陽(yáng)性對(duì)照組和含有未注射所述抗原的動(dòng)物抗血清的陰性對(duì)照組；3)具有通過(guò)與基質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生顏色的共軛標(biāo)記物的次級(jí)抗體共軛物；4)顯色基質(zhì)溶液，其與標(biāo)記物反應(yīng)以產(chǎn)生顏色；5)用于各個(gè)步驟的洗滌液；以及6)酶促反應(yīng)停止液。
該診斷試劑盒可通過(guò)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)來(lái)定量或定性分析抗體蛋白的抗原，從而診斷肝硬化?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中通常已知的技術(shù)來(lái)檢測(cè)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，包括ELISA、RIA、夾心法化驗(yàn)、聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)印跡法以及免疫印跡分析。例如，可提供該診斷試劑盒以用于使用涂布有重組單克隆抗體蛋白的96-孔微量滴定板的ELISA。
其上可涂布該抗體蛋白的有效反應(yīng)器的實(shí)例包括硝化纖維膜、由聚乙烯樹(shù)脂制成的96-孔板、由聚苯乙烯樹(shù)脂制成的96-孔板以及載玻片。
如前述，本發(fā)明提供的抗體較佳是從通過(guò)使動(dòng)物體內(nèi)的HCCR-2抗原蛋白致免疫而獲得的抗血清純化而得。HCCR-2蛋白特異抗體較佳是以約1到10μg/100μl的比率涂布每個(gè)反應(yīng)器。
本發(fā)明提供的診斷試劑盒中所含有的對(duì)照組包括陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組為含有HCCR-2蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合物，而陰性對(duì)照組為未感染HCCR-2蛋白抗原的動(dòng)物血清。在本發(fā)明的實(shí)例中，使用具有具有下列各種蛋白濃度的HCCR-2蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液0ng/ml(A)、20ng/ml(B)、40ng/ml(C)、80ng/ml(D)、160ng/ml(E)、320ng/ml(F)以及640ng/ml(G)。
作為次級(jí)抗體標(biāo)記物，較佳的是使用包括引發(fā)顯色等的已知標(biāo)記物且可用于本發(fā)明的標(biāo)記物包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP)；堿性磷酸酶；膠態(tài)金；熒光素如聚L-賴氨酸-熒光素異硫氰酸酯(FITC)或若丹明-B-異硫氰酸酯(RITC)；以及染料。在本發(fā)明中，例如，使用山羊抗兔IgG-HRP共軛物(IgG-HRP共軛物)。
所使用的色原體較佳根據(jù)涉及顯色劑的標(biāo)記物而變化，且其可用實(shí)例包括3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)以及鄰-苯二胺(OPD)。更佳以溶解于緩沖液(0.1M NaAc，pH5.5)中的形態(tài)提供色原體。例如TMB等色原體通過(guò)HRP分解，以用作次級(jí)抗體共軛物的標(biāo)記物以便產(chǎn)生顯色沉淀物。通過(guò)肉眼觀察顯色沉淀物的沉淀等級(jí)，由此測(cè)定HCCR-2蛋白抗原的存在。
洗滌液較佳包括磷酸鹽緩沖液、NaCl、吐溫(Tween)20，更佳包括含有0.02M磷酸鹽緩沖液、0.13M NaCl以及0.05％吐溫20的緩沖液。在抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)之后，將適量的洗滌液供應(yīng)入已經(jīng)歷次級(jí)抗體與抗原-抗體共軛物之間的反應(yīng)的反應(yīng)器中。重復(fù)洗滌液洗滌3到6次。較佳為將含磷酸鹽緩沖劑的0.1％BSA用作阻斷液，且較佳為將2N的硫酸用作酶促反應(yīng)停止液。
下文將描述通過(guò)使用該診斷試劑盒在標(biāo)本中檢測(cè)HCCR-2抗原早期診斷肝硬化的方法。陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組中的HCCR-2多克隆抗體和標(biāo)本試樣分別反應(yīng)，并以洗滌液洗滌。隨后，將以標(biāo)記物標(biāo)記的次級(jí)抗體共軛物添加到所得產(chǎn)物中并再次以洗滌液洗滌，其中該標(biāo)記物通過(guò)與基質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生顏色。隨后，將含基質(zhì)的溶液添加到所得產(chǎn)物中以誘發(fā)顯色。隨后，測(cè)量450nm下的吸光率。此處，標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液A的平均吸光率應(yīng)大于或等于0.000且小于或等于0.200。標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液F的平均吸光率應(yīng)大于或等于1.200且小于或等于3.000。將標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液A與F的吸光率值之間的平均值設(shè)定為截止值，確定試樣為陽(yáng)性或陰性試樣。當(dāng)試樣的吸光率大于標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液F的吸光率時(shí)，稀釋該試樣并且隨后再次測(cè)量其吸光率。將吸光率高于截止值的試樣識(shí)別為陽(yáng)性，而將吸光率低于截止值的試樣識(shí)別為陰性。
本發(fā)明提供的含有人原癌基因HCCR-2特異抗體的肝硬化診斷試劑盒是使用患者血清的新型免疫診斷工具，已證實(shí)其具有更高的準(zhǔn)確性和復(fù)現(xiàn)性?，F(xiàn)有地，也將用于診斷肝癌的AFP檢查工具用作肝硬化的血清診斷試劑盒，但其準(zhǔn)確性極差。但是，本發(fā)明提供的用于肝硬化早期診斷的血清HCCR-2檢查所展示的診斷準(zhǔn)確性約為95.1％，其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于常規(guī)AFP檢查。因此，本發(fā)明提供的診斷方法和試劑盒可極為有利地用于肝硬化的早期診斷和小HCC的診斷，因?yàn)槠渚哂休^高的準(zhǔn)確性和復(fù)現(xiàn)性。
現(xiàn)將通過(guò)下列實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，而非以任何方式將本發(fā)明的范疇局限于實(shí)例中所描述的特定實(shí)施例。
<實(shí)例1>HCCR-2多克隆抗體的產(chǎn)生<1-1>HCCR-2重組蛋白的產(chǎn)生為了產(chǎn)生作為肝硬化診斷標(biāo)記物的人原癌基因HCCR-2特異抗體，通過(guò)將對(duì)應(yīng)于GenBank登記號(hào)AF315598氨基酸序列號(hào)112-304的人原癌基因HCCR-2部分插入pET-32(+)載體的多克隆部位，制備pET-32b(+)/HCCR-2載體(New England biolabs，MA)。將該載體轉(zhuǎn)型為E.coli BL21(DE3)(Novagen，Wl)并以1mM異丙基(3-D-硫代乳-吡喃糖苷(IPTG)(SigmaChemical Co.制造)處理從而誘發(fā)表達(dá)，產(chǎn)生融合有45KDa麥芽糖蛋白的66 KDa HCCR-2112-304融合蛋白，并以淀粉酶樹(shù)脂試劑盒(New Englandbiolabs，MA)對(duì)其進(jìn)行純化(國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)案WO 02/44370 A1)。使經(jīng)純化的重組蛋白經(jīng)歷免疫印跡，從而確認(rèn)包括大量的約66kDa融合蛋白(圖1)。將如此分離且純化的HCCR-2重組蛋白用作抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)中的抗原以分析產(chǎn)生用于兔免疫的多克隆抗體的融合細(xì)胞系。
<1-2>兔免疫為了獲得制造特定針對(duì)實(shí)例<1-1>中所制備的HCCR-2重組蛋白的抗體所必須的經(jīng)免疫的兔子，使用新西蘭白兔(NZW)(平均重量為約2.5kg)。將200μg/l的HCCR-2重組蛋白與200μg/l的佛氏完全佐劑(Sigma ChemicalCo.制造)混合并乳化。將2ml所得乳液以每只兔子O.25ml的比率在8處背脊部位皮下投藥。首次注射之后，以兩周為時(shí)間間隔，使用佛氏不完全佐劑乳化經(jīng)免疫的抗原以相同于首次注射的方式在2周內(nèi)多次執(zhí)行加強(qiáng)注射。
<1-3>分離兔血清并且篩選特異多克隆抗體在最后一次接種的5天后，以2周為時(shí)間間隔從在實(shí)例<1-2>中經(jīng)免疫的兔子的動(dòng)脈收集血液，并自其分離出血清，儲(chǔ)存在-20℃直到用于各種試驗(yàn)。檢測(cè)血清的抗體特異性，結(jié)果表明，其僅與人原癌基因HCCR-2重組蛋白特異反應(yīng)。為了在從E.coli分離且純化的血清中篩選出與HCCR-2蛋白抗原特異反應(yīng)的血清，對(duì)實(shí)例<1-1>中所制備的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行ELISA。
具體地說(shuō)，為了抑制非特異性免疫響應(yīng)，通過(guò)將1％的脫脂乳-PBS涂覆在96-孔板(Falcon Co.，USA)上并使其在室溫下靜置1小時(shí)，從而涂布該96-孔板，并以1μg/孔的量將重組蛋白涂布到各個(gè)孔上。以含2％BSA的PBS溶液將兔血清流體稀釋成1×103、1×104、1×105、1×106以及1×107等各種濃度，并將所得稀釋溶液以100μl/孔的量添加到各個(gè)孔。此后，誘發(fā)抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)以使其在37℃下進(jìn)行2小時(shí)，接著以PBS溶液洗滌三次。隨后，將以含2％(W/V)BSA的PBS緩沖液稀釋成1/10,000的各份100μl山羊抗兔IgG(美國(guó)Sigma Co.制造)作為次級(jí)抗體添加到每個(gè)孔，并且在37℃下反應(yīng)1小時(shí)。
此后，將通過(guò)使10ml的0.1M經(jīng)磷酸鹽緩沖的檸檬酸鹽(pH5.0)、1mg的3.3′，5.5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(美國(guó)Sigma Co.制造)以及20μl的35％過(guò)氧化氫混合而獲得的100μl基質(zhì)溶液添加到各個(gè)孔中以誘發(fā)酶促反應(yīng)。將酶促反應(yīng)維持在室溫下15分鐘，且隨后將相同量的2N硫酸溶液加入其中以終止酶促反應(yīng)。在450nm下觀察顯色程度。從具有HCCR-2蛋白特異抗體的多克隆抗體中進(jìn)一步篩選出抗體滴定度大于陰性對(duì)照組抗體滴定度10倍的血清，其中滴定度是通過(guò)ELISA測(cè)量而得，并且分析所篩選出的細(xì)胞的特征。
<實(shí)例2>使用HCCR-2多克隆抗體進(jìn)行ELISA使用HCCR-2多克隆抗體通過(guò)ELISA以下列方式進(jìn)行肝硬化診斷。首先，以試樣涂布各個(gè)孔；其次，以從兔子體內(nèi)分離且純化的HCCR-2特異多克隆抗體涂布ELISA板孔。接著，分步檢測(cè)HCCR-2抗原-抗體結(jié)合在試樣中的存在。
<2-1>以試樣涂布各個(gè)孔將肝硬化和肝炎血清以及正常肝臟血清用作標(biāo)本。為了獲得用于測(cè)量截止值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)將HCCR-2重組蛋白分別稀釋成0ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml以及640ng/ml等各種濃度而制備標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液A、B、C、D、E、F及G。
將各份100μl的標(biāo)本分別分配到各個(gè)96-孔ELISA平底板并且在37℃下反應(yīng)4小時(shí)，接著以洗滌緩沖液(包括0.05％吐溫20的PBS，Ph7.4)洗滌4次。此處，將上文所制備的標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液用作陽(yáng)性對(duì)照組，而將正常兔血清用作陰性對(duì)照組。
<2-2>添加HCCR-2多克隆抗體將根據(jù)實(shí)例<1-3>所制備的HCCR-2蛋白特異多克隆抗體放入各個(gè)涂布有標(biāo)本的孔中，以蓋子覆蓋，并在4℃下靜置16到18小時(shí)。將多克隆抗體在0.5M碳酸鹽緩沖劑(pH9.6)中稀釋成5μg/ml，并且將100μl稀釋溶液添加到各個(gè)孔中。作為對(duì)照組，將未感染HCCR-2蛋白的正常兔血清在碳酸鹽緩沖液中稀釋500倍，并且分配到各個(gè)孔中(100μl/孔)。
隨后，以洗滌緩沖液將板的各個(gè)孔洗滌4次。為了阻斷非特異性蛋白結(jié)合部位，將阻斷液(含有2％BSA的PBS緩沖液(pH7.4))分配到各個(gè)孔(300μl/孔)，并且在37℃下靜置2小時(shí)。
<2-3>檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合體將100μl的稀釋10,000倍的辣根過(guò)氧化物酶共軛山羊抗兔IgG次級(jí)抗體添加到各個(gè)孔中，并且使該板在37℃靜置1小時(shí)，接著以洗滌緩沖液洗滌4次。隨后，將作為基質(zhì)的1mg3.3′，5.5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(SigmaCo.，USA)溶解于10ml檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)中并向其中添加2μl的35％過(guò)氧化氫，由此制備基質(zhì)溶液。將100μl所制備的基質(zhì)溶液分配到各個(gè)孔中，并在室溫下避光反應(yīng)15分鐘。此后，添加50μl的2N H2SO4溶液以終止反應(yīng)，并且測(cè)量450nm下的吸光率。對(duì)于各個(gè)標(biāo)本，將HCCR-2抗原的吸光率推算成從試樣吸光率中減去僅涂布有作為陽(yáng)性對(duì)照組的HCCR-2融合蛋白和作為陰性對(duì)照組的PBS的孔的吸光率所獲得的余數(shù)。以相同的方式，在計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光率值之后，將標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液A與F吸光率值之間的平均值設(shè)定為截止值。將吸光率高于截止值的試樣識(shí)別為陽(yáng)性，而將吸光率低于截止值的試樣識(shí)別為陰性。
此處，標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液A的平均吸光率應(yīng)大于或等于0.000且小于或等于0.200。標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液F的平均吸光率應(yīng)大于或等于1.200且小于或等于3.000。
從使用HCCR-2標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將截止值確定為10μg/ml?；谠摻刂怪担容^各個(gè)試樣的吸光率值以判定其為陽(yáng)性還是陰性。圖3展示了從肝硬化組和正常組收集的血液中的HCCR-2蛋白濃度的比較結(jié)果。
<實(shí)例3>通過(guò)使用HCCR-2多克隆抗體進(jìn)行的ELISA證實(shí)肝硬化診斷效率<3-1>對(duì)于肝硬化患者組的AFP和HCCR-2試劑盒的診斷準(zhǔn)確性為了證實(shí)使用HCCR-2多克隆抗體的ELISA診斷試劑盒和方法的肝硬化診斷效率，將使用實(shí)例2中所述的HCCR-2特異抗體通過(guò)ELISA進(jìn)行的測(cè)量與使用常規(guī)甲胎蛋白(AFP)檢查進(jìn)行的測(cè)量進(jìn)行比較，其中常規(guī)甲胎蛋白(AFP)檢查常規(guī)地用于HCC或肝硬化的診斷。使用市場(chǎng)上可買到的法國(guó)CISBio International的ELSA2-AFP試劑盒測(cè)量AFP水平。
為了根據(jù)診斷結(jié)果判定試樣是陽(yáng)性還是陰性，將AFP的截止值設(shè)定為20ng/ml，而將HCCR-2的截止值設(shè)定為10μg/ml，其是從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。通過(guò)麥內(nèi)瑪檢定(McNemar test)所測(cè)量的數(shù)據(jù)對(duì)各個(gè)肝硬化和正常母性組中的AFP陽(yáng)性與HCCR-2陽(yáng)性之間的反應(yīng)性差異進(jìn)行比較。從肝硬化和正常組推算HCCR-2敏感性、特異性、偽陽(yáng)性/陰性比以及95％置信區(qū)間。
將各個(gè)組之間的HCCR-2陽(yáng)性反應(yīng)性中的差異分別與費(fèi)雪精確檢定(Fisher′s exact test)所測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。將各個(gè)組的AFP陽(yáng)性反應(yīng)性與HCCR-2陽(yáng)性反應(yīng)性之間的差異與麥內(nèi)瑪檢定所測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。將SAS方差6.12(SAS/STAT軟件Changes and Enhancements throughRelease 6.12.Gary，NCSAS Institute，1997)用于所有統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平(significance level)為0.05。
表1展示了對(duì)于62個(gè)肝硬化患者中61的HCCR-2和AFP試劑盒的診斷準(zhǔn)確性比較結(jié)果，除去處于由62個(gè)肝硬化患者所組成的HCC組中的唯一一個(gè)患者。結(jié)果表明，基于HCCR-2的診斷準(zhǔn)確性為95.1％，其顯著高于基于AFP的診斷準(zhǔn)確性，18.0％(chi_M^2＝43.614，df＝1，P＝0.0001，麥內(nèi)瑪檢定)。
表1

<3-2>證實(shí)HCCR-2試劑盒作為肝硬化診斷試劑盒的效用如表2和3所示，使用實(shí)例2中所述的HCCR-2特異抗體通過(guò)ELISA方法對(duì)62個(gè)肝硬化患者和138個(gè)正常人進(jìn)行診斷。本發(fā)明提供的HCCR-2試劑盒的敏感性為95.2％，且其特異性為91.3％，偽陽(yáng)性和偽陰性分別為16.9％和2.3％。而且，整體診斷準(zhǔn)確性為92.5，由此確認(rèn)證實(shí)本發(fā)明提供的HCCR-2試劑盒作為診斷工具極為有效。
表2

表3

如前述，本發(fā)明提供的含有人原癌基因HCCR-2特異抗體的肝硬化診斷試劑盒是使用患者血清的新型免疫診斷工具，由于其具高于常規(guī)AFP檢查工具的準(zhǔn)確性和復(fù)現(xiàn)性，因此可有利地用于肝硬化的早期診斷。
權(quán)利要求
1.一種在試樣中檢測(cè)HCCR-2蛋白(GenBank登記號(hào)AF315598)的方法，其包括以下步驟1)將HCCR-2特異抗體放入涂布有試樣和對(duì)照組的反應(yīng)器中以誘發(fā)抗原-抗體反應(yīng)；2)使用次級(jí)抗體-標(biāo)記共軛物和標(biāo)記物的顯色基質(zhì)溶液來(lái)檢測(cè)所述抗原-抗體復(fù)合體；以及3)將試樣的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以測(cè)量HCCR-2蛋白在標(biāo)本試樣中的表達(dá)程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在試樣中檢測(cè)HCCR-2蛋白(GenBank登記號(hào)AF315598)的方法，其中所述抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)是通過(guò)下列任一技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)酶-鏈接免疫吸收劑化驗(yàn)(ELISA)、放射免疫化驗(yàn)(RIA)、夾心法化驗(yàn)(sandwich assay)以及在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行的免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)方法或免疫印跡分析(immunoblottinganalysis)，蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在試樣中檢測(cè)HCCR-2蛋白(GenBank登記號(hào)AF315598)方法，其中所述HCCR-2特異抗體是在動(dòng)物或卵中將人類HCCR-2抗原蛋白致免疫所獲得的抗血清純化而得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在試樣中檢測(cè)HCCR-2蛋白(GenBank登記號(hào)AF315598)的方法，其中所述標(biāo)本試樣為組織、血清或血漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在試樣中檢測(cè)HCCR-2蛋白(GenBank登記號(hào)AF315598)的方法，其中所述反應(yīng)器是選自由下列各物品構(gòu)成的組合硝化纖維膜、由聚乙烯或聚苯乙烯樹(shù)脂制成的孔板以及載玻片。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在試樣中檢測(cè)HCCR-2蛋白(GenBank登記號(hào)AF315598)的方法，其中將所述HCCR-2蛋白特異抗體以約1到10μg/100μl的量加入各個(gè)反應(yīng)器。
7.一種診斷肝硬化的試劑盒，其包括一針對(duì)人原癌基因HCCR-2蛋白AF315598)的特異抗體，通過(guò)以抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)測(cè)量標(biāo)本中的所述HCCR-2蛋白表達(dá)水平來(lái)執(zhí)行所述診斷。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述診斷肝硬化的試劑盒，其包括a)HCCR-2蛋白特異抗體；以及b)含有HCCR-2標(biāo)準(zhǔn)抗原的陽(yáng)性對(duì)照組和含有未注射所述抗原的動(dòng)物抗血清的陰性對(duì)照組。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷肝硬化的試劑盒，其還包括a)次級(jí)抗體共軛物，具有通過(guò)與基質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生顏色的共軛標(biāo)記物；b)顯色基質(zhì)溶液，其與所述標(biāo)記物反應(yīng)以產(chǎn)生顏色；c)用于各個(gè)步驟的洗滌液；以及d)酶促反應(yīng)停止液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述診斷肝硬化的試劑盒，其中所述次級(jí)抗體共軛物的標(biāo)記物是選自下列物質(zhì)構(gòu)成的組合辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、膠態(tài)金、熒光素以及染料。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述診斷肝硬化的試劑盒，其中所述顯色基質(zhì)選自下列物質(zhì)構(gòu)成的組合3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)以及鄰-苯二胺(OPD)。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述診斷肝硬化的試劑盒，其中所述抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)通過(guò)下列任一技術(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)酶-鏈接免疫吸收劑化驗(yàn)(ELISA)、放射免疫化驗(yàn)(RIA)、夾心法化驗(yàn)(sandwich assay)以及在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)、免疫印跡分析(immunoblotting analysis)或免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)方法。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述診斷肝硬化的試劑盒，其中所述HCCR-2特異抗體是在動(dòng)物或卵中將人類HCCR-2抗原蛋白致免疫所獲得的抗血清純化而得。
14.根據(jù)權(quán)利要求7所述診斷肝硬化的試劑盒，其中所述標(biāo)本試樣為組織、血清或血漿。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)肝硬化的方法，該方法通過(guò)使用特定結(jié)合到自人原癌基因HCCR－2表達(dá)的蛋白的抗體進(jìn)行的抗原－抗體結(jié)合反應(yīng)來(lái)測(cè)量活體內(nèi)標(biāo)本中的HCCR－2蛋白的表達(dá)水平；以及一種用于診斷肝硬化的試劑盒。由于改進(jìn)了準(zhǔn)確性和復(fù)現(xiàn)性，所述診斷方法和試劑盒可有利地用于對(duì)肝硬化的早期診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1795388SQ200480014598
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2004年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月26日
發(fā)明者金振宇 申請(qǐng)人:金振宇