專利名稱：高度可控制性電穿孔方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高度可控制性電穿孔方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞膜起將分子內(nèi)容物與其外部環(huán)境分隔的重要功能。細(xì)胞膜大部分由兩親類脂質(zhì)組成，其可白組裝成高度隔離的結(jié)構(gòu)，因此對于膜間的離子傳輸表現(xiàn)為高能屏障。
然而，類脂基質(zhì)可因強大的外部電場而被破壞，導(dǎo)致膜間傳導(dǎo)和擴(kuò)散通透性增加，如熟知的電穿孔現(xiàn)象。這些現(xiàn)象是因細(xì)胞膜中形成水性膜孔的結(jié)果。尤其是，電穿孔過程涉及在施加短期電場脈沖通常是介于較大盤電極之間時細(xì)胞膜的通透作用(Neumann，et al.，Bioelectrochem Bioenerg 48，3-16(1999)；Ho，et al.，Crit Rev Biotechnol16，349-62(1996))。
例如，圖2A和2B顯示傳統(tǒng)電穿孔系統(tǒng)20，電場的作用(如封閉環(huán)路22所示)會在細(xì)胞膜24上產(chǎn)生無規(guī)的膜孔26。這些膜孔的分布，僅就大小與數(shù)量而言，取決于施加電場的強度與時間。施加的電場越強且時間越長，則膜孔越多且越大。然而，這些膜孔的確切位置無法被控制，所以膜孔的最終分布是隨機的。研究人員無法控制化合物被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中的位置，而這常常是生化反應(yīng)途徑的重要因素。因此研究人員常需要依賴細(xì)胞本身的自然機制，但這在運用上卻是緩慢且困難。
電穿孔法用于導(dǎo)引大分子如DNA、RNA、染料、蛋白質(zhì)與各種化學(xué)藥劑進(jìn)入細(xì)胞。大的外部電場能引發(fā)高的膜間電位從而形成膜孔(例如，具有直徑為20-120nm范圍)。在施加電脈沖時，帶電大分子，如DNA，可以通過電泳主動地經(jīng)由所述膜孔穿入細(xì)胞膜(Neumann，etal.，Biophys J 712 868-77(1996))。不帶電的分子也可通過被動擴(kuò)散經(jīng)由所述孔進(jìn)入。在脈沖終止時，膜孔于上百毫秒時間內(nèi)再次關(guān)閉，該時間由恢復(fù)為常規(guī)膜的傳導(dǎo)值檢測出(Ho，1996，前述)此方法常用于實驗室設(shè)備中，以將化學(xué)和生物化合物注入細(xì)胞中，并避免依賴細(xì)胞本身的蛋白質(zhì)受體和細(xì)胞膜間的膜間通道。這使得研究人員易于研究化合物的生物效應(yīng)，判斷其是抗癌藥物還是致死毒物。然而，現(xiàn)有的電穿孔技術(shù)是有局限的。
因此，必須提供一種方法和系統(tǒng)以克服傳統(tǒng)電穿孔法的限制。

發(fā)明內(nèi)容
上述及其它現(xiàn)有技術(shù)中的問題和不足可以由本發(fā)明的可控制性電穿孔法的多種方法與設(shè)備加以克服或改進(jìn)。本發(fā)明的可控制性電穿孔系統(tǒng)和方法允許控制水性膜孔的大小、數(shù)量、位置與分布，因此增加了適用性。此處所述的可控制性電穿孔系統(tǒng)和方法一般運用至少兩個子系統(tǒng)和子過程。其中一個子系統(tǒng)和子過程運用較廣泛的效用以削弱細(xì)胞膜，稱為廣效性子系統(tǒng)。另一個子系統(tǒng)和子過程運用較局限的效用以定位膜上膜孔的位置，稱為局效性子系統(tǒng)。
本發(fā)明的上述與其它的特色及優(yōu)點，可由以下詳細(xì)的敘述和附圖為本領(lǐng)域技術(shù)人員領(lǐng)會與了解。


圖1A和1B顯示本發(fā)明所述的可控制性電穿孔系統(tǒng)的操作；圖2A和2B顯示傳統(tǒng)的電穿孔系統(tǒng)的操作；圖3A-3D顯示一細(xì)胞注入系統(tǒng)的一般實施方式；圖4A-4B顯示一細(xì)胞注入系統(tǒng)的實施例；圖5A-5B顯示用于一列細(xì)胞的細(xì)胞注入系統(tǒng)的實施例；
圖6顯示一利用多重磷脂質(zhì)膜層和電穿孔法的分離裝置；圖7顯示一利用多膜層、電穿孔法和一組微流的分離裝置；圖8顯示一利用在不同位置具有不同的孔的單膜層的分離裝置；圖9顯示一可用于本發(fā)明各種實施方式的電極板網(wǎng)柵(electrodegrid)的實施例。
發(fā)明詳述本發(fā)明所述的可控制性電穿孔系統(tǒng)和方法允許控制水性膜孔的大小、數(shù)量、位置與分布，因此增加了實用性。參照圖1A與1B，本發(fā)明所述的對于膜12可控制性電穿孔系統(tǒng)10與方法，一般而言運用至少兩個激活的子系統(tǒng)和子過程。圖1A顯示膜12的一部份，而圖1B顯示本發(fā)明所述的可控制性電穿孔系統(tǒng)10。
值得注意的是，僅存在其中一個激活的子系統(tǒng)將不足以在膜上開啟或產(chǎn)生膜孔14而必須運用兩個激活的子系統(tǒng)，以類似于邏輯“與”門方式運作。其中一個廣效性子系統(tǒng)16運用較廣泛的效用以削弱膜，而另一個局效性子系統(tǒng)18則運用較局限的效用以定位在膜12上的膜孔14的位置。同時運用廣效性子系統(tǒng)16與局效性子系統(tǒng)18可高度定位且控制電穿孔法，從而開啟膜孔14。
因此，舉例而言，相比于描述于背景技術(shù)部分及圖2A與2B的傳統(tǒng)的細(xì)胞膜電穿孔法，除了傳統(tǒng)電穿孔技術(shù)所使用的電場以外，本發(fā)明所公開的電穿孔系統(tǒng)和方法運用一個在細(xì)胞膜上特定位置的局效性子系統(tǒng)18，以控制膜孔14的位置。局效性子系統(tǒng)18會激發(fā)磷脂質(zhì)分子，因而降低廣效性子系統(tǒng)16產(chǎn)生水性膜孔所需的能量。因此，舉例而言，可施加給系統(tǒng)一極弱的電場，其不發(fā)生電穿孔現(xiàn)象。然而，此弱電場可在激光束激發(fā)過細(xì)胞膜的位置開啟水性膜孔。
廣效性子系統(tǒng)或子過程16可選自任何適用的膜削弱系統(tǒng)和/或過程。此弱系統(tǒng)和/或過程可選自電場(在某些優(yōu)選實施方式中為均勻電場)、微波能量、其它電磁輻射、低能激光束(即低于引發(fā)隨機電穿孔法所需的能量)、和包含至少一種前述弱能系統(tǒng)和/或過程的任意組合。廣效性子系統(tǒng)或過程16的能量大小一般低于傳統(tǒng)隨機開啟膜孔的電穿孔法的能量。另外，弱能系統(tǒng)和/或過程16的覆蓋區(qū)域(例如橫截面區(qū)域)一般包含大于所期望膜孔大小的區(qū)域。在某些實施方式中，該區(qū)域包含整個細(xì)胞膜或一組細(xì)胞膜。在其它實施方式中，該區(qū)域為細(xì)胞膜的一個部位。
局效性子系統(tǒng)或子過程18可選自任何適用的膜孔定位系統(tǒng)和/或過程。上述定位系統(tǒng)和/或過程可選自激光束、電極頭、和包含至少一種前述定位系統(tǒng)和/或過程的任意組合。定位系統(tǒng)和/或過程18的區(qū)域(例如橫截面區(qū)域)一般相對于所期望的膜孔大小較狹窄。因此，可以使受控制的膜孔具有亞微米級或納米級的尺寸(例如1-100nm)，現(xiàn)今及開發(fā)中的激光器和電極頭技術(shù)能達(dá)到上述亞微米級和納米級的尺寸。
應(yīng)用細(xì)胞注入本發(fā)明所述的可控制性電穿孔系統(tǒng)和過程，在控制的條件下，可用于注入大分子，包括DNA、RNA、染料、蛋白質(zhì)與各種化學(xué)藥劑。在不限制本發(fā)明的可控制性電穿孔系統(tǒng)的應(yīng)用的情況下，圖3A-5B顯示了運用可控制性電穿孔系統(tǒng)的細(xì)胞膜孔開口系統(tǒng)的各種實施方式。
參照圖3A-3D，系統(tǒng)30可控制性地將大分子注入細(xì)胞。圖3A顯示系統(tǒng)30包括用以固定細(xì)胞24的機構(gòu)32。機構(gòu)32為合適的微機械裝置，其包括在生物工藝領(lǐng)域廣泛已知的相關(guān)微系統(tǒng)。此機構(gòu)32優(yōu)選可固定個別細(xì)胞或控制細(xì)胞組。另外，機構(gòu)32也可用于從細(xì)胞24獲取生物的、電的、光的或其它的數(shù)據(jù)。
參照圖3B，系統(tǒng)30包括用以固定細(xì)胞24的機構(gòu)32，且可控制性電穿孔系統(tǒng)包括廣效性子系統(tǒng)16與局效性子系統(tǒng)18，其中局效性子系統(tǒng)18針對于細(xì)胞24的某一位置以引發(fā)膜孔34開口。
參照圖3C，經(jīng)由一納米噴嘴或其它合適的注射裝置36導(dǎo)入一大分子38。當(dāng)移除局效性子系統(tǒng)18和/或廣效性子系統(tǒng)16時，膜孔會關(guān)閉，使細(xì)胞24’內(nèi)具有大分子38。
圖4A與4B顯示用以在細(xì)胞24中引入例如以導(dǎo)入上述大分子的可控制性開孔34的可控制性電穿孔系統(tǒng)40。系統(tǒng)40包括以電場發(fā)生裝置42、44、46的形式的廣效性子系統(tǒng)，和來自適當(dāng)源的激光束48(未示出)。電場發(fā)生裝置的形式為一電極板42偶合至一可切換(經(jīng)由一開關(guān)44)的電壓源46。如圖所示，激光束可聚焦，而施加電場以激活膜孔開口機制，其類似于前述的邏輯“與”電路方式。
有關(guān)圖3A-3D和圖4A-4B的系統(tǒng)和方法的描述，研究人員僅需以組織結(jié)構(gòu)中少量的細(xì)胞暴露于生物化合物，并觀察其傳導(dǎo)至鄰近細(xì)胞訊號的方式。或者，研究人員可研究是否非對稱的細(xì)胞如神經(jīng)元和腸胃粘膜細(xì)胞對于在不同位置注入的化合物反應(yīng)不同。
參照圖5A與5B，系統(tǒng)50為類似圖3A-3D或圖4A-4B并結(jié)合一列細(xì)胞24組52的操作。當(dāng)廣效性子系統(tǒng)16與局效性子系統(tǒng)18操作時，細(xì)胞24上形成膜孔34。此膜孔可用于選擇性地將大分子導(dǎo)入細(xì)胞24中。
分離裝置參照圖6-10，其為利用本發(fā)明的可控制性電穿孔系統(tǒng)而獲得的過濾/分離裝置的各種實施方式。
圖6描述了系統(tǒng)60的一個實施方式，例如，分子篩。系統(tǒng)60包括多個膜層62，例如，磷脂質(zhì)雙層膜。每一膜層62在運用廣效性子系統(tǒng)時可經(jīng)受局效性子系統(tǒng)，另外膜孔64的位置可在組裝和/或制造時預(yù)先決定，例如，具有適當(dāng)?shù)奈?或毫微-缺陷，或由各膜層的不同電壓水平?jīng)Q定孔大小時可以一致。每一膜層所施加的不同電壓(例如V1、V2與V3)可產(chǎn)生從大膜孔64至小膜孔64的過濾梯度，從而使得分子66通過合適的膜層。
使用生產(chǎn)成本極低的磷脂質(zhì)雙層膜，相同的濾膜60可重復(fù)使用且采用電穿孔法可適用于所需的任何尺寸，小心控制施加的電場。除了多層濾膜，可以使用單個濾膜并并構(gòu)造使之適合于任何情形。
參照圖7，系統(tǒng)70顯示具有類似于圖6中所述功能的分子篩，其與具有通道74的生物芯片組72相連。通道74可基于尺寸收集各級大分子和分子。另外，通道74可加入或與梯度系統(tǒng)，例如壓力、熱力、電力或其它梯度相連以引導(dǎo)大分子和分子至組72。組72可為任何適用的微流體或毫微流體裝置。舉例而言，制造此類裝置的方法如描述于2003年11月30日的Reveo Inc.PCT Application No.PCT/US03/37304，其標(biāo)題為“Three Dimensional Device Assembly and Production MethodsThereof”，將其加入本文作為參考。
圖8顯示另一動態(tài)過濾裝置的實施例，其中一列激光器組提供膜孔開口的定位。圖8顯示過濾系統(tǒng)80，其包括連接于一廣效性子系統(tǒng)16與一局效性子系統(tǒng)18的膜層82。舉例而言，局效性子系統(tǒng)18可由激光器組88產(chǎn)生?；蛘?，除了激光器組88，可加入一光束導(dǎo)向裝置，從而只使用一個激光源。當(dāng)與膜層82上某位置相連的激光器組被激活時，膜孔84會開啟。膜孔的大小受控于預(yù)定的膜特性、局效性子系統(tǒng)區(qū)域或大小，或者廣效性子系統(tǒng)的大小。
細(xì)胞、蛋白質(zhì)、酶、DNA分子、RNA分子與其它大分子或分子可受制于一列容器86組，例如位于合適的微流體裝置上。因此，分離裝置80在任何用途下需要極規(guī)整和高度靈活。
圖9顯示本發(fā)明的各實施方式中，適于提供廣效性子系統(tǒng)的電極的范例。經(jīng)由以柵格形式提供電極，可供應(yīng)適用的電場產(chǎn)生系統(tǒng)以符合各種用途，包括局效性子系統(tǒng)、大分子導(dǎo)引、過濾或任何其它目的。
除了基于大小的過濾，前述的分離裝置也可基于離子價而分離，因為施加的電壓僅能驅(qū)使一種類型的離子通過膜。
盡管已顯示和描述了優(yōu)選實施方式，但在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下可以做各種改進(jìn)和修改。因此，需要指出的是通過舉例而描述的本發(fā)明并不限于此。
權(quán)利要求
1.膜的可控制性電穿孔系統(tǒng)，其包含有廣效性子系統(tǒng)，用以給所述膜提供廣泛的能量，和局效性子系統(tǒng)，用以給所述膜提供局限的能量，其中在對應(yīng)于所述局限的能量位置的位置處打開或產(chǎn)生孔。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)是選自電場、微波能、其它電磁輻射、和低能激光束的弱能系統(tǒng)，或者是包含至少一種前述弱能系統(tǒng)的任意組合。
3.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)的能量大小低于不具有所述局效性子系統(tǒng)從而產(chǎn)生無規(guī)膜孔的電穿孔系統(tǒng)的能量大小。
4.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)所覆蓋的區(qū)域包含大于所期望的膜孔的大小的區(qū)域。
5.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)所覆蓋的區(qū)域包含一個細(xì)胞的膜。
6.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)所覆蓋的區(qū)域包含一列細(xì)胞的膜。
7.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)所覆蓋的區(qū)域包含膜的一個部位。
8.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述局效性子系統(tǒng)是選自激光束、和電極頭的定位系統(tǒng)，或者是包含至少一種前述定位系統(tǒng)的任意組合。
9.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述局效性子系統(tǒng)的區(qū)域?qū)?yīng)于所述膜孔的大小。
10.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述膜孔具有亞微米級尺寸。
11.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述膜孔具有約100納米或更小的尺寸。
12.可控制性電穿孔系統(tǒng)，其包含有廣效性子系統(tǒng)，用以給膜提供廣泛的能量，和局效性子系統(tǒng)，用以給膜提供局限的能量，其中當(dāng)所述廣效性子系統(tǒng)與所述局效性子系統(tǒng)均被激活時，孔被打開。
13.可控制性地在膜上開孔的方法，其包括導(dǎo)引廣泛的能量至所述膜，和導(dǎo)引局限的能量至所述膜，其中在對應(yīng)于所述局限的能量位置的位置處打開或產(chǎn)生孔。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量是選自電場、微波能、其它電磁輻射、和低能激光束的能源系統(tǒng)，或者是包含至少一種前述能源系統(tǒng)的任意組合。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量的大小低于不具有所述局限的能量從而產(chǎn)生無規(guī)膜孔的電穿孔系統(tǒng)的能量大小。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區(qū)域包含大于所期望的膜孔大小的區(qū)域。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區(qū)域包含一個細(xì)胞的膜。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區(qū)域包含一列細(xì)胞的膜。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述廣泛的能量所覆蓋的區(qū)域包含膜的一個部位。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述局限的能量是選自激光束、和電極頭的定位系統(tǒng)，或者是包含至少一種前述定位系統(tǒng)的任意組合。
21.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述局限的能量的區(qū)域?qū)?yīng)于所述膜孔的大小。
22.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述孔具有亞微米級的尺寸。
23.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述孔具有約100納米或更小的尺寸。
24.細(xì)胞開孔系統(tǒng)，其包含有微機械裝置，用以固定細(xì)胞，和如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，用以可控制性地在所述細(xì)胞上開孔。
25.如權(quán)利要求24所述的細(xì)胞開孔系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)包含電極板和可切換的電壓源。
26.如權(quán)利要求24所述的細(xì)胞開孔系統(tǒng)，其中所述局效性子系統(tǒng)包含激光器。
27.細(xì)胞孔大分子系統(tǒng)，其包含有微機械裝置，用以固定細(xì)胞，如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，用以可控制性地在所述細(xì)胞上開孔，和大分子注入裝置，用以經(jīng)由所述孔將大分子注入所述細(xì)胞。
28.細(xì)胞開孔的方法，其包括固定細(xì)胞，和應(yīng)用如權(quán)利要求13所述的方法，可控制性地在所述細(xì)胞上開孔。
29.用以將大分子引入細(xì)胞內(nèi)的方法，其包括固定細(xì)胞，應(yīng)用如權(quán)利要求13所述的方法，可控制性地在所述細(xì)胞上開孔，和經(jīng)由所述孔將所述大分子引入所述細(xì)胞內(nèi)。
30.用于過濾分子或大分子的系統(tǒng)，其包含有多個膜層，各膜層包括如權(quán)利要求1所述的可控制性地在細(xì)胞上開孔的系統(tǒng)，各膜層被開啟成具有不同的孔徑，從而產(chǎn)生孔大小梯度。
31.過濾分子或大分子的系統(tǒng)，其包含有多個膜層，和廣效性子系統(tǒng)，其與各膜層相結(jié)合，其中各膜層包括具有缺陷的位置，在不激活所述廣效性子系統(tǒng)的情況下，所述位置關(guān)閉，而在激活所述廣效性子系統(tǒng)的情況下，所述位置被打開。
32.如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其中位于各膜層的缺陷控制所述孔的大小。
33.如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其中所述廣效性子系統(tǒng)的能量大小控制所述孔的大小。
34.用以過濾分子或大分子的系統(tǒng)，其包含有膜層，其包括如權(quán)利要求1所述的用以可控制性地在細(xì)胞上開孔的系統(tǒng)，其中所述局效性能量子系統(tǒng)包含一組局效性能量次子系統(tǒng)。
35.用以過濾分子或大分子的系統(tǒng)，其包含有膜層，其包括如權(quán)利要求1所述的用以可控制性地在細(xì)胞上開孔的系統(tǒng)，其中所述局效性能量子系統(tǒng)包含一組激光器。
36.用以過濾分子或大分子的系統(tǒng)，其包含有膜層，其包括如權(quán)利要求1所述的用以可控制性地在細(xì)胞上開孔的系統(tǒng)，其中所述局效性能量子系統(tǒng)包含與電磁能量源相連結(jié)的光束導(dǎo)向裝置。
37.可控制性開孔裝置，其包含有雙層細(xì)胞膜，激光束源，和電場源，其中將由來自所述激光束源的激光束施加于所述雙層細(xì)胞膜的一個位置，從而界定出一開孔位置，并施加來自所述電場源的電場，從而開孔。
38.如權(quán)利要求37所述的可控制性開孔裝置，其中所述雙層細(xì)胞膜包含磷脂。
39.如權(quán)利要求37所述的可控制性開孔裝置，其中，由所述激光束激發(fā)所述位置的分子，從而減少開孔所需的電場能量，其中所述電場可以比不存在激光束時開啟所述孔所需的電場弱。
40.過濾裝置，其包含如權(quán)利要求37、38和39所述的可控制性開孔裝置。
41.分離裝置，其包含數(shù)個如權(quán)利要求40所述的過濾裝置，所述過濾裝置堆疊在一起，并對各個過濾裝置施加不同的電壓從而使孔大小不同。
42.如權(quán)利要求40所述的過濾裝置，其中所述激光束源能將激光束導(dǎo)引至膜上的多個部位，由此界定當(dāng)施加電場時用以開孔的不同位置。
43.如權(quán)利要求42所述的過濾裝置，其中孔的大小因膜的特性或電場的級別而改變，所述過濾裝置還包括多個與膜上用以施加激光束的位置相連的容器。
44.用以分離顆粒的方法，其包括提供雙層膜，導(dǎo)引激光束至膜上的某位置，施加電場以在所述膜上的所述位置開孔，由此，小于所述孔大小的顆粒將被分離。
45.用以分離顆粒的方法，其包括提供多個雙層膜的堆疊，導(dǎo)引激光束至所述膜上的某位置，施加單獨的電場至各個膜，以在各個膜上開孔。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中改變施加至至少一個所述多個膜中的電場以改變開口大小。
47.分離顆粒的方法，其包括提供雙層膜，導(dǎo)引激光束至所述膜上的第一位置，施加電場以在所述膜上的第一位置處開孔，則小于第一膜孔大小的顆粒將被分離，并被收集于一第一容器中，導(dǎo)引激光束至所述膜上的第二位置，施加電場以在所述膜上的第二位置處開孔，則小于第二膜孔大小的顆粒將被分離，并被收集于一第二容器中。
全文摘要
本發(fā)明涉及可控制性電穿孔系統(tǒng)和方法，由于所述系統(tǒng)和方法可以控制水性膜孔的大小、數(shù)量、位置與分布，因此增加了適用性。所述的可控制性電穿孔系統(tǒng)和方法一般運用至少兩個激活子系統(tǒng)和子過程。其中一個子系統(tǒng)和子過程運用相對廣泛的效用以削弱膜，稱為廣效性子系統(tǒng)。另一個子系統(tǒng)和子過程運用相對局限的效用以定位膜中的膜孔的位置，稱為局效性子系統(tǒng)。
文檔編號C12M3/00GK1759172SQ200480006432
公開日2006年4月12日 申請日期2004年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日
發(fā)明者薩迪克·M.·法里斯 申請人:瑞威歐公司