專利名稱：運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域。具體地涉及一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳 操作方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前突出的全球性能源危機(jī)和環(huán)境污染問(wèn)題，使得利用生物技術(shù)和可再生資源 (生物質(zhì))進(jìn)行燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)，成為包括美國(guó)、巴西、中國(guó)等在內(nèi)的許多國(guó)家的重 大研發(fā)項(xiàng)目之一。這些國(guó)家都在嘗試開(kāi)發(fā)新的可用于更直接、更全面高效利用生物質(zhì)資源 的燃料乙醇生產(chǎn)菌種和工藝。而運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇發(fā)酵速度快、乙醇產(chǎn)率高(為理論值 的97 %，而酵母為理論值的90-92 % )，能耐受高糖濃度和高醇濃度，是目前所知產(chǎn)醇能力 最強(qiáng)的細(xì)菌之一，成為極具開(kāi)發(fā)潛力的乙醇生產(chǎn)菌種；運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌還能高產(chǎn)果聚糖、葡 萄糖酸、山梨醇等生物化工產(chǎn)品，極具工業(yè)利用價(jià)值。但運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌所能利用的碳源范圍太窄，僅限于葡萄糖、果糖和蔗糖。擴(kuò) 展它底物范圍的改造工作已取得很大進(jìn)展，2006年10月Dupont杜邦公司和Broin公司 聯(lián)合宣布了基于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌木糖利用工程菌株的農(nóng)作物秸稈產(chǎn)醇的工藝，并先后建 立了生物質(zhì)乙醇生產(chǎn)示范廠和中試工廠。菌株ZM4( = ATCC31821)和NCIMB11163的全 基因組序列也分別于2005年、2009年發(fā)表公布(Seo JS, Chong H, Park HS, et al. The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4. Nature Biotechnology. 2005 ；23 :63-68. Vassili N. Kouvelis, Elizabeth Saunders, Thomas S.Brettin, et al. Complete Genome Sequence of the Ethanol Producer Zymomonas mobilis NCIMB 11163. Journal of Bacteriology, 2009,191 (22) :7140-7141.)。然而，運(yùn) 動(dòng)發(fā)酵單胞菌的基礎(chǔ)科學(xué)研究和遺傳改造手段現(xiàn)狀還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用研究的需要。運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌遺傳背景知識(shí)的相對(duì)缺乏、嚴(yán)格的限制修飾系統(tǒng)、廣泛而多樣的內(nèi)源性質(zhì)粒、廣 泛的抗性譜等等因素，使得對(duì)它的遺傳操作手段至今仍然有限而不成熟。目前導(dǎo)入外源基因和進(jìn)行基因組DNA修飾(或染色體遺傳操作)是通過(guò)接合轉(zhuǎn)移 和轉(zhuǎn)化(化學(xué)法、電穿孔法)進(jìn)行的。接合轉(zhuǎn)移工作早在二十世紀(jì)八十年代就開(kāi)展了，但接 合轉(zhuǎn)移效率因菌株和質(zhì)粒差別很大，總體上是低的?；瘜W(xué)法轉(zhuǎn)化報(bào)道很少，因效率低和難以 重復(fù)而極少使用。電穿孔方法則方便、簡(jiǎn)單、相對(duì)穩(wěn)定，因而使用相對(duì)廣泛。一些寬宿主質(zhì)粒 載體和人為構(gòu)建的大腸桿菌-運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌穿梭質(zhì)粒載體被電穿孔轉(zhuǎn)化到不同的運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌菌株中，并能穩(wěn)定復(fù)制存在。這些不帶目的基因的質(zhì)粒載體的電穿孔轉(zhuǎn)化效率 與宿主菌株、質(zhì)粒類型和具體的操作條件、方法均直接相關(guān)，報(bào)道的轉(zhuǎn)化效率從IO1個(gè)/μ g DNA到IO6個(gè)/ μ g DNA不等，而分析其操作條件、手法，則彼此差別又很大。一般來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒越大，轉(zhuǎn)化效率越低。帶有目的基因的可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，較前述 不帶目的基因的可復(fù)制質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，要困難得多，所公開(kāi)的信息也少得多，目前僅有個(gè)別 的轉(zhuǎn)化效率的數(shù)據(jù)報(bào)道。對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行基因組DNA修飾(或染色體遺傳操作)時(shí)常規(guī)采用的基于宿主自身recA系統(tǒng)、通過(guò)長(zhǎng)同源臂的同源重組定點(diǎn)整合方式，或者是通過(guò)轉(zhuǎn)座子元件進(jìn)行 的隨機(jī)轉(zhuǎn)座方式，均首先需將相關(guān)質(zhì)粒或DNA分子，經(jīng)過(guò)電穿孔和(或)接合轉(zhuǎn)移的方式， 從胞外轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)；而質(zhì)?；駾NA分子進(jìn)入細(xì)胞后的整合、轉(zhuǎn)座過(guò)程，均屬于稀有事件，因 此基因組DNA修飾(或染色體遺傳操作)，客觀上更需要有高效、穩(wěn)定、重復(fù)性好的電穿孔轉(zhuǎn) 化方法。而目前這方面的信息更是十分有限的。綜上所述，目前的電穿孔轉(zhuǎn)化方法，都是針對(duì)特定菌株和特定質(zhì)粒的特殊應(yīng)用，難 以推廣到其它菌株和質(zhì)粒，相對(duì)缺乏通用性和穩(wěn)定性、重復(fù)性，難以滿足運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌分 子生物學(xué)研究和進(jìn)一步的改造應(yīng)用研究的需要，本領(lǐng)域需要建立更加通用、高效、穩(wěn)定的電 穿孔方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速優(yōu)化、適應(yīng)面廣、穩(wěn)定的、高 效的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，包括下述步驟將待轉(zhuǎn)化DNA通過(guò) 電穿孔轉(zhuǎn)化到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞中或用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液與待轉(zhuǎn) 化DNA共同孵育，通過(guò)電穿孔將孵育后的DNA轉(zhuǎn)化到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞中；所 述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞是將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)至OD6tltlnm = 0. 375 0. 420的 菌液濃縮100倍而制成；電穿孔操作的參數(shù)為2mm電擊杯中感受態(tài)細(xì)胞體積為80 μ 1 160 μ 1 ；電場(chǎng)強(qiáng)度為11. 0 14. OkV/cm ；復(fù)蘇時(shí)間為3h 24h。所述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液是用下述方法制成培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌至 OD600 = 0 . 6 1. 0的培養(yǎng)液，在8000 12000rpm、4°C、3 6min離心收集菌體，用等體積 的冰浴預(yù)冷的提取物緩沖液HND洗滌，用培養(yǎng)液體積的1/20到1/10體積的冰浴預(yù)冷的提 取物緩沖液HND重懸，冰上超聲破壁，14000 18000rpm、4°C、8 ianin離心，收集上清液， 所述提取物緩沖液HND為pH = 7. 0的200mM HEPES (N-(2-羥乙基)哌嗪-N，-2磺酸)， 20mM Na2EDTA, 5mM DTT ( 二硫蘇糖醇)。所述用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液與待轉(zhuǎn)化DNA共同孵育為選100 μ 1反應(yīng)體 系，包括 IOOmM HEPES，pH= 7. 0，IOmM Na2EDTA, 2. 5mM DTT,5mM MgCl2, ΙμΜ SAM(S_ 腺苷甲 硫氨酸)，2 10 μ g待轉(zhuǎn)化DNA，50 μ 1運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液，在37°C、反應(yīng)2 3 小時(shí)，純化，無(wú)菌水溶解。所述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌為ZM4、CP4、ATCC10988 或 ZM4(ldh: :FRT-cml_FRT)。所述2mm電擊杯中感受態(tài)細(xì)胞體積為120 μ 1。所述電場(chǎng)強(qiáng)度為11. 75 13. 25kV/cm。本發(fā)明的有益效果在于1、利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液處理待轉(zhuǎn)化DNA，使其獲得修飾，從而減 少電穿孔轉(zhuǎn)化時(shí)的宿主限制修飾系統(tǒng)的限制，提高轉(zhuǎn)化效率；2、根據(jù)不同的遺傳操作類型和目的選擇質(zhì)粒載體，選擇轉(zhuǎn)化效率更高的質(zhì)粒為出 發(fā)材料構(gòu)建重組質(zhì)粒；3、利用本發(fā)明的優(yōu)化了的關(guān)鍵電穿孔物理參數(shù)對(duì)不同的宿主和DNA進(jìn)行電穿孔，提高了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌電穿孔遺傳操作的轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性，適應(yīng)了所有通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化 進(jìn)行的、不同構(gòu)建目的的遺傳操作，從而又具有通用性。通過(guò)本發(fā)明的方法可進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化和基因組DNA修飾，從而可廣泛用于運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌包括基因功能、表達(dá)調(diào)控研究在內(nèi)的基礎(chǔ)研究和相關(guān)的應(yīng)用研究。


圖1.圖中1-1為穿梭載體擬B21 (5930bp)，l_2為穿梭載體 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)，1-3 為寬宿主載體 pBBRlMCS-2 (5144bp)，1-4 為定點(diǎn)整合載體 PBR328-ldhR-cml-ldhL(7447bp)的物理圖譜。其中，Ec ori即大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子，來(lái)自 質(zhì)粒pBR3^ ；Zm ori即運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌質(zhì)粒復(fù)制子，來(lái)自質(zhì)粒pZM2 ；tet即四環(huán)素抗性基 因，cml即氯霉素抗性基因，amp即氨芐青霉素抗性基因，Plac為大腸桿菌Iac基因的啟動(dòng) 子，IacZ為β -半乳糖苷酶基因，kan即卡拉霉素抗性基因，mob質(zhì)粒遷移相關(guān)基因，rep質(zhì) 粒復(fù)制相關(guān)基因，MCS為多克隆位點(diǎn)，Idh為乳酸脫氫酶基因，IdhR和IdhL分別用作同源重 組的同源臂。圖 2.質(zhì)粒 pBBRlMCS-2-Pgap-FLP (6880bp)的構(gòu)建示意圖。圖3.不同細(xì)胞濃縮倍數(shù)下電穿孔轉(zhuǎn)化pBBRlMCS_2(5144bp)到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌 株ZM4圖4.不同細(xì)胞濃縮倍數(shù)下電穿孔轉(zhuǎn)化pZB21 (5930bp)到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株CP4圖5.電擊杯中不同感受態(tài)細(xì)胞體積下電穿孔轉(zhuǎn)化pBBRlMCS_2(5144bp)到運(yùn)動(dòng)發(fā) 酵單胞菌菌株ZM4圖6.不同電場(chǎng)強(qiáng)度下電穿孔轉(zhuǎn)化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pBBRlMCS-2-Pgap-FLP(6880bp)到 ZM4圖7.不同電場(chǎng)強(qiáng)度下電穿孔轉(zhuǎn)化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)到 CP4圖8.不同復(fù)蘇時(shí)間下電穿孔轉(zhuǎn)化pBBRlMCS(5144bp)、p^21 (5930bp)到ZM4圖9.不同復(fù)蘇時(shí)間下電穿孔轉(zhuǎn)化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)到 CP具體實(shí)施例方式一般來(lái)說(shuō)，影響電穿孔轉(zhuǎn)化效率的三大制約因素即質(zhì)粒特性、宿主自身限制修飾 系統(tǒng)和電穿孔物理參數(shù)。針對(duì)這些制約因素，本發(fā)明分別采取了相應(yīng)的解決措施，具體地 是1、在電穿孔前用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液處理待轉(zhuǎn)化DNA，使待轉(zhuǎn)化DNA獲得宿主 的限制修飾系統(tǒng)的修飾，克服宿主對(duì)異源DNA進(jìn)入宿主以后的限制及降解作用；2、選擇轉(zhuǎn) 化效率更高的質(zhì)粒為出發(fā)材料構(gòu)建重組質(zhì)粒，再進(jìn)行轉(zhuǎn)化；3、選擇關(guān)鍵的電穿孔物理參數(shù) 進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)不同的宿主和DNA，選擇不同的參數(shù)優(yōu)化水平的組合；這些關(guān)鍵的電穿孔物 理參數(shù)包括用于制備電穿孔感受態(tài)細(xì)胞的菌液的生長(zhǎng)階段和制備的感受態(tài)細(xì)胞的密度， 電擊杯里感受態(tài)細(xì)胞體積，DNA濃度，電場(chǎng)強(qiáng)度，加入復(fù)蘇液后的復(fù)蘇時(shí)間。由于本發(fā)明對(duì) 這些措施的綜合運(yùn)用，因此提供了一種快速優(yōu)化的、通用的、穩(wěn)定的、高效的轉(zhuǎn)化方法。應(yīng)當(dāng)理解的是，由于用于電穿孔轉(zhuǎn)化的DNA類型多樣，其彼此差異極大(主要指大小、有無(wú)復(fù)制子，復(fù)制類型，選擇標(biāo)記類型，等等)，加上其所涉及的細(xì)胞內(nèi)生物過(guò)程類型不 同，電穿孔的最佳操作條件一般是需要摸索和優(yōu)化的，本發(fā)明的技術(shù)提供了針對(duì)新的菌株 和新的DNA類型時(shí)的一種快速優(yōu)化操作條件的方法，因而也同時(shí)具有了通用性、穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)理解的是，由于同上的原因，針對(duì)不同菌株和不同DNA類型的電穿孔操作，其 轉(zhuǎn)化效率是千差萬(wàn)別的，本發(fā)明所述的高效，不是簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)化效率數(shù)值的高低，而是相對(duì)于 特定菌株和特定DNA類型(相應(yīng)地有特定的細(xì)胞內(nèi)生物過(guò)程)的通常的轉(zhuǎn)化效率來(lái)說(shuō)的； 本發(fā)明所述的高效，對(duì)于那些本身效率很低、很難實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化而言，也可以理解為在快速優(yōu) 化的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化，即得到了目的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明所選用的用于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌外源基因轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒類型有1、可復(fù)制穿梭質(zhì)粒，包括l)p^21 (5930bp)，pZB21的圖譜見(jiàn)附圖1，pZB21的 構(gòu)建參見(jiàn)文獻(xiàn)(鄒少蘭，高衛(wèi)華，劉成等.運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌間穿梭載體的構(gòu) 建·南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，39(3) 23-28) ；2)pZB21-Plac-lacZ(6375bp), pZB21-Plac-lacZ的圖譜見(jiàn)附圖1，pZB21-Plac_lacZ的構(gòu)建參見(jiàn)文獻(xiàn)(張一婷，Zmobilis 中同源重組方法及誘導(dǎo)表達(dá)體系的研究，天津大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007. 6)；等等；2、可復(fù)制寬宿主質(zhì)粒，包括l)pBBRlMCS(5144bp)，其圖譜見(jiàn)附圖1(文獻(xiàn)來(lái)源 Kovach, ME. , Phillips, Rff. , Elzer, PH. , et al. pBBRlMCS :a broad-host-range cloning vector,BioTechniques,1994,16(5) :800-802 ；Kovach ME,Elzer PH,Hi 11 DS,et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995 ； 166 :175-176.可求得)；2) pBBRlMCS-Pgap-FLP(6880bp)，其構(gòu)建見(jiàn)圖2 ；所涉及的引物Pl到P4見(jiàn)表1。表1、構(gòu)建用引物
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征是包括下述步驟將待轉(zhuǎn)化 DNA通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞中或用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液 與待轉(zhuǎn)化DNA共同孵育，通過(guò)電穿孔將孵育后的DNA轉(zhuǎn)化到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞 中；所述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞是將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌培養(yǎng)至OD6tltlnm = 0. 375 0. 420 的菌液濃縮100倍而制成；電穿孔操作的參數(shù)為2mm電擊杯中感受態(tài)細(xì)胞體積為80 μ 1 160 μ 1 ；電場(chǎng)強(qiáng)度為11. 0 14. OkV/cm ；復(fù)蘇時(shí)間為3h 24h。
2.如權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征是所述運(yùn) 動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液是用下述方法制成培養(yǎng)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌至0D_ = 0. 6 1. 0 的培養(yǎng)液，在8000 12000rpm、4°C、3 6min離心收集菌體，用等體積的冰浴預(yù)冷的提取 物緩沖液HND洗滌，用培養(yǎng)液體積的1/20到1/10體積的冰浴預(yù)冷的提取物緩沖液HND重 懸，冰上超聲破壁，14000 18000rpm、4°C、8 ianin離心，收集上清液，所述提取物緩沖液 HND 為pH = 7. 0 的 200mM HEPES,20mM Na2EDTA, 5mM DTT。
3.如權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所 述用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液與待轉(zhuǎn)化DNA共同孵育為選100 μ 1反應(yīng)體系，包括 IOOmMHEPES, pH = 7. 0，IOmM Na2EDTA, 2. 5mM DTT, 5mM MgCl2,1 μ M SAM, 2 10 μ g 待轉(zhuǎn)化 DNA, 50 μ 1運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液，在37°C、反應(yīng)2 3小時(shí)，純化，無(wú)菌水溶解。
4 如權(quán)利要求1、2或3的一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所 述運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌為 ZM4、CP4、ATCC10988 或 ZM4(ldh: :FRT-cml_FRT)。
5.如權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)動(dòng)單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所述2mm 電擊杯中感受態(tài)細(xì)胞體積為120 μ 1。
6.如權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)動(dòng)單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，其特征在于所述電場(chǎng) 強(qiáng)度為 11. 75 13. 25kV/cm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的電穿孔遺傳操作方法，包括下述步驟將待轉(zhuǎn)化DNA通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞中或用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌無(wú)細(xì)胞提取液與待轉(zhuǎn)化DNA共同孵育，通過(guò)電穿孔將孵育后的DNA轉(zhuǎn)化到運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的感受態(tài)細(xì)胞中；本發(fā)明利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液處理待轉(zhuǎn)化DNA，使其獲得修飾，提高轉(zhuǎn)化效率；利用本發(fā)明的方法優(yōu)化了的關(guān)鍵電穿孔物理參數(shù)對(duì)不同的宿主和DNA進(jìn)行電穿孔，提高了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌電穿孔遺傳操作的轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性，適應(yīng)了所有通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)行的、不同構(gòu)建目的的遺傳操作，從而又具有通用性。
文檔編號(hào)C12N15/74GK102080097SQ201010241809
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者井欣, 張敏華, 張?chǎng)H, 洪解放, 鄒少蘭, 馬媛媛 申請(qǐng)人:天津大學(xué)