專利名稱：抑制tace或雙調(diào)蛋白調(diào)節(jié)egf受體信號(hào)反式激活的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在細(xì)胞或生物體內(nèi)抑制金屬蛋白酶TACE/ADAM17的活性和/或受體酪氨酸激酶配體雙調(diào)蛋白的活性，調(diào)節(jié)G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對受體酪氨酸激酶的反式激活。
G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和EGFR信號(hào)系統(tǒng)間的交流涉及細(xì)胞表面生長因子前體proHB-EGF的蛋白水解(1-3)。不過在人類癌癥細(xì)胞中EGFR信號(hào)反式激活的分子機(jī)制基本上還不清楚。
G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和EGFR間的受體間交流發(fā)生在不同的細(xì)胞類型中，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞(4)。用GPCR激動(dòng)劑處理細(xì)胞導(dǎo)致EGFR的激活和酪氨酸磷酸化，隨后導(dǎo)致產(chǎn)生EGFR特征的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)(5)。由于在GPCR刺激后，EGFR反式激活信號(hào)的快速動(dòng)力學(xué)和檢測不到EGFR配體釋放，因此推測EGFR反式激活的機(jī)制僅僅依賴于細(xì)胞內(nèi)因子(5，6)。相反，一個(gè)新型的EGFR反式激活的機(jī)制性概念涉及位于GPCR激活細(xì)胞的細(xì)胞表面的肝素結(jié)合EGF樣生長因子(HB-EGF)的蛋白水解釋放(1)。HB-EGF以及轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)和雙調(diào)蛋白(AR)屬于EGF樣配體家族，直接激活EGFR。這些分子以跨膜前體的形式合成，經(jīng)過蛋白水解切割產(chǎn)生可溶的并且可擴(kuò)散的生長因子(7)。依賴HB-EGF的EGFR信號(hào)反式激活機(jī)制已經(jīng)在血管平滑肌細(xì)胞(8)、心臟內(nèi)皮細(xì)胞(9)和心肌細(xì)胞(10)的GPCR有絲分裂信號(hào)研究中獲得了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持。重要的是，最近的數(shù)據(jù)表明了在囊性纖維化(3)、心臟病(2)和胃腸增生(11)的病理過程病因?qū)W中的EGFR信號(hào)反式激活通路。而且，不斷增加的證據(jù)證明GPCR信號(hào)的異常和人癌癥的發(fā)展和惡化直接相關(guān)(12)。我們最近證明GPCR-EGFR的串?dāng)_(cross-talk)通路廣泛存在于頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)細(xì)胞中，而且，GPCR激動(dòng)劑如LPA和卡巴膽堿通過GEFR的反式激活調(diào)節(jié)HNSCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移行為(13)。EGFR信號(hào)反式激活分子機(jī)制的闡明可能導(dǎo)致產(chǎn)生新的癌癥預(yù)防和治療方案，例如鱗狀細(xì)胞癌。
這里，我們證明用GPCR的激動(dòng)劑溶血磷脂酸(LPA)或卡巴膽堿刺激鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，特異導(dǎo)致EGFR配體雙調(diào)蛋白(AR)的金屬蛋白酶依賴型切割和釋放。而且，小的干擾RNA(siRNA)沉默AR基因或用中和抗體抑制AR的生物學(xué)活性均能防止GPCR-誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸磷酸化、下游有絲分裂信號(hào)事件、Akt/PKB的活化、細(xì)胞的增殖和遷移。而且，我們的證據(jù)表明在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中通過表達(dá)顯性失活的突變體或通過RNA干擾阻斷金屬蛋白酶-解聚素(disintegrin)TACE/ADAM17能夠抑制GPCR刺激的AR釋放和EGFR依賴的細(xì)胞反應(yīng)。所以，TACE和/或AR發(fā)揮GPCR介導(dǎo)的信號(hào)效應(yīng)子功能，并且是細(xì)胞受體串?dāng)_網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子。
首先，本發(fā)明涉及包括抑制金屬蛋白酶TACE/ADAM17的活性和/或受體酪氨酸激酶配體雙調(diào)蛋白的活性，通過在細(xì)胞中G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)酪氨酸激酶受體的反式激活的方法。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抑制”優(yōu)選“特異性地”抑制，其中，TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的活性被選擇性地抑制，即其它金屬蛋白酶如ADAM12，或其它受體酪氨酸激酶配體如HB-EGF的活性，都沒有被顯著性地抑制。通過選擇性地抑制TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白，可以實(shí)現(xiàn)高度特異地破壞受體酪氨酸激酶反式激活，這對降低藥物應(yīng)用時(shí)出現(xiàn)的不期望的副作用很重要。
而且，術(shù)語“抑制”優(yōu)選“直接”抑制，其中，抑制劑直接地和TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白或編碼上述物質(zhì)的核酸分子結(jié)合。不過，本發(fā)明，還包括“間接地”抑制，其中抑制劑不直接和TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白結(jié)合，而是和它們的前體或代謝物結(jié)合，特別是和雙調(diào)蛋白的前體前雙調(diào)蛋白結(jié)合。
術(shù)語“活性”優(yōu)選TACE/ADAM17切割前雙調(diào)蛋白和/或激活受體酪氨酸激酶，例如雙調(diào)蛋白激活EGFR。本發(fā)明的TACE/ADAM17抑制劑優(yōu)選能抑制受體酪氨酸激酶配體雙調(diào)蛋白的切割和釋放。本發(fā)明的雙調(diào)蛋白抑制劑優(yōu)選能抑制雙調(diào)蛋白的生物學(xué)活性、特別是EGFR酪氨酸磷酸化、下游有絲分裂信號(hào)事件、Akt/PKB的活化，細(xì)胞增殖和/或遷移。
本發(fā)明的另一方面是金屬蛋白酶TACE/ADAM17的抑制劑和/或受體酪氨酸激酶配體雙調(diào)蛋白的抑制劑預(yù)防和/或治療疾病的用途，該疾病是通過G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體酪氨酸激酶的反式激活引起的或與之相關(guān)。這種類型疾病的存在可通過測定G蛋白和/或GPCR的表達(dá)，例如在mRNA水平(cDNA陣列分析、SAGE、Northern印跡等)和/或在蛋白水平(Western印跡分析、免疫熒光顯微術(shù)、原位雜交技術(shù)等)來確定。這種類型疾病的存在也可通過檢測編碼G蛋白或GPCRs的基因組和/或mRNA分子中的激活突變的存在和/或病毒編碼的GPCRs的存在來確定。而且，可以確定血清中和/或疾病感染的組織中GPCR激動(dòng)劑如LPA和/或雙調(diào)蛋白的水平提高。需要指出的是這種類型的疾病不必與提高的受體酪氨酸激酶表達(dá)相關(guān)。
例如該疾病可以是如癌癥的過度增殖性疾病，例如鱗狀細(xì)胞癌，或是其它疾病，如過度增殖性皮膚病，例如銀屑病。
TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的活性可以在核酸水平受到抑制，如在基因水平或在轉(zhuǎn)錄水平。在基因水平的抑制可使部分或全部基因失活，即通過基因斷裂(disruption)。另外，可以在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行抑制，如應(yīng)用直接針對TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的mRNA的反義分子，如DNA分子、RNA分子或核酸類似物，核酶，如RNA分子或核酸類似物或能夠RNA干擾(RNAi)的小RNA分子，如RNA分子或核酸類似物。例如在美國專利6,180,403號(hào)專利中描述了用反義分子抑制TACE/ADAM17的表達(dá)，在這里引入作為參考。
而且，可以在蛋白質(zhì)水平抑制TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的活性，如應(yīng)用能夠引起TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白活性特異性地抑制的化合物。在蛋白質(zhì)水平的抑制包括例如采用抗TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的抗體或抗體片段。該抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體或重組抗體，如單鏈抗體或含有至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的此類抗體的片段，例如蛋白水解抗體片段Fab、Fab’或F(ab’)2片段或重組抗體片段，如scFv片段。為了治療目的，特別是用于人的治療時(shí)，特別優(yōu)選應(yīng)用嵌和抗體、人源化抗體或人抗體。
抗體或抗體片段可針對TACE/ADAM17的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域或是針對該分子的其它部分。抗體或抗體片段可如免疫沉淀所示選擇性地識(shí)別TACE/ADAM17的成熟形式，或TACE/ADAM17原形式(pro-form)?；蛟摽贵w或抗體片段可既識(shí)別成熟形式又識(shí)別原形式的TACE/ADAM17。
可以用已知的技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體，如Khler等人(Nature256(1975)，495-497)、Cole等人(Mol.Cell.Bill.62(1984)，109-120)或Kozbor等人(J.Immunol.Meth.81(1985)，31-42)所介紹的雜交瘤技術(shù)，上述文獻(xiàn)在此引入作為參考?？梢杂肕orrison等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)，6851-6855)、Neuberger等人(Nature 312(1984)，604-608)、Takeda等人(Nature 314(1985)，452-454)、Jones等人(Nature 321(1986)，522-525)、Riechmann等人(Naure 322(1988)，323-327)、Verhoeyen等人(Science 239(1988)，1534-1536)或Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，10029-10033)所述的技術(shù)制造嵌和抗體或人源化抗體，上述文獻(xiàn)在此引入作為參考。而且，Burton(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)，11120-11123)、Orlandi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，3833-3837)、Winter等人(Nature 349(1991)，293-299)或Huse等人(Science 254(1989)，1275-1281)描述了制造抗體或抗體片段的方法，上述文獻(xiàn)在此引入作為參考。
而且，可以使用TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的低分子量抑制劑。TACE/ADAM17抑制劑的實(shí)例為磺酸或磷酸衍生物，如磺胺類、磺胺異羥肟酸、磷酸酰胺異羥肟酸，如在WO 98/16503、WO 98/16506、WO 98/16514、WO 98/16520、Mac Pher son等人(J.Med.Chem.40，(1997)，2525)、Tamura等人(J.Med.Chem.41(1998)，690)、Levin等人(Bioorg.& Med.Chem.Lett.8(1998)，2657)、Pikul等人(J.Med.Chem.41(1998)，3568)、WO 97/18194、EP-A-0803505、WO 98/08853、WO 98/03166和EP-A-1279674所記述的抑制劑，上述文獻(xiàn)在此引入作為參考?？梢园凑障旅嬖斒龅暮Y選方法確認(rèn)更多的抑制劑。
用于治療目的時(shí)，以藥物組合物的形式給藥，該組合物中另外含有藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑和/或輔料。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中含有能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)的有效量的活性成分的組合物。治療有效劑量是指引起患者的癥狀改善或生存期延長的的化合物的量。這類化合物的毒性和治療效果可用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)性動(dòng)物中進(jìn)行測定，例如測定LD50(50％群體的致死劑量)和ED50(50％群體的治療有效劑量)。任何用于本發(fā)明方法的化合物的治療有效劑量可用細(xì)胞培養(yǎng)分析進(jìn)行初步評(píng)估。例如，可以配制在動(dòng)物模型中達(dá)到一定循環(huán)濃度范圍的劑量，其中包括在細(xì)胞培養(yǎng)中測定IC50(例如達(dá)到生長因子受體活性最大抑制效果一半時(shí)測試化合物的濃度)。這些信息可以用于更準(zhǔn)確地確定人體的有用劑量。毒性和治療效果的劑量比是治療指數(shù)，治療指數(shù)可以表示成LD50和ED50的比。優(yōu)選具有高治療指數(shù)的化合物。通過個(gè)人醫(yī)生視患者的情況而選擇確切的制劑、給藥途徑以及劑量(參見，如Fingl等人，1975，《治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)》，Ch.1，p.1)。
分別調(diào)節(jié)劑量和間隔時(shí)間以達(dá)到能有效維持受體調(diào)節(jié)效果的活性部分的血漿水平或最小有效濃度(MEC)。不同化合物的MEC不同，不過可以通過體外數(shù)據(jù)進(jìn)行估算，例如使用此處描述的方法測定達(dá)到50-90％受體抑制所必需的濃度。采用一定方案(regimen)進(jìn)行化合物給藥，該方案能在10-90％的時(shí)間內(nèi)維持血漿藥物水平高于MEC，該維持時(shí)間優(yōu)選在30-90％之間，最優(yōu)選在50-90％之間。達(dá)到MEC所需劑量取決于個(gè)體特性和給藥途徑。在局部給藥或選擇性吸收時(shí)，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關(guān)。
所給化合物的準(zhǔn)確劑量當(dāng)然取決于接受治療的個(gè)體，它取決于個(gè)體的體重、疾病的嚴(yán)重程度、給藥方式和醫(yī)生的處方建議。對于抗體或治療性活性核酸分子以及其它化合物，每日的劑量從0.001到100mg/kg，特別是每天從0.01到10mg/kg是合適的。
合適的給藥途徑例如包括口服、直腸給藥、肌內(nèi)給藥或胃腸道給藥；非腸道給藥，包括肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)注射、直接室內(nèi)注射、靜脈注射、腹膜內(nèi)注射、鼻內(nèi)注射或眼內(nèi)注射。
或可以采用局部給藥，而不是系統(tǒng)給藥方式，例如經(jīng)過注射化合物直接進(jìn)入到實(shí)體瘤，通常采用長效制劑(depot)或持續(xù)釋放劑型。
而且，可以采用靶向藥物遞送系統(tǒng)施用藥物，例如用腫瘤特異性抗體包被的脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體將靶向腫瘤并選擇性地被腫瘤吸收。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是一種方法，該方法用于確定通過G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體酪氨酸激酶反式激活的調(diào)節(jié)子，該方法包括檢測是否測試化合物能夠抑制TACE/ADAM17的活性和/或雙調(diào)蛋白的活性。該方法適合作為篩選方法，例如用于確定能調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的新型化合物或化合物種類的高通量篩選方法。而且，該方法適合于表征藥物效果和/或化合物的副作用的驗(yàn)證方法。該方法包括使用分離蛋白、細(xì)胞提取物、重組細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因非人的動(dòng)物。優(yōu)選重組細(xì)胞或非人的動(dòng)物和相應(yīng)的野生型細(xì)胞或動(dòng)物相比，表現(xiàn)出TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白表達(dá)的改變。
適當(dāng)?shù)氖荏w酪氨酸激酶的例子為EGFR和其它EGFR家族成員，如HER2、HER3或HER4、PDGFR、血管內(nèi)皮生長因子受體KDR/FIk-1、Trk受體、FGFR-1或IGF-1受體，還有其它類型的生長因子受體，如TNF受體1、TNF受體2、CD30和IL-6受體，其為G蛋白/GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶點(diǎn)。
而且，用下面的圖和實(shí)施例解釋本發(fā)明。


圖1.GPCR刺激EGFR涉及配體依賴性機(jī)制和伴隨從細(xì)胞表面釋放AR。a，EGFR信號(hào)反式激活需要金屬蛋白酶的活性和EGFR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。SCC-9細(xì)胞和marimastat(BB2516，10μM；20分鐘)、抗EGFR抗體ICR-3R(20μg/mL；60分鐘)或PTX(100ng/mL；18小時(shí))預(yù)孵育，并用LPA(10μM)、卡巴膽堿(Car，1mM)、EGF(7.5ng/mL)或pervanadate(PV，1mM)處理3分鐘。然后用抗EGFR抗體蛋白免疫沉淀(IP)細(xì)胞提取物后，用抗磷酸酪氨酸抗體免疫印記(IB)，并用抗EGFR抗體再次檢測。b，流式細(xì)胞分析EGF樣前體表達(dá)。收集SCC-9細(xì)胞對其表面HB-EGF、TGFa或AR染色，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。僅僅用FITC綴合的二抗標(biāo)記的細(xì)胞作為對照。c，LPA誘導(dǎo)的AR原(pro AR)的蛋白水解過程。SCC-9細(xì)胞和batimastat(BB94，10μM)或PTX預(yù)孵育，用LPA或TPA(1μM)對該細(xì)胞刺激5分鐘。收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面AR密度。d，GPCR誘導(dǎo)的AR的蛋白水解釋放。SCC-9細(xì)胞和batimastat或載體預(yù)孵育，然后用所示激動(dòng)劑刺激120分鐘。收集條件培養(yǎng)基(conditioned medium)并用ELISA分析總的AR數(shù)量。每個(gè)柱型條帶表示3個(gè)值的平均值(平均值±s.d.)，*，指激動(dòng)劑和BB94+激動(dòng)劑組間差異P＜0.03。
圖2.GPCR刺激需要AR觸發(fā)EGFR依賴的信號(hào)和生物學(xué)反應(yīng)。a，用RNA干擾(RNAi)阻滯EGF樣生長因子前體表達(dá)。用針對AR原(proAR)、HB-EGF原(proHB-EGF)或TGFα原(proTGFα)的siRNA轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞，培養(yǎng)2天，用所示RT-PCR分析基因表達(dá)或b，用LPA或卡巴膽堿刺激并且測定EGFR酪氨酸磷酸化含量。c，LPA誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移對AR的需要。分析SiRNA轉(zhuǎn)染的SCC-9細(xì)胞朝向趨化劑纖連蛋白的跨室(transwell)遷移。每個(gè)柱型條帶是表示3個(gè)值的平均值(平均值±s.d)，*，指對照s iRNA+LPA和proAR siRNA+LPA的組間差異P＜0.001。d，抗AR中和抗體和肝素對GPCR誘導(dǎo)的EGFR以及SHC酪氨酸磷酸化的作用。用抗AR抗體(aAR Ab，50μg/mL，60分鐘)或肝素(100ng/mL，15分鐘)預(yù)處理SCC-9細(xì)胞，然后如圖所示刺激3分鐘(EGFR)或5分鐘(SHC)。用抗磷酸化酪氨酸抗體免疫印記檢測沉淀的EGFR和SHC，然后用抗EGFR和抗SHC抗體分別重探測同一張膜。e，在體外Grb2和SHC的結(jié)合。如圖所示，SCC-9細(xì)胞和抑制劑預(yù)孵育，然后刺激5分鐘。用GST-Grb-2融合蛋白或單獨(dú)的GST和裂解物共同孵育。用單克隆抗SHC抗體對蛋白進(jìn)行免疫印記。f，AR是GPCR誘導(dǎo)的ERK/MAPK激活和Akt/PKB磷酸化所必需的。SCC-9或SCC-15細(xì)胞和抑制劑預(yù)孵育并刺激7分鐘。用抗磷酸化的ERK抗體免疫印記分析總裂解物，檢測磷酸化的ERK1/2。用抗ERK抗體重探測同一張膜。由3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)對ERK磷酸化進(jìn)行了定量分析(平均值±s.d.)。*，指LPA和抑制劑+LPA的差異P＜0.05。刺激Akt/PKB。用抗磷酸化的Akt/PKB抗體免疫印記細(xì)胞裂解物，然后用抗Akt/PKB抗體重探測同一張膜。g，AR抑制LPA誘導(dǎo)的DNA合成的作用。如圖所示用抑制劑處理SCC-15細(xì)胞，然后在有配體(LPA；AR，10ng/ml)和無配體的情況下孵育18小時(shí)。然后用3H-胸苷脈沖標(biāo)記細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)儀測定胸苷摻入。由3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了定量分析(平均值±s.d.)。*，指LPA和抑制劑+LPA的差異P＜0.001。
圖3.顯性失活的TACE抑制GPCR誘導(dǎo)的AR釋放和EGFR信號(hào)反式激活。a，在HNSCC細(xì)胞系中表達(dá)TACE。用單克隆TACE/ADAM17抗體由裂解物免疫沉淀TACE。用人TACE cDNA轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞作為陽性對照。b，是Timp-3而不是Timp-1抑制EGFR信號(hào)的反式激活。用編碼人Timp-1或Timp-3的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞。用所示激動(dòng)劑(左圖)刺激后用免疫印記檢測EGFR的激活。用抗VSV抗體對全細(xì)胞裂解物的免疫印記確定帶有C-末端VSV-tag的Timp-1/3的表達(dá)(右圖)。c，在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移后，SCC-9細(xì)胞中野生型、顯性失活的TACE或HA-標(biāo)簽標(biāo)記的ADAM12的表達(dá)。如所示進(jìn)行總裂解物的免疫印跡。d，分別用流式細(xì)胞術(shù)和AR ELISA測定顯性失活的TACE中止了LPA誘導(dǎo)的proAR切割(左圖)和AR釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基中(右圖)。e，顯性失活的TACE對GPCR刺激的EGFR信號(hào)反式激活的作用。
圖4.TACE siRNA抑制EGFR信號(hào)傳遞和通過GPCR激動(dòng)劑的細(xì)胞遷移。a，TACE siRNA阻斷內(nèi)源性TACE表達(dá)。用TACE或ADAM12 siRNA轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞。用RT-PCR(左圖)或用多克隆抗TACE抗體免疫印記(右圖)分析基因表達(dá)。b，TACE敲除導(dǎo)致在細(xì)胞表面上proAR的積累。用FACS分析在siRNA轉(zhuǎn)染的SCC-9細(xì)胞中AR的細(xì)胞表面含量。c，當(dāng)GPCR激活時(shí)，EGFR信號(hào)傳遞需要TACE。如圖所示用siRNA轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞并用激動(dòng)劑進(jìn)行刺激。按照上述方法測定EGFR、SHC、ERK和Akt的激活。d，鱗狀細(xì)胞癌響應(yīng)LPA的運(yùn)動(dòng)性取決于TACE。用LPA或AR處理siRNA轉(zhuǎn)染的SCC-9細(xì)胞并且進(jìn)行跨室遷移測定分析。
圖5.用抗金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體免疫沉淀成熟的TACE蛋白。使瞬時(shí)表達(dá)TACE-血凝素(HA)的HEK-293細(xì)胞血清饑餓(serum-starved)24小時(shí)，并且用含有5μM金屬蛋白酶抑制劑BB94的TritonX-100裂解緩沖液裂解細(xì)胞。用200μg粗裂解物和5μg對照IgG(單克隆抗HA抗體)或5μg單克隆抗TACE抗體免疫沉淀。然后SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用多克隆TACE抗體(CHEMICON#19027)免疫印記分析免疫沉淀的TACE蛋白。
圖6.內(nèi)源性TACE蛋白的免疫沉淀。使SCC-9細(xì)胞血清饑餓24小時(shí)，用含有5μM金屬蛋白酶抑制劑BB94的TritonX-100裂解緩沖液裂解細(xì)胞。用200μg粗裂解物和5μg對照IgG(單克隆抗HA抗體)或5μg單克隆抗TACE抗體免疫沉淀。然后SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用多克隆TACE抗體(CHEMICON#19027)免疫印記分析免疫沉淀的TACE蛋白。
圖7.TACE結(jié)合單克隆抗體的流式細(xì)胞分析。接種SCC9細(xì)胞，生長24小時(shí)。收集后，用抗TACE的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的單克隆TACE抗體細(xì)胞染色45分鐘。用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌后，將細(xì)胞和藻紅蛋白(PE)綴合的二抗孵育45分鐘，并用PBS再次洗滌。用BectonDickinson FACScalibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。
圖8.EGFR信號(hào)反式激活需要TACE活性。血清饑餓的SCC9細(xì)胞和5μg對照IgG(單克隆抗HA抗體)或所示的5μg單克隆抗TACE抗體預(yù)孵育30分鐘，然后用LPA(10μM)處理3分鐘。裂解之后，用抗EGFR抗體免疫沉淀(IP)EGFR。通過免疫印記(IB)用抗磷酸酪氨酸(αPY)抗體檢測酪氨酸磷酸化的EGFR，然后用抗EGFR抗體重探測同一張膜。
圖9.EGFR信號(hào)反式激活需要TACE活性。血清饑餓的SCC9細(xì)胞和5μg對照IgG(單克隆抗HA抗體)或所示的5μg單克隆抗TACE抗體預(yù)孵育30分鐘，然后用LPA(10μM)處理3分鐘。裂解之后，用抗EGFR抗體免疫沉淀(IP)EGFR。通過免疫印記(IB)用抗磷酸酪氨酸(αPY)抗體檢測酪氨酸磷酸化的EGFR，然后用抗EGFR抗體重探測同一張膜。
實(shí)施例1在鱗狀癌細(xì)胞中EGFR信號(hào)的反式激活需要通過TACE切割雙調(diào)蛋白原1.方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染所有細(xì)胞系(American Type Culture Collection，Manassas，VA)均按照供應(yīng)商的建議進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。如前所述(1)，用磷酸鈣共沉淀法進(jìn)行HEK-293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染?？闺p調(diào)蛋白(AR)、抗HB-EGF中和抗體(R & D Systems，Minneapolis，MN)、PTX、肝素(Sigma，St.Louis，MO)、marimastat(BB2516，Sugen公司，South SanFrancisco，CA)、batimastat(BB94，British Biotech，Oxford，UK)在添加各自的生長因子之前將上述各物質(zhì)添加到血清饑餓的細(xì)胞中。
用PCR從人胎盤cDNA文庫中擴(kuò)增編碼ADAM10、12、15和17的全長cDNA，并且亞克隆到pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA)和pLXSN載體(Clontech，Palo Aito，CA)中。如前所述(2，26)制造用于病毒生產(chǎn)缺少pro-和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的顯性失活蛋白酶構(gòu)建體。所有的蛋白酶構(gòu)建體包含C末端血凝素(HA)標(biāo)簽，可以用抗HA單克隆抗體(Babco，Richmond，CA)檢測。如前所述(29)，用pLXSN逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)質(zhì)粒通過磷酸鈣/氯化鈣法轉(zhuǎn)染雙嗜性包裝細(xì)胞系Phoenix。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集病毒懸浮物并且用于轉(zhuǎn)染亞融合SCC-9細(xì)胞(5×104細(xì)胞/6孔板)。
1.2蛋白質(zhì)分析裂解細(xì)胞并且如(13)所述進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫沉淀。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行Western印跡?？谷薊GFR(108.1)和SHC(1)抗體和GST-Grb2融合蛋白(5)已經(jīng)在前面進(jìn)行了表征。用4G10單克隆抗體(UBI，LakePlacid，NY)檢測磷酸酪氨酸。多克隆抗磷p44/p42(Thr202/Tyr204)MAPK抗體和抗磷Akt(Ser473)抗體購自NewEngland Biolabs(Beverly，MA)。多克隆抗Akt1/2和抗ERK2抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)，抗TACE抗體購自Chemicon(Harrow，UK)。
1.3流式細(xì)胞分析和ELISA如以前(1)所述，進(jìn)行ACS分析。用抗HB-EGF、AR(R & D Systems)或TGFα(Oncogene，Boston，MA)胞外域特異抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，PBS洗滌后，細(xì)胞和FITC綴合的二抗孵育并且用Becton DickinsonFACScalibur流式細(xì)胞儀分析。
用單克隆抗AR捕捉抗體和生物素化的多克隆檢測抗體以夾心ELISA(R&D Systems)法檢測游離AR的濃度。用稀釋在培養(yǎng)基中的重組人AR作為標(biāo)準(zhǔn)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Studen’s t檢驗(yàn)比較兩組間的數(shù)據(jù)。數(shù)值用平均值±s.d.表示，每個(gè)值至少一式三份樣品。P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.4RNA干擾和RT-PCR分析用Oligofectamine(Invitrogen)將21個(gè)核苷酸的siRNA雙鏈(Dharmacon Research，Lafayette，CO，USA)靶向內(nèi)源性基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并且如前所述(30)，每6孔板加入4.2μg siRNA。轉(zhuǎn)染的SCC-9細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后血清饑餓4天并進(jìn)行分析。用靶向目的基因的不同區(qū)域的siRNA雙鏈混合物取得了沉默靶基因的最高效果。所用的siRNA序列如下CCACAAAUACCUGGCUATAdTdT(SEQ ID NO1)，AAAUCGAUGUAAUGCAGAAdTdT(SEQ ID NO2)(AR)；GUGAAGUUGGGCAUGACUAdTdT(SEQ ID NO3)，UACAAGGACUUCUGCAUCCdTdT(SEQ ID NO4)(HB-EGF)；AACACUGUGAGUGGUGCCGdTdT(SEQ ID NO5)，
GAAGCAGGCCAUCACCGCCdTdT(SEQ ID NO6)(TGFa)；AAAGUUUGCUUGGCACACCUUdTdT(SEQ ID NO7)，AAAGUAAGGCCCAGGAGUGUUdTdT(SEQ ID NO8)，AACAUAGAGCCACUUUGGAGAdTdT(SEQ ID NO9)(TACE)；CCUCGCUGCAAAGAAUGUGdTdT(SEQ ID NO10)(ADAM12)，GACCUUGATACGACUGCUGdTdT(SEQ ID NO11)(ADAM12)；CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO12)(對照，GL2)。
用Western印跡(TACE)和RT-PCR分析驗(yàn)證靶向基因的特異性沉默。用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Roche，Mannheim，德國)反轉(zhuǎn)錄用RNeasy小型試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)分離的RNA。用PuReTaqReady-To-Go PCR Beads(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。定制的引物(Sigma Ark，Steinheim，德國)為proAR5’-tggtgctgtcgctcttgata-3’(SEQ ID NO13)和5′-GCCAGGTATTTGTGGTTCGT-3′(SEQ ID NO14)；proHB-EGF，5′-TTATCCTCCAAGCCACAAGC-3′(SEQ ID NO15)和5′-TGACCAGCAGACAGACAGATG-3′(SEQ ID NO16)；proTGFa，5′-TGTTCGCTCTGGGTATTGTG-3′(SEQ ID NO17)和5′-ACTGTTTCTGAGTGGCAGCA-3′(SEQ ID NO18)；TACE，5′-CGCATTCTCAAGTCTCCACA-3′(SEQ ID NO19)和5′-TATTTCCCTCCCTGGTCCTC-3′(SEQ ID NO20)；ADAM12，5′-CAGTTT CAC GGA AAC CCA CT-3′(SEQ ID NO21)和5′-GAC CAG AAC ACG TGC TGA GA-3′(SEQ ID NO22)。PCR產(chǎn)物在2.5％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用溴乙錠染色顯示DNA。用100-bp ladder(GIBCO，Gaathersburg，Maryland)在紫外燈下對該產(chǎn)物的位置和它們的大小進(jìn)行確定。
1.5增殖和遷移分析為了進(jìn)行3H-胸苷摻入分析(5)，將SCC-15細(xì)胞以3×104細(xì)胞/孔接種到12孔板上。不加血清培養(yǎng)48小時(shí)，如所示將細(xì)胞進(jìn)行預(yù)孵育和刺激。18小時(shí)后，用3H-胸苷(1μCi/ml)脈沖標(biāo)記細(xì)胞4小時(shí)，用三氯醋酸沉淀和隨后的液閃計(jì)數(shù)器測定胸苷的摻入。
采用改良的Boyden室按照以前方法(13)對細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性進(jìn)行分析。將siRNAs轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的SCC-9細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔接種到有或沒有激動(dòng)劑的24 transwell平皿的多聚碳酸酯膜插件(insert)(6.5mm直徑，8μm孔徑)上。下室充滿無FCS的含有10μg/ml纖連蛋白化學(xué)引誘物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。讓細(xì)胞遷移36小時(shí)。在孵育后，從該膜的上表面去除未遷移的細(xì)胞。用結(jié)晶紫固定并且染色遷移到下表面的細(xì)胞。將染色細(xì)胞在10％的醋酸中溶解，用微板讀數(shù)器檢測570nm的吸光度。
2.結(jié)果在HNSCC細(xì)胞中GPCR誘導(dǎo)的反式激活信號(hào)對廣譜的金屬蛋白酶抑制劑如batimastat(BB94)(13)和marimastat(BB2516，圖1A)是敏感的。和EGFR信號(hào)反式激活的配位依賴機(jī)制相一致的，我們發(fā)現(xiàn)單克隆抗EGFR抗體ICR-3R能防止EGF樣生長因子結(jié)合到該受體(14)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上，終止了在SCC-9細(xì)胞中GPCR和EGF誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸磷酸化(圖1A)。相反，ICR-3R不能干擾高效酪氨酸磷酸化酶抑制劑(15)pervanadate所引發(fā)的反應(yīng)，該抑制劑能增加很多胞內(nèi)蛋白的酪氨酸磷酸化量。以前的報(bào)告顯示GPCR誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸磷酸化需要HB-EGF的蛋白水解切割(1-3)，這促使我們提出是否在頭頸癌細(xì)胞中，HB-EGF或其它EGF樣生長因子參與EGFR反式激活通路的問題。通過cDNA微陣列分析，我們發(fā)現(xiàn)HB-EGF、TGFα和AR mRANs在SCC-4、SCC-9、SCC-15和SCC-25細(xì)胞中都有表達(dá)(沒有顯示數(shù)據(jù))。而且，以胞外域特異性抗體通過流式細(xì)胞術(shù)確定這些配體的表達(dá)和細(xì)胞表明定位(圖1B，展示了SCC-9的代表性數(shù)據(jù))。令人驚訝的是，用LPA(10μM)或佛波醇酯TPA(1mM)處理頭頸癌細(xì)胞，其發(fā)揮常規(guī)的脫落事件(shedding events)誘導(dǎo)劑的作用，減少了細(xì)胞表面外源性proAR的數(shù)量(圖1C)。不過，在細(xì)胞內(nèi)，LPA不能誘導(dǎo)proTGFα或proHB-EGF的蛋白水解切割，而用TPA刺激造成這兩種EGF樣生長因子的胞外域切割(未出示數(shù)據(jù))。這些發(fā)現(xiàn)證明LPA刺激選擇性誘導(dǎo)HNSCC中的proAR脫落。另外，batimastat(10μM)完全地終止了LPA誘導(dǎo)的proAR的胞外域切割(圖1C)，這證實(shí)proAR的脫落需要金屬蛋白酶的活性。與該觀察結(jié)果相同，主要的百日咳毒素(PTX)敏感的Gi/o家族G蛋白是LPA誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸磷酸化的介質(zhì)(圖1A)，PTX(100ng/mL)能夠部分抑制SCC-9細(xì)胞表面的proAR脫落(圖1C)。
除了細(xì)胞表面proAR減少之外，通過夾心ELISA測定發(fā)現(xiàn)，GPCR刺激造成在細(xì)胞培養(yǎng)基中成熟AR的積累(圖1D)。發(fā)現(xiàn)響應(yīng)卡巴膽堿的AR釋放和LPA刺激時(shí)相比相當(dāng)?shù)?，這表明在響應(yīng)GPCR配體的AR釋放的數(shù)量和EGFR酪氨酸磷酸化數(shù)量間存在直接關(guān)系(圖1A)。不過，用batimastat預(yù)孵育完全地防止了在細(xì)胞培養(yǎng)基中的GPCR和TPA誘導(dǎo)的AR的積累(圖1D)，證明了AR釋放的金屬蛋白酶依賴性。
我們用3個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測是否AR發(fā)揮功能需要GPCR誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸磷酸化和下游細(xì)胞反應(yīng)。首先，我們用小的干擾RNA(siRNA)沉默proAR、proHB-EGF和proTGFα在SCC-9細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)。用RT-PCR監(jiān)視靶基因表達(dá)的效率和特異性敲除(圖2A)，證實(shí)通過mRNA降解實(shí)現(xiàn)了基因沉默。同時(shí)檢測了siRNAs對EGFR反式激活信號(hào)的作用。如圖2B所示，對proAR的siRNA完全地阻斷了GPCR誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸磷酸化。不過，對proHB-EGF和proTGFα的siRNAs沒有顯著地改變反式激活信號(hào)，這表明對于proAR的特異性需要。另外，我們對proAR敲除是否影響GPCR誘導(dǎo)的頭頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)行了檢測。事實(shí)上，proAR siRNA在體外顯著抑制了LPA誘導(dǎo)的化學(xué)引誘性遷移(圖2C)。
第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，我們通過在鱗狀癌細(xì)胞系的SCC-4、SCC-9、SCC-15和SCC-25中檢測了AR中和抗體對通過LPA的EGFR酪氨酸磷酸化的效果。結(jié)果顯示用抗人AR胞外域的多克隆山羊抗體或單克隆小鼠抗體任一進(jìn)行預(yù)處理，能抑制EGFR反式激活信號(hào)(圖2D，顯示的是在SCC-9細(xì)胞中多克隆抗AR抗體的代表性數(shù)據(jù))。在用卡巴膽堿刺激頭頸癌細(xì)胞時(shí)得到了相似的結(jié)果(未出示數(shù)據(jù))。相反，用白喉毒素突變體CRM197或抗HB-EGF中和抗體對HB-EGF特異性地抑制，表現(xiàn)出對LPA或卡巴膽堿誘導(dǎo)的EGFR反式激活沒有影響(未出示數(shù)據(jù))。
第三個(gè)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)锳R含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而且葡糖胺聚糖肝素能防止角質(zhì)細(xì)胞(16)和MCF-10A(17)細(xì)胞內(nèi)AR激發(fā)的促有絲分裂反應(yīng)，我們評(píng)價(jià)了肝素對EGFR反式激活信號(hào)的作用。和預(yù)期一致，肝素(100ng/mL)完全地阻斷了LPA引起的EGFR酪氨酸磷酸化(圖2D)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，我們接著檢測了是否AR功能需要反式激活的EGFR的下游的SHC激活，因?yàn)橐阎B接物蛋白SHC的酪氨酸磷酸化和SHC-Grb2-Sos復(fù)合物的形成在連接激活的EGFR到Ras/MAPK級(jí)聯(lián)時(shí)是關(guān)鍵性的一步(18)。事實(shí)上，AR阻斷徹底防止了LPA誘導(dǎo)的SHC酪氨酸磷酸化(圖2D)和谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)Grb2融合蛋白的結(jié)合(圖2E)。
以前的多個(gè)實(shí)驗(yàn)表明EGFR反式激活是在GPCR激動(dòng)劑激活的ERK/MAPK通路中一個(gè)重要機(jī)制(4，12，19，20)。為了檢測是否在HNSCC細(xì)胞中LPA刺激的ERK/MAPK的活化需要AR，對AR抑制ERK1/2激活的作用進(jìn)行了研究。如圖2F所示，AR中和抗體、肝素和batimastat能在SCC-9和SCC-15細(xì)胞中阻止LPA誘導(dǎo)的ERK激活。除了促有絲分裂作用之外，LPA能夠作為存活因子(survival factor)激活ERK/MAPK途徑和Akt/PKB的磷酸肌醇3-激酶(PI3K)依賴性磷酸化(21，22)。因此我們進(jìn)一步提出了是否在頭頸癌細(xì)胞中LPA刺激能誘導(dǎo)Akt/PKB磷酸化的問題。結(jié)果表明LPA顯著地增加了Akt/PKB的Ser-473位的磷酸化(圖2F)。另外，通過LPA的Akt/PKB磷酸化對通過渥曼青霉素(wortmannin)或LY294002的PI3K抑制敏感(未出示數(shù)據(jù))，而且也能通過AR阻斷或batimastat處理去處這種作用(圖2F)。
為了進(jìn)一步擴(kuò)展我們對AR針對生長促進(jìn)性GPCR信號(hào)的功能研究，我們評(píng)價(jià)了AR抑制對LPA誘導(dǎo)的DNA合成的作用。如圖2G所示，當(dāng)用AR抑制時(shí)，HNSCC細(xì)胞表現(xiàn)出LPA觸發(fā)的DNA合成效率顯著降低，表明通過LPA的完全增殖性反應(yīng)需要AR。另外，batimastat和EGFR特異抑制劑酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)AG1478使通過LPA的DNA合成降低至基底水平以下?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明在HNSCC中的EGFR特征性的、促有絲分裂性以及轉(zhuǎn)移促進(jìn)性反式激活信號(hào)的產(chǎn)生需要AR。
最近的觀察結(jié)果表明在小鼠成纖維細(xì)胞中金屬蛋白酶解離素(disintegrin)TACE/ADAM17在proAR和其它EGF樣生長因子前體的組成性脫落中的作用(23，24)。另外，在體外，TACE的蛋白水解活性能被金屬蛋白酶-3(Timp-3)的而不是Timp-1的組織抑制劑所抑制(25)。因?yàn)門ACE在HNSCC細(xì)胞系中廣泛表達(dá)(圖3A)，所以我們研究了Timp-1和Timp-3對EGFR反式激活信號(hào)的作用。確實(shí)，在SCC-9細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的Timp-3而不是Timp-1的異位表達(dá)能抑制GPCR誘導(dǎo)的EGFR酪氨酸磷酸化(圖3B)。而且，缺少pro-和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的顯性失活TACE(26)(圖3C)的異位表達(dá)抑制了在SCC-9細(xì)胞中GPCR誘導(dǎo)的proAR切割、成熟AR的釋放(圖3D)以及EGFR信號(hào)反式激活(圖3E)。相反，ADAM10(3)和ADAM12(2)的顯性失活突變體均沒有表現(xiàn)出參與GPCR激發(fā)的proHB-EGF加工，類似的ADAM15突變體也沒有影響GPCR誘導(dǎo)的反應(yīng)(圖3E，ADAM12的代表性數(shù)據(jù))。
為了獨(dú)立驗(yàn)證在HNSCC中EGFR反式激活途徑對TACE的需要，我們用RNA干擾封閉了TACE的內(nèi)源性表達(dá)。用RT-PCR和Western印跡分析(圖4A)監(jiān)測TACE表達(dá)的抑制。有意思的是，siRNA對TACE的定向抑制造成在SCC-9細(xì)胞的細(xì)胞表面proAR積累(圖4B)，這一現(xiàn)象支持了TACE參與proAR的胞外域加工的觀點(diǎn)。另外，TACE siRNA特異性地抑制GPCR誘導(dǎo)的EGFR、SHC、ERK/MAPK和Akt/PKB的激活(圖4C)。最后，TACE siRNA還阻止SCC-9細(xì)胞響應(yīng)LPA產(chǎn)生的遷移(圖4D)。
3.討論越來越多實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持這一概念，即EGFR發(fā)揮多種GPCR信號(hào)的中心整合子(integrator)的作用，從而這些信號(hào)通往下游途徑(4、6、12)。此處的數(shù)據(jù)支持一個(gè)意外的在人癌細(xì)胞中的EGFR反式激活機(jī)制以及確認(rèn)了TACE在GPCR信號(hào)中的一個(gè)新型的生物學(xué)功能。我們的結(jié)果表明GPCR誘導(dǎo)的TACE激活具有生物學(xué)作用，能增加游離AR的數(shù)量。已經(jīng)描述了其它機(jī)制，在肺上皮細(xì)胞(3)和COS-7細(xì)胞(27)中的ADAM10或心肌細(xì)胞中的ADAM12(2)介導(dǎo)了EGFR的HB-EGF依賴性的反式激活。這是首次闡明跨膜proAR被切割是響應(yīng)GPCR刺激的結(jié)果，而且AR對介導(dǎo)特征在于GPCR激動(dòng)劑的特征癌細(xì)胞(hallmarkcancer cell)是功能相關(guān)的。我們闡明TACE依賴的AR釋放是GPCR誘導(dǎo)的EGFR刺激、ERK/MAPK途徑的激活、Akt/PKB的磷酸化、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移的必要條件。
TACE如何被異三聚體G蛋白所激活尚屬未知。盡管已經(jīng)表明ERK響應(yīng)TPA的刺激在735位蘇氨酸結(jié)合和磷酸化TACE的胞漿結(jié)構(gòu)域(28)，可是，在HNSCC細(xì)胞中GPCR誘導(dǎo)的AR釋放以及EGFR酪氨酸磷酸化對MEK抑制劑不敏感(未發(fā)表的觀察結(jié)果)，這表明ERK不參與EGFR的上游。未來研究的一個(gè)重要的問題將是確定GPCR信號(hào)的傳導(dǎo)是如何在一種細(xì)胞類型或生理學(xué)依賴性模式下被ADAM10/HB-EGF、ADAM12/HB-EGF或TACE/AR模型所介導(dǎo)。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在介導(dǎo)關(guān)鍵的癌細(xì)胞特性中的生理性重要的GPCR配體、TACE和AR的關(guān)聯(lián)性提供了令人矚目的證據(jù)。
實(shí)施例2，生產(chǎn)和表征抗TACE單克隆抗體2.1生產(chǎn)單克隆抗體產(chǎn)生抗TACE(ADAM17)的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體(Mabs)。用重組蛋白免疫BALB/c小鼠(J.H.Peters，H.Baumgarten和M.Schulze，Monoclonale Antikrper-Herstellung undCharakterisierung，Springer-Verlag，1985，Berlin HeidelbergNew York Tokio)，用購自Pierce，Rockford，IL，USA的T-GelTMAdsorbent進(jìn)行單克隆抗體的純化。
2.2功能分析用ELISA鑒定8個(gè)識(shí)別TACE金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。用上述抗體免疫沉淀HEK-293細(xì)胞的裂解物，所述細(xì)胞用編碼帶有血凝素表位標(biāo)簽(TACE-HA)的TACE(31)的真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。單克隆抗體432-2、400-1、343-3和432-7特異性地免疫沉淀了TACE的成熟形式。而α-HA抗體主要免疫沉淀原形式的TACE(圖5)。
而且，檢測了單克隆抗體免疫沉淀來自SCC-9細(xì)胞裂解物的內(nèi)源性TACE蛋白的能力。抗TACE金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體432-2、400-1、343-3和432-7特異地免疫沉淀TACE的成熟形式而不是原形式(pro-form)(圖6)。
對單克隆抗體檢測在活細(xì)胞的細(xì)胞表面的TACE的能力進(jìn)行了檢測?？贵w402-6和368-3無細(xì)胞表面染色能力，而367-3表現(xiàn)出弱的信號(hào)。相反，抗體343-3、374-5、400-1、432-2和432-7表現(xiàn)出很強(qiáng)的信號(hào)(圖7)。
最后，我們檢測了單克隆TACE抗體對LPA誘導(dǎo)的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCC-9中的EGFR酪氨酸磷酸化的作用。結(jié)果表明用374-5、432-2、400-1和367-3的預(yù)處理抑制了LPA誘導(dǎo)的EGFR信號(hào)反式激活(圖8)，而用單克隆TACE抗體進(jìn)行預(yù)處理不會(huì)對用EGF對EGFR的直接刺激產(chǎn)生影響(圖9)。
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序列表<110>MPG zur Frderung d.Wiss.e.V.
<120>抑制TACE或雙調(diào)蛋白調(diào)節(jié)EGF受體信號(hào)反式激活<130>29475PWO<140>
<141>
<150>EP 03 003 935.8<151>2003-02-21<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>misc_差異<222>(18)<223>T<220>
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<210>11<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)細(xì)胞中G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對受體酪氨酸激酶的反式激活的方法，包括抑制TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的細(xì)胞是人細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的細(xì)胞是鱗狀癌細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法，其中TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的活性在核酸水平受到抑制。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的抑制包括特異性的轉(zhuǎn)錄抑制。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的抑制包括應(yīng)用直接針對TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的反義分子、核酶或RNAi分子。
8.權(quán)利要求5的方法，其中的抑制包括基因失活。
9.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的方法，其中TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的活性在蛋白質(zhì)水平受到抑制。
10.權(quán)利要求9的方法，其中的抑制包括特異性的蛋白抑制。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中的抑制包括應(yīng)用直接針對TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的抗體或抗體片段。
12.權(quán)利要求9或10的方法，其中的抑制包括應(yīng)用TACE/ADAM17和/或雙調(diào)蛋白的低分子量抑制劑。
13.TACE/ADAM17的抑制劑和/或雙調(diào)蛋白的抑制劑在制備用于防止和/或治療疾病的藥物中的用途，所述的疾病是由G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致的受體酪氨酸激酶的反式激活引起的或與之相關(guān)。
14.權(quán)利要求13的用途，其中的疾病是過度增生性疾病。
15.權(quán)利要求14的用途，其中的疾病是癌癥。
16.權(quán)利要求15的用途，其中的疾病是鱗狀細(xì)胞癌。
17.權(quán)利要求13-16中任何一項(xiàng)的用途，其中的藥物另外包含藥物可接受的載體、稀釋劑和/或輔料。
18.預(yù)防和/或治療疾病的方法，該方法包括對有此需要的受試者給予有效量的TACE/ADAM17抑制劑和/或雙調(diào)蛋白抑制劑，所述疾病是由G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致的受體酪氨酸激酶反式激活引起的或與之相關(guān)。
19.一種方法，用來鑒定通過G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體酪氨酸激酶反式激活的調(diào)節(jié)劑，該方法包括測定測試化合物是否能夠抑制TACE/ADAM17的活性和/或雙調(diào)蛋白的活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細(xì)胞或生物體內(nèi)，抑制金屬蛋白酶TACE/ADAM17的活性和/或受體酪氨酸激酶配體雙調(diào)蛋白的活性，調(diào)節(jié)G蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對受體酪氨酸激酶的反式激活。
文檔編號(hào)C12N9/64GK1753690SQ200480004751
公開日2006年3月29日 申請日期2004年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月21日
發(fā)明者A·伍爾里馳, A·戈施溫德, S·哈特 申請人:馬普科技促進(jìn)協(xié)會(huì)