專利名稱：核酸外切酶保護dna探針雜交dna微陣列芯片檢測dna結合蛋白的制作方法
技術領域：
DNA結合蛋白(DNA-binding protein)是生物蛋白質組(proteomics)中一類能夠與DNA發(fā)生結合從而產生重要功能的蛋白質，這類蛋白質在基因表達調控(gene expression regulation)、DNA重組(DNA recombination)、DNA修復(DNA reparation)、DNA限制(DNA restriction)等細胞過程(cellular processes)中發(fā)揮重要作用。這類蛋白質中有一部分與DNA相互作用時，呈現DNA序列特異性結合功能，如與DNA發(fā)生DNA序列特異性結合的各類DNA結合蛋白、各種限制性內切酶等。由于這類蛋白質在細胞過程中發(fā)揮的重要作用作用，它們已經成為功能基因組(functional genomics)和蛋白質組(proteomics)研究的重要對象。因為這類蛋白質參與眾多基因的表達調節(jié)，因此與很多疾病存在密切的關系，成為診斷、治療和藥物研究的重要靶點(drug target)。DNA結合蛋白表達及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。本專利提出了一種檢測DNA結合蛋白表達和活化水平的新方法，該方法將為是分子生物學(molecular biology)、功能基因組學、蛋白質組學及生物醫(yī)學(Biomedicine)領域中的DNA結合蛋白相關研究提供一種新的檢測分析技術，可促進這些領域中DNA結合蛋白相關的科學研究，以及在生物醫(yī)學領域中提供一種疾病相關DNA結合蛋白的診斷技術、以及DNA結合蛋白為靶點的藥物篩選(drug screening)技術。
背景技術：
DNA結合蛋白是生物蛋白質組中一類重要的蛋白質，是功能基因組和蛋白質組研究的重要對象；許多疾病都與DNA結合蛋白的異常表達及活化存在密切的關系，成為疾病治療和藥物研究的重要靶點。DNA結合蛋白表達及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。因此，有關檢測分析DNA結合蛋白表達及活化程度技術的研究一直受到科學界的重視。
時至目前，科學家們已經建立多種基于DNA/蛋白質相互作用這一層次的DNA結合蛋白表達及活化程度的檢測分析技術。其中最經典的是電泳遷移率變動分析(Electrophoresis MobilityShift Assay)，即凝膠遷移實驗(gel shift assay)。該技術一般是人工合成含有DNA結合蛋白結合序列(consensus，binding sites)的雙鏈(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素標記寡核苷酸，將標記寡核苷酸與含有DNA結合蛋白的細胞或組織抽提物混合孵育一段時間后，進行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分離游離(free DNA)和與蛋白質結合的DNA(retarded DNA)，在通過X-光底片暴光顯現與蛋白質結合的DNA(retarded DNA)，來反映DNA結合蛋白表達及活化程度。這一技術目前仍非常有效地用于DNA結合蛋白檢測分析。但存在放射性標記對實驗人員及環(huán)境危害的缺陷。因此，對這一技術后來進行了非放射性標記的改進。即用地高辛(digoxigenin，DIG)標記寡核苷酸，進行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將電泳產物轉印(blotting)到尼龍膜(nylonmembrane)等介質上，依靠堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶耦聯的DIG抗體和相應酶的生色(colorimetric)或發(fā)光(chemiluminescent)底物(substrate)，進行化學生色或發(fā)光檢測，來反映DNA結合蛋白表達及活化程度。也有采用熒光(fluorescent)標記寡核苷酸進行電泳遷移率變動分析的改進技術。這些技術也能夠很好地用于DNA結合蛋白檢測分析。但這些技術仍然存在自身的缺點，即它們雖然避免了經典放射性標記探針凝膠遷移實驗的缺點，但同時帶來實驗流程的復雜化和更多的影響因素，如尼龍膜實驗的高背景、轉引設備需求及實驗成本提高等問題。同時，這些改進技術從根本上未擺脫種凝膠遷移實驗的技術思想，無法克服凝膠遷移實驗對實驗樣品數量需求大、實驗耗時長、分析效率低等缺陷。
鑒于這些技術目前仍然存在的缺點，建立從技術思想角度上完全不同于凝膠遷移實驗的DNA結合蛋白表達及活化檢測及分析技術是非常必要的。因此我們多年來一直從事DNA結合蛋白檢測新技術的研究，并且已經建立了多種雙鏈DNA微陣列芯片技術(中國專利ZL02112780.8、02137945.9、03152881.3、03132206.9)。在我們已經發(fā)明的專利技術中，對DNA結合蛋白的檢測是在芯片上直接制備雙鏈DNA，將DNA結合蛋白的結合位點嵌合固定在芯片上雙鏈DNA上，通過待檢蛋白溶液與雙鏈DNA芯片的反應，使蛋白質結合在芯片DNA上，進行DNA結合蛋白的檢測。這種方法在檢測中需要用熒光素標記蛋白質，或準備蛋白質的抗體并用熒光素進行標記才能實現芯片檢測，這不僅要求標記蛋白、制備抗體等實驗，而且標記對蛋白可能造成DNA結合功能的影響。這種方法在檢測一種蛋白質與芯片上眾多的DNA間的相互作用時，非常有效；但在檢測多種蛋白時，面臨一定的困難。特別重要的是，在實踐中需要檢測的對象常常是組織(tissue)、細胞(cell)等的核抽提物(nuclearextract)，要對這樣的復雜混合物進行熒光標記是很困難的，特別是對那些低豐度的DNA結合蛋白，要在核抽提物中標記它們是非常困難的。另外如果采用抗體，則需要制備所需要檢測的所有蛋白質的抗體，并用熒光標記它們，才能用于高通量檢測多種DNA結合蛋白，這一途徑顯然更加困難。由此，我們著力改進現有的DNA結合蛋白檢測技術，希望建立一些更加有效的技術，推動相關技術的產業(yè)化和應用。本發(fā)明中，我們將核酸外切酶保護分析(Exonuclease Protection Assay)技術、PCR(Polymerase Chain Reaction)技術及DNA微陣列芯片(DNA microarray chip)技術有效地結合在一起，建立了“核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白”技術，用于在不標記蛋白的情況下，同步(simultaneous)檢測多種DNA結合蛋白，即實現DNA結合蛋白的高通量(high throughput)分析檢測。

發(fā)明內容
(1)、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種不需要對DNA結合蛋白進行任何標記就可以高靈敏高通量檢測DNA結合蛋白的新技術，便于依靠基因芯片技術平臺實現DNA結合蛋白的高效分析。為分子生物學(molecular biology)、功能基因組學(functional genomics)、蛋白質組學(proteomics)及生物醫(yī)學(biomedicine)等領域中的DNA結合蛋白(DNA-binding protein)的相關研究提供一種新的實驗技術，促進這些領域中DNA結合蛋白相關的科學研究，以及針對DNA結合蛋白的臨床檢測和藥物篩選研究。
(2)、技術方案本專利提出了一種檢測DNA結合蛋白表達和活化水平的新技術，即“核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白”，運用該技術可以實現對DNA結合蛋白表達(expression)和活化(activation)水平的檢測分析。該技術的核心是將鑒定DNA結合蛋白DNA結合位點的核酸外切酶保護分析(Exonuclease Protection Assay)技術、核酸擴增的PCR(Polymerase Chain Reaction)技術及高通量檢測生物信息的DNA微陣列芯片(DNAmicroarray chip)技術巧妙地結合在一起，達到對DNA結合蛋白表達和活化水平的非標記(label-free)高通量(High throughput)分析。
運用該技術分析DNA結合蛋白表達及活化水平時，首先依據要檢測的DNA結合蛋白的DNA結合位點的核苷酸序列，如一般的共同基序(consensus)，以及本技術中運用核酸外切酶保護分析對PB-Probe結構的要求，設計并合成具有“旁側序列——DNA結合蛋白結合位點——PCR引物結合位點——標簽序列——PCR引物結合位點——DNA結合蛋白結合位點——旁側序列”結構的蛋白質結合DNA探針(簡稱“PB-Probe”)；對DNA結合蛋白進行檢測時，首先將多個PB-Probe等摩爾混合，成為PB-Probe溶液，再將待檢測的DNA結合蛋白溶液與PB-Probe溶液在有利與DNA/蛋白質結合的結合緩沖液中混合，在適宜反應溫度下進行結合反應適當時間；向DNA/蛋白質結合反應體系中加入核酸外切酶(exonuclease)反應液，在適宜溫度下酶切(digestion)適當時間，再加入終止液徹底終止核酸外切酶酶切活性；酶切反應終止后，對反應體系進行DNA純化，將純化后的DNA作為模板(template)，用PCR引物進行PCR擴增反應。在DNA/蛋白質結合反應中，若待檢溶液中存在相應PB-Probe的DNA結合蛋白，則DNA結合蛋白就會與溶液中的PB-Probe發(fā)生序列特異性結合反應(sequence-specific binding)，形成“PB-Probe/DNA結合蛋白”復合物(complex)，在這種復合物中，DNA結合蛋白結合在PB-Probe兩端的DNA結合位點上，形成了一種物理障礙(physicalhindrance)，當核酸外切酶消化時，則結合的DNA結合蛋白阻擋了核酸外切酶沿著PB-Probe的外切反應，使核酸外切酶不能降解PB-Probe上DNA結合位點內側的PCR引物結合位點(PCR primer-binding site)及標簽序列(Tag sequence)，因此在PCR反應中，被DNA結合蛋白保護的PB-Probe的PCR引物結合位點及標簽序列就可以實現擴增；而當待檢溶液中不存在相應PB-Probe的DNA結合蛋白時，裸露(naked)的PB-Probe就會受到核酸外切酶的攻擊，核酸外切酶對PB-Probe發(fā)生徹底降解，因此在PCR反應中，因無PCR引物結合位點及標簽序列，PCR就擴增不出產物。因此，PCR產物的有無及多少代表了待檢蛋白質溶液中DNA結合蛋白的有無及多少。為便于檢測PCR擴增產物，在PCR擴增中可運用熒光標記的單核苷酸(Mononuleotide)或引物(primer)，對PCR產物進行標記，再將熒光標記的PCR擴增產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交，依據芯片應該光掃描圖像獲得PCR產物中各種PB-Probe的數量信息，從而高通量判定待檢蛋白質溶液中DNA結合蛋白的有無及多少。此處所使用的Tag-DNA微陣列芯片是一種普通的單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)微陣列芯片(microarray chip)，但芯片上固定的DNA探針是專門針對PB-Probe上的標簽序列(Tagsequence)設計的，因此這些芯片DNA探針(CD-Probe)可檢測PCR產物中各種PB-Probe的數量信息。
運用該技術檢測DNA結合蛋白包括如下五個步驟
①制備PB-Probe、CD-Probe和Tag-DNA微陣列芯片；②PB-Probe與DNA結合蛋白結合；③核酸外切酶酶切；④PCR擴增及標記；⑤PCR產物與DNA微陣列芯片雜交檢測。
制備PB-Probe是運用該技術檢測DNA結合蛋白的第一步，也是很重要的一步。為實現本技術檢測DNA結合蛋白的功用，PB-Probe的設計和制備具有下列結構①PB-Probe為雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)分子；②PB-Probe的兩端各含有一個以上的相同DNA結合蛋白的結合位點；③PB-Probe的DNA結合蛋白結合位點內側有PCR引物結合位點；④PB-Probe的兩PCR引物結合位點之間存在特定的標簽(Tag)序列。因此本發(fā)明中使用的PB-Probe具有這樣的結構，即“旁側序列——DNA結合蛋白結合位點——PCR引物結合位點——標簽序列——PCR引物結合位點——DNA結合蛋白結合位點——旁側序列”。
PB-Probe是由兩堿基序列反向互補的單鏈核酸分子構成的線性(linear)雙鏈DNA分子。構成PB-Probe的兩堿基序列反向互補的單鏈核酸分子可以依靠兩種途徑獲得，一是運用固相化學合成兩條單鏈寡核苷酸，通過核酸退火，形成雙鏈DNA分子；二是設計并合成具有“旁側序列——DNA結合蛋白結合位點——引物序列1——引物序列2”或“旁側序列——DNA結合蛋白結合位點——引物序列1”的PCR引物，依靠PCR擴增反應從序列已知的自然生物基因組DNA中擴增獲得需要的PB-Probe。PCR擴增時可利用針對不同DNA片段的特異引物序列2擴增制備PB-Probe，而在DNA結合蛋白檢測中使用針對引物序列1合成的通用PCR引物方便地擴增PB-Probe。若有可能，在PB-Probe制備及檢測中都可以使用引物序列1，如利用克隆在具有通用引物結合序列載體中的基因組DNA片段制備PB-Probe。
為了運用核酸外切酶保護分析(Exonuclease Protection Assay)技術實現對DNA結合蛋白的檢測，本發(fā)明對傳統(tǒng)DNA足跡分析(DNA footprinting)中的DNA探針進行了重要改造，即在DNA探針的兩端各設立一個DNA結合蛋白結合位點，在兩DNA結合蛋白結合位點之間設立具有信息檢測功能的PCR引物結合序列和標簽序列，蛋白質與PB-Probe的兩DNA結合蛋白結合位點的結合與否，可依靠隨后的酸外切酶保護分析、PCR擴增和芯片雜交加以指示。DNA結合蛋白的結合位點，可以是從自然生物基因組中鑒定發(fā)現的結合序列如共同基序(consensus)外，例如，p53蛋白的DNA結合位點為 SP1蛋白的DNA結合位點為 NF-κ蛋白的DNA結合位點為 等；也可以是經體內外實驗篩選的DNA結合蛋白對其有良好序列特異性結合親合性的核酸序列。由于有些核酸外切酶如核酸外切酶III有時會越過結合位點較小的DNA結合蛋白，在探針設計上，可以在PB-Probe的每一端增設一個以上的蛋白質結合位點，或設計使用親合力較高的蛋白質結合位點。在PB-Probe設計上還需要注意在PB-Probe的兩個末端增設一些旁側序列，以便DNA結合蛋白與PB-Probe的良好結合。有些DNA結合蛋白不需要旁側序列，也可以和DNA結合蛋白結合位點發(fā)生良好的結合，此中情況下，也可以減少旁側序列的核苷酸數目或不要旁側序列。為了保證DNA結合蛋白按預定的行為與PB-Probe結合并實現對其檢測，一個PB-Probe上除專門在PB-Probe兩端設立的DNA結合蛋白結合位點外，其他序列包括旁側序列、PCR引物結合位點和標簽序列中都不得在含有DNA結合蛋白結合位點。為了檢測不同的DNA結合蛋白，不同的PB-Probe含有不同DNA結合蛋白的結合位點，在檢測體系中需要檢測多少種DNA結合蛋白，就需要設計并合成相應種類的PB-Probe。在檢測的探針溶液中則含有所有種類的PB-Probe，以同步(simultaneously)檢測多種DNA結合蛋白。但是，由于在檢測中將多種PB-Probe混合在一起作為探針溶液與蛋白質溶液進行結合反應，因此一個PB-Probe上的DNA結合蛋白結合位點序列不僅在該PB-Probe上是唯一的，在探針溶液中的所有PB-Probe上也必須是唯一的，特異的，即一種PB-Probe上不得出現兩種DNA結合蛋白的結合位點。
為了便于進行PCR擴增及檢測，本發(fā)明在PB-Probe的DNA結合蛋白結合位點內側設計了PCR引物結合位點。在一個PB-Probe上，PCR引物結合位點的序列必須是唯一的，即只有PCR引物結合位點可供PCR引物結合，其他序列包括旁側序列、蛋白質結合位點和標簽序列都不能和PCR引物退火。在一個PB-Probe上，標簽序列兩側的兩PCR引物結合位點序列可以相同(5′→3′)，也可以不同；若不同，在PCR擴增時就需要兩個不同的引物，及一對PCR引物；若相同，則只需要一個引物，就如RAPD一樣。由于在檢測中將多沖PB-Probe混合在一起作為探針溶液與蛋白質溶液進行結合反應，因此一個PB-Probe上的PCR引物結合位點序列不僅在該PB-Probe上是唯一的，在探針溶液中的所有PB-Probe上也必須是唯一的，特異的。可見，本發(fā)明中若對不同的PB-Probe設計不同的PCR引物結合位點時，探針溶液中PB-Probe種類越多，則需要設計合成的上PCR引物越多，則多重PCR的復雜性越大，特別是要兼顧PCR引物結合位點序列的特異性和一致的Tm值，則會更大地增加PB-Probe及PCR引物設計及合成的難度，因此這種設計方案顯然不是本發(fā)明優(yōu)先選擇的。比較而言，在所有PB-Probe上使用一對或一個通用的PCR引物結合位點，則極大地簡化了PB-Probe及PCR引物設計及合成，因此使用通用PCR引物結合位點和通用PCR引物是本發(fā)明最優(yōu)先采取的方案。
為了運用DNA微陣列芯片實現DNA結合蛋白的高通量檢測，本發(fā)明的PB-Probe的兩PCR引物結合位點之間設立了特定的標簽(Tag)序列。標簽序列和蛋白質結合位點一樣，不僅要求在同一PB-Probe上其序列是唯一的，在探針溶液中的所有PB-Probe上也必須是唯一的，特異的。這樣，一個PB-Probe上的標簽序列才能唯一性地代表該PB-Probe要檢測的靶蛋白。PB-Probe標簽序列的設計除序列特異性外，還應當注意其堿基組成，以便針對不同的PB-Probe標簽序列設計Tag-DNA微陣列芯片的DNA探針，特別是要求所有CD-Probe要有一致的Tm值。若PB-Probe是從基因組DNA中擴增制備，應對每個PB-Probe的標簽序列進行詳盡的蛋白質結合位點篩查，杜絕所有PB-Probe的標簽序列上含有任何已知的DNA結合蛋白的結合位點。對于序列已知的基因組及DNA克隆，這一工作并不困難。
運用本發(fā)明檢測DNA結合蛋白，還需準備PCR引物，以便在核酸外切酶酶切后擴增PB-Probe。本發(fā)明PCR引物的準備出遵循一般PCR引物設計的所有要求外，還應當按PB-Probe上PCR引物結合位點的序列特征進行合成。正如前面對PB-Probe上PCR引物結合位點設計的闡述，本發(fā)明盡量避免進行多重的PCR引物設計和合成，也避免進行多重PCR，應是優(yōu)先使用通用PCR引物。
Tag-DNA微陣列芯片檢測PCR擴增產物是本發(fā)明實現DNA結合蛋白檢測最后一步，也是體現本發(fā)明高通量特征的重要環(huán)節(jié)。Tag-DNA微陣列芯片的設計及制備具有如下特征①Tag-DNA微陣列芯片上固定著大量單鏈芯片DNA探針(Single-stranded CD-Probe)分子；②大量的CD-Probe分子的核苷酸序列各不相同，不同的CD-Probe分子其核苷酸序列在所有CD-Probe分子中是獨特的；③每一種CD-Probe分子的核苷酸序列設計對應著一種PB-Probe的標簽序列，即一種CD-Probe分子可與對應的PB-Probe的標簽序列的其中一條鏈雜交退火；④芯片上不同的CD-Probe分子對應不同的PB-Probe的標簽序列；⑤Tag-DNA微陣列芯片與PCR擴增的PB-Probe分子雜交時，不同CD-Probe分子可反映一種對應的PB-Probe分子的標簽序列在PCR產物中的存在與否及數量多少；⑥為了提高芯片檢測的精確性，可針對一個PB-Probe的標簽序列設計一個以上的CD-Probe，通過多CD-Probe信號的共顯性及信號強度的均勻性對PCR產物中相應PB-Probe的量做出精確的判別；⑦Tag-DNA微陣列芯片應設置陽性和陰性對照CD-Probe。
在DNA微陣列芯片檢測，一般要對檢測的DNA進行熒光標記，再與芯片雜交，雜交后芯片經熒光掃描分析，就可以獲得各個探針的雜交信號，進而判定檢測DNA中對應于各種芯片探針的靶DNA分子的數量信息。在本發(fā)明中，為便于運用Tag-DNA微陣列芯片對PCR擴增產物進行檢測分析，也需要在PCR擴增中對擴增產物進行標記。若使用共PCR擴增標記，就可以在PCR擴增反應體系中，加入熒光素標記的單核苷酸，如Cy3-dUTP、Cy3-dCTP等，使其進入PCR擴增的DNA產物鏈中；或使用熒光素標記的PCR引物，進行PCR擴增反應，使PCR擴增的DNA產物鏈帶上熒光分子。此種情況下PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，芯片經適當洗滌，就可以直接用基因芯片掃描儀、熒光顯微鏡等儀器進行熒光信號檢測。另外還可以采用其他標記方法實現標記，如PCR中使用帶DIG、生物素等的核苷酸，如DIG-dUTP、Biotin-dUTP等，也可以使用DIG、生物素等標記的PCR產物等，標記PCR產物；此種情況下PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，芯片經適當洗滌，再用熒光標記的DIG-抗體、生物素抗體或鏈親合素等與Tag-DNA微陣列芯片雜交，芯片經洗滌后，再用基因芯片掃描儀、熒光顯微鏡等儀器進行熒光信號檢測。除了標記PCR產物外，還可以采用不標記PCR產物的其他技術實現PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后的信號反映，如在PCR引物的5′末端增加一段寡核苷酸，其上4個其他堿基相間的插入多個dATP或dGTP，PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，進行含Cy3-dUTP或Cy3-dCTP的在片DNA聚合酶延伸反應，也可反映雜交信號；不過此種情況要求Tag-DNA微陣列芯片的CD-Probe是固定5′末端，而3′末端游離。另外若PCR引物的5′末端增加一段寡核苷酸，可以在PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，也可用一熒光標記的寡核苷酸與PCR引物5′末端增加寡核苷酸再雜交，反映PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交信號。此外其他技術，如3D-DNADendrimers，Rolling Circle Amplification Technology(RCA)，Au-DNA等技術進行PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交信號的反映。
本技術中用于檢測的DNA結合蛋白為各種來源的DNA結合蛋白，包括人工表達制備的DNA結合蛋白、從細胞或組織裂解物中分離純化的DNA結合蛋白和含有DNA結合蛋白的細胞或組織抽提物。檢測中首先要在適宜反應溫度(如37C)將PB-Probe與DNA結合蛋白在結合緩沖液中一起孵育適當時間，如20分鐘到半小時，其作用是DNA結合蛋白與PB-Probe在溶液中發(fā)生序列特異性識別并結合。結合反應體系中加入的PB-Probe的量要適宜。檢測中可以在同一反應體系中加入檢測不同DNA結合蛋白的PB-Probe，以高通量檢測多種DNA結合蛋白。
在DNA結合蛋白與PB-Probe發(fā)生序列特異性結合后，將核酸外切酶反應液加入反應體系中，使核酸外切酶對PB-Probe發(fā)生消化反應，徹底降解未與DNA結合蛋白結合的PB-Probe，使降解的PB-Probe不能在隨后的PCR擴增反應中擴增出來。消化PB-Probe所使用核酸外切酶為具有在雙鏈DNA上可從3′→5′或5′→3′外切消化DNA逐個釋放單核苷酸的酶，如Ba131、exonuclease III、E.coli DNA Polymerase I、T4 phage DNA Polymerase、T7 phage DNAPolymerase、λphage exonuclease等酶。在酶的選用上，應盡量選擇那些反應效率高，反應條件接近DNA/蛋白質結合緩沖液性質的核酸外切酶。在選用核酸外切酶時，那些可在單鏈和雙鏈DNA上都可以進行核酸外切消化的酶更有利。若選用只能在雙鏈DNA上進行核酸外切消化的酶時，如核酸外切酶III，需在核酸外切酶反應適宜時間后，加入S1核酸酶消除核酸外切酶產生的單鏈DNA，在進行PCR擴增。
我們的實驗表明，核酸外切酶III為本發(fā)明技術中可以使用的一個非常理想的核酸外切酶，該酶具有對雙鏈DNA的3′→5′外切活性，而且在廣泛的鹽濃度(0-100nM NaCl活KCl)和pH(7.6-8.5)條件中都具有穩(wěn)定的活性；該酶在一般DNA/蛋白質結合反應溫度下(37℃)下具有很高的外切活性(～500bp/分鐘，Promega)；另外，一般DNA/蛋白質結合緩沖液(具有Mg2+)就可以成為該酶的可行反應條件，因此在進行核酸外切酶III外切反應時，僅僅加入一些酶就可以了，不需要再加入其他緩沖液，所以非常適合運用本發(fā)明核酸外切酶酶切反應中。核酸外切酶III的消化效率非常高，在37℃，每分鐘可切除420個核苷酸(Fermentas)，因此酶反應的時間一般很短，而DNA/蛋白質復合物的壽命一般比核酸外切酶III反應所需要的時間長，加之核酸外切酶III的加入一般不會影響DNA/蛋白質復合物，因此核酸外切酶III被廣泛地用于常規(guī)DNA足跡分析(DNAfootprinting)或核酸外切酶保護分析(exonuclease IIIprotection assay)中。核酸外切酶III的另一好處是，該酶已經證實可用以分析細胞抽提物中的DNA結合蛋白，這對分析臨床樣品非常有利，因為臨床樣品常常是組織或細胞，從這些樣品中只要抽提出核蛋白或細胞蛋白，就可以用核酸外切酶III進行分析。因此，核酸外切酶III是本發(fā)明最優(yōu)先使用的核酸外切酶。但使用該酶時，不能使用3′端比5′端突出4個以上核苷酸的PB-Probe，平端和3′凹端的PB-Probe最好。
由于在核酸外切酶保護分析中延長酶反應會導致酶消化掉那些蛋白質結合后動態(tài)脫落的PB-Probe，導致出現假陰性結果。因此在核酸外切酶加入PB-Probe/蛋白質結合反應體系，反應適當時間后，應加入EDTA等終止試劑或高溫加熱完全終止核酸外切酶酶切反應，并立即對反應產物進行DNA純化，消除DNA結合蛋白及核酸外切酶等蛋白質，以便PCR擴增。
本技術中上面所述對一種待蛋白質溶液檢測時，對PCR產物用一種熒光素標記并與Tag-DNA微陣列芯片雜交，通過熒光信號的強弱反映蛋白質存在與否及數量。除了這種方式的檢測外，還可以對兩份蛋白質溶液，如一種為正常組織細胞核蛋白質抽提物，另一種為疾病狀態(tài)組織細胞核蛋白質抽提物，進行比較檢測，此種情況下，一種蛋白PCR產物用一種熒光素標記(如Cy3)，另一種蛋白PCR產物用另一種熒光素標記(如Cy5)，最后將兩種PCR產物混合與Tag-DNA微陣列芯片共雜交，芯片用雙通道熒光(Cy3、Cy5)掃描后，疊加雙色熒光圖像，判斷蛋白質表達或活化水平的上調(upregulate)或下調(downregulate)。
(3)、技術效果DNA結合蛋白因負責基因表達的調控等重要的細胞功能而成為目前基因組和蛋白組研究所重視的一類重要蛋白質，而且許多疾病與DNA結合蛋白異常表達及活化間存在的密的關系，引起了生物醫(yī)藥領域對DNA結合蛋白研究的關注，DNA結合蛋白已經成為疾病治療和藥物研究的重要靶點。因此，建立高通量DNA結合蛋白功能檢測及分析技術非常迫切。為此，本發(fā)明提出了一種非蛋白標記的DNA結合蛋白高通量檢測技術，利用本技術檢測DNA結合蛋白，可以克服傳統(tǒng)檢測DNA結合蛋白方法以及雙鏈DNA微陣列芯片的一些技術缺陷，實現DNA結合蛋白的高效分析。
本發(fā)明提出的“核酸外切酶保護DNA探針雜交Tag-DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白”技術，將核酸外切酶III保護分析技術、PCR擴增技術和DNA微陣列芯片技術結合在一起，建立了一種高效檢測分析DNA結合蛋白的新方法。經我們的實驗研究，本發(fā)明提出的技術可操作性強，實驗結果重復性良好。在推廣應用中，當我們商業(yè)化生產和提供PB-Probe、CD-Probe和Tag-DNA微陣列芯片及相關成套試劑的情況下，只經過四個實驗步驟就可以完成對多DNA結合蛋白的同步分析。本發(fā)明提供的DNA結合蛋白檢測新技術，可以借助常規(guī)PCR儀、基因芯片點樣儀、基因芯片掃描等儀器實現DNA結合蛋白的高通量檢測，這些儀器已經在很多實驗室得到應用，因此極大地方便了本技術的推廣使用。商業(yè)化提供的試劑盒可投入到科研、醫(yī)療等應用領域，用與DNA結合蛋白的相關研究、診斷和藥物篩選。因此，該技術將為分子生物學、功能基因組學、蛋白質組學等領域中的DNA結合蛋白的相關研究提供一種新的實驗技術，促進這些領域中DNA結合蛋白相關的科學研究和開發(fā)。
本發(fā)明技術生產的DNA結合蛋白檢測試劑盒，將在臨床輔助診斷和生物醫(yī)學中針對DNA結合蛋白的藥物篩選研究具有非常重要的應用價值。例如，DNA結合蛋白p53、NF-kB的表達及活化異常，在許多疾病中發(fā)揮的重要作用，因此成為臨床診斷中觀測的重要靶點，同時也是轉錄治療和藥物篩選重要靶點。
四

圖1核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白技術流程注解PB蛋白質結合(Protein Binding)；ED核酸外切酶消化(Exonuclease Digestion)；P純化(Purification)；A擴增(Amplification by PCR)；CH芯片雜交(Chip Hybridization)；S掃描(Scanning)。
圖2PCR擴增實驗結果圖3Tag-DNA微陣列芯片雜交實驗結果五具體實施方式
此處僅以制備PB-Probe檢測DNA結合蛋白NF-κB的實驗為例，說明本發(fā)明技術的具體
1、NF-κB PB-Probe，PCR引物，Tag-DNA微陣列芯片制備NF-κB PB-Probe 其中＿＿為NF-κB結合位點， 為PCR primer結合位點， 為Tag序列。
NF-κB PB-Probe制備時，將兩寡核苷酸以100μM濃度溶解在TEN緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH8.0)中；將配對寡核苷酸溶液等摩爾(molar)混合，95℃保溫10分鐘，緩慢冷卻到15～25℃。用TEN緩沖液稀釋部分PB-Probe原液至濃度為5μM，4℃保存?zhèn)溆谩?br> PCR引物primerR5′...GCTGGGCTGCTGC...3′Tm46.5GC76.9％primerF5′...CCGCTACGGCTCG...3′Tm47.5GC76.9％PCR引物寡核苷酸以50μM濃度溶解在水中。
Tag-DNA微陣列芯片CD-Probe5′...NH2-TTTTTTTTTTCTGCACTGCTCATTAATATACTTCTGG...3′positive5′...NH2-TTTTTTTTTTCTGCATGTATAGAACATAAGGTGTCGC...3′negative control將CD-Probe寡核苷酸以100μM濃度溶解在碳酸緩沖液(0.1M carbonatebuffer，pH9.0)。再將碳酸緩沖液稀釋的50μM的CD-Probe寡核苷酸用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點樣到醛基修飾玻片(SuperAldehyde slide，Telechem)表面，點樣后置于濕盒內用300mM K2HPO4(pH9.0)浸濕的濾紙上，密封濕盒，在37℃溫育30分鐘，再用2×SSC/1％SDS溶液洗滌2分鐘，用水簡單淋洗，N2吹干。芯片再用硼氫化鈉溶液
浸泡玻片30分鐘，除去過剩醛基，1％SDS溶液洗滌2分鐘，用水簡單淋洗，N2吹干。
2、NF-κB PB-Probe與DNA結合蛋白NF-κB的結合將2μl(1gsu/μl)DNA結合蛋白NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，Promega)]、2μl 5×DNA結合緩沖液(50mM HEPES pH7.9，250mM KCl，12.5mM DTT，0.5mM EDTA，0.25％NP-40，50％Glycerol，25％fetal bovine serum)和2μl 5μM NF-κB PB-Probe混合，再加入4μl水，形成DNA/蛋白質結合反應液。將DNA/蛋白質結合反應液在37℃孵育30分鐘。
3、核酸外切酶III反應將2μl 10×反應緩沖液[660mM Tris-HCl(pH8.0 at 30℃)，6.6mM MgCl2]和0.2μl 200U/μlExonuclease III(MBI Fermentas，#EN0191)加入結合反應體系中，37℃孵育5分鐘。再向酶反應溶液中加入75μl S1核酸酶反應液[40.5mM potassium acetate(pH4.6)，0.34M NaCl，1.35mMZnSO4，6.75％glycerol，S1 Nuclease 0.25U/μl)，37℃孵育5分鐘。加入10μl S1終止液(300mM Tris，50mM EDTA)，70℃加熱10分鐘滅活S1 Nuclease。用酚∶氯仿(1∶1)、酚∶氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提終止的酶反應溶液一次，再用冰乙醇沉淀DNA
，最后1ml 75％-20℃冰乙醇洗滌DNA一次，干燥DNA沉淀，將DNA溶解在10μl水中。
4、PCR擴增反應及標記用上面純化的DNA做模板，primerF和primerR為引物進行PCR擴增。100μl-PCR反應體系為2μl模板DNA，0.5μM primerR，0.5μM primerF，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，0.2mMdTTP，0.15mM dCTP，0.05mM Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia)，2mM MgSO4，10mM KCl，8mM(NH4)SO4，10mM Tris-HCl，pH9.0，0.05％NP-40，0.05U/μl Taq(Shenergy Biocolor)。PCR程序95℃2分鐘，94℃30秒、50℃45秒、72℃1分鐘循環(huán)25次，72℃5分鐘。用酚∶氯仿(1∶1)、酚∶氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提PCR產物一次，再用-20℃冰乙醇沉淀DNA
，最后用-20℃75％冰乙醇洗滌DNA一次，干燥DNA沉淀。將DNA溶解在50μl水中，95℃加熱10分鐘，冰上驟冷保存。
5、PCR擴增及標記產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測取2μl經純化溶解在水中的PCR產物與2μl 5×標準雜交液[25×SSC，0.5％N-lauroylsarcosine，0.1％SDS，5％blocking reagent(Roche)]混合，再加水6μl。將雜交液滴加到Tag-DNA微陣列芯片上，用蓋玻片覆蓋雜交液。將芯片放入雜交盒內，密封，60℃孵育3小時。取出芯片，用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌芯片一次，再用水簡單淋洗，300rpm離心芯片，除去芯片上殘留液體。用基因芯片掃描儀(ScanArrayLite，PackardBioScience BioChip Technologies)上獲取熒光圖像，掃描參數為Cy3通道、90％激光強度，80％PMT增益、5μm分辨率.。熒光偽彩圖像的信號強度用微陣列分析軟件(QuantArraymicroarray analysis software，Packard BioScience BioChip Technologies)進行分析。
權利要求
1.核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，提出了一種檢測DNA結合蛋白的新方法，其特征在于運用該方法檢測DNA結合蛋白包括如下步驟a)制備蛋白質結合DNA探針(簡稱PB-Probe)、PCR引物和Tag-DNA微陣列芯片；b)PB-Probe與DNA結合蛋白結合；c)核酸外切酶酶切；d)PCR擴增及標記；e)PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測。
2.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(a)準備的PB-Probe，每種PB-Probe都是由核苷酸序列組件“旁側序列→DNA結合蛋白結合位點→PCR引物結合位點→標簽序列→PCR引物結合位點→DNA結合蛋白結合位點→旁側序列”構成的線性雙鏈DNA分子。
3.根據權利要求2所述的PB-Probe的DNA結合蛋白結合位點，其特征在于一種PB-Probe只含有一種DNA結合蛋白的結合位點，不同PB-Probe含有不同DNA結合蛋白的結合位點；在所有PB-Probe的DNA序列中，一種PB-Probe的DNA結合蛋白結合位點只出現在該種PB-Probe的DNA結合蛋白結合位點位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在該種PB-Probe的DNA結合蛋白結合位點。
4.根據權利要求2所述的PB-Probe的PCR引物結合位點，其特征在于一種PB-Probe可含有兩個序列不同或相同的PCR引物結合位點，不同PB-Probe也可含有序列不同或相同的PCR引物結合位點；在所有PB-Probe的DNA序列中，PCR引物結合位點只出現在PB-Probe的PCR引物結合位點位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在PCR引物結合位點。
5.根據權利要求2所述的PB-Probe的標簽序列，其特征在于不同PB-Probe含有不同序列的標簽序列；在所有PB-Probe的DNA序列中，一種PB-Probe的標簽序列只出現在該種PB-Probe的標簽序列位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在該種PB-Probe的標簽序列。
6.根據權利要求2所述的PB-Probe的旁側序列，其特征在于一種PB-Probe可含有兩個序列不同或相同的旁側序列，不同PB-Probe也可含有序列不同或相同的旁側序列；在所有PB-Probe的旁側序列中，不存在所有PB-Probe的DNA結合蛋白結合位點、PCR引物結合位點和標簽序列。
7.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(a)準備的PCR引物，可與PB-Probe的PCR引物結合位點特異性退火結合；依據PB-Probe上PCR引物結合位點的序列設計，不同PB-Probe可以使用不同的PCR引物，也可以使用相同的PCR引物。
8.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(a)中準備的Tag-DNA微陣列芯片，固定著大量單鏈芯片DNA探針(簡稱CD-Probe)，各CD-Probe的核苷酸序列各不相同，一種CD-Probe只與一種PB-Probe的標簽序列特異性雜交退火，不同的CD-Probe可與不同的PB-Probe標簽序列特異性雜交退火；Tag-DNA微陣列芯片上有檢測所有PB-Probe的CD-Probe。
9.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(b)中PB-Probe與DNA結合蛋白結合，其中PB-Probe為多種PB-Probe的等量混合物，以便在一次檢測中同步獲得多種DNA結合蛋白的信息。
10.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(b)中PB-Probe與DNA結合蛋白結合，其中DNA結合蛋白為各種來源的DNA結合蛋白，包括人工表達制備的DNA結合蛋白、從細胞或組織裂解物中分離純化的DNA結合蛋白和含有DNA結合蛋白的細胞或組織抽提物。
11.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(b)中PB-Probe與DNA結合蛋白的結合，是DNA結合蛋白與PB-Probe間發(fā)生序列特異性識別并結合的過程。
12.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(c)中的核酸外切酶酶切是指將核酸外切酶加入步驟(b)反應產物中，使核酸外切酶從PB-Probe的兩端發(fā)生外切消化反應的過程。
13.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(c)中的核酸外切酶，為具有核酸外切活性的核酸酶，這些酶能從雙鏈DNA的3′或5′發(fā)生外切反應，逐個釋放單核苷酸。
14.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(d)PCR擴增及標記，是指以步驟(c)DNA產物為模板，以步驟(a)制備的PCR引物為引物進行的PCR擴增反應；在PCR擴增反應體系中，可加入標記物修飾的單核苷酸，或標記物修飾的PCR引物，使PCR擴增的DNA產物帶上標記。
15.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(e)PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測，是將PCR產物與雜交液混合，再與Tag-DNA微陣列芯片進行雜交反應，使PCR產物與CD-Probe發(fā)生序列特異性退火的過程。
16.根據權利要求1所述的核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，其特征在于步驟(e)PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測，在PCR產物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，要依據PCR產物標記的化學性質，進行信號獲取的過程。
全文摘要
核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白，提出了一種檢測DNA結合蛋白的新方法，其特征在于運用該方法檢測DNA結合蛋白包括如下步驟(a)制備蛋白質結合DNA探針、PCR引物和Tag－DNA微陣列芯片；(b)蛋白質結合DNA探針與DNA結合蛋白結合；(c)核酸外切酶酶切；(d)PCR擴增及標記；PCR產物與Tag－DNA微陣列芯片雜交檢測。本發(fā)明提出的“核酸外切酶保護DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結合蛋白”檢測DNA結合蛋白的特點是，不需對蛋白質進行任何化學修飾及標記，可同步對多種DNA結合蛋白進行高通量檢測，檢測靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK1746318SQ200410041930
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月10日 優(yōu)先權日2004年9月10日
發(fā)明者王進科 申請人:王進科, 南京新益華集團有限公司