專利名稱：檢測高原肺水腫易感性的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及檢測高原肺水腫(HAPE)易感性的方法。具體涉及利用已發(fā)現(xiàn)與HAPE流行有關的iNOS(可誘導的一氧化氮合酶)基因的等位基因變體。
背景技術(shù)：
高原肺水腫(HAPE)是一種非心源性肺水腫，隨機抽取的登山者中大約10％在快速攀登至海拔4000m以上后24小時內(nèi)發(fā)病。出于各種商務原因在海拔超過3000m的低地參與者中可觀察到類似現(xiàn)象。在易感HAPE對象中甚至顯示了更高的發(fā)病率，大約有60％過去曾疾病發(fā)生過此病(Houston CS等1960，Bartsch P等1997，1990)。通過預防性使用血管擴張劑或緩慢攀登可有效防止HAPE。然而，在長途旅行和登山運動中，由于接觸高海拔，HAPE仍然是最常見的致死原因(Hackett PH等1990)。如果不能實現(xiàn)補充供氧或快速下山的即刻治療，估計喜馬拉雅登山者中HAPE的發(fā)病率為50％(Lobenhoffer HP等1982)。人種和種族以及家族群之間的臨床表現(xiàn)和疾病嚴重性有可見差異贊同此病具有明顯的遺傳易感性。
雖然對影響HAPE發(fā)生的因素了解尚不完全，但實驗證據(jù)表明缺氧性肺血管收縮(HPV)起著重要作用(Scherrer U等1996)。通過侵入性或非侵入性方法測定已證明患HAPE的個體在高海拔時肺動脈壓過度升高。毛細血管的不均勻收縮有時會導致“毛細管滲漏”，然后形成水腫(Bartsch P等1991)。易患此病的人即使短時接觸高海拔，也顯示肺血管反應增加。這種過高的HPV的潛在病理生理學機制仍然未明。然而有證據(jù)表明，內(nèi)源性血管擴張劑一氧化氮(NO)可調(diào)節(jié)血管反應性(Palmer RMJ等1987)。NO調(diào)節(jié)血管張力歸因于cGMP途徑的介導(Bellamy TC等2002)。
以下研究著重涉及NO在HAPE中的作用NO的主要作用是改善換氣/灌氣比率，以及通過增加動脈血氧飽和度而降低肺泡與動脈的血氧張力差(Scherrer U等1996)。然而，在健康志愿者中，缺氧時給予NO合成拮抗劑NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)可增加肺動脈壓和血管阻力，類似于HAPE中觀察到的現(xiàn)象。由于這個原因，已利用NO作為吸入療法，來治療受影響個體的HAPE(Anand IS等1998)。
磷酸二酯酶5是負責肺中cGMP水解的關鍵酶。已發(fā)現(xiàn)磷酸二酯酶5的抑制劑可抑制缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓(Goldstein I等1998)。缺氧使易患HAPE的登山者呼出的NO減少，表明這種情況下NO的產(chǎn)生降低(Busch等2001)。因此，認為產(chǎn)生較低NO水平的缺陷性NO合成機制引起了HAPE的發(fā)病。NO由三種同工酶nNOS(神經(jīng)元一氧化氮合酶，NOS1)、iNOS(可誘導的一氧化氮合酶，NOS2)和eNOS(內(nèi)皮一氧化氮合酶，NOS3)所合成(Michel T等1997)。NOS1和NOS3是組成性表達，而NOS2是誘導后才表達。其中，提出最佳候選者是HAPE(患者)中缺乏的酶eNOS(毛皮一氧化氮合酶)，而同時誘導iNOS(可誘導的一氧化氮合酶)對立即恢復NO總儲備似乎也是不可避免的(Xia Y等1998)。而且，強效細胞信號傳導機制通常有利于募集定即早期生理反應所需的可誘導基因。預測iNOS的缺乏(即沒有激活)可能使缺氧而患HAPE的個體不能恢復其降低的NO水平。
HAPE患者的iNOS缺乏可發(fā)生在基因水平。在許多病例中，發(fā)現(xiàn)由于該基因序列的多態(tài)性，導致該基因表達的改變(Qadar Pasha MA等2001)。因此，iNOS基因的多態(tài)性很能夠改變其表達并與疾病相關。
目前HAPE的治療狀況是1.NO療法采用NO吸入療法來治療HAPE。NO主要通過改善換氣/灌氣比率和增加動脈血氧飽和度以降低肺泡與動脈血氧張力差而起作用。在HAPE患者中，NO誘導了動脈氧合作用的改善并伴隨肺中血流從水腫區(qū)段流向非水腫區(qū)段，導致整個毛細血管中血管收縮均勻/一致(Scherrer U等1996，Anand IS等1998)。
2.快速下山HAPE患者快速下山不僅能夠防止病情惡化，而且能夠改善疾病的發(fā)病(Hackett PH等2001)。
3.便攜式氣曩(PAC)常常使用裝滿氧氣的小圓筒形PAC作為HAPE的吸入療法(Hackett PH等2001)。
4.遺傳素質(zhì)只有本文中的一項研究提出，內(nèi)皮一氧化氮合酶基因(eNOS)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因(ACE)的遺傳變異可能使個體易患HAPE(Droma Y等2002)。該研究結(jié)果如下

HAPE現(xiàn)有療法的缺陷是1.發(fā)現(xiàn)HAPE患者對NO吸入沒有一致的反應。而且，所需的NO的濃度隨疾病的嚴重程度而不同。有時，吸入不充分可導致患者低血壓或甚至感染性休克。
2.由于惡劣的天氣和崎嶇的山路，HAPE患者立即下山常不可能(AnandIS等1998，Hackett PH等2001)。
3.由于超載問題，攜帶PAC有時看來不可行。此病癥狀的改善常常是暫時性的，除去氣囊可使患者病情惡化(Hackett PH等2001)。
4.所報道與HAPE相關的多態(tài)性不是此病特有的，在諸如糖尿病、冠狀動脈疾病、高血壓和心肌梗死等的血壓升高疾病中也有(Monti LD等2003，ViaM等2003)。所提及的等位基因差異的頻率看來與其它疾病相同。因此，等位基因?qū)Υ瞬〉淖饔每赡苁怯捎谄渌嚓P病理生理原因所致加重了HAPE的高血壓。而且，該研究沒有包括HA本地人(高海拔居民)，即在發(fā)生此病的相同環(huán)境中快樂居住的人群。
本發(fā)明的特征是提供一種檢測HAPE易感性的新方法。
另一個特征是提供iNOS基因中新的標記區(qū)。
又一個特征是提供iNOS基因中新的SNP。
又一個特征是顯示iNOS基因的等位基因變化與HAPE的相關性。
另一個特征是提供含有該新的SNP的新型擴增引物和探針。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供一種能消除上述缺陷的檢測HAPE易感性的方法。
另一個目的是提供iNOS基因中新的SNP。
另一個目的是提供含有該新的SNP的新型擴增引物和探針。
另一個目的是對低地居民和HAPE患者進行等位基因變化的相關性分析，以記錄與此病的相關性。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種檢測HAPE易感性的方法。具有涉及利用與HAPE流行有關的iNOS基因的等位基因變體。已認為產(chǎn)生較低NO水平的缺陷性一氧化氮(NO)合成機制與HAPE的發(fā)病有關。證明了iNOS基因負責NO的產(chǎn)生，因為NO產(chǎn)生的抑制劑可增加HAPE的嚴重性。本發(fā)明提供一種檢測HAPE易感性的方法，因為在已公開的標記區(qū)中這種iNOS基因的新型等位基因變化顯示與人群HAPE的流行呈負相關。
附圖簡要說明

圖1可誘導的一氧化氮合酶(iNOS)基因位置17cenq11.2的示意圖。垂直條表示外顯子區(qū)域(來自基因庫核苷酸序列ID No.NT010799)。
圖2顯示具有AA純合子的個體的序列特征。
圖3顯示具有GG純合子的個體的序列特征。
圖4顯示具有AG雜合子的個體的序列特征。
圖5顯示具有TC雜合子的個體的序列特征。
通過下面本發(fā)明優(yōu)選實施方式的描述，本發(fā)明的其它和另外方面的內(nèi)容、特征和優(yōu)點將顯而易見，優(yōu)選實施方式的為了公開的目的。本領域技術(shù)人員可考慮本發(fā)明其它實施方式。但所有這些其它實施方式均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及檢測HAPE易感性的方法。具體涉及利用與HAPE流行有關的iNOS基因的等位基因的變體。
I.鑒定iNOS基因上的標記區(qū)考慮到高海拔時NO功能的重要性，選擇iNOS(可誘導的一氧化氮合酶基因)作為本研究的候選基因。
II.選擇研究對象通過Lake Louise急性高山病(AMS)計分系統(tǒng)，評價HAPE的臨床嚴重性。簡要地說，評價了患者的五種癥狀頭痛，胃腸不適，疲勞、虛弱、或疲勞虛弱，眩暈、頭暈、或眩暈頭暈，和睡眠困難。也評價精神狀態(tài)的改變、共濟失調(diào)和外周性水腫。每種癥狀評定為0-3分。0分表示無癥狀；1分，輕微癥狀；2分，中度癥狀；3，嚴重癥狀。HAPE評分是所有8種癥狀的總和，HAPE評分＞6為患者(Anand IS等1998)。地低居民(LL)即使在高海拔下誘導至少三次也沒有發(fā)現(xiàn)任何上述癥狀。高海拔(HA)居民是來自遠古時期的HA永久居民。
III.提取白細胞基因組DNA采用鹽析方法提取血基因組DNA。在高鹽存在下溶解血紅細胞后，用細胞核裂解緩沖液(NLB)處理。乙醇沉淀蛋白和提取獲得DNA(Miller SA等1988)。
IV.鑒定iNOS基因的等位基因變化本發(fā)明新的多態(tài)性作為本發(fā)明的第一步驟，申請者利用自己設計的寡核苷酸引物，進行了iNOS基因標記區(qū)域的PCR擴增。根據(jù)人iNOS基因序列(基因庫登錄號NT_010799)設計引物。對純化的PCR產(chǎn)物的測序揭示，在人iNOS基因內(nèi)含子7中有一個新的單核苷酸多態(tài)性。因此，看來存在迄今尚未識別的人iNOS基因等位基因或亞型。
本發(fā)明提供人iNOS基因等位基因變體的序列，與數(shù)據(jù)庫中的人iNOS基因序列相比，該序列包含以下的新的單核苷酸多態(tài)性。
例如，具有表1所列多態(tài)性的人iNOS基因等位基因變體的核苷酸序列(SEQ ID NO1)為5’CAGCGGAGTGATGGCAAGCACGACTTCCGGGTGTGGAATGCTCAGCTCATCCGCTATGCTGGCTACCAGATGCCAGATGGCAGCATCAGAGGGGACCCTGCCAACGTGGAATTCACTCAGGTACCCGGCCCAGCCTCAGCCA*/GCCGGCCATTGGGGCGGGGAGCCCCGTGGTGAGCGAGTGACAGAGTGGAGCCCAGAGGAGACACGCAGCCCGGGCTTACAGACTCACAGGGCCCGTCTTGTTCCCCAGCTGTGCATC3’在上述序列中，SNP*用黑體表示。
表1

V.與疾病相關性分析42位HA本地居民、39位HAPE對照者和18位HAPE患者中SNP的分析揭示有三種基因型，即AA、AG和GG。這些等位基因的分布見表2小結(jié)。
表2

發(fā)現(xiàn)G等位基因頻率的順序為HA本地居民＞HAPE對照＞HAPE患者。生物統(tǒng)計學分析表明G等位基因與HA適應性以及A等位基因與該病明顯相關，如表3所示。在這里，使用差額比(OR)和95％可信區(qū)間作為基因型組合與此病之間相關性強度的一種衡量。認為P值＜0.05具有統(tǒng)計學差異。
表3

負責合成一氧化氮的一氧化氮合酶需要氧氣作為反應中的輔助因子。氧氣與iNOS中的加氧酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而合成NO，在低氧條件下，缺氧可導致較低的NO產(chǎn)生，然而，對該加氧酶結(jié)構(gòu)域中的酶活性修飾使得此酶不需要氧氣或需要較少的氧氣而正常產(chǎn)生NO。NO改善血紅蛋白的氧合作用和正常的NO產(chǎn)生可能涉及作用于適應性的機制，因而加氧酶結(jié)構(gòu)域中的改變有利于NO的產(chǎn)生。在本研究中，內(nèi)含子7中發(fā)現(xiàn)的新SNP靠近橫跨外顯子7至外顯子17的NOS2基因的加氧酶結(jié)構(gòu)域。很可能發(fā)現(xiàn)的SNP與附近的SNP有連鎖失平衡，導致最終影響到NOS2基因產(chǎn)生NO。
VI.診斷試劑盒本發(fā)明還提供診斷試劑盒，該試劑盒包括至少一個或多個SEQ ID 2和3所述的等位基因特異性寡核苷酸。通常，該試劑盒包括一對或多對能與不同多態(tài)性形式的等位基因雜交的等位基因特異性寡核苷酸。在一些試劑盒中，該等位基因特異性寡核苷酸被固定在基質(zhì)上。例如，同一基質(zhì)還可含等位基因特異性寡核苷酸探針，至少用于檢測表1中所示的多態(tài)性。試劑盒任選包括其它組分，例如，限制性內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或聚合酶、底物三磷酸核苷、標記方法(例如，當標記是生物素時，親和素酶偶聯(lián)物與酶底物和顯色原)，以及用于逆轉(zhuǎn)錄、PCR或雜交反應的合適的緩沖液。通常，該試劑盒還包括實施這些方法的說明書。
VII.核酸載體變體基因可在表達載體中表達，該載體中，變體基因與天然啟動子或其它啟動子可操作性相連接。通常，所述啟動子是能在哺乳動物細胞中表達的真核細胞啟動子。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列一般包括可被宿主識別的異源啟動子和任選的增強子。合適的啟動子如trp、lac、噬菌體啟動子、糖酵解酶啟動子和tRNA啟動子的選擇取決于所選宿主。也可使用市售表達載體。合適的宿主細胞包括細菌，如大腸桿菌、酵母菌、絲狀真菌；昆蟲細胞；哺乳動物細胞，一般是能無限增殖的細胞，例如小鼠、CHO、人和猴細胞系及其衍生細胞。優(yōu)選宿主細胞能夠加工該變體基因產(chǎn)物，產(chǎn)生適當?shù)某墒於嚯摹１景l(fā)明還提供能夠表達外源性變體基因的非人轉(zhuǎn)基因動物，和/或?qū)⒃摶蚺c啟動子和任選的增強子可操作性相連接，并將該構(gòu)建物顯微注射入合子中?？赏ㄟ^形成轉(zhuǎn)基因?qū)崿F(xiàn)內(nèi)源性變體基因的滅活，該轉(zhuǎn)基因中，通過插入陽性選擇標記使克隆的變體基因滅活。然后，將該轉(zhuǎn)基因引入胚胎干細胞，在胚胎干細胞中與內(nèi)源性變體基因同源重組。小鼠和其它嚙齒動物是優(yōu)選動物。這些動物可提供有用的藥物篩選系統(tǒng)。因此，本發(fā)明的主要實施方式涉及檢測高原肺水腫(HAPE)易感性的方法，所述方法包括以下步驟(a)監(jiān)測高原肺水腫相關癥狀選擇研究對象，(b)用常規(guī)方法提取研究對象白細胞的基因組DNA，(c)分別設計和合成SEQ ID No.2和SEQ ID No.3正向和反向寡核苷酸引物，擴增SEQ ID No.1人iNOS基因的內(nèi)含子7，(d)與已有的人iNOS基因進行比較，經(jīng)計算機鑒定新的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，(e)用上述SEQ ID No.2(正向引物)和SEQ ID 3(反向引物)引物，篩檢高海拔居住人群(HA本地居民)、低地居民(HAPE對照)和低地HAPE患者的新單核苷酸多態(tài)性，(f)計算步驟(e)人群中AA、AG和GG基因型的頻率，建立基因型與高海拔肺水腫的相關性，以及
(g)預測和統(tǒng)計學分析人群中該等位基因變體(AA、AG和GG基因型)的分布差異，其中，19480位是GG基因型時高原肺水腫低風險，19480位是AA基因型時該病高風險。
本發(fā)明的另一個實施方式涉及選自以下的能夠擴增人iNOS基因內(nèi)含子7的寡核苷酸引物(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQ ID No.2)，正向引物，和(b)5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ ID No.3)，反向引物。
本發(fā)明的另一個實施方式涉及選自以下的包含一個或多個多態(tài)性位點的寡核苷酸引物(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQ ID No.2)，正向引物，和(b)5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ ID No.3)，反向引物。
本發(fā)明的又一個實施方式涉及等位基因變體，這些變體中，iNOS基因的所述等位基因變體具有AA、AG和GG基因型一種檢測具有高原肺水腫(HAPE)易感性SNP基因型的診斷試劑盒，所述試劑盒包括引物和探針(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQ ID No.2)，正向引物(b)5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ ID No.3)，反向引物本發(fā)明的另一個實施方式涉及適合擴增含一個或多個多態(tài)性位點的iNOS基因區(qū)域的引物，所述引物包括(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQ ID No.2)，正向引物(b)SEQ ID 35′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ IDNo.3)，反向引物本發(fā)明的另一個實施方式涉及含iNOS基因的等位基因變體的核酸載體。
提供以下實施例來示例性描述本發(fā)明，不應理解為限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1鑒定標記基因考慮到NA中NO的重要功能，選擇iNOS(可誘導的一氧化氮合酶)作為本研究的候選基因。
實施例2研究對象的選擇用Lake Louise急性高山病(AMS)計分系統(tǒng)，評價HAPE的臨床嚴重性。簡要地說，評價了患者的五種癥狀頭痛，胃腸不適，疲勞、虛弱、或疲勞虛弱，眩暈、頭暈、或眩暈頭暈，和睡眠困難。也評價精神狀態(tài)的改變、共濟失調(diào)和外周性水腫。每種癥狀評定為0-3分。0分表示無癥狀；1分，輕微癥狀；2分，中度癥狀；3，嚴重癥狀。HAPE評分是所有8種癥狀的總和，HAPE評分＞6為患者(Anand IS等1998)。地低居民(LL)即使在高海拔下誘導至少三次也沒有發(fā)現(xiàn)任何上述癥狀。高海拔(HA)居民是來自遠古時期的HA永久居民。
實施例3提取白細胞基因組DNA采用鹽析方法提取血細胞基因組DNA。在高鹽存在下溶解血紅細胞后，用細胞核裂解緩沖液(NLB)處理。采用改進的鹽析方法，沉淀蛋白質(zhì)并提取外周血白細胞DNA。測定樣品波長260nm光密度，確定DNA的濃度(Miller SA等1988)。
實施例4鑒定iNOS基因的等位基因變體本實施例描述了用本發(fā)明的寡核苷酸引物作PCR和序列測定來鑒定iNOS基因的等位基因變體。然后用以下寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應擴增該DNA1. 5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC3′(如SEQ ID NO2所示)和2. 5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG3′(如SEQ ID NO3所示)。
采用以下條件進行聚合酶鏈反應步驟1，94℃4分鐘步驟2，94℃30秒步驟3，62.5℃30秒步驟4，72℃45秒步驟5，步驟2的34倍步驟6，72℃持續(xù)10分鐘在Perkin Elmer GeneAmp PCR系統(tǒng)9600中進行PCR。用2％瓊脂糖凝膠電泳分析該反應產(chǎn)生的258bp DNA片段。采用Amersham Pharmacia凝膠提取試劑盒(Amersham)純化切割自瓊脂糖凝膠條帶中的PCR產(chǎn)物，并且，在ABI Prism 377自動化DNA測序儀上用染料終止化學法對PCR產(chǎn)物的兩條鏈進行直接測序。PCR產(chǎn)物與人iNOS基因序列相同，除了表1所示的一對新堿基改變外。
實施例5iNOS基因的等位基因變體的核苷酸序列使用如實施例1所述的方法，得到iNOS基因的等位基因變體的核苷酸序列5’CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC TTC CGG GTG TGG AAT GCT CAGCTC ATC CGC TAT GCT GGC TAC CAG ATG CCA GAT GGC AGC ATC AGAGGG GAC CCT GCC AAC GTG GAA TTC ACT CAG GTA CCC GGC CCA GCCTCA GCC A*/GCC GGC CAT TGG GGC GGG GAG CCC CGT GGT GAG CGA GTGACA GAG TGG AGC CCA GAG GAG ACA CGC AGC CCG GGC TTA CAG ACT在上述序列中，SNP*以黑體表示。
實施例6G等位基因與適應性相關，A等位基因與疾病相關采用如實施例4所述的方法，對一系列提取自HA本地居民、HAPE對照和HAPE患者的DNA樣品進行測定。發(fā)現(xiàn)G等位基因與HA適應性以及A等位基因與疾病高度明顯相關。結(jié)果小結(jié)于下表

因此，具有GG基因型的個體是HAPE低風險，而具有AA基因型的個體是HAPE高風險，也可推斷到其它人群。
實施例7含iNOS變體序列的核酸載體制備含有一個或多個表1所示多態(tài)性位點的iNOS基因的等位基因變體轉(zhuǎn)染的載體和宿主細胞，如下所述。
變體基因可在表達載體中表達，該載體中，變體基因與天然啟動子或其它啟動子可操作性相連接。通常，所述啟動子是能在哺乳動物細胞中表達的真核細胞啟動子。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列一般包括可被宿主識別的異源啟動子和任選的增強子。合適的啟動子如trp、lac、噬菌體啟動子、糖酵解酶啟動子和tRNA啟動子的選擇取決于所選宿主。也可使用市售表達載體。合適的宿主細胞包括細菌，如大腸桿菌、酵母菌、絲狀真菌；昆蟲細胞；哺乳動物細胞，一般無限增殖的細胞，例如小鼠、CHO、人和猴細胞系及其衍生細胞。優(yōu)選宿主細胞能夠加工該變體基因產(chǎn)物，產(chǎn)生適當?shù)某墒於嚯摹?br> 本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明對治療HAPE具有以下附加的優(yōu)點。
1.可誘導的一氧化氮合酶可作為HAPE研究的一種新標記物。
2.負責擴增含新的SNP的PCR產(chǎn)物的新型引物序列。
3.可用于進一步相關性研究的新SNP(19480A/G)。
4.野生型等位基因(A)與該病明顯相關(表2和3)。
5.突變等位基因(G)與適應性明顯相關(表2和3)。
6.HA本地居民和HAPE對照的等位基因頻率之間存在明顯的差異(表2和3)。
7.G等位基因的存在使個體患此病的可能性減小。
8.可幫助個體出于各種原因決定是否訪問高海拔地區(qū)。
下面提供了SEQ ID No.1、2和3的序列表信息序列表一般信息申請人CSIR發(fā)明名稱檢測高原肺水腫(HAPE)易感性的方法序列編號03通訊地址lnstitute of genomics and integrative biology，CSIR，DelhiUniversity Campus，MallRoad-110007，lndia.
電話+91-11-27666156 傳真+91-11-27667471SEQ ID NO.1的信息1.序列特征1.長度258bp2.類型DNA5’CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC TTC CGG GTG TGG AAT GCT CAGCTC ATC CGC TAT GCT GGC TAC CAG ATG CCA GAT GGC AGC ATC AGAGGG GAC CCT GCC AAC GTG GAA TTC ACT CAG GTA CCC GGC CCA GCCTCA GCC A*/GCC GGC CAT TGG GGC GGG GAG CCC CGT GGT GAG CGA GTGACA GAG TGG AGC CCA GAG GAG ACA CGC AGC CCG GGC TTA CAG ACTCAC AGG GCC CGT CTT GTT CCC CAG CTG TGC ATC 3’3.生物體智人(人類)4.直接來源PCR5.名稱/關鍵詞標記區(qū)域6.序列編號1SEQ ID NO2的信息1.序列特征長度24bp類型DNA5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′生物體人工序列直接來源合成名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸序列編號2SEQ ID NO3的信息1.序列特征長度24bp類型DNA5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′生物體人造序列直接來源合成名稱/關鍵詞合成的寡核苷酸序列編號3
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權(quán)利要求
1.一種檢測高原肺水腫(HAPE)易感性的方法，所述方法包括以下步驟(a)通過監(jiān)測高原肺水腫相關癥狀選擇研究對象，(b)用常規(guī)方法提取研究對象白細胞的基因組DNA，(c)分別設計和合成SEQ ID No.2和SEQ ID No.3正向和反向寡核苷酸引物，擴增SEQ ID No.1人iNOS基因的內(nèi)含子7，(d)與已有的人iNOS基因序列進行比較，用計算機鑒定新的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，(e)用上述SEQ ID No.2(正向引物)和SEQ ID 3(反向引物)的引物篩檢高海拔居住人群(HA本地居民)、低地居民(HAPE對照)和低地HAPE患者的新單核苷酸多態(tài)性，(f)計算步驟(d)人群中AA、AG和GG基因型的頻率，建立基因型與高海拔肺水腫的相關性，以及(g)預測并統(tǒng)計學分析人群中所述等位基因變體(AA、AG和GG基因型)的分布差異，其中，19480位是GG基因型時高原肺水腫低風險，19480位是AA基因型時該病高風險。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述能夠擴增人iNOS基因內(nèi)含子7的寡核苷酸引物選自(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQ ID No.2)，正向引物，和(b)5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ ID No.3)，反向引物
3.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述含有一個或多個多態(tài)性位點的寡核苷酸引物選自(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQ ID No.2)，正向引物，和(b)5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ ID No.3)，反向引物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述iNOS基因等位基因變體具有AA、AG和GG基因型。
5.一種檢測具有高原肺水腫(HAPE)易感性的SNP基因型的診斷試劑盒，所述試劑盒包括以下引物和探針(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQID No.2)，正向引物(b)5′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ ID No.3)，反向引物。
6.一對適合擴增含一個或多個多態(tài)性位點的iNOS基因區(qū)域的引物，所述引物包括(a)5′CAG CGG AGT GAT GGC AAG CAC GAC 3′(SEQ ID No.2)，正向引物，(b)SEQ ID 35′GAT GCA CAG CTG GGG AAC AAG ACG 3′(SEQ IDNo.3)，反向引物。
7.含iNOS基因等位基因變體的核酸載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測高原肺水腫(HAPE)易感性的方法。具體涉及iNOS(可誘導的一氧化氮合酶)基因的等位基因變體，發(fā)現(xiàn)其與HAPE的流行相關。
文檔編號C12Q1/68GK1898394SQ200380110865
公開日2007年1月17日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者A·Q·M·帕夏, A·阿赫桑 申請人:科學工業(yè)研究委員會