專利名稱：抑制酵母生長(zhǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制酵母的生長(zhǎng)。特別地，公開了用于抑制酵母生長(zhǎng)及預(yù)防和治療酵母引起的疾病的產(chǎn)品和方法。
背景技術(shù)：
酵母經(jīng)常存在于人類居住環(huán)境和器官系統(tǒng)中。甚至，健康的個(gè)體也有生長(zhǎng)在粘膜上和胃腸道整個(gè)區(qū)域中的白色念珠菌(Candida albicans)(Shay K，Truhlar MR，Renner RP.老人中的口咽念珠菌病.J Am GeriatrSoc 1997；45863-870)?？谇缓脱例X之間的組織也給大量物種的微生物提供了優(yōu)良的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，例如，其中可以發(fā)現(xiàn)的微生物是白色念珠菌(Candidaalbicans)物種，較少數(shù)量的光滑念珠菌(C.glabrata)和熱帶念珠菌(C.tropicalis)酵母。正常地，酵母細(xì)胞處于鈍態(tài)，并且它們的生長(zhǎng)不會(huì)傷害健康個(gè)體。在不利情況下，酵母諸如白色念珠菌(C.albicans)開始形成菌絲，因此更深地穿透到粘膜中。這引起了局部酵母感染，在口腔中這表現(xiàn)為例如口腔念珠菌病，口炎或舌炎。
通常酵母感染前是下降的抵抗力，這可以由糖尿病、惡性腫瘤、免疫缺陷或一些藥物，例如廣譜抗生素、皮質(zhì)類固醇或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑引起?？谇晃⑸锿ㄟ^血液循環(huán)攜帶方式容易傳播到器官系統(tǒng)的其它部分，特別是在一般性健康狀態(tài)已經(jīng)惡化的人中，這可能產(chǎn)生嚴(yán)重的后果，諸如敗血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎(Shay等1997)。
人類中酵母感染的最常見和最重要的原因是白色念珠菌(Candidaalbicans)(Mkel等.1988.Lketieteellinen mikrobiologia(Medicalmicrobiology)，第5次修訂版，270-271頁.Published by Kustannus OyDuodecim 1988)。在健康人胃腸道中可以比較經(jīng)常地發(fā)現(xiàn)白色念珠菌(C.albicans)30到50％的人的口腔中帶有該酵母，約1％的在健康皮膚上和尿道中帶有該酵母。偶爾也可以發(fā)現(xiàn)念珠菌屬(Candida)的其它物種，最重要的念珠菌屬(Candida)物種是熱帶念珠菌(C.tropicalis)，假熱帶念珠菌(C.pseudotropicalis)，近平滑念珠菌(C.parapsilosis)，克魯斯氏念珠菌(C.krusei)，和季也蒙氏念珠菌(C.guilliermondi)，它們與白色念珠菌(C.albicans)相似，是人類中的機(jī)會(huì)病原體(Mkel等，1988)。
老年人通?；加卸喾N疾病，這些疾病和用于治療所述疾病的藥物一起可能削弱他們的免疫力，同時(shí)還有他們的牙齒健康(Pajukoski H，MeurmanJH，Snellman-Grhn S，Sulkava R.醫(yī)院和非醫(yī)院社區(qū)居住的老年患者的口腔健康.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Ra-diol Endod 199988437-443)。此外，不健康的口腔衛(wèi)生也會(huì)使老人受到酵母感染(Budtz-Jorgensen E，Mojon P，Banon-Clement JM，Baehni P.長(zhǎng)期住院治療中的口腔念珠菌病無齒和有齒個(gè)體比較.Oral Dis 1996；2285-290)。老化本身增加了酵母的出現(xiàn)和其數(shù)量，這表明器官系統(tǒng)抑制酵母生長(zhǎng)的能力隨著年齡而減弱(Lockhart SR，Joly S，Vargas K，Swails-Wenger J，Enger L，Soil DR.老年人口腔中對(duì)抗念珠菌定居的天然防御的崩潰.J DentRes 1999；78857-868)。
居住在芬蘭，赫爾辛基的老人中，在75％的老人中發(fā)現(xiàn)了酵母生長(zhǎng)，在33％的老人中發(fā)現(xiàn)了高數(shù)量的酵母生長(zhǎng)(Nrhi TO，Ainamo A，Meurman JH.老人中的唾液酵母、唾液和口腔粘膜.J Dent Res 1993；721009-1014)。在帶有酵母的老人中，發(fā)現(xiàn)60％的老人有念珠菌屬(Candida)酵母感染(Wilkieson C，Samaranayake LP，MacFarlane TW，Larney PJ等.長(zhǎng)期住院治療的老人中口腔念珠菌病.J Oral Pathol Med 1991；2013-16)。排在白色念珠菌(Candida albicans)之后的最常見的酵母是平滑念珠菌(C.glabrata)(29％)，熱帶念珠菌(C.tropicalis)(13％)，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(11％)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)(89％)(Lockhart等.1999)。
引起口腔酵母生長(zhǎng)增加的一個(gè)重要因素是減少的唾液分泌(Nrhi等.1993)。老化影響的5年跟蹤研究表明隨著老化，刺激的總唾液分泌減少，而緩沖能力(buffer capacity)增加(Nrhi TO，Kurki N，Ainamo A.5年跨度研究——在家居住的老人的唾液、唾液微生物和口腔健康，J Dent Res 1999；781640-1646)。內(nèi)分泌疾病和藥物的大量應(yīng)用尤其會(huì)減少唾液分泌(Pajukoski H，Meurman JH，Snellman-Grhn S.Keinnen S，Sulkava R.急性老人護(hù)理病房中老年患者中的唾液流和組成.Oral Surg Oral Med OralPathol Oral Radiol Endod 1997；84265-71)。唾液分泌率和緩沖能力降低的人，酵母含量明顯較高(Nrhi等.1993)。芬蘭老人的唾液分泌率在0.6和1.0ml/mm之間變化(Pajukoski等.1997)；發(fā)現(xiàn)多達(dá)55％的老人具有減少的唾液分泌(＜0.7ml/mm)，并且34％老人具有低的緩沖能力(Pajukoski等.1997)。
常規(guī)用抗真菌劑，諸如制霉菌素治療念珠菌病，并且在更嚴(yán)重的情況下，用氟康唑或伊曲康唑治療(Shay等，1997)。而且，更有效的口腔衛(wèi)生能夠減少長(zhǎng)期處于護(hù)理中的老年人的口腔粘膜中念珠菌的集群(Budtz-Jorgensen E，Mojon P，Rentsch A，Deslauriers N.口腔健康程序?qū)﹂L(zhǎng)期療養(yǎng)所中口腔念珠菌病發(fā)生的影響.Community Dent Oral Epidemiol2000；28141-149)。雙氯苯雙胍己烷/木糖醇口香糖的使用也能使酵母的數(shù)量減少22％(Simons D，Kidd EAM，Beighton D，Jones B.雙氯苯雙胍己烷/木糖醇口香糖對(duì)生齲齒唾液微生物菌群的作用老年患者中的臨床試驗(yàn).Caries Res 1997；3191-96)。
一些群體諸如長(zhǎng)期護(hù)理的患者和老人由于降低的免疫力，營(yíng)養(yǎng)不良和慢性疾病也易受一般的感染。此外，發(fā)現(xiàn)老年人中口腔衛(wèi)生和口腔微生物菌群與下呼吸道感染，諸如肺炎和支氣管炎有關(guān)(參見，Scannapieco FA.口腔細(xì)菌在呼吸感染中的作用，J Periodontol 1999；70793-802)。推測(cè)，感染由致病性微生物通過呼吸從口腔轉(zhuǎn)移到呼吸道而引起。影響長(zhǎng)期護(hù)理患者的最常見感染是上和下呼吸道感染(70％)，尿道感染(12％)，胃腸炎和腹瀉(12％)及皮炎和軟組織感染(6％)(Orr PH，Nicolle LE，Duckworth H，Brunka J，Kennedy J，Murray D等.養(yǎng)老院老人中發(fā)熱性泌尿系統(tǒng)感染.Am J Med 1996；10071-77)。衛(wèi)生保健的介入能將長(zhǎng)期住院護(hù)理的老人的上呼吸道感染減少16％(Makris AT，Morgan L，Gaber DJ，Richter A，Rubino JR，綜合感染控制方法對(duì)長(zhǎng)期護(hù)理院中的感染發(fā)生率的影響.Am J Infect Control 2000；283-7)。
酵母出現(xiàn)的另一個(gè)主要區(qū)域是生殖區(qū)；特別是在女性中常見酵母感染。最常見的婦科學(xué)癥狀是陰道炎；它也是尋求醫(yī)療咨詢的患者的主要癥狀之一(Mkel等.1988)。陰道炎最常由細(xì)菌引起，其次的最常見因素是酵母真菌，其中最常出現(xiàn)的物種是白色念珠菌(C.albicans)和光滑念珠菌(C.glabrata)。白色念珠菌(Candida albicans)是一種屬于陰道正常微生物菌群的酵母，正常地它不引起感染。通常，陰道的細(xì)菌菌群限制酵母生長(zhǎng)，但是在一些情況下，酵母生長(zhǎng)變得過度。引起酵母感染的危險(xiǎn)因素包括抗生素(特別是廣譜抗生素)的應(yīng)用，懷孕，糖尿病，引起免疫缺陷的疾病和皮質(zhì)類固醇的應(yīng)用。在婦科門診部，在10到20％的患者中可以發(fā)現(xiàn)酵母真菌，但是僅僅她們中一些人受到酵母引起的臨床外陰陰道炎影響。堿性pH有利于酵母生長(zhǎng)。酵母的毒力取決于例如，酵母含量，它的菌絲體侵入，它的類固醇受體和酵母形成蛋白酶的能力。研究已經(jīng)表明真菌菌絲能穿透陰道上皮(Mkel等.1988)。
已經(jīng)使用乳酸菌，它們對(duì)預(yù)防陰道炎具有不同的結(jié)果。6個(gè)月酸奶攝取減少了念珠菌建群和陰道炎的發(fā)生(Hilton等.1992，攝食含有嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的酸奶預(yù)防念珠菌陰道炎.Ann Intem Med1992；116353-357)。另一方面，根據(jù)Shalev小組(1996)進(jìn)行的研究，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)酸奶與巴氏滅菌酸奶比較，減少了細(xì)菌引起的陰道炎，而不是念珠菌屬酵母引起的陰道炎(Shalev等.1996.攝食含有嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)的酸奶與攝食巴氏滅菌酸奶比較對(duì)復(fù)發(fā)性念珠菌陰道炎和細(xì)菌性陰道病的預(yù)防.Arch Fam Med 1996；5.593-596；Sieber R，Dietz U-T.細(xì)菌性陰道病預(yù)防和治療中的嗜酸乳桿菌和酸奶.Int Dairy J 1998；8599-607；也參見Redondo-Lopez等.1990.乳桿菌在陰道細(xì)菌微生物菌群的控制和維持中的新作用，Rev Infect Dis 1990；12856-872)。
酵母真菌也引起尿道炎。
幾個(gè)研究已經(jīng)表明20-40％的人在胃腸道中帶有白色念珠菌(Lennette等.1985.臨床微生物學(xué)手冊(cè)，第4版.American Society for Microbiology，Washington D.C.，1985)。酵母在胃腸道中的過度生長(zhǎng)通常顯現(xiàn)為腹瀉。
術(shù)語“酵母綜合癥”通常指胃腸道中白色念珠菌(Candida albicans)增加的生長(zhǎng)，據(jù)認(rèn)為該增加的生長(zhǎng)可以抑制免疫系統(tǒng)，并且引起不同的綜合癥。酵母過度生長(zhǎng)與多種系統(tǒng)性癥狀，諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、不同的疼痛、疲勞和腸道癥狀有關(guān)。據(jù)認(rèn)定所述癥狀是由于酵母釋放的毒素引起的。然而，在這些癥狀和酵母之間尚不存在科學(xué)的相關(guān)性證據(jù)。用低碳水化合物、無酵母的飲食，可能地有利的酸化的和/或富含纖維的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)治療酵母綜合癥。特別地，酸化食物和酸化乳制品形成了飲食治療的重要成分。因此，乳酸細(xì)菌常常用于平衡擾亂的腸內(nèi)菌群。
因此，酵母間接地和直接地引起許多種類的疾病。因此，持繼需要發(fā)現(xiàn)新的方法以抑制酵母生長(zhǎng)和活性，預(yù)防和治療酵母引起的疾病，和緩解酵母相關(guān)的癥狀。
做為藥物治療的替代方案或者附加方案，現(xiàn)今在進(jìn)行利用其它衛(wèi)生保健方法的嘗試。最近的方法之一是利用實(shí)際上已受到消費(fèi)者熱烈歡迎的促進(jìn)健康的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或天然產(chǎn)品。因此，將抑制酵母生長(zhǎng)和活性的促進(jìn)健康的產(chǎn)品添加至一系列市售產(chǎn)品中是高度受歡迎的。優(yōu)選地，這些產(chǎn)品應(yīng)該是令人喜受的，并且是消費(fèi)者有些熟悉的，從而使得例如消費(fèi)者容易采用它們做為正常的每日飲食的一部分。
在現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中描述了益生菌做為抗微生物劑的作用。乳酸細(xì)菌能產(chǎn)生抗微生物的化合物、有機(jī)酸、乳酸、脂肪酸、過氧化氫、雙乙酰、二氧化碳和細(xì)菌素，這使得它們能抑制致病性微生物的生長(zhǎng)(McGroarty JA.人類女性泌尿生殖道中乳桿菌的益生菌作用，F(xiàn)EMS Immunol MedMicrobiol 1993；6251-264)。有些嗜酸乳桿菌株系通過產(chǎn)生過氧化氫體外防止念珠菌生長(zhǎng)(Jack M，Wood JB，Berry DR.硫氰酸酯參與酸乳桿菌對(duì)白色念珠菌的抑制的證據(jù).Microbios 1990；6237-46；Fitzsimmons N，Berry DR.通過嗜酸乳桿菌抑制白色念珠菌過氧化物酶系統(tǒng)參與的證據(jù).Microbios 1994；80125-133)。已發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)LGG ATCC 53103也產(chǎn)生抗微生物的化合物，可能是短鏈脂肪酸，其體外抑制例如大腸桿菌(Escherichia coli)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，沙門氏菌屬(Salmonella)，鏈球菌屬(Streptococcus)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，梭菌屬(Clostridium)和雙歧桿菌屬(Bifidobacteriutm)的生長(zhǎng)(Silva M，Jacobus NV，Deneke C，Gorbach SL.來源于人類乳桿菌屬株系的抗微生物物質(zhì).Antimicrobial AgentsChemother 1987；311231-1233)。
乳酸細(xì)菌也可以阻止其它微生物附著到上皮細(xì)胞上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外條件下，一些嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)和干酪乳桿菌(L.casei)株系阻止22-46％白色念珠菌附著到尿道上皮細(xì)胞(uroepithelialcell)上(Reid G，Tieszer C，Lam D.乳桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)和白色念珠菌(C.albicans)附著到纖維和上皮細(xì)胞上的影響.J Indust Microbiol 1995；15248-253)。在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LGG通過刺激細(xì)胞介導(dǎo)的白色念珠菌抗體免疫應(yīng)答可以減少小鼠胃腸道中白色念珠菌的數(shù)量和口腔區(qū)域的念珠菌病(Wagner RD，Pierson C，Warner T，Dohnalek M，F(xiàn)armer J，Roberts L等.免疫缺陷小鼠中益生細(xì)菌對(duì)念珠菌病的生物治療作用.Infect Immun 1997；654165-4172；Wagner RD，Pierson C，Warner T，Dohnalek M，Hilty M，Balish E.喂食熱滅活的嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌對(duì)定居了白色念珠菌的免疫缺陷小鼠的益生菌作用.J Food Protect 2000；63638-644)。
已發(fā)現(xiàn)乳桿菌LC 705和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種(Propionibacteriumfreudenreichii ssp.shermanii)PJS一起作用時(shí)可以在酸奶和凝乳酪中抑制酵母生長(zhǎng)(Suomalainen T，Myr-Mkinen A.丙酸細(xì)菌做為發(fā)酵牛奶和面包中的保護(hù)性培養(yǎng)物.Lait 1999；79165-174)。
通過增加巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的活性，T和B細(xì)胞的數(shù)量和抗體比例，乳酸細(xì)菌和它們的細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以激活器官系統(tǒng)的抗性(Perdigon G，Alvarez s，Rachid M，Agüero G，Gobbato N.專題論文人類的益生細(xì)菌用于有效性評(píng)估的臨床系統(tǒng)；益生菌對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激.J Dairy Sci 1995；781597-1606)。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LGG增強(qiáng)腸道對(duì)有害細(xì)菌、病毒和酵母的正常抵抗力(Kaila M，Isolauri E，Soppi E等.人類乳桿菌株系對(duì)人類腹瀉中循環(huán)抗體分泌細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng).Pediatr Res 1992；32141-144；Wagner等.1997)。在動(dòng)物試驗(yàn)中，乳桿菌GG也增加了唾液中分泌性IgA含量(Negretti F，Casetta P，Clerici-Bagozzi D，Marini A.在兔中用乳桿菌GG口服治療后關(guān)于腸和系統(tǒng)免疫應(yīng)答的研究.Phisiopath Clin 1997；715-21)。已知粘膜的分泌性IgA保護(hù)呼吸道、胃腸道和泌尿生殖器官不受感染(Nagura H.粘膜防御機(jī)理和分泌性lgA系統(tǒng)，Bifidobacteria Microflora1990；917-25)。因此，乳酸細(xì)菌也可以減少呼吸道和胃腸道感染，在對(duì)日托兒童進(jìn)行的研究中已經(jīng)獲得了這種指示((Hatakka K，Savilahti F，PnkA，Meurman JH，Poussa T，Nse L，Saxelin M，Korpela R.長(zhǎng)期食用益生菌牛奶對(duì)參加日托中心的兒童的感染的影響雙盲隨機(jī)試驗(yàn).在2000年5月提交給BMJ)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明目的是提供能夠抑制或減少人類和動(dòng)物中酵母生長(zhǎng)和活性的手段。通過如獨(dú)立權(quán)利要求中所述特征的本發(fā)明的產(chǎn)品，用途和方法達(dá)到該目的。從屬權(quán)利要求中公開了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。
本發(fā)明基于利用特定的益生菌抑制酵母生長(zhǎng)和活性，預(yù)防和治療酵母引起的疾病和緩解人類和動(dòng)物中酵母相關(guān)的癥狀。
因此，本發(fā)明涉及微生物鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)LGG，ATCC 53103，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)LC705，DSM 7061和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種(Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii)PJS，DSM 7067用于抑制人類和動(dòng)物中的酵母的用途。
對(duì)于本發(fā)明的目的，可以單獨(dú)或聯(lián)合攝取這些細(xì)菌?？梢跃痛?，例如以凍干產(chǎn)品形式攝取這些細(xì)菌，或者這些細(xì)菌可以用做可食性產(chǎn)品，諸如乳制品和飲料的添加劑或組分。對(duì)于制備菌株聯(lián)合，可以使用每種細(xì)菌的混合培養(yǎng)物或純培養(yǎng)物。也可以制備單位劑量形式諸如膠囊形式的組合。膠囊可以含有優(yōu)選地凍干培養(yǎng)物形式的所有上述細(xì)菌，或者可以制備一系列3種膠囊，每種膠囊一種細(xì)菌。
因此，本發(fā)明也涉及細(xì)菌鼠李糖乳桿菌LGG，ATCC 53103，干酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei ssp.rhamnosus)LC705，DSM 7061和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS，DSM 7067用于制備抑制酵母的產(chǎn)品的用途。
產(chǎn)品可以是例如，食品工業(yè)產(chǎn)品或制藥工業(yè)產(chǎn)品，或者促進(jìn)健康的產(chǎn)品或天然產(chǎn)品。優(yōu)選的產(chǎn)品包括促進(jìn)健康的奶制品諸如干酪，其中與產(chǎn)品制造相關(guān)向其中添加微生物。這些微生物也可以用作引子(starter)和作為構(gòu)成干酪或其它產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的元件。第二組優(yōu)選的產(chǎn)品包括藥物制劑，特別是片劑和膠囊，它們除了含有上述微生物外，還含有這些產(chǎn)品中常常使用的助劑和添加劑，并且也可能含有其它活性組分。特別地，優(yōu)選的產(chǎn)品包括口服食用的制劑，諸如片劑和膠囊，它們除了含有LGG，LC705和PJS外，還含有木糖醇。除了本發(fā)明使用的微生物外，產(chǎn)品也可以含有其它微生物。
這里公開的細(xì)菌、組合和其它產(chǎn)品對(duì)出現(xiàn)在人類器官系統(tǒng)中的酵母的生長(zhǎng)和活性有作用，并且它們可以預(yù)防酵母感染。因此，它們可以用于預(yù)防酵母引起的病癥和疾病，用于緩解與此相關(guān)的癥狀，和用于一般的健康改善。
本發(fā)明還涉及在人類和動(dòng)物中抑制酵母生長(zhǎng)和預(yù)防或治療酵母引起的疾病或緩解酵母相關(guān)癥狀的方法，該方法包括以足以產(chǎn)生期望效果的量給需要的個(gè)體施用微生物鼠李糖乳桿菌LGG，ATCC 53103，干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC705，DSM 7061和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS，DSM 7067。
發(fā)明詳述因此，本發(fā)明涉及特定益生力用于抑制人類或動(dòng)物器官系統(tǒng)中的酵母生長(zhǎng)和活性的用途。
益生菌是活的微生物，當(dāng)將其施用給人類或動(dòng)物時(shí)，其通過改善腸內(nèi)微生物平衡可以促進(jìn)宿主健康；在這方面，或者除了這方面外，益生菌還可以具有許多其它有用的特性。
最重要的益生菌是乳酸細(xì)菌，丙酸細(xì)菌和雙歧桿菌。這些細(xì)菌本質(zhì)上屬于人類和動(dòng)物的器官系統(tǒng)。乳桿菌是人類器官系統(tǒng)正常細(xì)菌菌群中重要的部分(Redondo-Lopez V，Cook RL，Sobel JD.乳桿菌在陰道細(xì)菌微生物菌群控制和維持中的新作用.Rev Infect Dis 1990；12856-872)。而丙酸細(xì)菌出現(xiàn)在皮膚上和胃腸道中(MacFarlane GT，Allison C，Gibson SAW，Cummings JH.微生物菌群有助于人類大腸中蛋白質(zhì)水解.J Appl Bacteriol1988；6437-46)。由于它們的安全性和促進(jìn)健康的作用，益生菌常常用在食品中。
在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了本發(fā)明將要使用的鼠李糖乳桿菌LGG，ATCC 53103，干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC705，DSM 7061和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS，DSM 7067。
例如，在美國(guó)專利5,032,399，Gorbach & Goldin中描述了鼠李糖乳桿菌GG(LGG)。已經(jīng)從人糞便分離了該株系，它能在pH3中很好地生長(zhǎng)，并且即使在更低pH值及高膽汁酸含量下它也能存活。該株系顯示了對(duì)粘液和上皮細(xì)胞優(yōu)良的附著。從葡萄糖產(chǎn)生乳酸的產(chǎn)率良好當(dāng)在MRS肉湯中生長(zhǎng)時(shí)，該株系產(chǎn)生1.5-2％的乳酸。該株系不發(fā)酵乳糖。該株系利用下面的碳水化合物D-阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、半乳糖醇、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖(慢慢地)、海藻糖、松三糖、龍膽二糖、D-塔格糖、L-巖藻糖和葡糖酸。在+15-45℃，該株系生長(zhǎng)良好，最適溫度是30-37℃。鼠李糖乳桿菌GG保藏在保藏機(jī)構(gòu)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)是ATCC 53103。
鼠李糖乳桿菌GG是人體中的天然細(xì)菌株系，并且已經(jīng)廣泛地研究了它的益生菌作用(Saxelin M.乳桿菌GG-具有詳盡臨床文獻(xiàn)記載的人類益生菌.Food Rev Int 1997；13293-313)。它在胃腸道中保持生活力，并且能臨時(shí)定居在腸內(nèi)(Goldin BR，Gorbach SL，Saxelin M，Barakat S，Gualtieri L，Salminen S.人類胃腸道中乳桿菌屬物種(株系GG)的存活.Dig Dis Sci 1992；37121-128)。LGG看起來至少也能臨時(shí)定居在口腔中，因?yàn)闉槠?天的LGG酸奶攝取結(jié)束后，長(zhǎng)達(dá)兩周長(zhǎng)的時(shí)間在受試者的唾液中發(fā)現(xiàn)了該細(xì)菌(Meurman JH，Antila H，Salminen S.在食用乳桿菌GG(ATCC 53103)制備的酸乳后，從健康志愿者唾液中回收該乳桿菌株系GG(ATCC 53103).Microbiol Ecol Health Dis 1994；7295-298)。目前，LGG被添加到大量商業(yè)銷售的酸奶和果汁產(chǎn)品(Gefilus)中。
在芬蘭專利92498，Valio Oy中更詳細(xì)地描述了干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC705。LC705是以鏈的形式存在的革蘭氏陽性短桿菌；同型發(fā)酵；弱蛋白水解；在+15-45℃，該株系生長(zhǎng)良好；不從精氨酸產(chǎn)生氨；是過氧氫酶陰性；當(dāng)在MRS肉湯(LAB M)中生長(zhǎng)時(shí)，該株系產(chǎn)生具有L(+)構(gòu)型光學(xué)活性的乳酸(1.6％)；該株系分解檸檬酸鹽(0.169％)，因此產(chǎn)生雙乙酰和3-羥基丁酮；該株系發(fā)酵至少下面碳水化合物(糖，糖醇)核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、鼠李糖、甘露醇、山梨糖醇、甲基-D-葡糖苷、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龍膽二糖、D-松二糖和D-塔格糖。LG705弱附著到粘液細(xì)胞上，但是適度地附著到上皮細(xì)胞上。在低pH和高膽汁酸含量中，該株系的生存力良好。該株系在5％的鹽度中存活良好，在10％的鹽度中存活得相當(dāng)好。干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC705保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM))，保藏號(hào)是DSM7061。
鼠李糖乳桿菌LC705可以例如用在瑞士埃曼塔爾干酪的制造中以防止梭菌(Clostridia)引起的丁酸發(fā)酵。該株系也用在食品中，在食品中，它做為酵母和霉菌生長(zhǎng)的抑制劑。在生物保存中，LC705株系與費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS聯(lián)合(FI92498)。
在芬蘭專利92498，Valio Oy中也更詳細(xì)地描述了費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種JS(PJS)。PJS是革蘭氏陽性短桿菌；它發(fā)酵葡萄糖、果糖、半乳糖和乳糖；它很好地發(fā)酵乳酸鹽；并且它的最適生長(zhǎng)溫度是32℃。該株系在低pH值和高膽汁酸含量中的生存力是優(yōu)良的。費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種JS保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM))，保藏號(hào)是DSM 7067。
除了根據(jù)本發(fā)明使用的微生物外，制造的產(chǎn)品也可以含有其它微生物，諸如乳業(yè)中所使用的引子中含有的微生物和益生菌。存在大量有文獻(xiàn)詳盡記載的引子菌株，這些菌株可以從生產(chǎn)者諸如丹麥的Hansen A/S和德國(guó)的Danisco/Wiesby GmbH商購(gòu)。
可以以純培養(yǎng)物或不同混合的培養(yǎng)物形式，利用常規(guī)方法培養(yǎng)本發(fā)明使用的微生物。可以就這樣使用培養(yǎng)物，或者如所期望的處理培養(yǎng)物，例如純化、濃縮、凍干或成品化以產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。例如，在公開的文獻(xiàn)FI92498和FI 20010157中詳細(xì)地描述了本發(fā)明所用微生物的制備。
根據(jù)本發(fā)明，足夠量的益生菌用于產(chǎn)生期望的酵母抑制作用。因此，可以例如，根據(jù)益生菌細(xì)胞的總數(shù)、總?cè)談┝亢彤a(chǎn)品的其它特性和組分，在大的范圍內(nèi)變化每種益生菌的數(shù)量。對(duì)于菌株組合，日劑量中益生菌含量通常是約106-1010cfu。
根據(jù)本發(fā)明，益生菌適于就這樣消費(fèi)，或者例如，在常規(guī)用于制備藥品的方法中制成膠囊、丸或片劑。本發(fā)明所用益生菌也可以添加到不同食用產(chǎn)品，諸如食品、飲料和糖食工業(yè)產(chǎn)品中，添加到健康促進(jìn)產(chǎn)品、天然產(chǎn)品等中。在本發(fā)明范圍中，含有特定益生菌的乳制品，特別地，干酪和涂抹食品、酸奶和其它酸化乳產(chǎn)品及兒童食品，果汁和湯、以及膠囊、丸和片被認(rèn)為是優(yōu)選的實(shí)施方式。
利用常規(guī)方法生產(chǎn)成品，其中在制備產(chǎn)品的過程中或在之后，在成品化過程中，添加益生菌。
進(jìn)行了試驗(yàn)以研究本發(fā)明所用益生菌抑制口腔酵母生長(zhǎng)的作用，其中所述試驗(yàn)在公開文獻(xiàn)中有更詳細(xì)的描述。這些酵母中最常見的一種酵母是白色念珠菌(Candida albicans)，它是酵母物種好的代表，并且廣泛地存在于人類生物體中，也是最有用的口腔和器官系統(tǒng)的其它部分中出現(xiàn)的其它酵母物種的模型生物體。實(shí)施例中所示結(jié)果表明本發(fā)明所用益生菌對(duì)口腔酵母數(shù)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低作用。根據(jù)初步的結(jié)果，顯然，本發(fā)明可以應(yīng)用于大程度地抑制、減少和減慢酵母的生長(zhǎng)和活性，其中該酵母也出現(xiàn)在器官系統(tǒng)的其它部分中，諸如腸道和泌尿生殖區(qū)中。
現(xiàn)在參考下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，提供這些實(shí)施例只是示例本發(fā)明，而不應(yīng)該認(rèn)為這些實(shí)施例以任何方式限制了本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1益生菌對(duì)白色念珠菌(Candida albicans)出現(xiàn)的影響該研究的主要目的是查明是否含有乳桿菌和丙酸細(xì)菌的益生菌聯(lián)合可以用于減少口腔中白色念珠菌的出現(xiàn)。選定含有活鼠李糖乳桿菌LGG，ATCC 53103，鼠李糖乳桿菌LC705，DSM 706l和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS，DSM 7067微生物的瑞士埃曼塔爾干酪(Emmental cheese)做為試驗(yàn)材料。選擇干酪是因?yàn)樗菍儆谌粘ｏ嬍车漠a(chǎn)品，它吃起來味道很好，并且根據(jù)本研究的目的容易分配。用做對(duì)照的干酪是荷蘭艾丹姆干酪(Edam cheese)，它不含有所述的三種細(xì)菌株系，但是含有正常的引子微生物，該引子微生物是乳球菌(Lactococci)。
入選240名個(gè)體用于該研究，他們的年齡從70歲到100歲。
該研究以安慰劑對(duì)照的雙盲試驗(yàn)形式實(shí)施，具有平行的研究組?？偟难芯科谑?9周，其中3周的導(dǎo)入期(run-in period)和16周的介入。在整個(gè)研究中禁止使用含有益生菌的食品。禁止的食品列表包括例如Emmental干酪和Polar干酪、凝乳酪、含有活乳酸菌的酸化乳產(chǎn)品、益生菌果汁和各種膠囊及相似的壓縮產(chǎn)品。
在整個(gè)研究期間，受試者堅(jiān)持他們通常的口腔衛(wèi)生習(xí)慣和他們正常的生活方式。
介入干酪介入持續(xù)了16周(wk)。在該期間，每天，一半受試者食用50g(＝6-7片)含有益生菌的干酪，另一半食用相同量的對(duì)照干酪。在早餐和晚餐，用藥和洗牙后食用未加熱的干酪。益生菌干酪含有107cfu/g鼠李糖乳桿菌LGG，107cfu/g鼠李糖乳桿菌LC705，和107cfu/g費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS。因此，細(xì)菌總數(shù)是109-1010cfu/天。
臨床口腔對(duì)照進(jìn)行口腔對(duì)照，并且在受試者居住的養(yǎng)老院/療養(yǎng)所取唾液樣品。臨床檢查包括記錄填充牙(filled teeth)和除去的牙(removedteeth)及齲齒(DMF)。也檢查牙周組織的情況，并且根據(jù)CPI指數(shù)分類。如果在口腔粘膜中有變化，記錄這些變化(包括感染、變色、創(chuàng)傷、苔癬樣損傷和潰瘍，增生、粘膜白斑(leucoplakia)、粘膜紅斑和其它變化)。在研究開始(0wk)和研究結(jié)束(16wk)時(shí)都進(jìn)行臨床對(duì)照。
唾液樣品在每天早晨，上午8點(diǎn)和11點(diǎn)間取唾液樣品以測(cè)定酵母、唾液分泌率和緩沖能力?？偸菄L試在相同時(shí)間從各個(gè)體取樣。在取樣前l(fā)小時(shí)，不允許受試者食用食物或洗牙。在研究開始(0wk)時(shí)，在研究的中期(8wk)和結(jié)束(16wk)時(shí)，采取用于酵母分析的唾液樣品。從第一個(gè)樣品(0wk)和最后一個(gè)樣品(16wk)測(cè)定唾液分泌速率和緩沖能力。從唾液檢測(cè)酵母，其中用棉簽從口腔粘膜取樣。利用Dentocult CA培養(yǎng)方法，其中在37℃，在培養(yǎng)箱中溫育試管2天，然后以0-3的等級(jí)(0＝無菌落，1＝1-20cfu/條(slip)，2＝21-50cfu/條，3＞50cfu)半定量地測(cè)定酵母生長(zhǎng)，由此檢測(cè)酵母(主要是白色念珠菌)。
通過測(cè)量靜止性(resting)唾液和刺激性唾液確定唾液分泌速率。唾液分泌過少的限值被認(rèn)為是0.1ml/min靜止性唾液；因此收集靜止性唾液15分鐘(1.5ml/15min)。收集刺激性唾液5分鐘(唾液過少的限值是3.5ml/5min)。
唾液緩沖能力與分泌速率有關(guān)。為此，用Dentobuff試驗(yàn)測(cè)量緩沖能力。對(duì)刺激性唾液進(jìn)行該試驗(yàn)，因?yàn)殪o止性唾液的緩沖能力總是很低的。
在介入期結(jié)束時(shí)，酵母的數(shù)量形成了該研究中的初級(jí)應(yīng)答變量。利用卡方檢驗(yàn)，檢測(cè)組之間的酵母出現(xiàn)和數(shù)量的差異。此外，利用邏輯回歸分析，考慮基線情況下的酵母出現(xiàn)或數(shù)量及人口統(tǒng)計(jì)因素(諸如年齡、性別、假體(prosthesis))，如果這些存在的話。在這方面，也將唾液分泌率和緩沖能力考慮為解釋性因素。相應(yīng)地分析高唾液含量。描述了唾液分泌率和緩沖能力的改變。
在下面的表中示出了結(jié)果，其中A代表食用益生菌干酪的組，B是對(duì)照組。
菌落數(shù)量表示如下0＝無菌落；1＝1-20cfu/條；2＝20-50cfu/條；3＝大于50cfu/條；。
表1表示在研究開始時(shí)和介入的第8和16周后受試者的精確酵母測(cè)量值，其中從該受試者獲得所有3次測(cè)量值(組A，n＝92，組B，n＝100)。表2表示在研究開始時(shí)和介入的第8和16周后受試者的分類酵母數(shù)量，其中從該受試者獲得所有3次測(cè)量值(組A，n＝92，組B，n＝100)。
表1在研究開始時(shí)和介入的第8和16周后的精確酵母結(jié)果

表2在研究開始時(shí)和介入的第8和16周后分類的酵母含量0比1-4

0-1比2-4

0-2比3-4

直接地和在考慮了干擾因素(如果有)的情況下，對(duì)介入的第8和16周后組A和B的酵母出現(xiàn)進(jìn)行比較。如果有干擾因素，這些因素為年齡、性別、居住的類型、診斷的次數(shù)、藥物的數(shù)量、BMI、唾液流速、緩沖能力和假體。利用逐步邏輯回歸考慮這些干擾因素。使該組和基線酵母情況進(jìn)入模型(塊1)，逐步考慮列表上的干擾因素(塊2顯著性標(biāo)準(zhǔn)p小于0.15)。在下表中示出了該結(jié)果，其中表3顯示較高酵母出現(xiàn)的組，即2-4類組中的直接比較，表4考慮了干擾因素，表5表示高酵母出現(xiàn)組，即3-4類組中的直接比較，表6考慮了干擾因素。在這些表中，縮寫OR＝優(yōu)勢(shì)率(odds ratio)，用于OR的縮寫CI＝優(yōu)勢(shì)率的置信區(qū)間。
表3 較高的酵母出現(xiàn)(2-4類)a)8周后

a)16周后

表4 較高的酵母出現(xiàn)(2-4類)，考慮了干擾因素

表5 高酵母出現(xiàn)(3-4類)a)8周后

a)16周后

表6 高酵母出現(xiàn)(3-4類)，考慮了干擾因素

結(jié)果表明老化、假體的應(yīng)用和減少的唾液分泌明顯地與增加數(shù)量的酵母有關(guān)。而且發(fā)現(xiàn)聲稱在研究前有規(guī)律地地使用含有乳酸細(xì)菌產(chǎn)品的受試者具有較低的起始酵母數(shù)量。
當(dāng)單獨(dú)檢查酵母結(jié)果而不考慮干擾因素時(shí)，可以看到酵母數(shù)量在益生菌組中比在對(duì)照組中減少更多。無論關(guān)注于研究酵母出現(xiàn)(1-4)、較高酵母出現(xiàn)(2-4)還是高酵母出現(xiàn)(3-4)，結(jié)果表明隨著介入的進(jìn)行，在所有這些組中屬于益生菌組的比例均降低了。而屬于對(duì)照組的比例明顯地沒有同樣地變化。相反，對(duì)照組中屬于較高酵母出現(xiàn)組的比例似乎甚至增加了。
當(dāng)考慮干擾因素時(shí)，觀察到與對(duì)照組比較，在較高(2-4)和高(3-4)酵母數(shù)量出現(xiàn)上，益生菌介入引起了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的降低。
因此，這些結(jié)果表明通過利用含有上述益生菌的干酪，可以顯著地減少酵母數(shù)量。因此，與本發(fā)明目的相符，本發(fā)明可以用于抑制酵母。
權(quán)利要求
1.微生物鼠李糖乳桿菌LGG，ATCC 53103、鼠李糖乳桿菌LC705，DSM 7061和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS，DSM 7067用于制備抑制酵母的產(chǎn)品的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物的用途，其特征在于制備食品工業(yè)或制藥工業(yè)的產(chǎn)品、促進(jìn)健康的產(chǎn)品或天然產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物的用途，其特征在于制備食品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物的用途，其特征在于制備乳制品，優(yōu)選地干酪。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的微生物的用途，其特征在于在該制備中也使用其它常規(guī)(引子)細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述的微生物的用途，其特征在于制備含有所述微生物的單位劑量形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物的用途，其特征在于所述劑量形式是口服制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微生物的用途，其特征在于所述劑量形式是，除了含有所述微生物外，還含有木糖醇的膠囊或片劑。
9.一種用于抑制動(dòng)物或人類中酵母生長(zhǎng)和緩解酵母相關(guān)癥狀的方法，該方法包括以足以產(chǎn)生期望效果的量給需要的個(gè)體施用微生物鼠李糖乳桿菌LGG，ATCC 53103、干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC705，DSM 7061和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS，DSM 7067。
全文摘要
本發(fā)明涉及在動(dòng)物或人類中應(yīng)用微生物鼠李糖乳桿菌LGG，ATCC53103，鼠李糖乳桿菌LC705，DSM 7061和費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種PJS，DSM 7067抑制酵母生長(zhǎng)、預(yù)防和治療酵母引起的疾病和緩解酵母相關(guān)癥狀。
文檔編號(hào)A23L1/03GK1708316SQ200380102490
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2003年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月4日
發(fā)明者T·索馬萊寧, A·梅于雷-梅基寧 申請(qǐng)人:瓦利奧有限公司