專利名稱：用于生產脂肽的工程菌株及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明要求保護的技術方案涉及一種引入外來遺傳材料修飾的細菌，具體地說是一種用于生產脂肽的工程菌株及其構建方法。
背景技術：
一般來說，油水界面上界面張力(γL)太高是造成石油采收率低的重要原因之一。當原油——水體系的γL降至0.07mNm-1時，采收率將陡增。在此臨界值以下，γL稍有降低會使石油采收率大幅增加。當前幾乎所有用于降低油水界面上界面張力的表面活性劑都是以石油產品為原料合成的，其工業(yè)需求量在過去十年內增長了300％，每年世界廣泛使用的化學合成表面活性劑已超過4×106噸。隨著生物技術的快速發(fā)展和環(huán)保意識的增強，人們希望用無污染可降解的生物表面活性劑能作為化學合成表面活性劑的替代物。脂肽正是這一類重要的生物表面活性劑，其分子中親水基團由短肽或氨基酸組成，疏水基團由脂肪酸組成，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的脂肽主要來自芽孢桿菌屬Bacillus sp.(1.Muriel H.A 13C solid-state NMR study of the structure and auto-oxidationprocess of natural and synthetic melanins.Biochimica et Biophysica Acta.1994.120419-27.2.Laurence T.Selective esterification of surfactinpreparation and properties of surfactin methyl esters.Biotechnol.Appl.Biochem.1994，20415-423.)。脂肽的最重要應用在于其具有高表面活性，特別是在三次采油中的應用潛力巨大。除此以外，脂肽類生物表面活性劑在環(huán)境生物工程領域也有著極大的應用潛力。在受烷烴和原油污染的土壤中加入它們，能夠提高憎水性化合物的親水性和生物可利用性，增加土壤微生物含量，提高烷烴降解速度，因而被認為是現(xiàn)代生物修復技術的一部分。同時，在食品工業(yè)中，由于脂肽類生物表面活性劑符合功能性食品和綠色食品添加劑的要求，隨著人們對于健康的日益重視，將成為一種應用廣泛的食品添加劑。
Bacillus licheniformis BAS50產生的JF-2脂肽類表面活性劑，室內實驗表明脂肽類表面活性劑具有增產原油的作用(Cooper D.G.Surface active compounds frommicroorganisms.Adv.Appl.Microbiol.1980，26229-256)。目前報道的僅有Bacilluslicheniformis JF-2和JF-86菌株以及Bacillus subtilis產生的surfactin脂肽。但是這些菌株產生的脂肽類表面活性劑的產率較低，致使脂肽類表面活性劑的生產成本過高，以致影響其廣泛應用(Georgiou，G.Surface active compounds from microorganisms.Biotechnol.1992，1060-65)。
CN1240482和日本專利03-098595都是公開了利用Bacillus subtilis生產多肽的方法。這些報道與本發(fā)明的技術主題雖然有關聯(lián)，但是并不屬于同一技術領域，也無法作為本發(fā)明專利性的對比文獻?？傊?，通過對國內外文獻數據庫的檢索尚未發(fā)現(xiàn)脂肽高產工程菌株的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是通過基因工程手段構建高產脂肽類生物表面活性劑工程菌株，以提高脂肽類生物表面活性劑的產量。
本發(fā)明解決該技術問題所采用的技術方案是一種用于生產脂肽的工程菌株，其特征在于名稱為Bacillus subtilis NK-LRL068，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC No.1080。
用于本發(fā)明Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株中表達comA基因的質粒是pHTCOM系列質粒，包括pHTCOMA、pHTCOMS-a和pHTCOMS-b質粒，pHTCOMA質粒的構建如圖4所示，pHTCOMS-a質粒的構建如圖5所示，pHTCOMS-b質粒的構建如圖6所示。
本發(fā)明的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株的構建方法是將包含啟動子區(qū)及上游序列的全長comA基因克隆于pHT315穿梭質粒，構建pHTCOMA表達質粒，如圖4所示；將comA序列克隆于Pspac強啟動子下游，同時用spoVG基因的核糖體結合位點序列取代comA本身的RBS，構建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b質粒，如圖5、6所示，將上述pHTCOM系列質粒轉化至Bacillus subtilis MO-L010菌株，獲得Bacillussubtilis NK-LRL068工程菌株，將包含啟動子區(qū)及上游序列的全長comA基因克隆于pHT315穿梭質粒，構建pHTCOMA表達質粒，如圖4所示；將comA序列克隆于Pspac強啟動子下游，同時用spoVG基因的核糖體結合位點序列取代comA本身的RBS，構建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b質粒，如圖5、6所示，將上述pHTCOM系列質粒轉化至Bacillussubtilis MO-L010菌株，獲得Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株，參考Bacillussubtilis全基因組、comA、Psrf序列，以及質粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析軟件進行輔助設計，上海Sangon或BioAsia合成獲得擴增引物分別如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’上游引物5’CGT ATC TAG AGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’CGT GAA TTC CTT TAC AGA TTT TAA 3’上游引物5’AAC AGC ATG CGA GCG GAA AGA TGT 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’上游引物5’TTC GGC ATG CAA ATT ATG GGT GAA 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’。
本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明提供的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株生產脂肽類表面活性劑的產率較高，其脂肽產量較Bacillus subtilis MO-L010菌株提高50％(見實施例)，利用本發(fā)明提供的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株產生的脂肽類表面活性劑也已經在原油乳化實踐中得到應用。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
圖1 pUCCOMA質粒的構建圖2 pMUTIN-COMA1質粒的構建圖3 pMUTIN-COMA2質粒的構建圖4 pHTCOMA質粒的構建圖5 pHTCOMS-a質粒的構建圖6 pHTCOMS-b質粒的構建具體實施方式
圖1表明以Bacillus subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴增出comA序列，并將該序列亞克隆于pUC19載體上，構建pUCCOMA質粒。
圖2表明將PCR擴增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4質粒，構建pMUTIN-COMA1整合質粒。
圖3表明將PCR擴增的comA response regulatory序列和HTH-LUXR區(qū)的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4構建重組質粒pMUTN-COMA2整合質粒。
圖4表明將全長comA基因(包含啟動子區(qū)及上游序列)克隆于pHT315穿梭質粒，構建pHTCOMA表達質粒圖5表明將comA的編碼序列克隆于Pspac強啟動子下游，同時用spoVG基因的核糖體結合位點序列取代comA本身的RBS，構建pHTCOMS-a質粒，圖6表明將全長comA基因克隆于Pspac強啟動子下游，同時用spoVG基因的核糖體結合位點序列取代comA本身的RBS，構建pHTCOMS-b質粒，實施例1將全長comA基因(包含啟動子區(qū)及上游序列)克隆于pHT315穿梭質粒，構建pHTCOMA表達質粒，如圖4所示；將comA序列克隆于Pspac強啟動子下游，同時用spoVG基因的核糖體結合位點序列取代comA本身的RBS，構建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b質粒，如圖5、6所示，將pHTCOM系列質粒轉化至Bacillus subtilis MO-L010菌株，獲得本發(fā)明的Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株。
實施例2用于本發(fā)明Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株中高效表達comA基因的pHTCOM系列質粒的制備方法如下第一步，Bacillus subtilis MO-L010基因組DNA的提取按照下列Bacillus基因組DNA的提取方法，對Bacillus subtilis MO-L010基因組DNA進行提取，得到DNA片斷大小為23kb；Bacillus基因組DNA的提取方法①挑取LB培養(yǎng)基平板上新鮮活化的單菌落于5ml LB培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)12小時，②轉移3ml菌液于5ml離心管中，4℃，轉速為12000r/min，用離心機離心5分鐘，棄掉上清液，③將細菌沉淀物用0.5M NaCl洗一次，盡量空干上清液，④將沉淀重懸于pH＝8.0的50mM Tris緩沖液1ml中，然后加入新鮮配置的溶解在pH＝8.0的0.25M Tris緩沖液中的濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液0.2ml和0.25M的EDTA溶液0.8ml，混勻后于37℃放置1小時，再加入200μl 10％SDS溶液，混勻后于55℃下放置5分鐘，⑤加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，轉速為12000r/min，用離心機離心10分鐘，形成上下兩相，⑥轉移⑤中上相至一新的離心管中，重復上個步驟直到無白色變性蛋白層出現(xiàn)，⑦取上清液，加入3μl 10mg/ml的去DNase的RNase溶液，于37℃水浴1小時，⑧加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，轉速為12000r/min，用離心機離心10分鐘，形成上下兩相，⑨轉移⑧中上相至一新的離心管中，加入1/10體積的pH＝5.2的3mol/L NaAc溶液和2倍體積的冷無水乙醇，于-70℃下放置30分鐘，⑩將⑨的液體于4℃下，轉速為12000r/min，用離心機離心10分鐘，棄上清液，用70％乙醇洗兩次，干燥后溶于100μl的TE溶液中，在-20℃下保存?zhèn)溆?；第二步，全長comA序列的擴增及測序按照下列引物設計及合成方法，獲得全長comA序列擴增引物如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’引物設計及合成方法參考Bacillus subtilis全基因組、comA、Psrf序列，以及質粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析軟件進行輔助設計，上海Sangon或BioAsia合成；按照下列DNA擴增方法，以Bacillus subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴增出全長comA，由上海生工測序，全長comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCA
DNA擴增方法①在200μl薄壁離心管中依次加入下列試劑，成分 體積 說明(μl)H2O 33.75按順序加入薄壁管，在冰上操作10×Ex Taq5.00Buffer(Mg2+free)25mmol/L MgCl24.002.5mmol/L dNTP5.00Mixture20pmol/μl上游引物1.0020pmol/μl下游引物1.00DNA模板 1.00 15ng/μl基因組DNA或0.5ng/μl質粒TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25total volume 50.00②在4℃短暫離心，使液體集中在管的底部，③將薄壁管放在PCR儀中按如下程序開始循環(huán)，熱蓋103℃熱變性 94℃ 5min 保溫 72℃ 9min4℃ 無限長第三步，構建pUCCOMA質粒按照第二步的引物設計及合成方法，獲得comA編碼序列擴增引物，如下上游引物5’GTA AAA GCT TGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’TGT TCT AGA CAA TCG TCG TTC T 3’按照第二步的DNA擴增方法，以Bacillus subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴增出comA編碼序列，并將該序列亞克隆于pUC19載體上，構建如圖1所示的pUCCOMA質粒，pUCCOMA質粒的擴增、提取都按照以下E.coli感受態(tài)細胞的制備、轉化及質粒DNA的提取等方法進行，
E.coli感受態(tài)細胞的制備和轉化方法E.coli JM109感受態(tài)的制備和轉化參照Promega公司pGEM-T Easy Vector SystemsTechnical Mannual；E.coli DH5α感受態(tài)的制備和轉化①在LB液體培養(yǎng)基中接入單菌落，于37℃下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.3～0.4，在4℃，轉速為5000r/min，用離心機離心10分鐘，收集菌體，②用原體積1/10的PIPES緩沖液輕懸，冰浴30分鐘，PIPES緩沖液的組成為PIPES2ml、0.5M CaCl212ml、甘油14ml、重蒸水72ml，③在4℃，轉速為5000r/min，用離心機離心10分鐘，棄盡上清液，輕緩地用1/25PIPES緩沖液重懸，即成感受態(tài)細胞，④每100μl感受態(tài)細胞加入4μl DNA連接產物，彈勻后冰浴30分鐘，⑤于42℃準確熱激45秒，立即放置在冰上2分鐘，加入200μl LB培養(yǎng)基重懸，在37℃，100r/min振蕩預培養(yǎng)1小時，⑥將預培養(yǎng)物涂布于含相應抗生素的LB培養(yǎng)基平板，20分鐘后倒置平皿，在37℃下正置培養(yǎng)16～20小時，⑦挑選單菌落，用下列方法提取質粒，然后進行電泳，酶切和PCR鑒定，E.coli質粒DNA提取方法E.coli質粒提取使用經典的堿裂解法提取，參照MolecuLar Cloning A laboratoryMannual，3rded；第四步Bacillus subtilis MO-L010菌株comA基因敲除實驗1.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得擴增comA response regulatory序列355bp的引物分別如下上游引物5’TTG GAA TTC ATG AAA AAG ATA CTA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4質粒，構建pMUTIN-COMA1質粒，如圖2所示，2.按照第二步的引物設計及合成方法，獲得擴增comA response regulator序列和HTH-LUXR區(qū)的5’端序列共482bp的引物分別如下上游引物5’GCC AAG CTT GGA AAA CAT GAA AAA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴增的comA response regulator序列和HTH-LUXR區(qū)的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4構建質粒pMUTN-COMA2質粒，如圖3所示，構建時將pMUTIN4的lacZ基因與comA基因的讀框融合，發(fā)生同源重組后lacZ基因則完全依賴于PcomA轉錄和表達，lacZ基因本身的RBS被置換為Bacillus subtilis 168 spoVG基因的RBS，保證lacZ基因在Bacillus subtilis細胞保持很高的表達活性；3.按照Bacillus subtilisMO-L010菌株感受態(tài)細胞的制備方法，制備感受態(tài)細胞，Bacillus subtilis MO-L010菌株感受態(tài)細胞的制備方法①挑單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，于37℃180r/min振蕩培養(yǎng)過夜，全部轉移到含0.5M山梨醇的100ml LB液體培養(yǎng)基中，于37℃180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.7～0.75，②冰上預冷20分鐘后，在4℃，轉速為5000r/min，用離心機離心10分鐘，用預冷的含0.5M山梨醇、0.5M甘露醇和10％甘油的電擊緩沖液洗四次，③將沉淀重懸于2ml的預冷的電擊緩沖液中，終細胞濃度為1.3～1.4×1010cfu/mL，即得感受態(tài)細胞，直接存儲于-70℃下，該感受態(tài)細胞轉化自主復制質粒的效率達到108個轉化子/μgDNA，轉化整合質粒的效率達到1～10個轉化子/μgDNA，4.按照下列Bacillus subtilis MO-L010感受態(tài)細胞的電轉化方法，將pMUTIN-COMA1與pMUTIN-COMA2各1μg混勻后，電轉化Bacillus subtilis MO-L010，篩選紅霉素抗性菌株，獲得comA基因敲除菌株，pMUTIN-COMA1與pMUTIN-COMA2與Bacillus subtilisMO-L010染色體有一段幾百bp的同源序列，同源重組則發(fā)生在這段序列之間，造成comA基因失活的機理為Campbell-type(single cross-over)整合模型；Bacillus subtilis MO-L010感受態(tài)細胞的電轉化方法①60μl感受態(tài)細胞與1μl質粒DNA混合，自主復制質粒，濃度25～50ng/μL，整合質粒濃度1～5ug/μl，以不加質粒的感受態(tài)細胞作陰性對照，②將①的混合物和陰性對照分別轉移至預冷的電轉化杯中，冰上放置1～5分鐘，③1mm electrode gap轉化杯，采用2kV/mm，4.5～5.9ms電擊，2mm electrode gap轉化杯，采用2.5kV/mm，4.0～5.9ms電擊一次，所用儀器為BioRad，MicropμLserTM，④立即加入500μl含有0.5M山梨醇和0.38M甘露醇的LB培養(yǎng)基，⑤轉移至無菌的1.5ml離心管，于37℃，100r/min，預培養(yǎng)3小時，⑥將培養(yǎng)液鋪在1/2含相應抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，正置2小時后倒置培養(yǎng)，1/2 LB培養(yǎng)基包括胰蛋白胨0.5％、NaCl0.25％、酵母粉0.25％，pH＝7.0～7.2，⑦挑選單菌落，提取質粒進行電泳、酶切、PCR鑒定。
采用以上方法進行感受態(tài)細胞制備和轉化，轉化自主復制質粒效率為108個轉化子/μgDNA，整合載體的轉化率為1～10個轉化子/μgDNA。
5.按照下列提供的脂肽發(fā)酵方法、培養(yǎng)基和測定方法，將Bacillus subtilisMO-L010與其comA基因敲除菌株的脂肽合成能力進行比較，由發(fā)酵結果可見，comA基因斷裂失活使細胞幾乎完全喪失了產生脂肽和降低表面張力的能力，本實驗為comA基因是脂肽合成酶基因轉錄與表達的必需基因提供了一個有力的證據，脂肽發(fā)酵方法和培養(yǎng)基①挑取2環(huán)菌落接種于50ml LB液體培養(yǎng)基中，于37℃180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為1.2，②接種①中種子培養(yǎng)液4ml至110ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃ 180r/min振蕩培養(yǎng)48小時，1升脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖10g、MgSO4.7H2O 0.2g、KH2PO44.1g、NH4NO34g、Na2HPO414.3g、酵母粉0.1g、0.4mol/l的FeSO42μl、0.7mol/l的CaCl24μl，pH＝7.0；脂肽產量的測定方法取樣后，于30℃，轉速為10000r/min，用離心機離心15min，徹底去掉菌體，上清液再離心一次，棄沉淀，取上清液調節(jié)pH＝2.0，于4℃下放置12小時，轉速為10000r/min，離心10min，棄上清液，沉淀干燥后稱干重，此干重即為脂肽粗品產量。
第五步，構建pHTCOMA、pHTCOMS-a、pHTCOMS-b質粒將包含啟動子區(qū)及上游序列的全長comA基因克隆于pHT315穿梭質粒，構建pHTCOMA表達質粒，如圖4所示；將comA序列克隆于Pspac強啟動子下游，同時用spoVG基因的核糖體結合位點序列取代comA本身的RBS，構建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b質粒，如圖5、6所示，按照上述第二步中提供的引物設計及合成方法，獲得擴增引物分別如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’上游引物5’CGT ATC TAG AGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’CGT GAA TTC CTT TAC AGA TTT TAA 3’上游引物5’AAC AGC ATG CGA GCG GAA AGA TGT 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’上游引物5’TTC GGC ATG CAA ATT ATG GGT GAA 3’下游引物5’GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’實施例3脂肽高產工程菌株Bacillus subtilis NK-LRL068的構建comA基因敲除實驗證實，comA基因是Bacillus subtilis MO-L010脂肽合成的必需基因。但是，comA基因的表達卻在脂肽合成酶基因lps的大量轉錄與表達的時期下降，因此如果增加平衡期的comA表達量，應當能夠提高lps基因的表達水平。
1.將pHTCOMA、pHTCOMS-a、pHTCOMS-b分別電轉化Bacillus subtilis MO-L010感受態(tài)細胞，通過增加選擇壓力的方式保持質粒穩(wěn)定，erythromycin 25μg/ml。從comA表達量來看，pHTCOMS質粒明顯優(yōu)于pHTCOMA質粒菌株，其中pHTCOMS-a質粒的蛋白表達效率高于pHTCOMS-b質粒，將帶有pHTCOMS-a質粒的Bacillus subtilis MO-L010菌株命名為Bacillus subtilis NK-LRL068。
2.Bacillus subtilis MO-L010和Bacillus subtilis NK-LRL068的發(fā)酵動態(tài)按照上述第四步中提供的脂肽發(fā)酵方法、培養(yǎng)基和測定方法，將Bacillussubtilis MO-L010與Bacillus subtilis NK-LRL068菌株的脂肽合成能力進行比較，發(fā)現(xiàn)，質粒pHTCOMS-a轉化入Bacillus subtilis MO-L010菌株后，重組菌株仍保持了原菌株的生長態(tài)勢，它們的生長動態(tài)、pH值和表面張力變化趨勢相同，因此可以看出重組質粒轉化入Bacillus subtilis MO-L010菌株后，對菌株的生長能力影響很小。
比較兩菌株的脂肽合成過程，在對數生長中期以前，Bacillus subtilis NK-LRL068菌株脂肽合成量低于不攜帶質粒的Bacillus subtilis MO-L010菌株，但隨著細胞的生長，卻發(fā)生了反轉，前者脂肽產量增加的速度與總量明顯高于后者，最終產量高出50％左右，如表1所示，表1 Bacillus subtilis MO-L010和Bacillus subtilis NK-LRL068脂肽合成量的比較
權利要求
1.用于生產脂肽的工程菌株，其特征在于名稱為Bacillus subtilisNK-LRL068，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC No.1080。
2.根據權利要求1所述的用于生產脂肽的工程菌株，其特征在于用于Bacillus subtilis NK-LRL068工程菌株中表達comA基因的質粒是pHTCOM系列質粒，包括pHTCOMA、pHTCOMS-a和pHTCOMS-b質粒，pHTCOMA質粒的構建如圖4所示，pHTCOMS-a質粒的構建如圖5所示，pHTCOMS-b質粒的構建如圖6所示。
3.權利要求1所述的用于生產脂肽的工程菌株的構建方法，其特征在于將包含啟動子區(qū)及上游序列的全長comA基因克隆于pHT315穿梭質粒，構建pHTCOMA表達質粒，如圖4所示；將comA序列克隆于Pspac強啟動子下游，同時用spoVG基因的核糖體結合位點序列取代comA本身的RBS，構建pHTCOMS-a和pHTCOMS-b質粒，如圖5、6所示，將上述pHTCOM系列質粒轉化至Bacillus subtilis MO-L010菌株，獲得Bacillus subtilisNK-LRL068工程菌株，參考Bacillus subtilis全基因組、comA、Psrf序列，以及質粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析軟件進行輔助設計，上海Sangon或BioAsia合成獲得擴增引物分別如下上游引物5’ CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’ TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’上游引物5’ CGT ATC TAG AGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’ CGT GAA TTC CTT TAC AGA TTT TAA 3’上游引物5’ AAC AGC ATG CGA GCG GAA AGA TGT 3’下游引物5’ GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’上游引物5’ TTC GGC ATG CAA ATT ATG GGT GAA 3’下游引物5’ GCG ATC TAG ATG GGT AAC GCC AGG 3’。
4.根據權利要求3所述的用于生產脂肽的工程菌株的構建方法，其特征在于將pHTCOMA、pHTCOMS-a、pHTCOMS-b分別電轉化Bacillus subtilis MO-L010感受態(tài)細胞，通過增加選擇壓力的方式保持質粒穩(wěn)定，erythromycin 25μg/ml，其中帶有pHTCOMS-a質粒的Bacillus subtilis MO-L010菌株命名為Bacillus subtilisNK-LRL068。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產脂肽的工程菌株及其構建方法，用于生產脂肽的工程菌株名稱為Bacillus subtilis NK－LRL068，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC No.1080，用于Bacillus subtilis NK－LRL068工程菌株中表達comA基因的質粒是pHTCOM系列質粒，包括pHTCOMA、pHTCOMS－a和pHTCOMS－b質粒，pHTCOMA質粒的構建如圖4所示，pHTCOMS－a質粒的構建如圖5所示，pHTCOMS－b質粒的構建如圖6所示，利用本發(fā)明提供的Bacillus subtilis NK－LRL068工程菌株生產脂肽類表面活性劑的產率較高，其脂肽產量較Bacillus subtilis MO－L
文檔編號C12N15/74GK1554747SQ200310122140
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月26日 優(yōu)先權日2003年12月26日
發(fā)明者顧曉波, 黃英, 劉如林, 梁鳳來, 馬建芳 申請人:南開大學