專利名稱：人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)及其培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，尤其是一種無滋養(yǎng)層的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以及利用該系統(tǒng)培養(yǎng)人類胚干細胞的方法，使人類胚干細胞增殖及維持未分化狀態(tài)。
背景技術：
人類胚干細胞(human embryonic stem cells；HES)是指囊胚期胚胎(blastocyst)中內(nèi)細胞團(inner cell mass)的細胞，其在生物學的特征如下(1)正常核型(Normal karyotype)；(2)較高的細胞核/細胞質比例；(3)堿性磷酸酯酶(Alkaline phosphatase)呈陽性反應；(4)mRNA-OCT4陽性，此物質為多發(fā)性(pluripotent)細胞擁有的特征；以及(5)將此細胞注入免疫不全老鼠身體，可形成具三個胚層細胞的畸瘤(teratoma)。
人類胚干細胞因具有無限分裂增殖與分化成各種組織細胞的能力，近一、二年來，被認為是組織工程的最佳細胞組件，且可廣泛應用于臨床藥物研發(fā)與細胞醫(yī)療上。人類胚干細胞的培養(yǎng)與一般體細胞不同，相比較而言，胚干細胞對體外生長要求嚴格，一方面要促進細胞分裂增殖，另一方面又要抑制細胞分化。
人類胚胎干細胞為一種貼壁細胞(錨地依賴細胞，anchorage-dependent cells)，即體外培養(yǎng)細胞需附著在適宜的底物(substratum)上才能生長。目前人類胚干細胞的培養(yǎng)方式是將胚干細胞培養(yǎng)在一層去活化滋養(yǎng)層細胞上，藉由滋養(yǎng)層細胞來提供胚干細胞生長所需的重要因子，以提供人類胚胎干細胞生長、增殖與維持其未分化狀態(tài)。
上述滋養(yǎng)層細胞可選自初代小鼠胚胎纖維母細胞(primary mouseembryonic fibroblast；PMEF)、小鼠胚胎纖維母細胞株(mouse embryonicfibroblast；STO)、小鼠胎兒的纖維母細胞(murine fetal fibroblast；MFF)、人類胚胎纖維母細胞(human embryonic fibroblast；HEF)、人類胎兒肌肉細胞(human fetal muscle；HFM)、人類胎兒皮膚細胞(human fetalskin cell；HFS)、人類成人皮膚細胞(human adult skin cell)、人類包皮纖維母細胞(human foreskin fibroblast；HFF)、人類成人輸卵管上皮細胞(human adult fallopian tubal epithelial cell；HAFT)、人類骨髓基質細胞(human marrow stromal cells；hMSCs)(WO 03/02944、WO 03/014313、J.H.Park等，Biol Reprod.，692007-2017，2003、M.Amit等，Biol Reprod.，68(6)2150-2156，2003、Outi Hovattal等，Hum.Reprod.，18(7)1404-1409，2003、Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002、James A.等，Science，282(6)1145-1147，1998及Linzhao Cheng等，Stem Cells，21131-142，2003)。
然而上述的培養(yǎng)方式使得人類胚干細胞的產(chǎn)量及臨床應用上會面臨下列有關生物安全性及細胞品質穩(wěn)定性的問題(1)異種(異源)生物細胞共培養(yǎng)模式，會有異種/異源生物間病毒或其它致病原感染的安全性疑慮；(2)由于滋養(yǎng)層細胞多來自初代培養(yǎng)的細胞(primary cells)，不同批次的初代培養(yǎng)細胞，會有不同的滋養(yǎng)層功效，所以培養(yǎng)的胚干細胞品質較難控制；(3)供應的細胞來源與數(shù)量有限，限制胚干細胞的產(chǎn)量及應用；以及(4)滋養(yǎng)層的存在，會影響到胚干細胞研發(fā)時所使用的技術，例如基因轉染(transfection)等。由于滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)具有上述難以掌控的缺點，因此無滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，是目前人類胚干細胞研發(fā)的關鍵技術。
相關無滋養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)是以下列物質取代滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)人類胚干細胞層粘連蛋白(laminin)、纖維粘連蛋白(fibronectin)、膠原蛋白IV(collagen IV)以及一種自老鼠腫瘤細胞(Engelbreth-Hom-Swarm tumorcell)萃取的基底膜基質(Matrigel)(WO 03/020920、US 2003/0017589及Xu，C.等，Nat Biotechnol.，19(10)971-974，2001)。由于該物質是選自胞外基質(extracellular matrix；ECM)的成分之一進行培養(yǎng)，而實際上天然的胞外基質除有支撐細胞的作用，而且也作為一種物質交換和訊息的區(qū)域，允許營養(yǎng)物質、代謝產(chǎn)物和生長因子在細胞之間擴散，這并不是單一成分物質便可取代的。再者，胞外基質除上述成分物質外，還有彈性蛋白(elastin)、蛋白聚糖及其它糖基蛋白等物質。目前有學者指出前述培養(yǎng)系統(tǒng)僅適用于培養(yǎng)某些特定的人類胚干細胞株(如H1，H9)，對于其它人類胚干細胞株則效果不佳(Outi Hovattal等，Hum.Reprod.，18(7)1404-1409，2003)。由此可知，目前仍亟需開發(fā)更安全、適用性更廣泛的無滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于上述傳統(tǒng)胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的缺失，本發(fā)明的主要目的是提供一種新的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，用以達到維持人類胚胎干細胞的未分化生長及增殖的目的。
本發(fā)明提供的培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)基質，萃取自滋養(yǎng)層細胞的胞外基質；及條件培養(yǎng)基，收集自培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)液。
其中，所述培養(yǎng)基質的制備方法，是將滋養(yǎng)層細胞以氫氧化鈉(NaOH)或三硝基甲苯(triton)處理后，去除細胞內(nèi)的物質，即可獲得該細胞的胞外基質以作為培養(yǎng)基質。在該培養(yǎng)基質的制備方法中，去除細胞內(nèi)物質的方法可用水或緩沖液清洗。
所述條件培養(yǎng)基的制備方法，包括(a)將滋養(yǎng)層細胞去活化處理；(b)將步驟(a)所述的細胞置于一培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；(c)收取其細胞培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一目的是提供一種培養(yǎng)人類胚干細胞的方法，利用前述的培養(yǎng)系統(tǒng)，使人類胚干細胞增殖及維持未分化狀態(tài)。
該培養(yǎng)方法的步驟包括取得人類胚干細胞；將人類胚干細胞培養(yǎng)于前述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)；以及持續(xù)培養(yǎng)，使人類胚干細胞增殖及維持未分化狀態(tài)。所述的人類胚干細胞在本發(fā)明的無滋養(yǎng)層的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中可維持至少五代的未分化與增殖狀態(tài)。
先前的研究結果發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層維持胚干細胞生長增殖的重要因子，包括滋養(yǎng)層細胞分泌于培養(yǎng)液中的生長因子以及滋養(yǎng)層分泌建構的細胞外基質。因此本發(fā)明便是藉由移除滋養(yǎng)層細胞，而保留具有功效的重要因子，包括胞外基質結構以及滋養(yǎng)層細胞所分泌的養(yǎng)分，從而發(fā)展出一套不需滋養(yǎng)層細胞存在的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，突破人類胚干細胞產(chǎn)量及臨床應用的難題。
為了達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明所提供的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，是用以維持人類胚胎干細胞的未分化生長及增殖，該系統(tǒng)包括培養(yǎng)基質，萃取自滋養(yǎng)層細胞的胞外基質；及條件培養(yǎng)基，收集自培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)液。
本發(fā)明中所述人類胚干細胞(human embryonic stem cells；HES)是指人類囊胚期胚胎(Blastocyst)中內(nèi)細胞團(Inner cell mass)的多發(fā)性(pluripotent)細胞。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述人類胚干細胞株種系優(yōu)選為hES-3或hES-4的人類胚干細胞株。
本發(fā)明中所述的培養(yǎng)基質(culture matrix)是指提供作為細胞培養(yǎng)時的附著底物(substratum)。除少數(shù)懸浮型細胞外，絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞需附著在適宜的底物上才能生長。細胞貼附在底物上生長的性質稱錨地依賴性。原則上，凡對細胞無毒性的物質都可用作底物，但不同的細胞，對底物要求各異，底物不適，細胞生長不良。目前人類胚干細胞的培養(yǎng)方式是將胚干細胞培養(yǎng)在一層去活化滋養(yǎng)層細胞上，藉由滋養(yǎng)層細胞來提供胚干細胞生長所需的重要因子，以提供人類胚胎干細胞生長、增殖與維持其未分化狀態(tài)。
本發(fā)明中所述滋養(yǎng)層細胞(Feeder Cells)也稱飼養(yǎng)細胞，可采用纖維細胞或其它細胞，以大劑量輻射線照射，如珈瑪射線(γ-ray)輻射；或采用藥劑處理，如絲裂霉素C(mitomycin C)進行去活化(inactivation)處理，使生存的細胞失去增殖能力但仍保有代謝等生理功能，如合成重要生長因子。令其作為底物，將其它細胞接種于其上；滋養(yǎng)層細胞的代謝產(chǎn)物利于其它細胞生長，從而被稱為滋養(yǎng)層細胞。常見用于人類胚干細胞的滋養(yǎng)層細胞有初代小鼠胚胎纖維母細胞(primary mouseembryonic fibroblast；PMEF)、小鼠胚胎纖維母細胞株(mouse embryonicfibroblast；STO)、小鼠胎兒的纖維母細胞(murine fetal fibroblast；MFF)、人類胚胎纖維母細胞(human embryonic fibroblast；HEF)、人類胎兒肌肉細胞(human fetal muscle；HFM)、人類胎兒皮膚細胞(human fetalskin cell；HFS)、人類成人皮膚細胞(human adult skin cell)、人類包皮纖維母細胞(human foreskin fibroblast；HFF)、人類成人輸卵管上皮細胞(human adult fallopian tubal epithelial cell；HAFT)、人類骨髓基質細胞(human marrow stromal cells；hMSCs)等。
在本發(fā)明的最優(yōu)選實施例中，所述滋養(yǎng)層細胞優(yōu)選選自小鼠胚胎纖維母細胞或人類包皮纖維母細胞。
本發(fā)明中所述胞外基質(Extracellular Matrix；ECM)是指細胞分泌出來的大分子物質，其主要由三類生物分子所組成(1)結構蛋白(Structural proteins)膠原蛋白(collagen)及彈性蛋白(elastin)；(2)特化蛋白(Specialized proteins)如纖維粘連蛋白(fibronectin)、層粘連蛋白(laminin)、肌絲蛋白質(fibrillin)；以及(3)蛋白聚糖(Proteoglycans；PG)其是以蛋白質為核心，連接葡萄胺聚糖(glycosaminoglycans；GAGs)重復單元的長鏈以形成一復雜的高分子量生物分子。胞外基質除有支撐細胞的作用，而且也作為一種物質交換和訊息的區(qū)域，允許營養(yǎng)物質、代謝產(chǎn)物和生長因子在細胞之間擴散。有關胞外基質的制備都可由熟悉本領域的技術人員所完成，并可參見美國專利第5993844號。
本發(fā)明中所述條件培養(yǎng)基(Conditional Medium；CM)是指經(jīng)培養(yǎng)過特定細胞的培養(yǎng)液。該條件培養(yǎng)基可用于提供另一細胞的生長培養(yǎng)。有關條件培養(yǎng)基的制備都可由熟悉本領域的技術人員所完成，并可參見美國專利公開第2003/0017589、2002/0137204、2002/0072117、2002/0022268號以及Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002。
本發(fā)明中用以培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)液的制備也可由熟悉本領域的技術人員所完成，并另可參見美國專利第5690926號、美國專利公開第2003/0008392、2003/0073234、2002/0160509號以及Reubinoff BE.等，NatBiotechnol.，18(4)399-404，2002。一般而言，培養(yǎng)液的主要成分是胺基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和一些其它輔助物質。另外，除上述基礎培養(yǎng)液外，還可添加一些促細胞生長增殖或抑制分化的生長因子，如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor；ILF)、纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor；FGF)、干細胞因子(Stem cell factor；SCF)、胰島素-轉鐵蛋白-硒G補充物(insulin-transferrin-selenium Gsupplement；ITS G supplement)(WO03/020920、US2003/0017589、US5690926、US5453357及Xu，C.等，Nat Biotechnol.，19(10)971-974，2001、Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002)。
本發(fā)明中所述培養(yǎng)基質的制備方法，包括將滋養(yǎng)層細胞以氫氧化鈉(NaOH)或三硝基甲苯(triton)處理后，去除細胞內(nèi)的物質，如細胞核或胞器等，即可獲得該細胞的胞外基質以作為培養(yǎng)基質。
在該培養(yǎng)基質的制備方法中，所述去除細胞內(nèi)物質的方法可以為用清洗液清洗，如用緩沖液或水清洗。
本發(fā)明中所述條件培養(yǎng)基的制備方法，包括(a)將滋養(yǎng)層細胞去活化處理；(b)將步驟(a)所述的細胞置于一培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；以及(c)收取其細胞培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)基。


圖1為顯示本發(fā)明利用無滋養(yǎng)層的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)人類胚干細胞的方法流程圖。
圖2A顯示小鼠的胚胎纖維母細胞(MEF)型態(tài)(300X)。
圖2B顯示由小鼠的胚胎纖維母細胞的胞外基質結構(300X)。
圖2C顯示在掃描式電子顯微鏡下觀察小鼠的胚胎纖維母細胞的胞外基質的纖維束及網(wǎng)架結構(2000X)。
圖3A顯示人類包皮纖維母細胞(HSF)型態(tài)(300X)。
圖3B顯示由人類包皮纖維母細胞的胞外基質結構(300X)。
圖4A顯示以小鼠的胚胎纖維母細胞制備的培養(yǎng)基質所培養(yǎng)的人類胚干細胞(hES3)型態(tài)(10X)。
圖4B顯示以人類包皮纖維母細制備的培養(yǎng)基質所培養(yǎng)的人類胚干細胞(hES3)型態(tài)(10X)。
圖5A顯示以小鼠的胚胎纖維母細胞制備的培養(yǎng)基質所培養(yǎng)的人類胚干細胞(hES3)具有高活性的堿性磷酸酯酶(10X)。
圖5B顯示以人類包皮纖維母細制備的培養(yǎng)基質所培養(yǎng)的人類胚干細胞(hES3)具有高活性的堿性磷酸酯酶(10X)。
圖6顯示本發(fā)明的無滋養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)所培養(yǎng)的人類胚干細胞(hES3)的OCT-4表現(xiàn)。其中，1代表小鼠胚胎纖維母細胞為滋養(yǎng)層，2代表人類包皮纖維母細胞為滋養(yǎng)層，3代表利用本發(fā)明系統(tǒng)胚干細胞，4為無細胞樣品的對照組。
具體實施例方式
以下藉由實施例并配合附圖進一步詳細說明本發(fā)明的技術特征，但下述的實施例并非用以限定本發(fā)明的保護范圍。
請參閱圖1，其顯示本發(fā)明的利用無滋養(yǎng)層的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)人類胚干細胞的方法，其步驟包括取得人類胚干細胞，例如hES3和/或hES4；將人類胚干細胞培養(yǎng)于前述本發(fā)明所述的無滋養(yǎng)層的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)；以及使人類胚干細胞維持增殖及未分化狀態(tài)，其中，前述人類胚干細胞在無滋養(yǎng)層的胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中可維持至少五代的未分化與增殖狀態(tài)。
實施例一、本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的組成物制備1.條件培養(yǎng)基的制備小鼠的胚胎纖維母細胞或人類包皮纖維母細胞(購自臺灣動物科技研究所)于纖維母細胞培養(yǎng)液(90％DMEM+10％FBS)。該細胞培養(yǎng)約3天后以絲裂霉素C(購自Sigam)進行去活化作用，以抑制細胞增生，但仍保有代謝等生理功能。每日收取該細胞培養(yǎng)液備用。上述培養(yǎng)液配方如下80％Dulbecco的改良的Eagle’s培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium；DMEM)(購自Gibco)與20％牛血清(Fetal Serum Bovine；FBS)(購自Hyclone)，并添加1mMβ-乙基硫醇(β-mercaptoethanol)(購自Gibco)、1％非必需胺基酸(non-essential amino acids)(購自Gibco)、1％谷胺酸(glutamine)(購自Gibco)、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒G補充物(insulin-transferrin-selenium G supplement；ITS G supplement)(購自Gibco)(請參考Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936，2002)。其中牛血清也可以用血清替代物(serum replacement)取代，制備成無血清培養(yǎng)液。當然，視培養(yǎng)細胞的需要，本發(fā)明的無滋養(yǎng)層胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)同樣也可使用其它培養(yǎng)基成分，并不局限于本實施例所使用的條件培養(yǎng)基。
2.培養(yǎng)基質的制備培養(yǎng)小鼠的胚胎纖維母細胞或人類包皮纖維母細胞于纖維母細胞培養(yǎng)液(90％DMEM+10％FBS)，細胞培養(yǎng)約3天后以絲裂霉素C進行去活化作用。去活化的纖維母細胞再經(jīng)培養(yǎng)3至28天后，以0.05N氫氧化鈉(NaOH)或0.1％三硝基甲苯(Triton，購自Sigma)打破其細胞膜，并以pH7.4的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline；DPBS，1X)(購自Gibco)清洗以去除細胞內(nèi)的胞器及細胞核，即可獲得胞外基質。
實施例二、利用本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)人類胚干細胞將人類胚干細胞(細胞株種系HES-3或HES-4)以切割方式切成100至5,000個細胞不等的細胞團，再逐一將這些細胞團移至上述的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，接著將培養(yǎng)皿放在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每1-2天更換培養(yǎng)液一次，待細胞數(shù)目增加約5至15倍時，則可再以切割方式進行細胞的繼代培養(yǎng)(Subculture)。
實施例三、本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)基質觀察圖2A顯示小鼠的胚胎纖維母細胞型態(tài)，將小鼠的胚胎纖維母細胞藉由實施例一的步驟制成培養(yǎng)基質，其結構如圖2B所示。將前述基質結構藉由掃描式電子顯微鏡觀察，可觀察到該培養(yǎng)基質的纖維束及網(wǎng)架結構，如圖2C所示。
圖3A與圖3B分別顯示用來制備培養(yǎng)基質的人類包皮纖維母細胞型態(tài)，以及將人類包皮纖維母細胞利用前述步驟所制成的培養(yǎng)基質結構。
實施例四、人類胚干細胞未分化性質的分析為進一步確認利用本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)效果，可藉由觀測特定表現(xiàn)于未分化的人類胚干細胞的分子記號，例如堿性磷酸酯酶、OCT-4、SSEA-3、SEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等(請參考Thomson JA等，Science，282(6)1145-1147，1998或Reubinoff BE等，Nat Biotechnol.18(4)399-404，2000)，以便判斷胚干細胞的未分化狀態(tài)。
本實施例采用檢測堿性磷酸酵素以及轉錄因子OCT-4的表現(xiàn)來觀察本發(fā)明無滋養(yǎng)層胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)功效。關于檢測堿性磷酸酵素的方法參照Reubinoff BE等，Nat Biotechnol.，18(4)399-404，2000所敘述的方式，而OCT-4的檢測方法則依照Richards，M.等，Nat Biotechnol.，20(9)933-936.2002所敘述的方式來操作。其檢測結果分述如下1.細胞型態(tài)觀察圖4A與圖4B分別顯示本發(fā)明利用小鼠的胚胎纖維母細胞或人類包皮纖維母細胞做為培養(yǎng)基質的培養(yǎng)系統(tǒng)所培養(yǎng)的人類胚干細胞型態(tài)。
2.堿性磷酸酶檢測人類胚干細胞具有高活性的堿性磷酸酵素，所以藉由鑒定培養(yǎng)的人類胚干細胞的堿性磷酸酵素活性，可以得知人類胚干細胞未分化的程度。實驗結果發(fā)現(xiàn)不論小鼠的胚胎纖維母細胞或人類包皮纖維母細胞為培養(yǎng)基質的培養(yǎng)系統(tǒng)，其所培養(yǎng)的人類胚干細胞均具有高活性的堿性磷酸酵素(染色結果呈現(xiàn)鮮艷的紅色)，顯示其保持于未分化的全能狀態(tài)(圖5A與圖5B)。且根據(jù)實驗結果顯示，胚干細胞在本發(fā)明的無滋養(yǎng)層人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中至少可持續(xù)繼代培養(yǎng)五代仍維持胚干細胞增殖及未分化的特性。
3.OCT-4檢測比較利用各種培養(yǎng)系統(tǒng)所培養(yǎng)的胚干細胞OCT-4的表現(xiàn)，結果如圖6所示，分別為小鼠胚胎纖維母細胞為滋養(yǎng)層(lane1)、人類包皮纖維母細胞為滋養(yǎng)層(lane2)以及利用本發(fā)明系統(tǒng)(lane3)所培養(yǎng)的胚干細胞OCT-4的表現(xiàn)情形，其中l(wèi)ane4為無細胞樣品的對照組。本發(fā)明的無滋養(yǎng)層人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)所培養(yǎng)的人類胚干細胞可觀察到轉錄因子OCT-4的表現(xiàn)(lane3)，此OCT-4為未分化的人類胚干細胞所特有的轉錄因子，由此可知，本發(fā)明的無滋養(yǎng)層人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)確實可保持人類胚干細胞維持于未分化的階段，且OCT-4的表現(xiàn)量與在傳統(tǒng)滋養(yǎng)層培養(yǎng)的人類胚干細胞(lane1與lane2)相當。
本發(fā)明的無滋養(yǎng)層的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有下列優(yōu)勢(1)由于本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中不需要滋養(yǎng)層細胞與人類胚干細胞共同培養(yǎng)，所以可以避免不同細胞培養(yǎng)造成的病源性(pathologic)感染，增加人類胚干細胞的安全性及臨床的可應用性；(2)藉由控管無細胞的培養(yǎng)基質及含有生長因子的培養(yǎng)液，可以進一步管制人類胚干細胞的培養(yǎng)條件及細胞品質；(3)本發(fā)明的培養(yǎng)方法可以應用于開發(fā)人類胚干細胞的產(chǎn)量系統(tǒng)；(4)了解人類胚干細胞與微環(huán)境的互動，促進胚干細胞的研發(fā)及應用；(5)建立人類胚干細胞株；(6)胚干細胞株的基因改造工程(如基因轉染技術)。
上述實施例僅是用來詳細敘述本發(fā)明的內(nèi)容，并非用以限制本發(fā)明于所揭示的特定形式。本發(fā)明的保護范圍以權利要求書的范圍所定義為基準，并且包括不脫離本發(fā)明的精神與范圍的所有修飾與類似的變更。
權利要求
1.一種培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，用以維持人類胚胎干細胞的未分化生長及增殖，該培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)基質，萃取自滋養(yǎng)層細胞的胞外基質；及條件培養(yǎng)基，收集自培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)液；其中，所述滋養(yǎng)層細胞選自初級小鼠胚胎纖維母細胞、小鼠胚胎纖維母細胞株、小鼠胎兒的纖維母細胞、人類胚胎纖維母細胞、人類胎兒肌肉細胞、人類胎兒皮膚細胞、人類成人皮膚細胞、人類包皮纖維母細胞、人類成人輸卵管上皮細胞或人類骨髓基質細胞。
2.如權利要求1所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述滋養(yǎng)層細胞為小鼠胚胎纖維母細胞或人類包皮纖維母細胞。
3.如權利要求1所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)基質的制備方法，包括將滋養(yǎng)層細胞以氫氧化鈉或三硝基甲苯處理后，去除細胞內(nèi)的物質，即可獲得該細胞的胞外基質以作為培養(yǎng)基質。
4.如權利要求3所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述去除細胞內(nèi)物質的方法為用水或緩沖液清洗。
5.如權利要求4所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
6.如權利要求1所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述條件培養(yǎng)基的制備方法，包括(a)將滋養(yǎng)層細胞去活化處理；(b)將步驟(a)所述的細胞置于一培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；以及(c)收取其細胞培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)基。
7.如權利要求6所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述滋養(yǎng)層細胞去活化處理為以γ射線照射或絲裂霉素C處理。
8.如權利要求7所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述滋養(yǎng)層細胞去活化處理為以絲裂霉素C處理。
9.一種人類胚干細胞的培養(yǎng)方法，其步驟包括取得人類胚干細胞；將人類胚干細胞培養(yǎng)于如權利要求1-8任一項所述的培養(yǎng)人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)；以及持續(xù)培養(yǎng)，使人類胚干細胞維持增殖及未分化狀態(tài)。
10.如權利要求9所述的人類胚干細胞的培養(yǎng)方法，其中所述的人類胚干細胞在無滋養(yǎng)層的人類胚干細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中可維持至少五代的未分化與增殖狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人類胚干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)及其培養(yǎng)方法，本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)是用以維持人類胚胎干細胞的未分化生長及增殖，該培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)基質，萃取自滋養(yǎng)層細胞的胞外基質；以及條件培養(yǎng)基，收集自培養(yǎng)滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)液。本發(fā)明同時還提供一種利用本發(fā)明的系統(tǒng)培養(yǎng)人類胚干細胞的方法。
文檔編號C12N13/00GK1626651SQ20031011943
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權日2003年12月10日
發(fā)明者楊梅如, 張光寧, 徐麗道, 黃俊杰, 陳婉昕, 郭兆塋 申請人:財團法人工業(yè)技術研究院