專利名稱：一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞增殖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的方法，具體地說涉及一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞增殖的方法。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)由于創(chuàng)傷、缺血和變性疾病等原因造成大量神經(jīng)元損傷后就不能修復(fù)。近幾年利用神經(jīng)干細(xì)胞移植嘗試治療多種神經(jīng)和退行性疾病成為研究的熱點，并為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能恢復(fù)帶來了希望。神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有多分化潛能的原始細(xì)胞，具有自我更新和增殖的能力，并在特定因素影響或誘導(dǎo)下，向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，由于神經(jīng)干細(xì)胞具有潛在的分化能力，即在一定條件下能定向分化，因此，當(dāng)成體神經(jīng)組織受損或變性后，可利用特定的環(huán)境因素誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向相應(yīng)的神經(jīng)組織或細(xì)胞分化，進而用其替代損傷組織或細(xì)胞，所以，神經(jīng)干細(xì)胞無論是作為腦組織移植的供體，還是作為體內(nèi)誘導(dǎo)分化的靶細(xì)胞，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生提供了一條新的途經(jīng)。
研究人神經(jīng)干細(xì)胞的重要性主要是其潛在的治療價值，目前，用于臨床治療的人神經(jīng)干細(xì)胞主要來源于人胚胎或成體腦組織。個體腦內(nèi)成體神經(jīng)干細(xì)胞不易獲取，含量較少；來源于胚胎的神經(jīng)干細(xì)胞存在倫理學(xué)問題，特別是神經(jīng)干細(xì)胞在體外無血清培養(yǎng)條件下，增殖緩慢，并且隨著傳代次數(shù)的增加而處于負(fù)增殖狀態(tài)，因此，獲得充足、安全而合格的神經(jīng)干細(xì)胞是研究和應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療的前提條件。然而，目前還沒有一條切實可行的方法來促進神經(jīng)干細(xì)胞的體外增殖。
我們都知道氧是生命存在的必要條件，也是細(xì)胞生理功能的一種重要調(diào)節(jié)因子。而低氧是生命發(fā)育的基本環(huán)境，如哺乳動物的胚胎是在低氧環(huán)境中發(fā)育生長的；成體哺乳動物腦組織內(nèi)的局部氧水平只有1％-5％，也是一種生理性的低氧環(huán)境。然而，目前體外哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)條件是在37℃下，5％二氧化碳和95％空氣的混合氣(氧含量是20％)。近年來關(guān)于低氧對干細(xì)胞的增殖和分化的調(diào)節(jié)作用只有零星的報道，2000年Sean J.Morrison andStuder Lorenz分別研究報道低氧(3％)可促進來源于胎鼠的外周神經(jīng)嵴干細(xì)胞(Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenaldifferentiation by isolated neural crest stem cells，JNeurosciencee，2000，207370-7376)和中樞神經(jīng)前體細(xì)胞(Enhancedproliferation，survival，and dopaminergic differentiation of CNS precursors inlowered oxygen，J Neurosciencce，2000，207377-7383)的增殖，并且誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元方向分化。然而，迄今未見有關(guān)低氧對體外培養(yǎng)人神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化影響的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞增殖的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人在實驗中意外的發(fā)現(xiàn)適宜的低氧濃度對體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞具有促進其增殖作用，使這些細(xì)胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)，并在適宜的條件下能分化為有功能的神經(jīng)元。
本發(fā)明的方法包括以下內(nèi)容首先進行人神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定從流產(chǎn)的胎兒腦內(nèi)，取出海馬組織剪成碎塊，加入胰酶和DNA酶I消化后，離心棄上清，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞球，經(jīng)胰酶消化后，用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后傳代接種于涂有多聚賴氨酸的平皿，置孵育箱培養(yǎng)。用神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物Nestin鑒定分離培養(yǎng)的神經(jīng)球和傳代的神經(jīng)干細(xì)胞。
低氧對人神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖作用將原代或傳代的神經(jīng)干細(xì)胞分別放在含氧量為20％的常氧和含氧量分別為3％和10％的低氧環(huán)境中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞球增多。經(jīng)統(tǒng)計分析，在10％的低氧環(huán)境下，神經(jīng)球的形成數(shù)目明顯高于常氧組，同樣在3％的低氧組形成的神經(jīng)球數(shù)目也有所增高。用脲嘧啶的類似物，在細(xì)胞的合成期摻入到DNA雙鏈中，作為細(xì)胞增殖的指標(biāo)，觀察低氧對貼壁生長的神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。在低氧前，將BrdU加入到培養(yǎng)基中，然后將神經(jīng)干細(xì)胞分別放在不同的環(huán)境下培養(yǎng)后，BrdU染色結(jié)果顯示在3％和10％低氧環(huán)境中BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目均明顯高于常氧組。
低氧環(huán)境中培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞能分化為具有功能的神經(jīng)元將不同環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球，在分化液中吹打成單細(xì)胞，接種在涂膠的平皿中，在含有胎牛血清的分化液中，24小時后可見細(xì)胞均貼壁生長，并長出突起，一般需9-12天才能變?yōu)槌墒斓纳窠?jīng)元。結(jié)果顯示在3％O2和10％低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化后形成的神經(jīng)元生長狀態(tài)好，神經(jīng)元的數(shù)目多于常氧組。表明低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力并沒有受到明顯的影響，并更有利于其向神經(jīng)元方向分化。
低氧對分化后的神經(jīng)細(xì)胞電生理特性的影響已知成熟的神經(jīng)元具有特征性的鈉-鉀電流，鈉-鉀電流的存在也是神經(jīng)元具有功能的前提，且膜電位的大小可反應(yīng)細(xì)胞的成熟程度。發(fā)明人檢測了低氧對分化后的神經(jīng)細(xì)胞膜上鈉-鉀電流的影響，結(jié)果顯示在3％低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，分化后神經(jīng)細(xì)胞膜鈉-鉀電流大，明顯高于在20％和10％的低氧環(huán)境中誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元，而在10％低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，分化后神經(jīng)細(xì)胞膜鈉-鉀電流小于20％和3％的低氧環(huán)境中分化的神經(jīng)元(如圖6所示)。該結(jié)果提示3％低氧環(huán)境更有利于神經(jīng)細(xì)胞的成熟。
綜上所述，低氧可促進人神經(jīng)干細(xì)胞的體外增殖，使這些細(xì)胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)，在低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞能分化為具有功能的神經(jīng)元，而且在3％低氧環(huán)境更有利于神經(jīng)干細(xì)胞的成熟。
利用環(huán)境中的低氧調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，具有實驗流程簡單，重復(fù)性強，結(jié)果可靠，在體外易調(diào)控，對神經(jīng)干細(xì)胞無損傷和毒副作用，實用性強的特點，并可避免使用胎腦組織引起的倫理學(xué)限制。


圖1.為分離培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞鑒定圖。其中A原代接種的人海馬神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)3天后，所形成的神經(jīng)球呈Nestin染色陽性。B原代培養(yǎng)3天后所形成的神經(jīng)球，經(jīng)傳代后貼壁生長3天的細(xì)胞呈Nestin染色陽性(200×)。
圖2.為低氧對神經(jīng)球形成的增殖作用圖。其中A10％低氧環(huán)境下培養(yǎng)3天后所形成的神經(jīng)球。B常氧環(huán)境下培養(yǎng)3天后形成的神經(jīng)球(100×)。
圖3.為低氧對貼壁生長的神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用圖。A在10％低氧環(huán)境下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞摻入BrdU陽性的細(xì)胞。B在常氧環(huán)境下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞摻入BrdU陽性的細(xì)胞。黑色表示BrdU陽性的細(xì)胞(200×)。
圖4.低氧對神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的統(tǒng)計圖?？v坐標(biāo)軸表示在不同濃度的氧環(huán)境下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞摻入BrdU陽性的細(xì)胞數(shù)，在低氧環(huán)境(3％和10％)下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞摻入BrdU陽性的細(xì)胞數(shù)明顯高于常氧對照組，P＜0.01，與對照組相比)。
圖5.低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞能分化為成熟的神經(jīng)元。A10％O2；B3％O2；C20％O2；黑色的核為NeuN-陽性的神經(jīng)元(200×)。
圖6.代表性的神經(jīng)細(xì)胞膜的鈉-鉀電流圖。其中A20％O2；B3％O2；C10％O2。
具體實施例方式
實施例一 人神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)1.人神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)參考Studer L.的神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法(Transplantation of expandedmesencephalic precursors leads to recovery in parkinsonian rats，Nat Neurosci1290-295)，取妊娠9-12周的流產(chǎn)胎兒的胎腦，在解剖鏡下剝?nèi)ツX膜，分離海馬組織剪成1mm大小的碎塊，加入含0.125％的胰酶消化液。置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，再加入DNA酶I 37℃消化10分鐘，用含血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打后，1000轉(zhuǎn)/分5分，棄上清加入無血清bFGF 20ng/ml及1％N2和B27)，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后按1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶，置孵育箱，每3-4天換半液。原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞球，經(jīng)胰酶消化后，用完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后，按1×105/ml傳代接種于涂有多聚賴氨酸的35mm塑料平皿，置孵育箱培養(yǎng)。
2.人神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，或原代培養(yǎng)的神經(jīng)球，經(jīng)傳代后接種在涂膠的35mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天后，用4％的多聚甲醛固定后，進行Nestin免疫組化染色。鼠Nestin抗體(1∶1000)，4℃過夜，生物素標(biāo)記的二抗(Vector，1∶1000)，4℃過夜，ABC復(fù)合物(1∶1000)常溫60分種，用DAB法顯色，為棕色的胞漿沉淀物。經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin染色鑒定，原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球Nestin陽性如圖1和傳代后貼壁生長的神經(jīng)干細(xì)胞Nestin陽性如圖2。后面的實驗都是用第2和3代的人神經(jīng)干細(xì)胞進行的。
實施例二 低氧環(huán)境對人神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖作用1.實驗分組及低氧條件的確定實驗分3組，分別為常氧對照組(20％O2)3％低氧組(3％O2)和10％低氧組(10％O2)。自制細(xì)胞低氧培養(yǎng)箱，向密閉箱中分別通入含3％或10％O2，5％CO2和氮氣平衡的混合氣體，開始通氣量1L/min，持續(xù)通氣30min后，調(diào)整至維持量0.1L/min繼續(xù)通氣，保持密閉容器內(nèi)的氧含量分別為3％或10％O2。
2.神經(jīng)干細(xì)胞增殖的檢測方法1)神經(jīng)球計數(shù)法原代分離的神經(jīng)干細(xì)胞分別放在不同氧濃度的環(huán)境中培養(yǎng)3天后，雙盲法計數(shù)神經(jīng)球的形成個數(shù)，在200倍顯微鏡下每瓶計數(shù)50個視野，每組4瓶，計算其平均值。在200倍顯微鏡下，雙盲法記數(shù)BrdU染色陽性細(xì)胞的數(shù)目，每皿計數(shù)50個視野，每組5-6皿，計算其均值，組間比較用非配對Student’sT-test。
2)BrdU摻入及免疫組化染色神經(jīng)球經(jīng)傳代后接種在涂膠的35mm的培養(yǎng)皿中，每皿加入BrdU 20ul(終濃度為10uM)，然后分別放在含3％，10％和常氧環(huán)境中培養(yǎng)3天，用4％的多聚甲醛固定后，進行BrdU免疫組化染色。2N HCl常溫30分鐘變性處理后，加入鼠BrdU-抗體(MolecularProbe，1∶1000)4℃ 48小時，生物素標(biāo)記的二抗(Vector，1∶1000)，4℃過夜，ABC復(fù)合物(1∶1000)常溫60分鐘，用硫酸鎳胺-DAB染色法顯色，BrdU免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞為黑色的細(xì)胞核沉淀物。在200倍顯微鏡下，雙盲法記數(shù)BrdU染色陽性細(xì)胞的數(shù)目，每皿計數(shù)50個視野，每組5-6皿，計算其均值，組間比較用非配對Student’sT-test。
3.低氧環(huán)境對人神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖作用1)將原代培養(yǎng)的細(xì)胞分別放在常氧(含氧量為20％)和低氧(含氧量分別為3％和10％)環(huán)境中培養(yǎng)3天，顯微鏡下觀察在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞球增多。經(jīng)統(tǒng)計分析在10％的低氧環(huán)境下，神經(jīng)球的形成數(shù)目明顯高于常氧組，增殖的神經(jīng)球數(shù)目為常氧組的2.4倍(如圖3)，同樣，在3％的低氧環(huán)境中形成的神經(jīng)球數(shù)目也有所增高，為常氧組的1.5倍。
2)低氧對貼壁生長的神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖作用。5-溴脫氧尿苷(BrdU)是脲嘧啶的類似物，在細(xì)胞的合成期摻入到DNA雙鏈中，可作為細(xì)胞增殖的指標(biāo)。在低氧前，將BrdU加入到培養(yǎng)基中，然后將神經(jīng)前體細(xì)胞分別放在不同的環(huán)境下培養(yǎng)72小時后，BrdU染色結(jié)果顯示在低氧環(huán)境中(3％和10％)BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目分別比常氧組增加了63％和88％，明顯高于常氧組(如圖3)。BrdU摻入實驗表明在低氧環(huán)境中BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照組。
實施例三 低氧環(huán)境中培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力1.神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法將第2或3代的神經(jīng)干細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，按1×105/ml傳代接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，分別放在常氧對照組(20％O2)，3％低氧組(3％O2)和10％低氧組(10％O2)環(huán)境中增殖至神經(jīng)球長到有50-100個細(xì)胞，取出后去除生長液，在含1％FBS和1％N3的DMEM/F12分化液中吹打成單細(xì)胞，計數(shù)后按1×105/ml，分別接種在35mm2涂膠的平皿中，常氧條件下，培養(yǎng)9-12天，每3-4天換液一次，觀察對其分化的影響。
2.分化為成熟神經(jīng)元的檢測方法NeuN免疫組化染色將分化后的細(xì)胞用4％的多聚甲醛固定，加入鼠NeuN抗體(MolecularProbe，1∶1000)4℃ 48小時，生物素標(biāo)記的二抗(Vector，1∶1000)，4℃過夜，ABC復(fù)合物(1∶1000)常溫60分鐘，用聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，NeuN免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞為棕色的細(xì)胞核沉淀物。
3.低氧環(huán)境中培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞能分化能力檢測以上結(jié)果表明低氧(含氧量分別為3％和10％)能促進神經(jīng)干細(xì)胞的體外擴增，那么，在低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞其分化能力是否發(fā)生變化？為此，發(fā)明人觀察低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。將不同環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球，在分化液中吹打成單細(xì)胞，接種在涂膠的平皿中，在含有1％胎牛血清的分化液中，24小時后可見細(xì)胞均貼壁生長，并長出突起，一般需9-12天才能變?yōu)槌墒斓纳窠?jīng)元，并且結(jié)果顯示在3％O2和10％低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化后形成的神經(jīng)元生長狀態(tài)好，數(shù)目多于常氧組(如圖5所示)。該結(jié)果表明低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力并沒有受到明顯的影響，反而更有利于其向神經(jīng)元方向分化。
實施例四 低氧環(huán)境中培養(yǎng)的神經(jīng)元的功能鑒定1.神經(jīng)元的電生理特性檢測方法將第3代神經(jīng)干細(xì)胞球接種在35cm涂膠的平皿中分化，分化液為含1％胎牛血清的DMEM/F12(1％N3)，每3-4天換液一次，培養(yǎng)9-12天，待神經(jīng)細(xì)胞胞體變大，突起變長成網(wǎng)，用細(xì)胞胞外記錄的方法，記錄細(xì)胞的鈉-鉀電流，每組隨機測6-8個細(xì)胞，計算鈉-鉀電流的均數(shù)并進行統(tǒng)計分析。
2.低氧對分化后的神經(jīng)細(xì)胞電生理特性的影響已知成熟的神經(jīng)元具有特征性的鈉-鉀電流，鈉-鉀電流的存在也是神經(jīng)元具有功能的前提，因此，發(fā)明人又進一步檢測了低氧對分化后的神經(jīng)細(xì)胞膜上鈉-鉀電流的影響。結(jié)果顯示在低氧(3％)環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，分化后神經(jīng)細(xì)胞膜鈉-鉀電流大，明顯高于在20％和10％的低氧環(huán)境中誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元，而在低氧(10％)環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，分化后神經(jīng)細(xì)胞膜鈉-鉀電流小于20％和3％的低氧環(huán)境中分化的神經(jīng)元(如圖6所示)。該結(jié)果提示3％低氧環(huán)境有利于神經(jīng)細(xì)胞的成熟。
**該研究得到了國家自然科學(xué)基金重大項目的資助。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞增殖的方法，其特征在于采用低氧環(huán)境，促進體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的低氧環(huán)境為氧濃度低于20％的環(huán)境。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中氧的濃度為3％至10％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中的氧濃度為3％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于低氧環(huán)境中的氧濃度為5％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞增殖的方法。本發(fā)明通過適宜的氧濃度對體外培養(yǎng)的人神經(jīng)干細(xì)胞進行調(diào)節(jié)，使這些細(xì)胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)，并且在低氧環(huán)境中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞能分化為具有功能的神經(jīng)元。通過本發(fā)明的方法，采用物理手段，體外調(diào)節(jié)人神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，實現(xiàn)少量取樣、體外擴增、大量獲取，進而實現(xiàn)應(yīng)用人神經(jīng)干細(xì)胞治療多種臨床神經(jīng)損傷和退行性疾病，具有較好的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C12N5/08GK1621515SQ20031011681
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者朱玲玲, 范明, 趙彤, 丁愛石, 吳燕, 劉淑紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所