專利名稱：新膽固醇氧化酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來(lái)源于馬紅球菌的新膽固醇氧化酶基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膽固醇氧化酶(Cholesterol oxidase，COX)是膽固醇降解代謝過(guò)程中的第一個(gè)酶。它能夠催化膽固醇3位羥基氧化成羰基，生成中間產(chǎn)物五烯三酮，然后催化5位烯烴雙鍵異構(gòu)成4位烯烴雙鍵，生成終產(chǎn)物4-膽甾烯-3-酮，同時(shí)將脫下的氫與氧氣生成H2O2。
自然界中有多種微生物可分泌產(chǎn)生膽固醇氧化酶，包括鏈霉菌(Streptomyces)、短桿菌(Brevibacter)、紅球菌(Rhodococcus)、諾卡氏菌(Ncardia)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)等，其產(chǎn)生的膽固醇氧化酶的基本特性見(jiàn)表1表1 目前發(fā)現(xiàn)的幾種膽固醇氧化酶的基本特性分子量 等電點(diǎn) 穩(wěn)定PH 最適 活性溫度范 最適溫度酶的來(lái)源文獻(xiàn)(kD)(PI)范圍PH 圍(℃) (℃)鏈霉菌 60 /4.0-11.0 7.070℃失活 60 Lartillot等，PREP.-BIOCHEM.，1990，20(1)51-62短桿菌 33 8.9 4.0-10.0 7.560℃失活 37 Takayuki等，Agr.Biol.Chem.，1973，37(10)2345-2350紅球菌 55 9.1 4.0-10.0 7.820-7047 Ming-Tsun等，Biotechnol.ApplBiochem.，1997，26159-162諾卡氏菌64 /5.0-9.0 7.020-6030 Peter等，Biochemi.J.，1982，201515-521Noriyuki等，假單胞桿菌 60 /4.0-11.0 7.04-60 60 APPL.ENVIRON.MICROBIO.，1998，64(5)1929-1932節(jié)桿菌 57 /6.0-10.0 7.570℃失活 50 蘇起恒等，微生物學(xué)報(bào)，1991，31(6)449-53膽固醇氧化酶的利用主要包括三個(gè)方面(一)作為血漿總膽固醇檢測(cè)試劑的主要成分人體內(nèi)膽固醇代謝和輸送的異常往往與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)聯(lián)，能夠引起心肌梗死、中風(fēng)、動(dòng)脈瘤和膽石癥等疾病，膽固醇的一些代謝產(chǎn)物如類甾醇和類甾烷酮有致癌作用，因此，檢測(cè)血漿和食物中的膽固醇含量在臨床上具有重要意義。而目前通常使用的方法是將膽固醇氧化酶和膽固醇脂酶、過(guò)氧化氫酶復(fù)合在一起，或?qū)⑦@3種酶固定在膜上，做成酶電極，作為血漿總膽固醇的檢測(cè)試劑。(二)用于降低食品中的膽固醇含量研究表明人體內(nèi)膽固醇的水平與飲食有一定的關(guān)系，一般認(rèn)為在0-600mg/天攝入范圍內(nèi)，每增加100mg膽固醇/1000kcal，血液中膽固醇含量會(huì)增加3-12mg/天。而許多高營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)物食品如肉類、牛奶、蛋黃、動(dòng)物的腦肝心腎等臟器均含有較高的膽固醇，使用膽固醇氧化酶處理可有效降低這類食品中膽固醇的含量，而基本不影響這類食品的風(fēng)味。(三)用于抗蟲(chóng)植物基因工程膽固醇氧化酶是一種新型的、高效的殺蟲(chóng)劑，它對(duì)鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、直翅目、同翅目等害蟲(chóng)都有不同程度的毒殺作用，尤其對(duì)鞘翅目棉鈴象甲具有極強(qiáng)的毒殺能力，將膽固醇氧化酶基因克隆到植物中，可以選育出抗蟲(chóng)植物新品種。
自然篩選的高產(chǎn)膽固醇氧化酶微生物菌株，產(chǎn)酶活力一般都只在300u/L發(fā)酵液上清，調(diào)整培養(yǎng)條件也只能小幅度提高產(chǎn)酶效率。構(gòu)建轉(zhuǎn)膽固醇氧化酶基因的工程菌才是真正解決問(wèn)題的關(guān)鍵。目前，科學(xué)家們已經(jīng)從鏈霉菌、甾短桿菌、紅球菌等幾種產(chǎn)酶微生物中分離獲得了膽固醇氧化酶基因，并通過(guò)構(gòu)建細(xì)菌表達(dá)載體和植物表達(dá)載體，使膽固醇氧化酶在大腸桿菌、變青鏈霉菌以及轉(zhuǎn)基因煙草中獲得表達(dá)(David R.Corbin等，Applied and EnvironmentMicrobiolohy，1994，60(12)4239-4244)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的膽固醇氧化酶基因，它來(lái)源于馬紅球菌，這種基因所編碼的蛋白具有降解膽固醇的作用，可用作血漿總膽固醇檢測(cè)試劑的主要成分，也可用來(lái)降低肉、蛋、奶等食品中的膽固醇含量，同時(shí)它對(duì)鞘翅目的棉鈴象甲、鱗翅目的棉鈴蟲(chóng)等多種害蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒殺作用，可用于蟲(chóng)害防治。本發(fā)明的膽固醇氧化酶基因具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明提供的新膽固醇氧化酶基因編碼一種新的膽固醇氧化酶。該膽固醇氧化酶具有以下生理生化特性，酶反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)間為20分鐘；最適反應(yīng)溫度為50℃；30-60℃之間比較穩(wěn)定；最適PH為8.0；在PH7-10之間比較穩(wěn)定；Vm為0.017μmol/min，Km為0.37mM。本發(fā)明的膽固醇氧化酶具有的如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，分子量56KD。
本發(fā)明提供的新膽固醇氧化酶經(jīng)純化后比活力為5.7U/mg，比報(bào)道的其它來(lái)源的膽固醇氧化酶比活力高。
本發(fā)明提供的新膽固醇氧化酶基因核苷酸序列與已報(bào)道的來(lái)源于紅球菌的膽固醇氧化酶基因choE核苷酸序列同源性為99％，屬高度同源。但本發(fā)明提供的新膽固醇氧化酶基因與choE基因相比，在基因的3’端缺失一個(gè)氨基酸編碼序列TTC，該三聯(lián)體密碼子編碼的苯丙氨酸位于膽固醇氧化酶羧基端活性結(jié)構(gòu)域內(nèi)。
本發(fā)明提供的新膽固醇氧化酶基因編碼的新膽固醇氧化酶因在活性區(qū)缺失苯丙氨酸而引起其生理生化特性發(fā)生變化，使該酶的最適反應(yīng)溫度與節(jié)桿菌來(lái)源的膽固醇氧化酶相同，為50℃。活性溫度范圍比報(bào)道的紅球菌來(lái)源的膽固醇氧化酶窄，只在30℃-60℃的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)活性，70℃表現(xiàn)失活。穩(wěn)定PH范圍由一般的膽固醇氧化酶在酸性、中性、堿性條件(PH4-11)下均表現(xiàn)穩(wěn)定而變化成在酸性條件下不穩(wěn)定，只在中性和堿性條件(PH7-10)下穩(wěn)定。同時(shí)，該氨基酸的缺失直接引起本發(fā)明提供的新膽固醇氧化酶的比活升高，達(dá)5.7U/mg。
本發(fā)明的膽固醇氧化酶基因能夠在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有膽固醇氧化酶活性。利用全長(zhǎng)膽固醇氧化酶基因序列，按正確的閱讀框架融合到分泌表達(dá)載體的α-因子信號(hào)肽編碼序列下游。表達(dá)載體線性化后整合入畢赤酵母基因組中。
本發(fā)明的膽固醇氧化酶基因用于酵母轉(zhuǎn)化時(shí)，電擊轉(zhuǎn)化法效果較好。
本發(fā)明的膽固醇氧化酶基因可以不經(jīng)改造直接在植物中進(jìn)行表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有膽固醇氧化酶活性。針對(duì)棉鈴象甲等不同害蟲(chóng)的危害特點(diǎn)，可使用棉鈴組織特異表達(dá)啟動(dòng)子等組織特異性啟動(dòng)子使該基因在植物的特定組織部位高效表達(dá)。
本發(fā)明的膽固醇氧化酶基因用于植物轉(zhuǎn)化時(shí)，所有常規(guī)方法均可使用。在進(jìn)行棉花等花朵較大的植物材料轉(zhuǎn)化時(shí)，花粉管通道法因可克服品種差異而轉(zhuǎn)化效果較好。


圖1分兩段PCR擴(kuò)增新膽固醇氧化酶基因瓊脂糖凝膠電泳圖譜1 陰性對(duì)照
2 PCR擴(kuò)增獲得的新膽固醇氧化酶基因片段13 PCR擴(kuò)增獲得的新膽固醇氧化酶基因片段2M MBI 1 kb DNA ladder Mix圖2 完整膽固醇氧化酶基因酶切鑒定結(jié)果M MBI 1 kb DNA ladder Mix1-4 pUCW/HindIII+EcoRI圖3 畢赤酵母分泌表達(dá)膽固醇氧化酶的SDS-PAGE結(jié)果M Protein Marker1 陰性對(duì)照2 含pPIC9W表達(dá)載體酵母轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清圖4 膽固醇氧化酶基因植物表達(dá)盒組成示意圖具體實(shí)施方式
給出以下實(shí)施例的目的是舉例詳細(xì)描述本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明待批權(quán)利范圍的限制。在本發(fā)明技術(shù)特征和待批權(quán)利要求范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作出某些等同的改動(dòng)和顯而易見(jiàn)的改進(jìn)。
實(shí)施例一編碼新膽固醇氧化酶基因的分離1.1馬紅球菌基因組DNA提取膽固醇氧化酶基因供體菌為馬紅球菌，從北京動(dòng)物園蒙古野驢新鮮糞便中分離獲得。取50mL培養(yǎng)3d的菌液，于4℃，5000r/min，離心10min，收集菌體，用TES(30mmol/L Tris-Hcl，5mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，pH8.0)Buffer洗滌一次菌體，再用5倍體積的含20％蔗糖的TES Buffer重懸菌體(每克濕菌體按大致1mL計(jì)算)，并加溶菌酶至終濃度為5mg/mL，37℃溫育2h；于4℃，5000r/min，離心20min收集沉淀，用含20％蔗糖的TES Buffer懸浮沉淀，加入EDTA至終濃度0.1mol/L，室溫處理10min，再加入蛋白酶K至終濃度0.1mg/mL，60℃溫育1h；加NaCl至終濃度0.8mol/L，CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)至終濃度1％，65℃溫育10min；然后用酚、酚/氯仿(1∶1)、氯仿/異戊醇(24∶1)分別抽提一次，0.6×體積異丙醇沉淀，70％乙醇洗滌，DNA沉淀用TE溶解。
1.2新膽固醇氧化酶基因的克隆1.2.1分兩段擴(kuò)增新膽固醇氧化酶基因設(shè)計(jì)并合成如下兩對(duì)引物引物對(duì)1 5′-GGGGATCCATGACCGATAGCCGGGCGAACAG-3′BamHI5′-CCGAATTCATGTACTCGAGGTCGTACACGTTG-3′EcoRI XhoI引物對(duì)2 5′-GTACGACGTCGACTACATGAAGAAGGAGGCTGCC-3′SalI5′-GGGAATTCCTGGATGTCGGACGAGATGATCTTGTC-3′EcoRI為了方便PCR產(chǎn)物克隆，在引物對(duì)1中，引入了BamHI和EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，在引物對(duì)2中，引入了SalI和EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。以馬紅球菌基因組DNA為模板，利用上面兩對(duì)引物按PCR方法分兩段擴(kuò)增膽固醇氧化酶基因。Taq DNA聚合酶選用上海生工生物工程公司的適于擴(kuò)增大片段和高保真的Taq plus I DNA聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，68℃，1.5min，共30個(gè)循環(huán)；68℃，10min降至4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，由引物對(duì)1擴(kuò)增到一條740bp主帶，為基因片段F1，由引物對(duì)2擴(kuò)增到一條900bp主帶，為基因片段F2，如圖1所示。切出這兩條主帶，Glassmilk純化回收，分別利用BamHI+EcoRI和SalI+EcoRI雙酶切，將回收的擴(kuò)增片段克隆至載體質(zhì)粒pUCm-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在添加氨芐青霉素50μg/ml以及X-gal和IPTG的平板上篩選重組克隆，并提取質(zhì)粒(J.薩姆布魯克等，《分子克隆》(第二版)，1996)進(jìn)行酶切鑒定。最后獲得重組質(zhì)粒pUCF1和pUCF2。
1.2.2兩段擴(kuò)增片段連接成新膽固醇氧化酶基因利用SalI和EcoRI從pUCF2質(zhì)粒上切出基因片段F2，連接到經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切后呈線性的pUCF1質(zhì)粒上，在添加氨芐青霉素50μg/ml的平板上篩選重組克隆，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示。最后獲得含有完整新膽固醇氧化酶基因choEW的重組質(zhì)粒pUCW。
實(shí)施例二新膽固醇氧化酶基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)2.1重組分泌表達(dá)載體的構(gòu)建利用BamHII和EcoRI從pUCW上切下新膽固醇氧化酶基因choEW，與用XhoI和EcoRI雙酶切的pPIC9K酵母表達(dá)載體連接，同時(shí)在連接體系中添加BamHI/XhoI adaptor，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在添加卡那霉素50μg/ml的平板上篩選重組克隆，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，最終獲得重組載體pPIC9W。
2.2重組分泌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母及重組酵母的篩選質(zhì)粒pPIC9W經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，通過(guò)重組，目的基因可以整合至酵母基因組中。在外源誘導(dǎo)物甲醇存在的條件下，AOX1啟動(dòng)子可以啟動(dòng)其下游基因的表達(dá)，并且信號(hào)肽可以指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入酵母的分泌途徑，最終分泌至胞外。
研究中首先用BglII酶切重組質(zhì)粒pPIC9W，使之線性化，然后電擊轉(zhuǎn)化酵母受體菌畢赤酵母GS115(His-，Mut+)，轉(zhuǎn)化物涂布RDB平板。由于載體中沒(méi)有酵母復(fù)制子，位于載體上的his4基因必須整合進(jìn)酵母基因組中才能表達(dá)，所以只有轉(zhuǎn)化子才能在不含His的基本培養(yǎng)基RDB(1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，1.34％Yeast Nitrogen Base With Ammonium Sulfate withamino acids(YNB)，0.00004％Biotin，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％賴氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％異亮氨酸，1.5％瓊脂)上生長(zhǎng)。
用無(wú)菌牙簽從轉(zhuǎn)化平板上挑取His+重組子，先點(diǎn)至MM(1.34％YNB，0.00004％Biotin，O.5％甲醇，1.5％瓊脂)平板，再點(diǎn)至MD(1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，1.5％瓊脂)平板，篩選出在MD平板上生長(zhǎng)正常，在MM平板上生長(zhǎng)緩慢，具有正確的His+MutS表型的重組子。重組酵母的MutS表型說(shuō)明已有外源基因整合到酵母基因組中AOX1基因位點(diǎn)，從而破壞了該基因的功能。
2.3新膽固醇氧化酶在重組酵母中分泌表達(dá)挑取重組酵母菌株接種于裝有5mL BMGY培養(yǎng)基[1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)]的15ml試管，8層紗布封口，于30℃搖床培養(yǎng)48h，5000rpm離心，棄去上清，用1mL BMMY培養(yǎng)基[1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)]重新懸浮菌體，在30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)48h，離心取50μl上清，直接進(jìn)行膽固醇氧化酶活性檢測(cè)，另取50μl上清，加等體積2×SDS-PAGE加樣緩沖液，沸水煮3-5min，12000rpm，離心10min，取10μl，用15％的SDS-PAGE檢測(cè)上清中膽固醇氧化酶的表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)其為大約56KD的蛋白質(zhì)分子。新膽固醇氧化酶基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示。
2.4畢赤酵母分泌產(chǎn)生的新膽固醇氧化酶活性檢測(cè)游離的膽固醇經(jīng)膽固醇氧化酶的催化與氧氣反應(yīng)生成膽甾烯酮和H2O2，H2O2可使體系中的4-氨基氨替吡啉和苯酚在辣根過(guò)氧化物酶的作用下反應(yīng)生成紅色的醌化物，該醌化物顏色的深淺與膽固醇的含量成正比(Allian et al.1974)。用pH7.0的磷酸緩沖液(50mmol/L)配制成1mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)膽固醇溶液(100ml)，其中含有14mmol/L的苯酚、1.4mmol/L的4-氨基-氨替吡啉、0.768％的Triton X-100、5Units的辣根過(guò)氧化物酶。取200ul于微孔板中，加入50μl誘導(dǎo)培養(yǎng)后的畢赤酵母培養(yǎng)液上清，于30℃反應(yīng)，同時(shí)在500nm下監(jiān)測(cè)其紅色的變化及酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀的讀數(shù)?？梢园l(fā)現(xiàn)在加入上清不到1分鐘的時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)液開(kāi)始變紅，隨著時(shí)間的推移，反應(yīng)液的顏色越來(lái)越紅。證明誘導(dǎo)培養(yǎng)后的畢赤酵母培養(yǎng)液上清中含有高活性的新膽固醇氧化酶。
實(shí)施例三新膽固醇氧化酶基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及向模式植物煙草中的導(dǎo)入及鑒定3.1新膽固醇氧化酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建的新膽固醇氧化酶基因植物表達(dá)盒中包括以下基因表達(dá)調(diào)控元件5’端的35S啟動(dòng)子、加倍的增強(qiáng)子、Ω序列及kozak序列，3’端的多聯(lián)終止序列、切割序列、正確加工序列以及NOS終止子。這些表達(dá)調(diào)控元件除355啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之外都是通過(guò)化學(xué)方法人工合成的(詳見(jiàn)中國(guó)專利CN 951 19563.8，1995)。在本實(shí)驗(yàn)室所保存的帶有人工合成的Bt.殺蟲(chóng)蛋白基因表達(dá)盒的質(zhì)粒pG4AB中包括有這些元件。
利用BamHII和EcoRI從pUCW上切下新膽固醇氧化酶基因choEW，與用經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pG4AB后純化回收的2.7kb載體片段連接，同時(shí)在連接體系中加入鈍化EcoRI位點(diǎn)的EcoRI/XhoI adaptor，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在添加氨芐青霉素50μg/ml的平板上篩選重組克隆，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，最終獲得含新膽固醇氧化酶基因的重組載體pG4AW。新膽固醇氧化酶基因表達(dá)盒的組成如圖4所示。
用HindIII和EcoRI雙酶切切下pG4AW中的3.1kb新膽固醇氧化酶基因表達(dá)盒，克隆到經(jīng)HindIII和EcoRI雙酶切后回收的pBI121.1大片段上，在添加卡那霉素50μg/ml的平板上篩選重組克隆，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，最終獲得含新膽固醇氧化酶基因的重組質(zhì)粒pGBI1214AW。這就是所構(gòu)建的新膽固醇氧化酶基因的植物表達(dá)載體。
3.2新膽固醇氧化酶基因植物表達(dá)載體向模式植物煙草中的導(dǎo)入及鑒定3.2.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取LBA4404單菌落接種于5ml YEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素100μg/ml)中，28℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。吸取2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值約為0.6。將菌液轉(zhuǎn)至無(wú)菌離心管中，冰浴30分鐘，5000rpm離心5分鐘，用1.7ml 20mmol/L無(wú)菌CaCl2重懸菌體，加入300μl無(wú)菌甘油，混勻后，按每管200μl分裝于無(wú)菌1.5ml微量離心管中。
3.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LBA4404細(xì)胞在200μl LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中加入2μg重組質(zhì)粒pGBI1214AW DNA，冰浴5分鐘，然后轉(zhuǎn)至液氮中冷凍8分鐘，迅速于37℃水浴中溫育5分鐘后，加入800μl YEB液體培養(yǎng)基，28℃、250rpm預(yù)表達(dá)培育4～5小時(shí)，然后涂鋪含有卡那霉素、鏈霉素的YEB平板，28℃培育24~48小時(shí)，出現(xiàn)帶有相應(yīng)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的菌落。
3.2.3煙草的轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備28℃、200rpm過(guò)夜培養(yǎng)含重組質(zhì)粒pGBI1214AW 50ml，5000rpm離心5分鐘，收集菌體沉淀，用MS液體培養(yǎng)基洗滌一次后，再用MSO液體培養(yǎng)基重懸至OD600＝0.2～0.5(2)浸染取煙草無(wú)菌苗的嫩葉片，用刀切成約0.5cm的小方塊，在農(nóng)桿菌懸液中浸泡5～10分鐘，然后用無(wú)菌濾紙吸干；(3)共培養(yǎng)將葉塊擺放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中(上面鋪2層濾紙)于25℃避光共培養(yǎng)3天；(4)選擇培養(yǎng)將葉片轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中，于25℃光照培養(yǎng)箱(光照12小時(shí)，黑暗12小時(shí))中培養(yǎng)至抗性芽的出現(xiàn)；(5)分化培養(yǎng)將2～3cm長(zhǎng)的抗性芽移到生根培養(yǎng)基中，一星期后逐漸長(zhǎng)出根來(lái)；(6)抗性小苗的獲得待小苗長(zhǎng)到5～8cm高時(shí)，移栽到含有營(yíng)養(yǎng)土的小塑料缽中。
3.2.4轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)鑒定3.2.4.1 PCR鑒定取1克煙草新鮮葉片，加等量AL2O3，于液氮中研成粉末，裝入離心管中，加入2ml DNA提取緩沖液(100mM Tris.Cl pH8.0，500mM NaCl，50mM EDTA pH8.0，臨用前加入10mM β-巰基乙醇)，劇烈振蕩1分鐘，加入0.4ml 10％SDS，輕輕混勻，于65℃溫育10～20分鐘，至顏色翠綠，加入0.4ml冰冷的5M KAc，輕輕混勻，冰上放置30分鐘，然后于4℃12000rpm離心15分鐘，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入0.6倍體積異丙醇后用RNase處理，純化備用。
以轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板，分別用所合成的choAL基因特異引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)和Bt殺蟲(chóng)蛋白基因特異引物(SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17)進(jìn)行如下PCR反應(yīng)在一滅菌的0.2ml微量離心管中，加入10×PCR buffer 5.0μldNTP(10mM each)1.0μl(終濃度200μM)
MgCl2(25mM) 4.0μl(終濃度2mM)引物1(10pmol/μl) 1.5μl(終濃度300nM)引物2(10pmol/μl) 1.5μl煙草基因組DNA模板 2.0μl(1~2μg)Taq酶(5U/μl) 0.5μlH2O 至總體積50μl；后進(jìn)入PCR反應(yīng)程序；PCR反應(yīng)程序95℃ 5分鐘94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 7分鐘；電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分別有與預(yù)期大小相符的DNA擴(kuò)增片段。
3.2.4.2 Southern Blot分析(1)轉(zhuǎn)膜取適量煙草基因組DNA(約30μg)，用適量的限制性內(nèi)切酶HindIII+EcoRI消化完全(約5U/μg植物DNA，酶切12～16小時(shí))，取少量電泳確證酶切完全，酚、氯仿抽提后純化后，0.8％瓊脂糖凝膠電泳過(guò)夜，約1.5V/cm。待電泳完成后將膠轉(zhuǎn)入0.25N HCl中脫嘌呤15~30分鐘，至溴酚藍(lán)完全變?yōu)辄S色。蒸餾水沖洗后將膠轉(zhuǎn)入0.4N NaOH中漂洗20分鐘，至溴酚藍(lán)完全恢復(fù)為藍(lán)色，與此同時(shí)，將HybondTM-N+尼龍膜在超純水中浸潤(rùn)后轉(zhuǎn)入0.4N NaOH中浸泡5分鐘以上，以0.4N NaOH為轉(zhuǎn)膜液，利用真空轉(zhuǎn)膜儀用較小的負(fù)壓轉(zhuǎn)膜約1小時(shí)，完成后標(biāo)記尼龍膜點(diǎn)樣孔一角，然后在2×SSC(1.75％NaCl，0.88％檸檬酸鈉，pH＝7.0)溶液中浸泡10分鐘，濾紙吸干尼龍膜(紫外交聯(lián)3分鐘或夾在兩張濾紙中于80℃烘烤2小時(shí))，用保鮮膜包裹保存?zhèn)溆谩?br> (2)預(yù)雜交配制預(yù)雜交液于50ml離心管中依次加入ddH2O、5×HBS(3mol/L NaCl，0.1mol/L PIPES，20mmol/L EDTApH6.8)和Denhardt’s III(2％Fioll 400，2％PVP 360，2％gelatin，10％SDS，5％Na2P2O7·10H2O)，混勻后置于65℃水浴中，各溶液用量視膜的多少而定，具體情況如下1-2膜 3-6膜7-10膜ddH2O(ml) 6 13205×HBS(ml) 2 4 6Denhardt’s III(ml)1 2 3SSDNA(ml) 0.3 0.6 0.9(SS DNA(Salmon Sperm DNA，10mg/ml)需用超聲波打斷，并在使用前于100℃變性7分鐘后迅速置于冰上，待50ml離心管中的預(yù)雜交液澄清后加入)將雜交膜放入雜交管中，倒入雜交液，使雜交液浸潤(rùn)雜交膜，蓋緊雜交管后置于雜交爐65℃雜交5～6小時(shí)(新膜)或2小時(shí)(舊膜)；探針標(biāo)記采用Promega公司的探針標(biāo)記試劑盒，取適量待標(biāo)記的DNA片段，95～100℃變性5分鐘，迅速置于冰上，在微量離心管中依次加入
5×labling buffer 10μldCTP、dGTP、dTTP混合液2μl待標(biāo)記的DNA片段 25ngMarker DNA10ngBSA 2μlα-32P-dATP 2.5μlKlenow酶 1μlddH2O至總體積50μl室溫反應(yīng)5小時(shí)或37℃1~2小時(shí)進(jìn)行標(biāo)記；(3)雜交探針標(biāo)記完成后，于100℃變性7分鐘，迅速置于冰浴5分鐘，加入雜交管中，于雜交爐65℃與預(yù)雜交后的雜交膜雜交12小時(shí)以上；(4)洗脫用65℃預(yù)熱的2×SSC，0.5％SDS的洗脫液于65℃洗膜15分鐘，重復(fù)一次；然后用65℃預(yù)熱的0.2×SSC，0.5％SDS的的洗脫液于65℃洗膜15分鐘，重復(fù)一次；(5)2×SSC洗膜15分鐘后晾干，(紫外交聯(lián)3分鐘或夾在兩張濾紙中于80℃烘烤2小時(shí))，用保鮮膜包裹；(6)放射自顯影于暗室將X-光片放于膜上，專用夾夾好后，置-70℃冰箱中曝光1～7天后洗片。結(jié)果表明，絕大部分轉(zhuǎn)基因煙草為Southern Blot陽(yáng)性。
3.2.5轉(zhuǎn)基因煙草膽固醇氧化酶活性檢測(cè)挑取Southern Blot陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草植株和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵葜仓?，分別取1g左右新鮮葉片，液氮研磨后加Tris-Cl緩沖液，混勻后離心，取20μl上清液，加入100μl膽固醇氧化酶活性檢測(cè)液(1.4mmol/L 4-氨基-安替吡啉，7mmol/L苯酚，0.5mol/L磷酸鈉緩沖液PH7.0，1mmol/L膽固醇，1g/L辣根過(guò)氧化物酶)，觀察反應(yīng)液顏色的變化。
結(jié)果在所測(cè)試的26株轉(zhuǎn)基因煙草中，有7.7％(2/26)的反應(yīng)液顏色暗紅，有38.5％(10/26)的反應(yīng)液顏色深紅，有53.8％(14/26)的反應(yīng)液顏色淺紅或很淡，接近對(duì)照煙草的顏色。說(shuō)明部分轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)出了具有較高膽固醇氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
3.2.6轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲(chóng)性測(cè)試取轉(zhuǎn)基因煙草及對(duì)照非轉(zhuǎn)基因煙草葉片，放入平皿中，葉柄基部用濕潤(rùn)棉球包好，保持葉片青鮮。每片葉接入6～10頭棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，以膠布封好平皿，防止幼蟲(chóng)爬走，重復(fù)3次，4日后統(tǒng)計(jì)分析殺蟲(chóng)結(jié)果。
在未轉(zhuǎn)基因煙草中，棉鈴蟲(chóng)大量取食，發(fā)育正常，生長(zhǎng)迅速；在部分轉(zhuǎn)基因煙草中，棉鈴蟲(chóng)少兩取食后即出現(xiàn)拒食反應(yīng)，發(fā)育受到抑制，最后死亡。
實(shí)施例四新膽固醇氧化酶基因植物表達(dá)載體向棉花中的導(dǎo)入及鑒定4.1新膽固醇氧化酶基因植物表達(dá)載體的大量制備1)將30ml含有pGBI1214AW的細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對(duì)數(shù)晚期(OD值約0.6)；2)在500ml LB培養(yǎng)基中加入25ml對(duì)數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖(300rpm)培養(yǎng)24～36小時(shí)；
3)4℃以5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收獲菌體，棄上清；4)將細(xì)菌沉淀用100ml冰冷的STE溶液洗滌一次；5)將洗過(guò)的細(xì)菌沉淀物重懸于20ml溶液I中；6)加40ml新配制的溶液II，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，于室溫放置5-10分鐘；7)加30ml用冰預(yù)冷的溶液III，封住瓶口，輕輕搖動(dòng)離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰上放置30分鐘，讓DNA充分復(fù)性；8)4℃以5000rpm離心20分鐘，棄沉淀，上清用擦鏡紙過(guò)濾；9)加0.6×體積的異丙酵，充分混勻，于室溫放置10分鐘，并于室溫以8000rpm離心15分鐘，棄上清；10)核酸沉淀于室溫用70％乙醇洗滌一次，并于室溫風(fēng)干；11)用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀；12)加入3ml用冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，4℃下以10000rpm離心10分鐘，棄沉淀；13)上清加等量的異丙醇，混勾后于室溫以10000rpm離心10分鐘，棄上清；14)核酸沉淀于室溫用70％乙醇洗滌一次，在真空冷凍干燥器內(nèi)干燥；15)用500μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，于室溫放置30分鐘；16)加500μl含13％(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，于4℃以12000rpm離心5分鐘，棄上清；17)用400μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提1次；18)加100μl 10mol/L乙酸銨充分混勻，加2×體積(約1ml)無(wú)水乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12000rpm離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒DNA；19)吸去上請(qǐng)，加200μl處于4℃的70％乙醇，稍加振蕩，用微量離心機(jī)于4℃以12000rpm離心2分鐘；20)吸去上清，在真空冷凍干燥器內(nèi)干燥質(zhì)粒DNA；用500μl TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，并將DNA貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 4.2植物受精胚囊注射法轉(zhuǎn)化棉花編碼膽固醇氧化酶的基因在植物中的高效表達(dá)對(duì)于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物是最為關(guān)鍵的，但是外源基因轉(zhuǎn)化植物是否能獲得成功，也是致關(guān)重要的環(huán)節(jié)。在本發(fā)明之前，本領(lǐng)域科技人員熟知的利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電激法等方法轉(zhuǎn)化植物雖然有許多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不僅受到實(shí)驗(yàn)室條件和昂貴的儀器及費(fèi)用極高等的限制，更重要的是上述方法都有一個(gè)不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生產(chǎn)上發(fā)揮著重要作用的優(yōu)良植物品種，由于基因型的不同，不能通過(guò)愈傷途徑再生成植株；或再生植株極為困難。在這樣時(shí)情況下，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)植物受精膠囊注射轉(zhuǎn)化的技術(shù)或稱植物受精膠囊注射轉(zhuǎn)化法(CN 95119563.8)，成功地獲得了具有高抗蟲(chóng)能力的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花。雖然本發(fā)明優(yōu)選棉花作為子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精膠囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于1).適合于所有植物的基因型；2).方法簡(jiǎn)單，有效；3).不受實(shí)驗(yàn)室條件、儀器的限制，且費(fèi)用低；4)速度快，一年內(nèi)即可獲得轉(zhuǎn)基因植物種子及后代。
在本實(shí)施例中，子房注射外源基因轉(zhuǎn)化植物受精胚囊的方法，是在棉花開(kāi)花授粉后的大約10-24小時(shí)之間。如在珠心孔道封閉之前，用微量注射系統(tǒng)將外源基因溶液注射到子房?jī)?nèi)，外要材料即可通過(guò)珠孔和珠心孔道，逐漸擴(kuò)散到或在珠心孔道封閉的過(guò)程中被擠壓到剛受精后的胚囊內(nèi)。在受精卵分裂的過(guò)程中，外源基因被吸收整合到受精卵細(xì)胞的基因組中，從而完成外源基因?qū)牒驼线^(guò)程。
棉花是常異花授粉作物，為保持品種(系)的相對(duì)純度，在開(kāi)花的前一天下午，將要在第二天開(kāi)花的蕾用線扣緊，使花瓣不易張開(kāi)，以使其自花授粉。開(kāi)花后約10小時(shí)左右，即當(dāng)天開(kāi)花的晚6點(diǎn)鐘左右花粉管進(jìn)人胚囊后，即可進(jìn)行外源基因的注射。注射前將花瓣連同雄蕊剝?nèi)ヂ冻鲇租?，抹去幼鈴頂端的花柱，我們?cè)O(shè)計(jì)的微量注射系統(tǒng)吸取預(yù)冷的外源基因溶液，從抹掉幼鈴的頂端，沿中軸垂直插入幼鈴大小的2/3處，再將微量注射器向上提到1/3的地方，留下約幼鈴1/3的插入空間，緩慢將注射裝置內(nèi)的外源溶液注射到插入空間內(nèi)。此后，外源DNA溶液將沿著珠孔和珠心孔道向受精胚囊內(nèi)擴(kuò)散，或由于珠心孔道在逐漸封閉而被擠壓進(jìn)受精胚囊中而實(shí)現(xiàn)其整合。一般注射的外源基因溶液為10ul，總量約為0.25-0.5ug。當(dāng)然，對(duì)于不同的作物可根據(jù)其子房?jī)?nèi)胚珠數(shù)目的多少，適當(dāng)?shù)卦黾踊驕p少外源基因的注射量。外源基因注射后為了防止和減少幼鈴的脫落，提高成鈴率，在幼鈴柄基部用毛筆涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夾在幼鈴柄基部和莖(枝)之間，同時(shí)將所說(shuō)注射外源基因的幼鈴所在的枝條頂端摘掉，以保持幼鈴的充分營(yíng)養(yǎng)，從而將有利于成鈴和鈴內(nèi)種子的發(fā)育。
4.3轉(zhuǎn)膽固醇氧化酶基因棉花的分子生物學(xué)檢測(cè)及酶活和抗蟲(chóng)性測(cè)試應(yīng)用實(shí)施例3.2.4、3.2.5和3.2.6的方法，對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)基因棉花植株分別進(jìn)行了PCR、Southern Blot分析、膽固醇氧化酶酶活檢測(cè)以及抗棉鈴蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。證實(shí)了融合殺蟲(chóng)基因已轉(zhuǎn)入到了棉花基因組中并獲得了高效表達(dá)。
新膽固醇氧化酶及其應(yīng)用.ST25SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>新膽固醇氧化酶及其應(yīng)用<130>新膽固醇氧化酶及其應(yīng)用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>551<212>PRT<213>馬紅球菌<400>1Met Thr Asp Ser Arg Ala Asn Arg Ala Asp Ala Thr Arg Gly Val Ala1 5 10 15Ser Val Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly20 25 30Val Ile Ala Leu Ser Ser Met Ser Thr Ser Ala Ser Ala Ala Pro Ser35 40 45Arg Thr Leu Ala Asp Gly Asp Arg Val Pro Ala Leu Val Ile Gly Ser50 55 60Gly Tyr Gly Gly Ala Val Ala Ala Leu Arg Leu Thr Gln Ala Gly Ile65 70 75 80Pro Thr Gln Ile Val Glu Met Gly Arg Ser Trp Asp Thr Pro Gly Ser85 90 95Asp Gly Lys Ile Phe Cys Gly Met Leu Asn Pro Asp Lys Arg Ser Met100 105 110Trp Leu Ala Asp Lys Thr Asp Gln Pro Val Ser Asn Phe Met Gly Phe115 120 125Gly Ile Asn Lys Ser Ile Asp Arg Tyr Val Gly Val Leu Asp Ser Glu130 135 140Arg Phe Ser Gly Ile Lys Val Tyr Gln Gly Arg Gly Ala Gly Gly Gly145 150 155 160
新膽固醇氧化酶及其應(yīng)用.ST25Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala Val Thr Pro Lys Arg Asn Tyr Phe165 170 175Glu Glu Ile Leu Pro Ser Val Asp Ser Asn Glu Met Tyr Asn Lys Tyr180 185 190Phe Pro Arg Ala Asn Thr Gly Leu Gly Val Asn Asn Ile Asp Gln Ala195 200 205Trp Phe Glu Ser Thr Glu Trp Tyr Lys Phe Ala Arg Thr Gly Arg Lys210 215 220Thr Ala Gln Arg Ser Gly Phe Thr Thr Ala Phe Val Pro Asn Val Tyr225 230 235 240Asp Leu Asp Tyr Met Lys Lys Glu Ala Ala Gly Gln Val Thr Lys Ser245 250 255Gly Leu Gly Gly Glu Val Ile Tyr Gly Asn Asn Ala Gly Lys Lys Ser260 265 270Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Gln Ala Ala Ala Thr Gly Lys Leu Thr275 280 285Ile Thr Thr Leu His Arg Val Thr Lys Val Ala Pro Ala Thr Gly Ser290 295 300Gly Tyr Ser Val Thr Met Glu Gln Ile Asp Glu Gln Gly Asn Val Val305 310 315 320Ala Thr Lys Val Val Thr Ala Asp Arg Val Phe Phe Ala Ala Gly Ser325 330 335Val Gly Thr Ser Lys Leu Leu Val Ser Met Lys Ala Gln Gly His Leu340 345 350Pro Asn Leu Ser Ser Gln Val Gly Glu Gly Trp Gly Asn Asn Gly Asn355 360 365Ile Met Val Gly Arg Ala Asn His Met Trp Asp Ala Thr Gly Ser Lys370 375 380Gln Ala Thr Ile Pro Thr Met Gly Ile Asp Asn Trp Ala Asp Pro Thr385 390 395 400Ala Pro Ile Phe Ala Glu Ile Ala Pro Leu Pro Ala Gly Leu Glu Thr405 410 415Tyr Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile Thr Lys Asn Pro Glu Arg Ala Arg420 425 430Phe Gln Phe Asn Ser Gly Thr Gly Lys Val Asp Leu Thr Trp Ala Gln435 440 445Ser Gln Asn Gln Lys Gly Ile Asp Met Ala Lys Lys Val Phe Asp Lys450 455 460
新膽固醇氧化酶及其應(yīng)用.ST25Ile Asn Gln Lys Glu Gly Thr Ile Tyr Arg Thr Asp Leu Phe Gly Val465 470 475 480Tyr Lys Thr Trp Gly Asp Asp Phe Thr Tyr His Pro Leu Gly Gly Val485 490 495Leu Leu Asn Lys Ala Thr Asp Asn Phe Gly Arg Leu Pro Glu Tyr Pro500 505 510Gly Leu Tyr Val Val Asp Asp Ser Leu Val Pro Gly Asn Val Gly Val515 520 525Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr Ala Leu Ala Glu Arg Asn Met Asp Lys530 535 540Ile Ile Ser Ser Asp Ile Gln545 550<210>2<211>1656<212>DNA<213>馬紅球菌<400>2atgaccgata gccgggcgaa cagagccgat gcgactcggg gggttgcatc cgtctcacgc 60cgtcgattcc ttgcgggcgc aggtctgacc gcgggagtca tcgcgctctc gtcgatgtcg120acctccgcct ccgcagcccc cagccgcacc ctcgccgacg gcgaccgcgt ccctgccctc180gtcatcggca gtggatacgg cggtgccgtc gccgcgctgc ggctgacgca ggccggtatc240cccacgcaga tcgtcgagat gggccgcagc tgggacaccc cgggctccga cggcaagatc300ttctgcggga tgctcaaccc cgacaagcgc tcgatgtggt tggccgacaa gaccgatcag360ccggtcagca acttcatggg cttcggcatc aacaagagca tcgaccggta cgtcggcgtc420ctcgactccg agcggttctc cggcatcaag gtctaccagg gccgcggcgc cggcggcggc480tcgctcgtca acggcggtat ggcagtcacc ccgaagcgca actacttcga ggagatcctg540ccgtcggtcg actcgaacga gatgtacaac aagtacttcc cgcgcgccaa caccggtctg600ggtgtcaaca acatcgacca ggcgtggttc gagtccaccg agtggtacaa gttcgcccgc660accggccgca agaccgccca acgttcgggt ttcacaaccg ctttcgtgcc caacgtgtac720gacctcgact acatgaagaa ggaggctgcc ggccaggtca ccaagtcggg cctcggcggt780gaggtcatct acggcaacaa cgccggcaag aagtcgctcg acaagaccta cctcgcgcag840gccgcggcca ccgggaagct gacgattacg actctgcacc gcgtcaccaa ggtcgcgccg900gccaccggca gcggctacag cgtgacgatg gaacagatcg acgagcaggg caacgtcgtc960gccaccaagg tcgtcaccgc cgatcgggtg ttcttcgcgg ccggcagcgt cggcaccagc 1020aagctcctgg tctcgatgaa ggcgcagggc cacctgccga acctgtcgtc gcaggtcggc 1080gagggctggg gcaacaacgg caacatcatg gtgggccgcg cgaaccacat gtgggacgcc 1140
新膽固醇氧化酶及其應(yīng)用.ST25accggatcca agcaggccac catcccgacg atgggaatcg acaactgggc cgacccgacg 1200gcaccgatct tcgcggagat cgccccgctg ccggccgggc tcgagaccta cgtcagcctg 1260tacctggcca tcacgaagaa ccccgaacgt gctcgcttcc agttcaattc gggcaccggc 1320aaggtcgatc tcacctgggc tcagtcgcag aaccagaagg gcatcgacat ggccaagaag 1380gtgttcgaca agatcaacca gaaggaaggc acgatctacc ggaccgatct gttcggcgtg 1440tacaagacgt ggggcgacga cttcacgtac cacccgctgg gcggcgtgct gctgaacaag 1500gcgaccgaca acttcggccg cctgcccgag taccccggcc tgtacgtcgt ggacgactcg 1560ctcgtccccg gcaatgtcgg cgtcaacccg ttcgtcacga tcaccgcgct cgccgagcgc 1620aacatggaca agatcatctc gtccgacatc cagtag165權(quán)利要求
1.一種新膽固醇氧化酶，它具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的核苷酸序列及其功能等同序列。
3.按照權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，它具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列
4.一種生產(chǎn)新膽固醇氧化酶的方法，包括將權(quán)力要求2所述的新膽固醇氧化酶基因?qū)牍こ叹甑牟襟E。
5.一種生產(chǎn)新膽固醇氧化酶的工程菌株，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的新膽固醇氧化酶基因。
6.按照權(quán)利要求5所述的工程菌株，其特征在于，它是畢赤酵母。
7.一種生產(chǎn)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括將權(quán)利要求2所述的新膽固醇氧化酶基因?qū)胫参锏牟襟E。
8.一種抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植株，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的新膽固醇氧化酶基因。
9.按照權(quán)利要求8所述的植株，其特征在于，它是棉花植株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新膽固醇氧化酶基因以及該基因編碼的蛋白質(zhì)。該膽固醇氧化酶基因來(lái)源于馬紅球菌，這種基因所編碼的膽固醇氧化酶可用于降低食品中的膽固醇含量，用于食品加工。同時(shí)，這種基因所編碼的膽固醇氧化酶可高效毒殺棉鈴象甲，并抑制鱗翅目昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖，可用于作物的蟲(chóng)害防治。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1557949SQ20031011379
公開(kāi)日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者郭三堆, 張銳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 郭三堆, 張銳