專(zhuān)利名稱(chēng)：日本血吸蟲(chóng)的特異性抗原及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)。更具體地，本發(fā)明涉及日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)的特異性抗原、其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的寄生蟲(chóng)。
血吸蟲(chóng)病免疫學(xué)診斷方法的靈敏度與特異性，除與選擇實(shí)驗(yàn)的方法的不同有關(guān)外，主要與所用診斷抗原的特性有關(guān)。目前常用粗制的成蟲(chóng)與蟲(chóng)卵抗原用于血吸蟲(chóng)病診斷的敏感性雖較高，但由于其常混有宿主抗原及含有其它寄生蟲(chóng)如肝吸蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)的共有抗原成分，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，特異性較低。
此外由于傳統(tǒng)抗原多為蟲(chóng)源性，來(lái)源較少，耗資大，難以適應(yīng)大規(guī)模查病的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用基因重組方法生產(chǎn)合成抗原用于診斷寄生蟲(chóng)病已成為可能，國(guó)內(nèi)外也有研究證實(shí)，使用血吸蟲(chóng)特異性的、純化的天然或重組的抗原不僅可以提高血吸蟲(chóng)病診斷的敏感性和特異性，而且檢測(cè)抗某些特異抗原的短程抗體具有一定的療效考核價(jià)值1983年Cordingley等以PJSC73為載體，成功的從曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵中克隆出了一個(gè)40kDa可與抗SEA兔血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)的多肽。從此，各國(guó)研究者對(duì)血吸蟲(chóng)重組抗原進(jìn)行了廣泛的研究。
免疫素(Immunophilin)是免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的受體，屬FK506結(jié)合蛋白(FKBP)超家族，與熱休克結(jié)合免疫素p59等結(jié)構(gòu)相似。其具有肽基脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶(PPIase)活性，是蛋白折疊中重要的伴侶分子，并可與多種胞內(nèi)受體蛋白結(jié)合。存在于血吸蟲(chóng)體內(nèi)的免疫素可與人體內(nèi)FKBP12相互作用，在血吸蟲(chóng)感染中起重要作用。
1995年Osman從曼氏血吸蟲(chóng)尾蚴cDNA文庫(kù)中篩選出一與免疫素基因同源的1.4kb的基因(Smp50基因)，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白分子量為50kDa，可為曼氏血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫的多克隆兔血清識(shí)別[Osman A，Kiang D，Lo Verde PT，et al.Schistosoma mansonicharacterization ofp50，an immunophilin.Exp Parasitol 1995；80(3)550-559]。
1992年Moser在體外重組表達(dá)了曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵中的一種鈣結(jié)合蛋白Sm16，該蛋白可為免疫兔血清識(shí)別，被認(rèn)為是一種具潛力的診斷抗原[Moser D，Doenhoff MJ，Klinkert MQ.A stage-specific calcium-binding proteinexpressed in eggs of Schistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol1992；51(2)229-238]。其后Rao的研究發(fā)現(xiàn)Sm16具有抗感染的作用，是一種兔疫調(diào)節(jié)蛋白在血吸蟲(chóng)的免疫逃避中起著重要作用，重組表達(dá)的Sm16具有強(qiáng)烈的免疫活性可為多克隆的免疫兔血清所識(shí)別[Rao KV，Ramaswamy K.Cloning andexpression of a gene encoding Sm16，an anti-inflammatory protein fromSchistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol 2000；108(1)101-108]。
然而，迄今為止還沒(méi)有公開(kāi)過(guò)日本血吸蟲(chóng)的特異性抗原蛋白。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)日本血吸蟲(chóng)的特異性抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種日本血吸蟲(chóng)的特異性抗原蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供所述日本血吸蟲(chóng)特異性抗原蛋白的制法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的sj50蛋白，它是日本血吸蟲(chóng)特異性抗原，且選自下組(a)具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有針對(duì)日本血吸蟲(chóng)的免疫原性的蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼本發(fā)明所述的sj50蛋白。
較佳地，所述的多核苷酸，它選自下組(a)SEQ ID NO3中1-1413位的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO3中12-1286位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種日本血吸蟲(chóng)免疫原性蛋白的制備方法，該方法包含
(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)本發(fā)明上述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，還提供了一種能與本發(fā)明所述的sj50蛋白特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測(cè)樣品中是否存在抗日本血吸蟲(chóng)抗體的方法，包括將樣品與上述的與sj50蛋白特異性結(jié)合的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在抗日本血吸蟲(chóng)抗體。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)抗體的試劑盒，它含有本發(fā)明所述的sj50蛋白和說(shuō)明書(shū)。較佳地，該試劑盒還含有本發(fā)明所述的sj16蛋白。更佳地，該試劑盒還含有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種組合物，它含有本發(fā)明的sj50蛋白或其免疫原性片段和衍生物和藥學(xué)上可接受的載體的。較佳地，該組合物還含有本發(fā)明所述的sj16蛋白或其免疫原性片段和衍生物。本發(fā)明的組合物可作為疫苗用于預(yù)防日本血吸蟲(chóng)。


圖1是日本血吸蟲(chóng)Sj50和Sj16基因的PCR擴(kuò)增電泳圖(1％瓊脂糖凝膠電泳)。各泳道是M，PCR參照分子量；1，Sj16基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2，Sj50擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2是重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16的PCR鑒定圖(1％瓊脂糖凝膠電泳)。各泳道是M，PCR參照分子量；1，pGEX4T-1-Sj50 PCR產(chǎn)物，質(zhì)粒為模板；2，pGEX4T-1-Sj16 PCR產(chǎn)物，質(zhì)粒為模板；3，pGEX4T-1-Sj50 PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增細(xì)菌為模板。4，pGEX4T-1-Sj16 PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增細(xì)菌為模板。
圖3是重組質(zhì)粒限制性?xún)?nèi)切酶分析圖1％瓊脂糖凝膠電泳)。各泳道是M，PCR參照分子量；F，經(jīng)EcoR I和Xho I酶切的pGEX4T-1-Sj50；S，經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后的pGEX4T-1-Sj16。
圖4是重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16在大腸桿菌BL21中表達(dá)產(chǎn)物的12％SDS-PAGE分析圖。各泳道是M，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1，誘導(dǎo)表達(dá)后的pGEX4T-1-Sj50；2，誘導(dǎo)表達(dá)前的pGEX4T-1-Sj50；3，誘導(dǎo)表達(dá)后的pGEX4T-1-Sj16；4，誘導(dǎo)表達(dá)前的pGEX4T-1-Sj16；5，誘導(dǎo)后的PGEX4T-1。
圖5是GST-Sj50融合蛋白和GST-Sj16融合蛋白，經(jīng)凝血酶(凝血酶)切后12％SDS-PAGE分析。各泳道是M，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1，GST-Sj50融合蛋白；2，酶切不完全GST-Sj50融合蛋白；3，酶切后的GST-Sj50融合蛋白；4，GST-Sj16融合蛋白；5，酶切不完全GST-Sj16融合蛋白；3，酶切后的GST-Sj16融合蛋白。
圖6顯示了日本血吸蟲(chóng)感染兔血清中抗Sj50和抗Sj16抗體檢測(cè)結(jié)果。
圖7顯示了日本血吸蟲(chóng)感染兔血清中抗Sj50抗體檢測(cè)結(jié)果。治療組兔于感染后10周接受吡喹酮治療。
圖8顯示了日本血吸蟲(chóng)感染兔血清中抗Sj16抗體檢測(cè)結(jié)果。治療組兔于感染后10周接受吡喹酮治療。
圖9顯示了正常人及急慢性日本血吸蟲(chóng)病人血清中抗Sj50抗體和抗Sj16抗體檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，不僅首次分離出了日本血吸蟲(chóng)免疫素蛋白Sj50和鈣結(jié)合蛋白Sj16，還重組表達(dá)了日本血吸蟲(chóng)免疫素蛋白Sj50和鈣結(jié)合蛋白Sj16并將其用于血吸蟲(chóng)抗體的檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明人根據(jù)血吸蟲(chóng)免疫素編碼基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)寡核甘酸引物，以日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA為模板，體外擴(kuò)增了日本血吸蟲(chóng)免疫素(Sj50)編碼基因，重組入質(zhì)粒PGEX-4T-1后，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)并純化獲一50kDa的蛋白質(zhì)Sj50。以Sj50作為診斷抗原用于血吸蟲(chóng)抗體的ELISA檢測(cè)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)特異性和敏感性分別為94.12％和76.67％，并且感染兔血清中抗Sj50抗體水平可反映兔感染和治療狀況。用于血吸蟲(chóng)病人血清中的抗體檢測(cè)時(shí)，sj50檢測(cè)的特異性為98.3％，急性病人和慢性病人檢測(cè)的敏感性分別為95.2％和63.2％，并可用于區(qū)分急慢性感染。
此外，本發(fā)明人還分離和重組表達(dá)了鈣結(jié)合蛋白Sj16，并將其用于日本血吸蟲(chóng)病的診斷，在感染動(dòng)物血清與人血清檢測(cè)中都獲得了較為理想的結(jié)果。
如本文使用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明蛋白”或“本發(fā)明多肽”指日本血吸蟲(chóng)免疫素蛋白Sj50和鈣結(jié)合蛋白Sj16。
本發(fā)明除了包括SEQ ID NO2和4所示的日本血吸蟲(chóng)特異性抗原蛋白之外，還包括具有與所述的抗原蛋白有相同的抗日本血吸蟲(chóng)的免疫原性、SEQ ID NO.2或4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能或免疫原性。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的免疫原性。該術(shù)語(yǔ)還包括SEQ ID NO2和4蛋白的活性片段和活性衍生物。
此外，在本發(fā)明中，還包括了SEQ ID NO2或4的免疫蛋白的保守性變異多肽”，即與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
以Sj16為例，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。對(duì)于sj16而言，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)(1-435位)序列有差別的核酸序列。
以Sj50為例，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。對(duì)于sj50而言，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO4的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)(12-1286位)序列有差別的核酸序列。
本發(fā)明的日本血吸蟲(chóng)特異性抗原蛋白的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的本發(fā)明蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)日本血吸蟲(chóng)sj16和sj50蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在抗日本血吸蟲(chóng)抗體的方法。用重組抗原檢測(cè)抗體時(shí)，如果重組抗原中含有載體蛋白，載體蛋白可能會(huì)抑制抗原表位，也可能引起交叉反應(yīng)。本發(fā)明中所用的原核表達(dá)質(zhì)粒為pGEX4T-1(購(gòu)自Pharmacia公司)，該質(zhì)粒在SD序列下游是GST基因，而克隆的外源基因則與GST基因相連。當(dāng)進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物為GST和目的基因產(chǎn)物的融合體。高效表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)Glutathione Sepharose 4B純化，凝血酶切后可去除GST獲所需的蛋白。本發(fā)明所用的Sj50與Sj16即為去除了GST載體的純化蛋白，用于血吸蟲(chóng)抗體檢測(cè)可提高檢測(cè)的敏感性與特異性。
通過(guò)基因工程方法制備抗原，所獲抗原純度高，可以大量生產(chǎn)。不僅可以解決大量診斷抗原的來(lái)源，而且利于檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明為日本血吸蟲(chóng)病的診斷提供了二種診斷抗原Sj50和Sj16，特別是Sj50因其有區(qū)分急慢性感染的可能，在日本血吸蟲(chóng)病的診斷具有很廣闊的前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例材料質(zhì)粒PGEX4T-1(購(gòu)自Pharmacia公司)。
Taq DNA聚合酶(申友公司)、Pfu DNA多聚酶(BBST公司)、dNTP Mix(Sangon公司)、10×Pfu buffer(BBST公司)限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和Xho I、EcoR I buffer、BSAT4 DNA連接酶(Promega)、2×連接緩沖液(Promega)、10×連接緩沖液(Promega)100bp DNA Ladder(Gene RulerTM)GST-5’引物、GST-3’引物(申友公司)QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN)Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System(V10GENE)辣根過(guò)氧物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG結(jié)合物、辣根過(guò)氧物酶標(biāo)記的羊抗人IgG結(jié)合物(Sigma)。
96孔酶標(biāo)板(Nunc公司)實(shí)施例1
制備各種血清1.1 日本血吸蟲(chóng)感染兔血清建立日本血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型。新西蘭白色種兔30只，分籠飼養(yǎng)，分別經(jīng)腹壁接種日本血吸蟲(chóng)尾蚴100條。感染后10周，隨機(jī)抽取10只兔子以吡喹酮200mg/kg胃飼進(jìn)行藥物治療。隔周自兔耳靜脈取血1-2ml，12小時(shí)內(nèi)分離血清，-20℃凍存。
1.2 正常人及血吸蟲(chóng)病人唾液及血清病人血清標(biāo)本來(lái)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲(chóng)病研究所，中國(guó)血吸蟲(chóng)病參考血清庫(kù)，其中急性病人血清62份，慢性病人血清57份。正常人血清及唾液標(biāo)本取自第二醫(yī)科大學(xué)在校學(xué)生，共計(jì)57份。
實(shí)施例2Sj50基因與Sj16基因的獲得2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)Sj50基因與Sj16基因序列，經(jīng)Primerexpress軟件分析設(shè)計(jì)引物，由上海申友生物生物工程公司合成二對(duì)引物。
Sj50-F為5’CCGGAATTCATGTCGGAGACGCCAAAGC3’(SEQID NO5)，引入EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC；Sj50-R為5’CCGCTCGAGCAGAATTAAGCTCTCACAGGGCA3’(SEQ ID NO6)；引入Xho I酶切位點(diǎn)CTCGAG；引物Sj16-F為5’CCGGAATTCCTTCATCTCAGAATAATGTCGGA3’(SEQ ID NO7)，引入EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC；Sj16-R為5’CCGCTCGAGCATACGTTTGACGTACATAAGCT’3’(SEQ ID NO8)，引入Xho I酶切位點(diǎn)CTCGAG。
引物貯存濃度50mM、工作濃度為10mM。
2.2.Sj50基因、Sj16基因的PCR擴(kuò)增以用常規(guī)方法制備的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系共計(jì)50μl，其中模板1.5μl、5’引物2μl、3’引物2μl、dNTP 2.5μl、10×Pfu緩沖液5μl、Pfu DNA多聚酶0.5μl、去離子水36.5μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 5min；變性94℃ 1min；退火56℃ 1min；復(fù)性72℃ 2min；循環(huán)30次，最后一個(gè)循環(huán)復(fù)性再延長(zhǎng)8min后，樣后存于4℃。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCR Purification kit回收純化。
結(jié)果1％瓊脂糖凝膠電泳顯示有Sj50基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有一條條帶大小約1.1Kb與預(yù)計(jì)相同。Sj16基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有一條清晰的條帶大小約440bp與理論擴(kuò)增大小相符(圖1)。
對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，Sj16基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，ORF位于1-435位，編碼一個(gè)全長(zhǎng)為145aa的蛋白(SEQ ID NO2)。Sj50基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3，其ORF位于12-1286位，編碼一個(gè)全長(zhǎng)為425aa的蛋白(SEQ ID NO4)。
MSDENRWIAV FNSLDKDGNK LLTRDEIEQC LKSLGVSESF AEKIIKETDL50NKDGKISLDE YLKALRKIPP RDKCSSVERW KEVFQSIDKD NSGKVSAKEL100DEFLKSTGND INKSCLENWM ATNDKNKDGE LDYAEFLAYV RQTYE 145(SEQ ID NO2)MSETPKQSEE EYLKDFIDLS PSGDRGILKK VVREGYSDIK PCDGDTVIVH50YVGTNFGGEK HGEVFDSSRA RNEKFEFTIG KGSVIKAWDI GVATMRLGEV100CELIASPEYA YMDGKSLKFE VELFETMGSD VSRNKDGSIR KSIIKKGRDI150HNPVAGAEAT IVFRNLLNLT EETEVTYCVG DPPSNVPDEL DQSVRHMNTG200EVSRIVVYKD GHSLTSGDSD KDRIVYELTL KSFEKTKHLS GITSFPERIA250YANTLKEKAN NFLKDSKFDS AIELYKRLDD ELQYVVANGP TRQRNCLGFT300VAVQLNLALV YLKLCKPRQC IEFCKKVLDN FSDNEKALFR IGQAHLLRKD350HEEAVVYFKG LYPKILTMHL LYNRFKSVRK RLEEPKDIER KKFRHIFERC400KDTGIKLDAQ NHEDGVVVND EKSAL 425(SEQ ID NO4)2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建回收純化的Sj50基因、Sj16基因和質(zhì)粒pGEX4T-1分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XhoI進(jìn)行酶切。10μl模板加EcoR I 1μl、Xho I 1μl、EcoR I buffer1.5μl、BSA 0.5μl和去離子水1μl，共計(jì)15μl于1.5ml Eppendorf管中37℃水浴過(guò)夜。
酶切后的Sj50基因、Sj16基因和質(zhì)粒pGEX4T-1，用QIAquick PCRPurification kit回收純化。純化的目的基因片段和載體酶切片段，測(cè)定OD值，計(jì)算片段和載體片段濃度，目的片段和載體片段按3∶1摩爾比進(jìn)行連接。連接體系中含T4 DNA連接酶1μl、10×連接緩沖液1μl、去離子水、pGEX4T-1(80ng)、Sj50基因(60ng)或Sj16基因(20ng)，共計(jì)10μl于1.5ml Eppendorf管中12℃-14℃連接過(guò)夜，構(gòu)建成Sj50基因、Sj16基因表核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16。
結(jié)果經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切后的Sj50基因、Sj16基因分別和質(zhì)粒pGEX4T-1連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α內(nèi)擴(kuò)增。以擴(kuò)增細(xì)菌為模板，GST-5’、GST-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所獲條帶與目標(biāo)條帶大小一致(見(jiàn)圖2)。
2.3 表達(dá)載體的鑒定通過(guò)電轉(zhuǎn)將重組質(zhì)粒pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞，電壓2KV，電容25μF，電阻300Ω，轉(zhuǎn)化時(shí)間5.43mS。轉(zhuǎn)化后的菌體加入1ml LB培養(yǎng)液，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)1hr后，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
隨機(jī)挑取上述平板上的菌落進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系共計(jì)10μl，內(nèi)含模板3μl、GST-5’引物0.25μl、GST-3’引物0.25μl、dNTP 0.4μl、10×Pfu buffer1μl、Tag DNA聚合酶0.1μl、去離子水5μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 3min；變性94℃ 1min；退火56℃ 1min；復(fù)性72℃ 1.5min；循環(huán)30次，最后一個(gè)循環(huán)復(fù)性再延長(zhǎng)8min后，樣后存于4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測(cè)。
隨機(jī)挑取Sj50和Sj16陽(yáng)性克隆分別加入含100μg/ml氨芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基5ml，37℃ 300rpm擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)夜。用Mini-MTM Plasmid DNAExtraction System抽提并純化質(zhì)粒。對(duì)所抽質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Xho I酶切鑒定。
結(jié)果用Mini-MTM Plasmid DNA Extraction System從大腸桿菌中抽提并純化質(zhì)粒。對(duì)所抽質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Xho I酶切鑒定。結(jié)果顯示有各有二條明顯的條帶(質(zhì)粒與目的基因，見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例3Sj16和Sj50重組基因在大腸桿菌中的表達(dá)通過(guò)鈣轉(zhuǎn)法將以上抽提的pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21。內(nèi)含50μl BL21鈣轉(zhuǎn)感受肽細(xì)胞的1.5ml Eppendorf管中加入重組質(zhì)粒2μl，冰浴30min后，37℃熱休克5min，立即冰浴2min。每管加入預(yù)溫至37℃的LB培液，37℃ 300rpm培養(yǎng)1hr后，取100μl涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，培養(yǎng)皿倒置于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
隨機(jī)挑取Sj16和Sj50陽(yáng)性克隆接種于3ml含100μg/ml芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基，37℃搖至OD600＝0.6。取2ml加入IPTG至終濃度1mM，1ml不加誘導(dǎo)物作為對(duì)照，28℃ 250rpm，培養(yǎng)4hour。4℃ 4000g離心10min沉淀菌體。誘導(dǎo)管每管加入100μl PBS，對(duì)照管每管加入50μl PBS。每管取出15μl菌體加入3μl 6×SDS-PAGE樣品緩沖液2μl作SDS-PAGE電泳，濃縮膠4％，分離膠12％。電泳條件濃縮膠80V，分離膠100V。電泳結(jié)束膠于考氏亮藍(lán)R250染液中固定、染色，在乙醇-冰醋酸液中脫色。
結(jié)果pGEX4T-1-Sj50和pGEX4T-1-Sj16轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前各出現(xiàn)一分子量約為80kDa和40kDa的條帶，即為Sj50基因產(chǎn)物與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合體、Sj16基因產(chǎn)物與GST的融合體(圖4)。
實(shí)施例4GST-Sj50和GST-Sj16融合蛋白的大規(guī)模制備和純化4.1 融合蛋白的大規(guī)模制備分別選取可表達(dá)融合蛋白GST-Sj50和GST-Sj16的細(xì)菌克隆接種于5ml含100μg/ml芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天分別將其接種到500ml含100μg/ml芐青霉素的2XYT液體培養(yǎng)基。37℃搖至OD600＝0.6后，每瓶加入IPTG至濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)4hr，4℃ 8,000rpm離心10min收獲細(xì)菌存于-20℃。
在收獲的二種細(xì)菌沉淀中，分別加入20ml預(yù)冷的PBS、240μl 1M DTT、和480μl PMSF，超聲裂解細(xì)菌(每次20sec，共計(jì)2min)。加入20％ TritonX-100至終濃度為1％，冰浴30min使溶合蛋白完全溶解。4℃以13,000rpm離心30min，收集上清液。
在27ml的上清中加入1ml 50％ Glutathione Sepharose 4B凝膠漿，4℃顛倒混勻結(jié)合1hr。3000rpm，4℃離心10min去上清。在沉淀中加入5ml PBS，4℃離心10min去上清，收集沉淀，共重復(fù)3次。將收集的沉淀轉(zhuǎn)移至凝膠柱中，待柱床穩(wěn)定后，用大量的PBS洗脫未結(jié)合的雜蛋白。在1ml床體積膠中加入還原型谷胱苷肽溶液(10mM Glutathione，50mM Tris-HCl，pH 8.0)1ml，室溫下顛倒混均10min，收集洗脫液即為純化的融合蛋白。用PBS透析融蛋白，測(cè)定OD260、OD280值，計(jì)算蛋白濃度。
4.2 Sj16和Sj50蛋白的純化按40μg蛋白加入0.2μl凝血酶的比例，分別在純化的GST-Sj50和GST-Sj16融合蛋白中加入凝血酶，室溫顛倒混均2hr。在凝血酶酶切后的蛋白液中加入1ml 50％Glutathione Sepharose 4B凝膠漿，4℃顛倒混勻結(jié)合1hr。3000rpm，4℃離心10min，收集上清液，即為純化的Sj16和Sj50蛋白。測(cè)定OD260、OD280值，計(jì)算蛋白濃度。
結(jié)果表達(dá)的融合蛋白經(jīng)親和層析(glutathione sepharose 4B)后獲得了較為純的融合蛋白，再使凝血酶(thrombin)從表達(dá)的融合蛋白中切下了GST分子(26kDa)，分別獲得了分子量約為40kDa與16kDa純化的Sj50和Sj16分子(圖5)。
實(shí)施例5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法以0.5μg/ml 100μlSj16和Sj50蛋白包被96孔酶標(biāo)板，室溫過(guò)液。稀釋的0.3％Tween-20-PBS(1∶10)洗滌后用0.3％Tween-20-PBS每孔120μl 37℃封閉1hour。洗滌3次后加入1∶100稀釋的人或兔血清樣本100μl，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后加入1∶2000稀釋的羊抗人IgG過(guò)氧化物酶結(jié)合物或羊抗兔過(guò)氧化物酶結(jié)合物100μl每孔，37℃孵育1小時(shí)。洗滌后，每孔加入100μl底物OPD室溫顯色15分鐘后，加2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在自動(dòng)酶標(biāo)儀上以492nm波段讀取OD值。判斷標(biāo)準(zhǔn)每一受檢標(biāo)本的OD值等于或大于陰性對(duì)照OD值均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(x+2SD)定為陽(yáng)性閾值。
5.1 血吸蟲(chóng)感染病兔血清中的特異性抗體的檢測(cè)以純化的Sj50和Sj16為診斷抗原，共有17只兔子感染前與感染后9-11周兔血清中的抗Sj50抗體和抗Sj16抗體被檢測(cè)。
圖6顯示了血清中兩抗體檢測(cè)的結(jié)果。兩者在感染前都有1只兔子呈陽(yáng)性反應(yīng)，檢測(cè)的特異性為94.12％。在感染后9-11周，兔血清中的抗Sj50抗體和抗Sj16抗體較感染前都有顯著升高(P＜0.05)，其中13只兔子體內(nèi)抗Sj50抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率76.47％，15只兔子體內(nèi)抗Sj16抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率88.23％(表1)。
表1 日本血吸蟲(chóng)感染兔血清中抗Sj50和抗Sj16抗體檢測(cè)結(jié)果診斷 OD值(x±SD) 陽(yáng)性界值陽(yáng)性數(shù) P值樣本數(shù)抗原 感染前 感染后9-11周(x+2*SD) 感染前 感染后9-11周(配對(duì)t檢驗(yàn))Sj500.593±0.164 1.289±0.468 0.921 17 1 139.163E-06Sj160.606±0.197 1.501±0.524 1.000 17 1 156.855E-06圖7顯示了治療組與未治療組兔血清中抗Sj50抗體動(dòng)態(tài)變化。治療組兔血清中抗Sj50抗體水平在治療后11周與治療前相比顯著性下降(p＝0.00080＜0.05)，與感染前抗體水平相比無(wú)顯著性差異(p＝0.84466＞0.05)。同一時(shí)期，非治療組兔體內(nèi)的抗體仍維持在高水平與感染后11周無(wú)顯著性差別(p＝0.70445＞0.05)。治療組與非治療組組間相比，在感染前與感染后9-11周兩組兔血清中抗Sj50抗體水平都無(wú)顯著性差異(感染前p＝0.15183＞0.05，感染后p＝0.32546＞0.05)而治療后11周，治療組兔體內(nèi)抗體水平遠(yuǎn)低于同一時(shí)期未治療組(p＝0.00089＜0.05)(表2)。
表2 日本血吸蟲(chóng)感染兔血清中抗Sj50抗體的動(dòng)態(tài)變化OD值組別樣本數(shù)感染周數(shù) P值(t檢驗(yàn))(x±SD)感染前 0.653±0.111 0.70445(未治療組感染后21周與11周比較)未治療組 8感染后11周1.415±0.552 0.00344(未治療組感染后21周與感染前比較)感染后21周1.456±0.486 0.00080(治療組感染后21周與9周比較)感染前0.539±0.190 0.84466(治療組感染后21周與感染前比較)感染后9周 1.177±0.377 0.15183(感染前治療組與未治療組比較)治療組9感染后21周 0.32546(感染后9-11周治療組與未治療組比較)0.547±0.150(治療后11周)0.00089(感染后21周治療組與未治療組比較)圖8顯示了治療組與未治療組兔血清中抗Sj16抗體動(dòng)態(tài)變化。與抗Sj50抗體相同，治療組兔血清中抗Sj16抗體水平在治療后11周顯著性下降(p＝0.00171＜0.05)，與感染前抗體水平相比無(wú)顯著性差異(p＝0.104242＞0.05)。同一時(shí)期，非治療組兔體內(nèi)的抗體仍維持在高水平與感染后11周無(wú)顯著性差別(p＝0.865405＞0.05)。治療組與非治療組組間相比，在感染前與感染后9-11周兩組兔血清中抗Sj16抗體水平者無(wú)顯著性差異(感染前p＝0.56034＞0.05，感染后p＝0.58679＞0.05)，而治療后11周，治療組兔體內(nèi)抗體水平遠(yuǎn)低于同一時(shí)期未治療組(p＝0.00834＜0.05)(表3)。
表3 日本血吸蟲(chóng)感染兔血清中抗Sj16抗體的動(dòng)態(tài)變化OD值組別 樣本數(shù) 感染周數(shù) P值(t檢驗(yàn))(x±SD)感染前 0.576±0.1080.86541(未治療組感染后21周與11周比較)未治8 感染后11周 1.423±0.6120.00277(未治療組感染后21周與感染前比較)療組感染后21周 1.443±0.5320.00171(治療組感染后21周與9周比較)感染前 0.633±0.2630.10424(治療組感染后21周與感染前比較)感染后9周1.570±0.4570.56034(感染前治療組與未治療組比較)治療組 9感染后21周 0.58679(感染后9-11周治療組與未治療組比較)0.766±0.215(治療后11周) 0.00834(感染后21周治療組與未治療組比較)5.2 急慢性血吸蟲(chóng)病人血清中特異性抗體的檢測(cè)將Sj50與Sj16抗原用于血吸蟲(chóng)病人血清中抗體的檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖9和表4。
表4 正常人及急慢性日本血吸蟲(chóng)病人血清中抗Sj50抗體和抗Sj16抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性閾值 陽(yáng)性數(shù)診斷 組別 OD值(x±SD) 樣本數(shù) P值(團(tuán)體t檢驗(yàn))(x+2*SD) (陽(yáng)性率％)抗原正常人 0.2826±0.0815 58 1 (1.7％) 7.20E-26正常—急血)Sj50 急性血吸蟲(chóng)病人 0.7614±0.22440.445762 59 (95.2％)5.42E-14(正?！?慢性血吸蟲(chóng)病人 0.5571±0.2078 57 36 (63.2％)1.04E-06(急血—慢血)正常人 0.2824±0.078 58 1 (1.7％) 7.28E-17(正?！毖?Sj16 急性血吸蟲(chóng)病人 0.6421±0.24910.438962 53 (85.5％)2.94E-15(正?！?慢性血吸蟲(chóng)病人 0.5806±0.2104 57 40 (70.2％)0.14701(急血—慢血)58份正常人血清標(biāo)本中兩診斷抗原各有1份標(biāo)本呈陽(yáng)性反應(yīng)，假陽(yáng)性率1.7％。對(duì)于62名急性血吸蟲(chóng)病人血清的檢測(cè)結(jié)果顯示，在59名患者體內(nèi)查見(jiàn)抗Sj50抗體，陽(yáng)性率為95.2％高于抗Sj16抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率85.5％(53/62)。慢性血吸蟲(chóng)病人血清中抗Sj50抗體與抗Sj16抗體的檢測(cè)率都低于急性血吸蟲(chóng)病人，其中抗Sj50抗體的檢測(cè)的敏感性為63.2％(36/57)，抗Sj16抗體檢測(cè)的敏感性為70.2％(40/57)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以Sj50為診斷抗原，急性與慢性血吸蟲(chóng)病人抗體檢測(cè)結(jié)果間有顯著性差異(P＝1.04E-06＜0.05)，而Sj16抗原則無(wú)法區(qū)分急性與慢性感染(P＝0.14701＞0.05)。
討論在本發(fā)明中，本發(fā)明人分離出了日本血吸蟲(chóng)免疫素蛋白Sj50和鈣結(jié)合蛋白Sj16，還重組表達(dá)了日本血吸蟲(chóng)免疫素蛋白Sj50和鈣結(jié)合蛋白Sj16并將其用于血吸蟲(chóng)抗體的檢測(cè)。對(duì)于日本血吸蟲(chóng)病的診斷，在感染動(dòng)物血清與人血清檢測(cè)中都獲得了較為理想的結(jié)果。
為了尋找新的日本血吸蟲(chóng)病診斷抗原，本發(fā)明人對(duì)日本血吸蟲(chóng)大陸株成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)進(jìn)行了大規(guī)模ESTs(表達(dá)序列標(biāo)簽)的測(cè)序。在分析表達(dá)序列標(biāo)簽的過(guò)程中獲得了若干個(gè)與Smp50具有較高同源性的ESTs，本發(fā)明人將這些ESTs進(jìn)行電子拼接，得到了日本血吸蟲(chóng)sjp50基因的全長(zhǎng)編碼序列。與GenBank中的nt和nr庫(kù)進(jìn)行同源比較，發(fā)現(xiàn)與一個(gè)來(lái)自日本血吸蟲(chóng)菲律賓株的免疫素基因序列(Schistosoma japonicum immunophilin-like mRNA sequence，AF175126)核苷酸一致性高達(dá)94％，但未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)；而與Sm的免疫素基因序列核苷酸一致性84％，氨基酸一致性為71％。
由于Sjp50和Smp50在核苷酸水平氨基酸水平上的一致性達(dá)到了71％，本發(fā)明人認(rèn)為他們很可能也具有相似的功能。Smp50的研究顯示P50屬FK506結(jié)合蛋白(免疫素)超家族，與熱休克結(jié)合免疫素P59等結(jié)構(gòu)相似，具有PPIase活性，可幫助血吸蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白組裝和蛋白折疊，而且能夠與熱休克蛋白90相互作用，一起構(gòu)成類(lèi)固醇激素受體復(fù)合物的成分。已知宿主的激素對(duì)血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，但到目前為止，人們尚未直接證據(jù)表明血吸蟲(chóng)體內(nèi)有類(lèi)固醇激素受體存在。而Sjp50和Smp50的存在可能對(duì)驗(yàn)證類(lèi)固醇受體提供一些支持。以前的研究顯示，P50可以被曼氏血吸蟲(chóng)可溶性抽提物以及表皮抽提物所識(shí)別，說(shuō)明Smp50可能存在于表皮，且抗P50的抗血清不能識(shí)別Hela細(xì)胞和大腸桿菌的抽提物，說(shuō)明來(lái)源于不同物種的FKBP雖然在一般結(jié)構(gòu)上有許多相似性，但在全部結(jié)構(gòu)以及序列上的差異足以產(chǎn)生不同的抗體反應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Sjp50可作為潛在的診斷和疫苗靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
本實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明人重組了Sj16，并將其用于日本血吸蟲(chóng)病的診斷，在感染動(dòng)物血清與人血清檢測(cè)中都獲得了較為理想的結(jié)果。
Sj16與曼氏血吸蟲(chóng)的SME16基因具有較高的同源性。SME16被認(rèn)為是蟲(chóng)卵階段特異的鈣結(jié)合蛋白，但其在蟲(chóng)卵中的功能尚不清楚。1992年Moser在體外重組表達(dá)了曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵中的一種鈣結(jié)合蛋白Sm16(SME16)，該蛋白可為免疫兔血清識(shí)別，被認(rèn)為是一種具潛力的診斷抗原。其后Rao的研究發(fā)現(xiàn)Sm16具有抗感染的作用，是一種兔疫調(diào)節(jié)蛋白在血吸蟲(chóng)的免疫逃避中起著重要作用，重組表達(dá)的Sm16具有強(qiáng)烈的免疫活性可為多克隆的免疫兔血清所識(shí)別。值得注意的是，鈣結(jié)合蛋白是一類(lèi)重要的參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的蛋白家族，該類(lèi)蛋白與靶蛋白結(jié)合后可使后者發(fā)生構(gòu)象改變，從而激發(fā)一系列生物學(xué)反應(yīng)，如肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、酶激活和細(xì)胞生長(zhǎng)等[Silva AC，Reinach FC.Calcium binding inducesconformational changes in muscle regulatory proteins.Trends BiochemSci 1991；16(2)53-7]。鑒于SME16在蟲(chóng)卵中的高表達(dá)和鈣結(jié)合蛋白的重要生理功能，有理由認(rèn)為，SME16在調(diào)節(jié)蟲(chóng)卵細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中必然發(fā)揮著重要而獨(dú)特的作用。有意思的是SME16與童蟲(chóng)、成蟲(chóng)特異的鈣結(jié)合蛋白sm20[AvercroftJC，Huggins MC，Dunne DW，et al.Characterisation of Sm20，a 20-kilodaltoncalcium-binding protein of Schistosoma manoni.Mol Biochem Parasitol1990；38(2)211-9]以及尾蚴特異的8-KDa鈣結(jié)合蛋白[Am D，Grossman Z，Markovics A，et al.Rapid changes in the expression of a gene encoding a calciumbinding protein in Schistosoma mansoni.Mol Biochem Parasitol1989；34(2)167-75]除了具有相似的鈣結(jié)合位點(diǎn)外，相互之間并不具有明顯的同源性。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110> 國(guó)家人類(lèi)基因組南方研究中心中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所上海第二醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院<120> 日本血吸蟲(chóng)的特異性抗原及用途<130> 027624<160> 8<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 438<212> DNA<213> 日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)<220>
<221> CDS<222> (1)..(435)<223>
<400> 1atg tcg gat gaa aac cga tgg att gca gtt ttt aat tca cta gat aaa 48Met Ser Asp Glu Asn Arg Trp Ile Ala Val Phe Asn Ser Leu Asp Lys1 5 10 15gat gga aat aag tta tta aca cgt gat gaa att gag caa tgc ttg aaa 96Asp Gly Asn Lys Leu Leu Thr Arg Asp Glu Ile Glu Gln Cys Leu Lys20 25 30agt ctt ggc gtt tct gaa agt ttt gcc gaa aag ata atc aag gaa act144Ser Leu Gly Val Ser Glu Ser Phe Ala Glu Lys Ile Ile Lys Glu Thr35 40 45gac ttg aat aaa gat gga aaa atc tct ttg gat gaa tac ctg aaa gca192Asp Leu Asn Lys Asp Gly Lys Ile Ser Leu Asp Glu Tyr Leu Lys Ala50 55 60cta aga aaa atc cct cca cgt gac aaa tgt tca agt gtt gaa cgt tgg240Leu Arg Lys Ile Pro Pro Arg Asp Lys Cys Ser Ser Val Glu Arg Trp65 70 75 80aaa gaa gta ttt caa tcc ata gat aaa gat aat tca ggc aaa gtt tct288Lys Glu Val Phe Gln Ser Ile Asp Lys Asp Asn Ser Gly Lys Val Ser85 90 95
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Glu145<210> 3<211> 1413<212> DNA<213> 日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)<220>
<221> CDS<222> (12)..(1286)<223>
<400> 3acgcagttga c atg tcg gag acg cca aag cag tct gaa gag gaa tat cta50Met Ser Glu Thr Pro Lys Gln Ser Glu Glu Glu Tyr Leu1 5 10aaa gat ttc ata gac tta agc cca tct ggt gat cgt ggt att ctc aag 98Lys Asp Phe Ile Asp Leu Ser Pro Ser Gly Asp Arg Gly Ile Leu Lys15 20 25aaa gta gta cga gaa ggc tac tcg gac atc aaa cca tgc gat ggt gac146Lys Val Val Arg Glu Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Pro Cys Asp Gly Asp30 35 40 45acg gtc ata gta cat tat gtc ggt act aac ttc ggt ggt gaa aag cat194Thr Val Ile Val His Tyr Val Gly Thr Asn Phe Gly Gly Glu Lys His50 55 60ggt gaa gta ttc gac tca agc aga gcc cga aat gaa aag ttt gaa ttt242Gly Glu Val Phe Asp Ser Ser Arg Ala Arg Asn Glu Lys Phe Glu Phe65 70 75aca att ggg aaa ggt agt gta att aaa gct tgg gat atc ggt gtt gca290Thr Ile Gly Lys Gly Ser Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ala80 85 90act atg agg ttg gga gaa gtt tgt gaa ttg atc gcg tcg cct gaa tat338Thr Met Arg Leu Gly Glu Val Cys Glu Leu Ile Ala Ser Pro Glu Tyr95 100 105gcg tac atg gat ggg aaa tct ctt aag ttt gag gtg gag ctt ttt gaa386Ala Tyr Met Asp Gly Lys Ser Leu Lys Phe Glu Val Glu Leu Phe Glu110 115 120 125act atg ggc tct gat gtc agc aga aac aaa gat ggg agt att cgc aag434Thr Met Gly Ser Asp Val Ser Arg Asn Lys Asp Gly Ser Ile Arg Lys130 135 140tca att att aaa aag gga aga gat atc cac aat cct gta gct ggg gct482Ser Ile Ile Lys Lys Gly Arg Asp Ile His Asn Pro Val Ala Gly Ala145 150 155gaa gcc act att gtt ttc cgc aat ctt ttg aac ttg acg gag gaa aca530Glu Ala Thr Ile Val Phe Arg Asn Leu Leu Asn Leu Thr Glu Glu Thr160 165 170gaa gtc aca tat tgt gtt ggc gac cct cca tca aac gta ccg gat gag578
Glu Val Thr Tyr Cys Val Gly Asp Pro Pro Ser Asn Val Pro Asp Glu175 180 185ttg gac caa tct gtt cgt cac atg aat aca ggt gaa gtc agc cgt att 626Leu Asp Gln Ser Val Arg His Met Asn Thr Gly Glu Val Ser Arg Ile190 195 200 205gtg gtt tac aaa gac ggt cat tca tta act tct gga gat tcg gat aaa 674Val Val Tyr Lys Asp Gly His Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Lys210 215 220gat aga ata gtt tac gaa cta aca ctg aag tct ttt gaa aag acc aaa 722Asp Arg Ile Val Tyr Glu Leu Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Thr Lys225 230 235cac ctc tct ggt att acg tct ttt cca gag cga ata gcc tat gca aat 770His Leu Ser Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu Arg Ile Ala Tyr Ala Asn240 245 250aca ctt aaa gag aag gcc aac aat ttc tta aag gat tct aaa ttt gat 818Thr Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asn Phe Leu Lys Asp Ser Lys Phe Asp255 260 265tca gct atc gaa tta tat aaa cgt ttg gac gat gag ctg cag tac gta 866Ser Ala Ile Glu Leu Tyr Lys Arg Leu Asp Asp Glu Leu Gln Tyr Val270 275 280 285gtg gct aat ggg cct acc aga caa agg aat tgt ctg ggg ttc act gta 914Val Ala Asn Gly Pro Thr Arg Gln Arg Asn Cys Leu Gly Phe Thr Val290 295 300gct gtc caa ctc aat tta gct ctg gtc tat ctg aag ctt tgt aaa ccc 962Ala Val Gln Leu Asn Leu Ala Leu Val Tyr Leu Lys Leu Cys Lys Pro305 310 315aga caa tgt att gag ttt tgc aag aaa gtg ctc gat aat ttt agc gac1010Arg Gln Cys Ile Glu Phe Cys Lys Lys Val Leu Asp Asn Phe Ser Asp320 325 330aac gaa aag gcg cta ttt aga att ggt cag gca cat tta cta cgt aag1058Asn Glu Lys Ala Leu Phe Arg Ile Gly Gln Ala His Leu Leu Arg Lys335 340 345gac cat gaa gaa gca gtt gtt tac ttc aaa gga ttg tat cca aaa atc1106Asp His Glu Glu Ala Val Val Tyr Phe Lys Gly Leu Tyr Pro Lys Ile350 355 360 365cta aca atg cat ctg ctg tat aac agg ttc aaa tct gtg agg aag aga1154Leu Thr Met His Leu Leu Tyr Asn Arg Phe Lys Ser Val Arg Lys Arg370 375 380tta gaa gag cca aaa gat ata gaa cga aag aag ttt cgt cat att ttc1202Leu Glu Glu Pro Lys Asp Ile Glu Arg Lys Lys Phe Arg His Ile Phe385 390 395gaa cgt tgt aaa gac acc ggg att aaa ctc gat gct caa aat cat gag1250Glu Arg Cys Lys Asp Thr Gly Ile Lys Leu Asp Ala Gln Asn His Glu400 405 410gat ggg gtt gta gtg aat gat gaa aag tct gcc ctg tgagagctta 1296Asp Gly Val Val Val Asn Asp Glu Lys Ser Ala Leu415 420 425attctgtgtg tggcatgaag ttagcacccc cgtgattttg taaatgtttc ttataattac 1356tggtttaatt tcaagttgct gaatacattt taaagcaacc aaaaaaaaaa aaaaaaa 1413
<210> 4<211> 425<212> PRT<213> 日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)<400> 4Met Ser Glu Thr Pro Lys Gln Ser Glu Glu Glu Tyr Leu Lys Asp Phe1 5 10 15Ile Asp Leu Ser Pro Ser Gly Asp Arg Gly Ile Leu Lys Lys Val Val20 25 30Arg Glu Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Pro Cys Asp Gly Asp Thr Val Ile35 40 45Val His Tyr Val Gly Thr Asn Phe Gly Gly Glu Lys His Gly Glu Val50 55 60Phe Asp Ser Ser Arg Ala Arg Asn Glu Lys Phe Glu Phe Thr Ile Gly65 70 75 80Lys Gly Ser Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Gly Val Ala Thr Met Arg85 90 95Leu Gly Glu Val Cys Glu Leu Ile Ala Ser Pro Glu Tyr Ala Tyr Met100 105 110Asp Gly Lys Ser Leu Lys Phe Glu Val Glu Leu Phe Glu Thr Met Gly115 120 125Ser Asp Val Ser Arg Asn Lys Asp Gly Ser Ile Arg Lys Ser Ile Ile130 135 140Lys Lys Gly Arg Asp Ile His Asn Pro Val Ala Gly Ala Glu Ala Thr145 150 155 160Ile Val Phe Arg Asn Leu Leu Asn Leu Thr Glu Glu Thr Glu Val Thr165 170 175Tyr Cys Val Gly Asp Pro Pro Ser Asn Val Pro Asp Glu Leu Asp Gln180 185 190Ser Val Arg His Met Asn Thr Gly Glu Val Ser Arg Ile Val Val Tyr195 200 205Lys Asp Gly His Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Lys Asp Arg Ile210 215 220Val Tyr Glu Leu Thr Leu Lys Ser Phe Glu Lys Thr Lys His Leu Ser225 230 235 240Gly Ile Thr Ser Phe Pro Glu Arg Ile Ala Tyr Ala Asn Thr Leu Lys245 250 255Glu Lys Ala Asn Asn Phe Leu Lys Asp Ser Lys Phe Asp Ser Ala Ile260 265 270Glu Leu Tyr Lys Arg Leu Asp Asp Glu Leu Gln Tyr Val Val Ala Asn275 280 285Gly Pro Thr Arg Gln Arg Asn Cys Leu Gly Phe Thr Val Ala Val Gln290 295 300Leu Asn Leu Ala Leu Val Tyr Leu Lys Leu Cys Lys Pro Arg Gln Cys305 310 315 320Ile Glu Phe Cys Lys Lys Val Leu Asp Asn Phe Ser Asp Asn Glu Lys
325 330 335Ala Leu Phe Arg Ile Gly Gln Ala His Leu Leu Arg Lys Asp His Glu340 345 350Glu Ala Val Val Tyr Phe Lys Gly Leu Tyr Pro Lys Ile Leu Thr Met355 360 365His Leu Leu Tyr Asn Arg Phe Lys Ser Val Arg Lys Arg Leu Glu Glu370 375 380Pro Lys Asp Ile Glu Arg Lys Lys Phe Arg His Ile Phe Glu Arg Cys385 390 395 400Lys Asp Thr Gly Ile Lys Leu Asp Ala Gln Asn His Glu Asp Gly Val405 410 415Val Val Asn Asp Glu Lys Ser Ala Leu420 425<210> 5<211> 28<212> DNA<213> 人工序列<220>
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<221> misc_feature<222> (1)..(32)<223> 引物<400> 8ccgctcgagc atacgtttga cgtacataag ct3權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白，它是日本血吸蟲(chóng)特異性抗原，其特征在于，它選自下組(a)具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或插入而形成的具有針對(duì)日本血吸蟲(chóng)的免疫原性的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，它具有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，它選自下組(a)SEQ ID NO3中1-1413位的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO3中12-1286位的核苷酸序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體。
7.一種日本血吸蟲(chóng)免疫原性蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白。
8.一種能與權(quán)利要求1所述的蛋白特異性結(jié)合的抗體。
9.一種檢測(cè)樣品中是否存在抗日本血吸蟲(chóng)抗體的方法，其特征在于，包括將樣品與權(quán)利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在抗日本血吸蟲(chóng)抗體。
10.一種檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)抗體的試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的蛋白和說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum)的特異性抗原，即日本血吸蟲(chóng)免疫素蛋白Sj50和鈣結(jié)合蛋白Sj16。本發(fā)明不僅分離了日本血吸蟲(chóng)免疫素蛋白Sj50和鈣結(jié)合蛋白Sj16的基因，還重組表達(dá)了這兩種蛋白，解決大量診斷抗原的來(lái)源。Sj50和sj16能夠高敏感性與特異性地檢測(cè)血吸蟲(chóng)抗體，特別是Sj50具有區(qū)分急慢性感染的可能，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1629188SQ20031010939
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者胡薇, 王兆軍, 沈大康, 薛純良, 馮正, 韓澤廣 申請(qǐng)人:國(guó)家人類(lèi)基因組南方研究中心, 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所, 上海第二醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院