專利名稱：生產(chǎn)維生素c的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從L-山梨糖酮生產(chǎn)L-抗壞血酸(維生素C)的方法，其中使用醛脫氫酶，即從Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的無細胞提取物中純化得到的L-山梨糖酮脫氫酶。
上述的酶公開于EP 0 922 759 A2中，其催化從L-山梨糖酮到2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)的氧化反應。
維生素C對人類來說是非常重要且必不可少的營養(yǎng)因子。對維生素C的工業(yè)合成是通過“Reichstein方法”來進行的。D-葡糖醛酮和L-山梨糖酮是豆類和菠菜的維生素C生物合成途徑中假定的中間產(chǎn)物，催化從L-山梨糖酮到維生素C的氧化反應的依賴尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的酶已經(jīng)被部分地純化出來。然而，還未有關(guān)于用來源于細菌的酶將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為維生素C的報道。我們出乎意料地發(fā)現(xiàn)，該酶不僅能將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為2-KGA，在特定反應下還能將其轉(zhuǎn)化為維生素C。
本發(fā)明提供了從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括在存在電子受體的情況下，將L-山梨糖酮與經(jīng)過純化的L-山梨糖酮脫氫酶相接觸，以及從反應混合物中分離出得到的維生素C，所述L-山梨糖酮脫氫酶具有如下物理化學屬性(a)分子量150,000±6,000Da或230,000±9,000Da(由2或3個同源亞基組成，每個亞基具有75,000±3,000Da的分子量)；(b)底物特異性對醛類化合物有活性；(c)輔助因子吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)和血紅素c；(d)最優(yōu)pH用于從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的最優(yōu)pH為6.4至8.2之間；(e)抑制劑Co2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、一碘乙酸和乙二胺四乙酸。
就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“經(jīng)過純化的”也包括從其天然環(huán)境中分離出來的。
在有電子受體存在的情況下，從L-山梨糖酮到維生素C的氧化按照如下的反應方程式發(fā)生
當氧作為電子受體時，所述的酶不起作用。此外，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)不是合適的電子受體。然而，其它常規(guī)的電子受體可與本發(fā)明的方法聯(lián)合使用。2，6-二氯酚靛酚(2，6-dichlorophenolindophenol，DCIP)、甲硫吩嗪(phenazinemethosulfate，PMS)、氰化亞鐵(ferriccyanide)和細胞色素c是優(yōu)選的電子受體。
對酶進行的試驗可以按照下文所述來開展a)對L-山梨糖酮脫氫酶的活性進行產(chǎn)物(維生素C)試驗反應混合物由1.0mM的PMS、25mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、1.0μM吡咯喹啉醌(PQQ)、1.0mM的CaCl2、50mM的L-山梨糖酮和酶溶液加上水組成，其最終體積為100μl，在試驗前現(xiàn)配現(xiàn)用。除非另有指明，所述反應都在30℃進行60分鐘。通過高效液相色譜(HPLC)聯(lián)合UV探測器(TOSOH UV8000；TOSOH Co.，Kyobashi 3-2-4，Chuo-ku，Tokyo，Japan)、雙泵(TOSOH CCPE；TOSOH Co.)、積分器(ShimaduzC-R6A；Shimadzu Co.，Kuwahara-cho 1，Nishinokyo，Chukyo-ku，Kyoto，Japan)和柱子(YMC-Pack polyamine-II；YMC，Inc.，3233 Burnt Mill DriveWilimington，NC 28403，U.S.A.)，在264nm波長處對生產(chǎn)出的維生素C的量進行測量。生產(chǎn)出的2-KGA的量由HPLC來測量。酶活的一個單位被定義為在反應混合物中于60分鐘內(nèi)生產(chǎn)出1mg的維生素C或2-KGA的酶的量。
b)對L-山梨糖酮脫氫酶的活性進行光度測定試驗反應混合物由1.0mM的DCIP、1.0mM的PMS、50mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、1.0μM的PQQ、2.0mM的L-山梨糖酮和酶溶液加上水組成，其最終體積為100μl，在試驗前現(xiàn)配現(xiàn)用。于25℃從L-山梨糖酮開始反應，在600nm測量DCIP的初始還原率(initial reduction rate)，以得到酶活性。酶活性的一個單位被定義為每分鐘催化1μ摩爾DCIP還原的酶的量。當pH為7.0時，DCIP的消光系數(shù)被計為14.2mM-1。用作對照的小管中含有除L-山梨糖酮之外的上述所有組分。
根據(jù)EP 0 922 759 A2中描述的方法，可以從G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的無細胞提取物(cell free extract)中分離出本發(fā)明的L-山梨糖酮脫氫酶。
因此，本發(fā)明提供了上述從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的方法，其中，所述的L-山梨糖酮脫氫酶獲得自G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)菌株、具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鑒定特征的屬于Gluconobacter屬的微生物或其突變體。
根據(jù)《布達佩斯條約》的規(guī)定，G.oxydans DSM 4025于1987年3月17日被保藏在Gttingen(德國)的Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，編號為DSM No.4025。送交保藏者是東方科學儀器進出口集團有限公司，其是為中華人民共和國北京市三里河路52號的中國科學院微生物研究所而送交的。有效的送交保藏者是所述的研究所，其完整地址是中國人民共和國北京市海淀區(qū)中關(guān)村中國科學院微生物研究所，100080。
此外，該菌株的傳代培養(yǎng)物也已于1992年3月30日被保藏在National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(AIST)，Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan，這也是根據(jù)《布達佩斯條約》的規(guī)定，保藏編號為FERM BP-3812。送交保藏者是Nippon Roche K.K.，6-1，Shiba 2-chrome，Minato-ku，Tokyo 105-8532Japan。該傳代培養(yǎng)物也是本發(fā)明中最優(yōu)選使用的。
在培養(yǎng)了微生物G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)之后，可以按照下述來對酶進行分離和純化(1)通過離心或過濾從液體培養(yǎng)液中收獲細胞。
(2)用水、生理鹽水或具有適當pH的緩沖溶液洗所收獲的細胞。
(3)將洗過的細胞懸浮于緩沖溶液中，通過均質(zhì)機、超聲波儀或法式擠壓儀或者通過用溶菌酶進行處理等方式來對細胞進行破碎，以得到破碎細胞的溶液。
(4)從破碎細胞的無細胞提取物中分離及純化出所述的酶，優(yōu)選是從微生物的胞質(zhì)部分來進行分離和純化。
用于本發(fā)明所提供的方法的酶可作為催化劑用于從L-山梨糖酮來生產(chǎn)維生素C。反應可以在有電子受體例如DCIP、PMS等存在的情況下，在磷酸緩沖液、Tris緩沖液等溶液中，在大約6.4至大約9.0之間的pH和大約20℃至大約60℃之間的溫度下，進行大約0.5至48小時。反應在大約7.0至8.2之間的pH和大約20℃至50℃范圍內(nèi)的溫度下進行大約0.5至24小時是L-山梨糖酮有效轉(zhuǎn)化為維生素C的一種條件。
因此，在本發(fā)明的方法中，反應在大約6.4至大約9.0之間的pH和大約20℃至大約60℃之間的溫度下進行大約0.5至大約48小時。優(yōu)選的反應在大約7.0至大約8.2之間的pH和大約20℃至大約50℃范圍內(nèi)的溫度下進行大約0.5至大約24小時。
反應混合物中L-山梨糖酮的濃度可根據(jù)其它反應條件變化，但是，一般而言，其在大約0.5g/L至大約50g/L之間，優(yōu)選在大約1g/L至大約30g/L之間。
根據(jù)本發(fā)明，催化反應可以開展于水或水性溶劑中，所述水性溶劑例如是甲醇、乙醇、丙酮或上述溶劑中任何一種與水的混合物，然而，就經(jīng)濟和易于操作的角度而言，水是優(yōu)選的。
在本發(fā)明的方法中，也可以使用處于固定狀態(tài)的酶，所述的酶是被合適的載體固定的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)普遍已知的用于固定酶的任何方法。例如，所述的酶可被直接固定到具有一個或多個功能基團的樹脂的膜、顆粒等上，或者其可通過具有一個或多個功能基團的橋聯(lián)化合物(bridgingcompound)被連接到樹脂上，所述橋聯(lián)化合物例如是戊二醛。
通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的傳統(tǒng)方法，可以將反應混合物中產(chǎn)生的維生素C分離出來，其可以以鹽的形式被分離出來，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽等。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的傳統(tǒng)方法可將該鹽轉(zhuǎn)化為游離酸。具體而言，可以通過下列步驟的任何合適的組合或重復來進行分離通過利用產(chǎn)物和周圍雜質(zhì)屬性的不同而形成鹽，所述屬性例如是溶解度、被吸收性和溶劑間的分布系數(shù)；吸附，例如在離子交換樹脂上進行的；其它方法等。單獨使用上述工藝或?qū)⑵浣M合起來，形成了分離產(chǎn)物的方法。可用傳統(tǒng)手段對由此獲得的產(chǎn)物進行進一步的純化，例如，通過重結(jié)晶或色譜來純化。
下述實施例將對本發(fā)明進一步地加以闡述。
實施例1制備L-山梨糖酮脫氫酶除非另有指明，所有操作都是在8℃進行的，緩沖液是0.05M的磷酸鉀(pH為7.0)。
(1)培養(yǎng)G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的細胞在含有5.0％的D-甘露醇、0.25％的MgSO4·7H2O、1.75％的玉米漿、5.0％的面包酵母、0.5％的尿素、0.5％的CaCO3和2.0％的瓊脂的瓊脂平板中于27℃被培養(yǎng)了4天。將一接種環(huán)的細胞接種到500ml的Erlenmeyer瓶中的50ml種子培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上以180rpm于30℃培養(yǎng)一天，所述種子培養(yǎng)基含有2％的L-山梨糖、0.2％的酵母提取物、0.05％的甘油、0.25％的MgSO4·7H2O、1.75％的玉米漿、0.5％的尿素和1.5％的CaCO3。
培養(yǎng)液(10ml)被轉(zhuǎn)移到含有100ml相同的種子培養(yǎng)基的500mlErlenmeyer瓶中，以與上文中同樣的方式培養(yǎng)。由此制備出來的種子培養(yǎng)物被用于向30L發(fā)酵罐中的15升培養(yǎng)基接種，所述培養(yǎng)基含有8.0％的L-山梨糖、0.05％的甘油、0.25％的MgSO4·7H2O、3.0％的玉米漿、0.4％的酵母提取物和0.15％的消泡劑。發(fā)酵參數(shù)為800rpm的攪拌速度、0.5vvm(空氣體積/培養(yǎng)基體積/分鐘)的通氣和30℃的溫度。發(fā)酵期間用氫氧化鈉將pH保持在7.0。48小時的培養(yǎng)后，通過連續(xù)離心收獲了30升含有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)細胞的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液是用兩組發(fā)酵罐得到的?；厥蘸屑毎某恋?，將其懸浮于適當體積的鹽水中。
以2,500rpm(1,000xg)對懸浮液進行離心后，回收含有細胞的上清液，以除去來自培養(yǎng)基成分中玉米漿和酵母提取物的不溶物質(zhì)。在8,000rpm(10,000xg)再進行離心，以獲得細胞沉淀。結(jié)果從30升培養(yǎng)液中獲得了123g的G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)細胞(濕重)。
(2)制備胞質(zhì)部分將細胞沉淀(64.2g)懸浮于280ml緩沖液中，用法式壓力細胞擠壓儀(French pressure cell press)對其進行處理。離心以除去完整細胞后，上清液被命名為無細胞提取物，在100,000xg對該無細胞提取物進行60分鐘的離心。得到的上清液(227ml)被稱為G.oxydans DSM 4025(FERMBP-3812)的可溶解部分。用緩沖液對此部分進行透析之后，150ml經(jīng)透析部分被用于下一個純化步驟，所述經(jīng)透析后的部分具有0.107單位/mg蛋白質(zhì)的比活性。
(3)二乙胺基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)-纖維素柱色譜將透析液(150ml)上樣到DEAE-纖維素柱(Whatman DE-52，3×50cm)中，所述的柱已被緩沖液平衡和洗過，以洗脫掉較小的蛋白。然后用含有0.28M、0.32M、0.36M NaCl的緩沖液，逐步洗脫結(jié)合到樹脂上的蛋白質(zhì)。主要的蛋白質(zhì)活性是在使用0.36M NaCl的時候被洗脫出來的?；钚圆糠?143ml)被收集起來。
(4)羧甲基-纖維素柱色譜用超濾儀(Centriprep-10，Amicon)過濾一部分(127ml)從上一個步驟獲得的活性部分，以對其進行濃縮。用緩沖液對濃縮后的樣品(28ml)進行透析后，將經(jīng)透析后的部分(31ml)中的28ml上樣到已用緩沖液平衡過的羧甲基-纖維素柱(Whatman CM-52，3×23cm)上。收集經(jīng)過柱子而不與樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。
(5)Q-瓊脂糖凝膠柱色譜(#1)用超濾儀(Centriprep-10)對收集到的活性部分(43ml)進行濃縮。將一部分(9.5ml)來自前一步的經(jīng)過濃縮的部分(10ml)上樣到已用緩沖液平衡過的Q-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia，1.5×50cm)上。用含有0.3M的NaCl的緩沖液洗過柱子之后，將NaCl以0.3M至0.6M的線性梯度添加到緩沖液中。在NaCl濃度在0.55M至0.57M范圍內(nèi)的情況下，活性部分被洗脫出來。
(6)Q-瓊脂糖凝膠柱色譜(#2)用超濾儀(Centriprep-10)對從前一個步驟收集到的活性部分(22ml)進行濃縮。用緩沖液對該濃縮液(3.0ml)進行透析。經(jīng)過透析的樣品(3.5ml)被上樣到已用緩沖液平衡過的Q-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia，1.5×50cm)上。用含有0.35M NaCl的緩沖液洗過柱子之后，將NaCl以0.35M至0.7M的線性梯度添加到緩沖液中。在NaCl濃度為0.51M至0.53M范圍內(nèi)的情況下，活性部分被洗脫出來。
(7)凝膠過濾(Sephacryl S-300高分辨率)柱色譜用超濾儀(Centriprep-10)對從前一個步驟收集到的活性部分(20ml)進行濃縮。將經(jīng)過濃縮和脫鹽(低于0.1M NaCl)的樣品(2.0ml)中的1.5ml的部分上樣到Sephacryl S-300高分辨率柱(Pharmacia，1.5×120cm)中，所述的柱已用含有0.1M NaCl的緩沖液平衡過。收集活性部分(12ml)，用緩沖液對其進行透析。
(8)疏水柱(RESOURCE ISO)色譜用超濾儀(Centriprep-10)對來自前一個步驟的透析后的活性部分進行濃縮。將一部分(1.5ml)經(jīng)過濃縮的樣品(1.75ml)加入到等體積(1.5ml)的緩沖液中，所述緩沖液含有3M的硫酸銨(終濃度為1.5M)。對樣品進行離心(15,000×g)之后，將上清液上樣到RESOURCEISO柱(Pharmacia，1.0ml)中，所述的柱已用含有1.5M硫酸銨的緩沖液平衡過。用含有1.5M硫酸銨的緩沖液洗過柱子之后，用含有1.5M至0.75M線性梯度的硫酸銨的緩沖液洗脫出蛋白質(zhì)來。當硫酸銨濃度在1.12M至1.10M范圍內(nèi)的情況下，對應于L-山梨糖酮脫氫酶的活性部分就被洗脫出來。通過透析杯(Dialysis-cup MWCO 8000，Daiichi purechemicals)用緩沖液對活性部分進行透析。之后收集此部分將其貯藏在-20℃。表1中給出了對酶的純化步驟的概括。
表1對來自G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的醛脫氫酶的純化
實施例2pH對來自L-山梨糖酮的反應產(chǎn)物的影響反應混合物由100μl的100mM多種緩沖液中的經(jīng)過純化的酶(0.42μg)、L-山梨糖酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)組成，將其在30℃培養(yǎng)1小時。通過薄層色譜(Silica gel60F254，MERCK)和HPLC來對反應產(chǎn)物進行分析。在pH在6.4至大約8.0的范圍內(nèi)的情況下，檢測了維生素C的產(chǎn)生。另一方面，如表2所示，pH范圍在5.4至大約9.0的情況下，檢測了2-KGA的生產(chǎn)。
表2pH對來自L-山梨糖酮的反應產(chǎn)物的影響
實施例3溫度對活性的影響反應混合物在25mM的磷酸鉀緩沖液(pH為7.0)中，含有0.42μg經(jīng)過純化的L-山梨糖酮脫氫酶、50mM的L-山梨糖酮、1μM的PQQ、1mM的CaCl2、1mM的PMS，將所述反應混合物在多個溫度下培養(yǎng)60分鐘。如表3中所示，L-山梨糖酮被轉(zhuǎn)化成了維生素C和2-KGA。
表3溫度對從L-山梨糖酮到維生素C和2-KGA的轉(zhuǎn)化活性的影響
權(quán)利要求
1.一種用于從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括在存在電子受體的情況下，將L-山梨糖酮與經(jīng)過純化的L-山梨糖酮脫氫酶相接觸，以及從反應混合物中分離出得到的維生素C，所述L-山梨糖酮脫氫酶具有如下物理化學屬性(a)分子量150,000±6,000Da或230,000±9,000Da(由2或3個同源亞基組成，每個亞基具有75,000±3,000Da的分子量)；(b)底物特異性對醛類化合物有活性；(c)輔助因子吡咯喹啉醌和血紅素c；(d)最優(yōu)pH用于從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的最優(yōu)pH為6.4至8.2之間；(e)抑制劑Co2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、一碘乙酸和乙二胺四乙酸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的L-山梨糖酮脫氫酶獲得自Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)菌株、具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鑒定特征的屬于Gluconobacter屬的微生物或其突變體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中反應在大約6.4至大約9.0的pH和大約20℃至大約60℃的溫度下，進行大約0.5至大約48小時。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的方法，其中反應在大約7.0至大約8.2的pH和大約20℃至大約50℃的溫度下，進行大約0.5至大約24小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及用分離自Gluconobacter oxydansDSM 4025(FERM BP－3812)的醛脫氫酶從L－山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的方法，所述醛脫氫酶具有如下物理化學屬性(a)分子量為150,000±6,000Da或230,000±9,000Da(由2或3個同源亞基組成，每個亞基具有75,000±3,000Da的分子量)；(b)對醛類化合物有底物特異性活性；(c)輔助因子是吡咯喹啉醌和血紅素c；(d)用于從L－山梨糖酮生產(chǎn)維生素C的最優(yōu)pH為6.4至8.2之間；和(e)Co
文檔編號C12N9/04GK1685050SQ03823199
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者星野達雄, 宮崎太郎, 杉澤輝秀 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司