專(zhuān)利名稱(chēng)：作為心血管病的標(biāo)志和治療靶的il1rl－1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷和治療心血管疾病的方法和組合物。更特別地，本發(fā)明涉及可用于治療心血管疾病的分離的分子，所述心血管疾病包括心臟肥大，心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭。
背景技術(shù)：
在發(fā)達(dá)國(guó)家中，盡管在心血管疾病的治療上已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但是心血管疾病仍然是疾病和死亡的最常見(jiàn)的原因。因此，心血管疾病如心肌梗塞和中風(fēng)的預(yù)防和治療已經(jīng)成為主要為公共健康服務(wù)的一個(gè)重要領(lǐng)域。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了幾個(gè)心血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因素，并且已經(jīng)在臨床上廣泛用于發(fā)現(xiàn)高危患者。這種篩選檢查包括評(píng)估總的和HDL膽固醇水平。但是，許多明顯是低度到中度危險(xiǎn)的患者也會(huì)發(fā)生心血管疾病，而辨別這類(lèi)患者的能力還非常有限。而且，累積數(shù)據(jù)表明在不同的患者人群中，對(duì)具有患心血管疾病危險(xiǎn)的患者和已患有心血管疾病的患者進(jìn)行的預(yù)防性和治療性治療的有益效果的程度也有所不同。然而，目前還缺乏用于確定某種治療效果較好還是效果較差的診斷性檢測(cè)數(shù)據(jù)。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了用于診斷和治療心血管疾病的方法和組合物。更特別地，本發(fā)明識(shí)別了基因，當(dāng)心臟細(xì)胞受到機(jī)械誘導(dǎo)而變形的時(shí)候該基因在細(xì)胞中受到正調(diào)控?；谶@個(gè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分子可用于治療心血管(包括血管)疾病，包括心臟肥大，心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭。
除此之外，還提供了使用這些分子診斷任何上述心血管(血管)疾病的方法。
還進(jìn)一步提供了用于制備治療上述疾病的治療劑的組合物。
因此本發(fā)明在幾個(gè)方面包括了多肽，編碼這些多肽的分離核酸，上述分子的功能性修飾物和變體，上述分子的有用片段，以及相關(guān)的治療方法和診斷方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種診斷由核酸分子的異常表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的異常(或上述分子的獨(dú)特片段的異常)表征的疾病的方法。該方法包括使來(lái)自患者的生物樣品與試劑接觸，所述試劑特異地與所述核酸分子，其表達(dá)產(chǎn)物，或者其表達(dá)產(chǎn)物的片段結(jié)合，檢測(cè)所結(jié)合試劑的量，由此確定所述核酸分子的表達(dá)或者其表達(dá)產(chǎn)物是否有異常，表達(dá)有異常即診斷為疾病，其中所述核酸分子為白介素1受體樣1(IL1RL-1，也稱(chēng)為T(mén)1/ST2，ST2，和Fit-1，SEQ ID NO1和2是可溶形式，SEQ ID NO3和4是膜結(jié)合形式)。術(shù)語(yǔ)IL1RL-1，T1/ST2，ST2和Fit-1在本說(shuō)明書(shū)中可以互換使用。在一些實(shí)施方案中，所述疾病是選自下組的心血管疾病心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是心臟肥大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是心力衰竭。在特定的實(shí)施方案中，生物樣品包括生物活組織切片樣品，以及生物流體例如血液/血清。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了確定患者的心血管疾病階段(例如退化，發(fā)展或者發(fā)作)的方法，其中所述階段由核酸分子的異常表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的異常(或上述分子的特定片段的異常)表征。所述方法包括監(jiān)控患者樣品的選自下組的參數(shù)(i)IL1RL-1核酸分子(或其獨(dú)特片段)，(ii)由IL1RL-1核酸編碼的多肽，(iii)由該多肽衍生的肽(或其獨(dú)特片段)，以及(iv)可選擇性結(jié)合所述多肽或肽(或其獨(dú)特片段)的抗體，這些參數(shù)可以確定患者的所述心血管疾病(例如退化，發(fā)展或者發(fā)作)所處的階段。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是任何前述實(shí)施方案中所述的生物流體或是組織。在特定的實(shí)施方案中，監(jiān)控的步驟包括使所述樣品與一種選自下組的可檢測(cè)到的試劑接觸(a)可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)所述核酸分子選擇性雜交的分離的核酸分子，(b)可選擇性地與(ii)所述多肽，或者(iii)所述的肽結(jié)合的抗體，以及(c)可選擇性地與(iv)的抗體結(jié)合的多肽或肽。所述抗體，多肽，肽，或核酸都可以用可檢測(cè)到的標(biāo)記例如放射性標(biāo)記或酶進(jìn)行標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括監(jiān)控(檢測(cè))樣品中的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)樣品的監(jiān)控持續(xù)一段時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種試劑盒。所述試劑盒包括容器，其中含有可以選擇性地與任何上述IL1RL-1分離核酸，或其表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合的試劑，以及對(duì)照，用于與所述試劑與任意上述分離核酸或其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合的測(cè)量值進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，用于與測(cè)量值進(jìn)行比較的對(duì)照具有預(yù)先確定的值。在特定的實(shí)施方案中，對(duì)照包括任意上述分離核酸的表達(dá)產(chǎn)物的表位。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種治療心血管疾病的方法。所述方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的可治療心血管疾病的IL1RL-1分子。在特定的實(shí)施方案中，所述心血管疾病選自心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括同時(shí)給予選自下組的制劑抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白IIb/IIIa受體抑制劑，能與細(xì)胞粘附分子結(jié)合并能抑制白細(xì)胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，β-腎上腺素受體阻斷劑，環(huán)氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統(tǒng)抑制劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種治療心臟肥大的方法。所述方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的可治療患者的心臟肥大的制劑以增加IL1RL-1核酸分子或者其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種治療患者以減少患者發(fā)生心血管疾病的危險(xiǎn)性的方法。所述方法包括給IL1RL-1分子表達(dá)水平異常的患者施用有效量的能減少心血管疾病危險(xiǎn)性，或者降低患者在未來(lái)發(fā)生心血管疾病的危險(xiǎn)性的制劑，其中所述制劑是抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白IIb/IIIa受體抑制劑，能與細(xì)胞粘附分子結(jié)合并能抑制白細(xì)胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，β-腎上腺素受體阻斷劑，環(huán)氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統(tǒng)抑制劑。在特定的實(shí)施方案中，所述患者沒(méi)有需要用所述制劑治療的其它癥狀。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種鑒定可用于治療心血管疾病的候選試劑的方法。所述方法包括在不存在候選試劑的條件下測(cè)定心臟細(xì)胞或組織中IL1RL-1分子的表達(dá)，其中所述心臟細(xì)胞或組織中IL1RL-1分子的為第一種表達(dá)量，使所述心臟細(xì)胞或組織與候選試劑接觸，測(cè)定所述IL1RL-1分子表達(dá)的檢測(cè)量，其中在存在候選試劑的條件下表達(dá)的檢測(cè)量與第一種表達(dá)量相比有所降低，表明該候選試劑可用于治療心血管疾病。在重要的實(shí)施方案中，IL1RL-1分子是任一個(gè)SEQ ID NO1-4所述的分子。在特定的實(shí)施方案中，所述心血管疾病選自心臟肥大(例如非適應(yīng)性肥大)，心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物。所述藥物組合物包括一種試劑，所述試劑包括制藥有效量的可治療心血管疾病的IL1RL-1分離核酸分子(SEQ ID NO1或3)，或其表達(dá)產(chǎn)物(例如SEQ ID NO2或4)，以及藥學(xué)可接受的載體。在特定的實(shí)施方案中，所述心血管疾病選自心臟肥大，心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，還提供了制備用于治療心血管疾病的藥物的方法。所述藥物優(yōu)選包括有效量的至少一種上述分子或組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了固相核酸分子陣列。所述陣列基本由一組核酸分子，其表達(dá)產(chǎn)物，或其片段(核酸片段或者多肽分子片段)組成，其中至少一種IL1RL-1分子(包括其表達(dá)產(chǎn)物，或其片段)固定于固相底物之上。在一些實(shí)施方案中，固相陣列進(jìn)一步包括至少一種對(duì)照核酸分子。
在特定的實(shí)施方案中，所述固相底物包括選自下組的物質(zhì)玻璃，硅，硅酸鋁，硅酸硼，金屬氧化物例如氧化鋁和氧化鎳，各種粘土，硝化纖維素，和尼龍。優(yōu)選所述底物是玻璃。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合固定于固體底物之上。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了評(píng)價(jià)患者在用能減少心血管疾病危險(xiǎn)性的試劑進(jìn)行的治療中獲益的可能性的方法。在重要的實(shí)施方案中，所述試劑選自抗炎制劑，抗血栓形成制劑，抗血小板制劑，纖維蛋白溶解劑，降脂劑，直接凝血酶抑制劑，糖蛋白IIb/IIIa受體抑制劑，能與細(xì)胞粘附分子結(jié)合并能抑制白細(xì)胞與這些分子接觸的能力的制劑，鈣通道阻斷劑，β-腎上腺素受體阻斷劑，環(huán)氧合酶-2抑制劑，或者血管緊張素系統(tǒng)抑制劑。所述方法包括獲得患者的IL1RL-1分子水平，將所述IL1RL-1分子水平與心血管疾病診斷特異性的預(yù)定值相比較。所述IL1RL-1分子水平與預(yù)定值的比較可以表明患者是否通過(guò)用所述試劑進(jìn)行的治療而獲益。在特定的實(shí)施方案中，心血管疾病診斷特異性的預(yù)定值是多個(gè)預(yù)定標(biāo)記物水平范圍，所述的比較步驟包括確定所述患者的水平落在哪個(gè)預(yù)定標(biāo)記物水平范圍中。所述心血管疾病可以是選自心臟肥大，心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭中的疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種預(yù)測(cè)心血管疾病結(jié)果的方法。所述方法包括獲得患者的IL1RL-1分子水平，將所述IL1RL-1分子水平與心血管疾病的預(yù)測(cè)結(jié)果特異性的預(yù)定值相比較。所述IL1RL-1分子水平與預(yù)定值的比較可以表明患者是會(huì)具有好的/正的結(jié)果還是會(huì)具有壞的/負(fù)的結(jié)果。在一些實(shí)施方案中高水平的IL1RL-1分子可能表示負(fù)的結(jié)果，而低水平可能表示正的結(jié)果。在特定的實(shí)施方案中，心血管疾病的預(yù)測(cè)結(jié)果特異性的預(yù)定值是多個(gè)預(yù)定標(biāo)記物水平范圍，所述的比較步驟包括確定所述患者的水平落在哪個(gè)預(yù)定標(biāo)記物水平范圍中。所述心血管疾病可以是選自心臟肥大，心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和心力衰竭中的疾病。
IL1RL-1分子的任何序列都可以用于本發(fā)明的任何方面和任何實(shí)施方案中。例如，除了如SEQ ID NO1和3所述的核苷酸序列之外，還包括如SEQ ID NO5和7所述的核苷酸序列。除了包括如SEQ ID NO2和4所述的預(yù)測(cè)氨基酸序列之外，還包括如SEQ ID NO6和8所述的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
本發(fā)明的這些方面和其他方面將通過(guò)發(fā)明詳述來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)描述。
序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO1是人IL1RL1(可溶的)cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是人IL1RL1(可溶的)cDNA(SEQ ID NO1)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
SEQ ID NO3是人IL1RL1(膜結(jié)合的)cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO4是人IL1RL1(膜結(jié)合的)(SEQ ID NO3)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
SEQ ID NO5是鼠Fit-1S cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO6是鼠Fit-1S cDNA(SEQ ID NO5)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
SEQ ID NO7是鼠Fit-1M cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO8是鼠Fit-1M cDNA(SEQ ID NO7)的翻譯產(chǎn)物的預(yù)測(cè)氨基酸序列。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是Northern Blot結(jié)果，顯示了經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后8％周期性機(jī)械應(yīng)變對(duì)于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中Fit-1的表達(dá)的影響。
圖2是Northern Blot結(jié)果，顯示了經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，8％周期性機(jī)械應(yīng)變，血管緊張素受體的阻斷，血管緊張素II，IL-1b，和佛波酯對(duì)于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中IL1RL-1的表達(dá)的影響。
圖3是Northern Blot結(jié)果，顯示了經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，8％周期性機(jī)械應(yīng)變，過(guò)氧化氫，和TIRON對(duì)于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中IL1RL-1的表達(dá)的影響。
圖4是Northern Blot結(jié)果，顯示了經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，在心肌細(xì)胞發(fā)生8％周期性機(jī)械應(yīng)變的過(guò)程中，放線菌素D和環(huán)己亞胺對(duì)于IL1RL-1表達(dá)的誘導(dǎo)的影響。
圖5是Northern Blot結(jié)果，顯示了經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，8％周期性機(jī)械力單獨(dú)，或與IL-1b一起，以及在沒(méi)有機(jī)械應(yīng)變的條件下的佛波酯，對(duì)于IL1RL-1的表達(dá)的影響。
圖6是Northern Blot結(jié)果，顯示了經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，8％周期性機(jī)械應(yīng)變對(duì)于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中空泡型ATP酶的表達(dá)的影響。
圖7顯示了本發(fā)明的試劑盒的外形特征。
圖8顯示了心肌細(xì)胞中機(jī)械應(yīng)變對(duì)T2/ST2的mRNA誘導(dǎo)的早期(左)和晚期(右)階段。3小時(shí)達(dá)到最大誘導(dǎo)量，維持9小時(shí)，然后經(jīng)15小時(shí)下降。頂部組為T(mén)1/ST2 RNA；底部組為溴化乙錠。無(wú)應(yīng)變?yōu)闆](méi)有機(jī)械應(yīng)變。
圖9顯示了通過(guò)機(jī)械應(yīng)變(8％)，白介素-1(10ng/ml)和佛波酯(PMA，200nM)在1小時(shí)和3小時(shí)對(duì)T1/ST2的mRNA的誘導(dǎo)。PMA＞機(jī)械應(yīng)變＞IL-1。頂部組為T(mén)1/ST2 mRNA，底部組為溴化乙錠。
圖10顯示了T1/ST2可能是在心肌細(xì)胞中IL1/IL-受體信號(hào)傳導(dǎo)中由NF-kB的激活誘導(dǎo)的一種基因。IL-1和機(jī)械應(yīng)變?cè)谟脤?duì)照腺病毒感染的條件下誘導(dǎo)T1/ST2 mRNA(左)。在被IB腺病毒感染的條件下(右)會(huì)降低NF-B DNA的結(jié)合活性，IL-1對(duì)T1/ST2的誘導(dǎo)被阻斷。機(jī)械應(yīng)變對(duì)T1/ST2的誘導(dǎo)被IB腺病毒感染部分阻斷，表明機(jī)械應(yīng)變還通過(guò)另一種途徑誘導(dǎo)T1/ST2。頂部組為T(mén)1/ST2 mRNA，底部組為溴化乙錠。
圖11顯示了小鼠心肌梗塞后TI/ST2蛋白的表達(dá)，在梗塞后1天和3天進(jìn)行免疫組化分析。40倍放大。
圖12以圖解方式顯示了人患者心肌梗塞后體循環(huán)中的ST2蛋白水平；a.在心肌梗塞后1天與14天和90天相比ST2蛋白顯著增加；b.線性回歸分析證明了在心肌梗塞后1天循環(huán)ST2蛋白和肌酸激酶之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系(p＜0.001)。Log ST2＝0.454(log CK)-1.07；c.心肌梗塞后1天循環(huán)ST2蛋白水平和和射血分?jǐn)?shù)的四分位值分析。較低的射血分?jǐn)?shù)伴隨著較高的ST2蛋白。
圖13顯示了在隨訪的30天內(nèi)，ST2基準(zhǔn)水平的升高表示較高的死亡率。(對(duì)數(shù)秩，p＝0.0009)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及多個(gè)基因的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心臟細(xì)胞受到機(jī)械誘導(dǎo)發(fā)生應(yīng)變變形的時(shí)候所述基因在細(xì)胞中受到正調(diào)控。由于這個(gè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分子可以用于治療心血管疾病，包括心臟肥大，心肌梗塞，中風(fēng)，動(dòng)脈硬化，和/或心力衰竭。
除此之外，還提供了使用這些分子診斷任何上述心血管疾病的方法。
進(jìn)一步，還提供了用于制備治療上述疾病的治療劑的組合物。
這里所述的“正調(diào)控”是指提高基因和/或它所編碼的多肽的表達(dá)?！疤岣弑磉_(dá)”是指提高本發(fā)明的任何一種核酸(IL1RL-1，SEQ ID NO1，3)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、和/或翻譯(即達(dá)到可檢測(cè)的水平)，這些過(guò)程的任何一種受到正調(diào)控都會(huì)導(dǎo)致該基因(核酸)編碼的多肽的濃度/量的增加。相反地，這里所述的“負(fù)調(diào)控”或“降低表達(dá)”是指降低基因和/或它所編碼的蛋白的表達(dá)。基因表達(dá)的正調(diào)控或負(fù)調(diào)控可以直接根據(jù)分別檢測(cè)所述基因的mRNA水平，或所述基因編碼的多肽的蛋白表達(dá)水平的升高或降低確定，檢測(cè)可以用所屬領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ǎ绶謩e用核酸雜交或抗體檢測(cè)方法，并與對(duì)照相比較。
這里所說(shuō)的“心臟細(xì)胞”是指心肌細(xì)胞。
這里所說(shuō)的“分子”包括“核酸”和“多肽”兩者。
這里所說(shuō)的“表達(dá)”指核酸和/或多肽表達(dá)。
這里所說(shuō)的“患者”指哺乳動(dòng)物或非人的哺乳動(dòng)物。在所有的實(shí)施方案中，人核酸，多肽，以及人患者都是優(yōu)選的。用人分子和其它文獻(xiàn)所述的鼠分子得到的結(jié)果預(yù)示著用其它同源序列也可以得到這樣的結(jié)果。
通常，同源序列和等位基因與本發(fā)明的人序列具有至少80％的核苷酸相同性和/或至少85％的氨基酸相同性。進(jìn)一步，同源序列和等位基因可以與人序列分別具有至少90％，95％，或甚至99％的核苷酸相同性和/或至少95％，98％，或者甚至99％的氨基酸相同性。同源性可以用NCBI(Bethesda，Maryland)提供的各種公開(kāi)軟件計(jì)算。實(shí)例包括Altschul SF等的啟發(fā)式算法(JMol Biol，1990，215403-410)，也稱(chēng)為BLAST?？梢杂霉曹浖?EMBL，Heidelberg，Germany)和商業(yè)軟件(例如OxfordMolecular Group/Genetics Computer Group，Madison，WI，Accelrys，Inc.，San Diego，CA的Mac Vector序列分析軟件)進(jìn)行Pairwiseand ClustalW對(duì)準(zhǔn)排列(BLOSUM30矩陣設(shè)置)。本發(fā)明還包括上述核酸的Watson-Crick互補(bǔ)序列。
在篩選相關(guān)基因，例如本文所述的序列的同源序列和等位基因的時(shí)候，可以在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行Southern blot，并使用探針。這里所說(shuō)的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指所屬領(lǐng)域所熟悉的參數(shù)。對(duì)于核酸來(lái)說(shuō)，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件通常是指條件為低離子強(qiáng)度，溫度低于DNA雜交復(fù)合物的熔解溫度(Tm)(通常是比雜交的Tm低3℃)。較高的嚴(yán)謹(jǐn)條件有助于使探針序列和靶之間具有更高的特異性。核酸雜交的嚴(yán)謹(jǐn)條件是所屬領(lǐng)域熟知的，可以在描述此方法的文獻(xiàn)中找到，例如，Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York?！案叨葒?yán)謹(jǐn)條件”的一個(gè)實(shí)例是65℃，6×SSC。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件的另一個(gè)實(shí)例是在65℃雜交，雜交緩沖液由3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清清蛋白，2.5mM NaH2PO4[pH7]，0.5％SDS，2mMEDTA組成。(SSC是0.015M氯化鈉/0.15M檸檬酸鈉，pH7；SDS是十二烷基磺酸鈉；EDTA是乙二胺四乙酸)。雜交后，將DNA轉(zhuǎn)移膜上，在室溫用2×SSC洗滌，然后用0.1×SSC/0.1×SDS洗滌直至溫度達(dá)到68℃。在另一個(gè)例子中，可用甲酰胺雜交溶液代替雜交水溶液。這時(shí)嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可以是，例如50％甲酰胺溶液，42℃。還可以使用其他條件，試劑等，也可以達(dá)到類(lèi)似的嚴(yán)謹(jǐn)程度。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些條件，因此這里不再描述。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員能夠控制條件使得可以清楚地鑒定本發(fā)明的IL1RL-1核酸的同源序列和等位基因。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員還熟知篩選細(xì)胞的方法，表達(dá)這些分子文庫(kù)，然后從文庫(kù)中分離出相關(guān)核酸分子并測(cè)序。
根據(jù)本發(fā)明給出的全長(zhǎng)人和鼠cDNA的克隆，可以用標(biāo)準(zhǔn)菌落雜交技術(shù)從cDNA文庫(kù)中分離出其它哺乳動(dòng)物序列例如與相關(guān)人和鼠核酸相應(yīng)的(小鼠，牛等的)cDNA，還可以用同源性搜索進(jìn)行識(shí)別，例如用這里描述的任何算法或所屬領(lǐng)域已知的算法在GenBank中搜索。例如GenBank序列號(hào)Y07519.1和D13695.1是小鼠IL1RL-1的同源序列，在本發(fā)明的各個(gè)方面都可以和本發(fā)明的同源鼠序列互換使用，而不背離本發(fā)明的精神。
相應(yīng)這里所說(shuō)的核酸，術(shù)語(yǔ)“分離的”意思是(i)在體外通過(guò)例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增；(ii)通過(guò)克隆產(chǎn)生重組體；(iii)通過(guò)切割和凝膠分離進(jìn)行純化；或者(iv)通過(guò)例如化學(xué)合成進(jìn)行合成。分離的核酸可以容易地通過(guò)所屬領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)獲得。因此，在其5’和3’端的限制性位點(diǎn)已知的，或者已公開(kāi)了其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物序列的載體中所含有的核苷酸序列被認(rèn)為是分離的，但是以天然狀態(tài)存在的或是存在于其天然宿主中的核酸序列則不是分離的。分離的核酸可以被純化，但是不需要純化。例如在克隆或表達(dá)載體內(nèi)的分離的核酸是不純的，因?yàn)樵诩?xì)胞內(nèi)它可能只包含微量的物質(zhì)。但是這樣的核酸如本文所用的術(shù)語(yǔ)一樣是分離的，因?yàn)樗梢院苋菀子盟鶎兕I(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的任何上述IL1RL-1核酸的表達(dá)，包括上述序列的獨(dú)特片段，可以用不同的方法確定。這里所說(shuō)的相關(guān)核酸的“獨(dú)特片段”是指較大核酸的“特征片段”。例如，獨(dú)特片段應(yīng)足夠長(zhǎng)，以確保它的精確序列在人基因組中除上述定義的每一個(gè)核酸之外都不存在。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以確定一個(gè)片段在人基因組中是否是獨(dú)特的。但是，獨(dú)特片段不包括完全由本申請(qǐng)的申請(qǐng)日之前公開(kāi)的核苷酸序列組成的片段。
獨(dú)特片段可以用作Southern和Northern blot檢測(cè)的探針，以識(shí)別核酸，或者可以用于擴(kuò)增檢測(cè)例如使用PCR進(jìn)行的檢測(cè)。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，優(yōu)選使用大的探針如200，250，300個(gè)或更多個(gè)核苷酸用于特定用途如Southern和Northern blots，而優(yōu)選使用較小的片段用作其它用途如PCR。獨(dú)特片段也可以用于產(chǎn)生融合蛋白以生成抗體，或者結(jié)合多肽片段，或者生成免疫檢測(cè)成分。同樣地，獨(dú)特片段可以用于產(chǎn)生非融合片段，例如IL1RL-1多肽，它可用于，例如抗體的制備，免疫檢測(cè)或治療。獨(dú)特片段進(jìn)一步可用作反義分子，以分別抑制上述核酸和多肽的表達(dá)。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，獨(dú)特片段的大小取決于它們?cè)谶z傳密碼上的保守性。因此，SEQ ID NO1，和3及其互補(bǔ)序列的一些區(qū)域的獨(dú)特片段較長(zhǎng)，而其它序列的獨(dú)特片段較短，一般是12到32個(gè)核苷酸長(zhǎng)(例如12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31和32個(gè)堿基)或者更多，直至每個(gè)公開(kāi)的序列的全長(zhǎng)。如上所述，本發(fā)明公開(kāi)了每個(gè)序列的每一個(gè)片段，從第一個(gè)核苷酸，第二個(gè)核苷酸等等開(kāi)始，直至離末端8個(gè)核苷酸，以每個(gè)序列的第8位，第9位，第10位核苷酸等等之后的任一個(gè)結(jié)束，直至最后一個(gè)核苷酸，(該序列如上所述是獨(dú)特的)。例如，事實(shí)上SEQ ID NO1從第1個(gè)核苷酸到第1357個(gè)核苷酸區(qū)域，或者SEQ ID NO3從第1個(gè)核苷酸到第2058個(gè)核苷酸區(qū)域的任何片段，或其具有20個(gè)或更多個(gè)核苷酸的互補(bǔ)序列都是獨(dú)特的。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知選擇這種序列的方法，典型地是基于獨(dú)特片段能將所感興趣的序列選擇性地與人基因組中的其它序列區(qū)分開(kāi)。將片段序列與已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相比較就足夠了，雖然還可以在體外進(jìn)行驗(yàn)證性的雜交和測(cè)序分析。
本發(fā)明的特定方面包括選擇性地與編碼多肽的核酸分子結(jié)合以降低該多肽活性的反義寡核苷酸。
這里所說(shuō)的“反義分子”，“反義寡核苷酸”，和“反義”所描述的寡核苷酸是寡核糖核苷酸，寡脫氧核糖核苷酸，修飾的寡核糖核苷酸，或者修飾的寡脫氧核糖核苷酸，它們可在生理?xiàng)l件下與含有特定基因的DNA或該基因的轉(zhuǎn)錄mRNA雜交，從而抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和/或抑制該mRNA的翻譯。反義分子應(yīng)能通過(guò)與靶基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交從而干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到反義寡核苷酸的確切長(zhǎng)度以及它與靶互補(bǔ)的程度取決于所選擇的特定靶，包括靶的序列以及組成該序列的特定堿基。優(yōu)選反義寡核苷酸的組成和排布使其能夠在生理?xiàng)l件下選擇性地與靶結(jié)合，即在生理?xiàng)l件下相對(duì)于靶細(xì)胞中的其它序列更多地是與靶序列結(jié)合?；赟EQ ID NO1，和3，或等位基因或同源染色體和/或cDNA序列，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易選擇并合成可用于本發(fā)明的任何適當(dāng)?shù)姆戳x分子。要達(dá)到足夠的選擇性和抑制能力，反義寡核苷酸應(yīng)當(dāng)包括至少10個(gè)，更優(yōu)選地至少15個(gè)與靶互補(bǔ)的連續(xù)堿基，雖然在特定的條件下，長(zhǎng)度為7個(gè)堿基的修飾寡核苷酸也可成功用于反義寡核苷酸(Wagner et al.，Nat.Med，1995，1(11)1116-1118；Nat.Biotech.，1996，14840-844)。最優(yōu)選地，反義寡核苷酸含有20-30個(gè)堿基的互補(bǔ)序列。
雖然寡核苷酸可以是基因或mRNA轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義物，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸相應(yīng)于N末端或者5’上游位點(diǎn)，例如翻譯起始，轉(zhuǎn)錄起始或者啟動(dòng)子位點(diǎn)。除此之外，反義寡核苷酸也可以靶定3’未翻譯區(qū)域。在所屬領(lǐng)域中，也可以靶定mRNA剪接位點(diǎn)，但是如果存在其它的mRNA剪接則不傾向于使用這種方式。除此之外，反義物優(yōu)選靶定不影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如，Sainio et al.，Cell Mol.Neurobiol.14(5)439-457，1994)和不與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)。最后，雖然SEQ IDNO1和3，公開(kāi)了cDNA序列，所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易獲得上述序列的基因組DNA序列。因此，本發(fā)明還提供了與SEQ ID NO1和3相應(yīng)的基因組DNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸。類(lèi)似地，無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)就可以獲得其等位基因或者同源的人cDNA和基因組DNA的反義物。
本發(fā)明的寡核苷酸可以包括RNAi分子。RNA干擾或者說(shuō)“RNAi”包括使用雙鏈RNA(dsRNA)阻斷基因表達(dá)(參見(jiàn)，例如Sui，G，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.995515-5520，2002)。本發(fā)明的實(shí)施方案中使用的RNAi策略方法是所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸可以由“天然的”脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或其任意組合組成。也就是說(shuō)一個(gè)天然核苷酸的5’端和另一個(gè)天然核苷酸的3’端可以通過(guò)核苷間的磷酸二酯鍵共價(jià)結(jié)合，如天然狀態(tài)那樣。這些寡核苷酸可以通過(guò)所屬領(lǐng)域公知的方法，通過(guò)人工操作或者用自動(dòng)合成儀制備。它們也可以通過(guò)載體重組產(chǎn)生。
但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義寡核苷酸還包括“修飾的”寡核苷酸。也就是說(shuō)，所述寡核苷酸可以通過(guò)多種方式修飾，修飾的方式不妨礙它們與其靶雜交，但是可以增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或者它們對(duì)目標(biāo)的靶定，或者增強(qiáng)它們的治療效果。
這里所說(shuō)的術(shù)語(yǔ)“修飾的寡核苷酸”是指這樣的寡核苷酸(1)其中至少兩個(gè)核苷酸通過(guò)合成的核苷間連接(即除一個(gè)核苷酸的5’端和另一個(gè)核苷酸的3’端之間的磷酸二酯鍵以外的連接)相連和/或(2)其中通常不與核酸相連的化學(xué)基團(tuán)與該寡核苷酸共價(jià)連接。優(yōu)選的核苷間連接是硫逐磷酸酯，膦酸烷基酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，硫逐磷酸烷基酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸鹽，磷酸三酯，乙酰胺，羧甲基酯和肽。
術(shù)語(yǔ)“修飾的寡核苷酸”還包括具有共價(jià)修飾的堿基和/或糖的寡核苷酸。例如，修飾的寡核苷酸包括具有與除3’位置的羥基以外的以及除5’位置的磷酸基團(tuán)以外的低分子量的有機(jī)基團(tuán)共價(jià)連接的骨架糖。因此修飾的寡核苷酸可以含有2’-O-烷基化核糖基團(tuán)。除此之外，修飾的寡核苷酸可以含有糖例如用阿拉伯糖代替核糖。因此本發(fā)明包括含有在生理?xiàng)l件下與編碼SEQ ID NO2和/或4的多肽的核酸互補(bǔ)并與之雜交的修飾的反義分子的藥物制備物，以及藥學(xué)可接收的載體。
反義寡核苷酸可以作為藥物組合物的一部分給藥。這樣的藥物組合物可以含有反義寡核苷酸和所屬領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)生理學(xué)和/或藥學(xué)可接收的載體的組合。所述組合物應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌的，并且在適于給患者施用的單位重量或單位體積中含有治療有效量的反義寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接收的”是指不會(huì)干擾活性成分的生物學(xué)活性的效果的非毒性物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“生理學(xué)可接收的”是指與生物系統(tǒng)例如細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)物，組織，或生物體相容的非毒性物質(zhì)。載體的特征取決于給藥的方式。生理學(xué)和藥學(xué)可接收的載體包括稀釋劑，填充物，鹽，緩沖液，穩(wěn)定劑，增溶劑，以及所屬領(lǐng)域熟知的其它物質(zhì)。
本發(fā)明還包括編碼由SEQ ID NO1和/或3的核酸，片段及其變異體編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，以及含有這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。實(shí)際上，任何細(xì)胞，不論是原核的或真核的，只要能被異源DNA或RNA轉(zhuǎn)化并能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或維持，都可以用于本發(fā)明。實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如小鼠，倉(cāng)鼠，豬，羊，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等。細(xì)胞可以是多種組織類(lèi)型，包括肥大細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，卵母細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，它們可以是初始細(xì)胞或細(xì)胞系。特定的例子包括CHO細(xì)胞和COS細(xì)胞。也可以使用不含細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)代替細(xì)胞。
這里所說(shuō)的“載體”可以是任何核酸，其中所需要的序列可以通過(guò)限制性切割和連接插入該核酸，以在不同的遺傳環(huán)境中傳遞或者在宿主細(xì)胞中表達(dá)。載體通常是由DNA組成，雖然RNA載體也可以使用。載體包括但不限于質(zhì)粒，噬菌粒和病毒基因組?？寺≥d體是能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并且可由一種多種內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)表征的載體，其中該載體可以以確定的方式切割，并且所需的DNA序列可以連接到其中并使新的重組載體保留了其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。如果載體是質(zhì)粒，當(dāng)質(zhì)粒在宿主細(xì)菌增加拷貝數(shù)的時(shí)候所需序列可以復(fù)制多次，或者在宿主通過(guò)有絲分裂繁殖之前在每個(gè)宿主中只復(fù)制一次。如果載體是噬菌體，可以在溶胞階段主動(dòng)復(fù)制，或者在溶源階段被動(dòng)復(fù)制。表達(dá)載體是所需的DNA序列可以通過(guò)限制性切割和連接插入其中并且與調(diào)控序列可操作地連接并通過(guò)RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的載體。載體可以進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)適用于識(shí)別已經(jīng)被或沒(méi)有被載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的標(biāo)記序列。標(biāo)記包括，例如編碼可以增加或減少對(duì)抗體或其它化合物的抗性或敏感性的的蛋白的基因，編碼其活性可以用所屬領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法檢測(cè)的酶的基因(例如-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶)，以及可見(jiàn)的能影響所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞，宿主，菌落或噬斑的表型的基因(例如綠色熒光蛋白)。優(yōu)選的載體是能夠自發(fā)復(fù)制并表達(dá)存在于DNA區(qū)段中并與之可操作地連接的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物的載體。
這里所說(shuō)的編碼序列和調(diào)控序列，當(dāng)它們共價(jià)連接以使編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄受到調(diào)控序列的影響或控制的時(shí)候稱(chēng)為“可操作地連接”。如果需要，編碼序列可以翻譯為功能蛋白。如果5’調(diào)控序列的啟動(dòng)子誘導(dǎo)導(dǎo)致了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，并且如果兩個(gè)DNA序列之間的連接狀態(tài)不會(huì)(1)導(dǎo)致出現(xiàn)移碼突變，(2)干擾啟動(dòng)子區(qū)域指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，或者(3)干擾相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)的能力，則兩個(gè)DNA被稱(chēng)為可操作地連接。因此，如果啟動(dòng)子區(qū)域能夠影響DNA序列的轉(zhuǎn)錄并使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠被翻譯成所需的蛋白質(zhì)或多肽，則啟動(dòng)子區(qū)域應(yīng)當(dāng)是可操作地與編碼序列連接。
基因表達(dá)所需的調(diào)控序列的確切特征隨種屬或細(xì)胞類(lèi)型的不同而不同，但是通常包括，轉(zhuǎn)錄和反義分別所必需的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT序列，等等。這種5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列通常包括啟動(dòng)子區(qū)域，該啟動(dòng)子區(qū)域含有對(duì)可操作連接的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子序列。調(diào)控序列還可以含有所需的增強(qiáng)子序列或者上游活化子序列。本發(fā)明的載體可以任選地含有5’前導(dǎo)序列或信號(hào)序列。選擇和設(shè)計(jì)合適的載體在所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力和判斷力之內(nèi)。
含有所有表達(dá)所必需元件的表達(dá)載體是商業(yè)可獲得的，也是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見(jiàn)，例如，Sambrook et a1.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989?？梢酝ㄟ^(guò)向細(xì)胞中引入編碼多肽或其片段或變體的異源DNA(RNA)構(gòu)建基因工程細(xì)胞。該異源DNA(RNA)可操作地受到轉(zhuǎn)錄元件的控制，使其可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)異源DNA。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中優(yōu)選的mRNA表達(dá)系統(tǒng)包括例如pcDNA3.1(可從Invitrogen，Carlsbad，CA獲得)，其含有可選擇的標(biāo)記例如賦予G418抗性的基因(有助于選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系)，以及人巨細(xì)胞病毒(CMV)增強(qiáng)子-啟動(dòng)子序列。除此之外，適于在靈長(zhǎng)類(lèi)或犬細(xì)胞系中表達(dá)的是pCEP4載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其含有Epstein Barr病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)，有助于使質(zhì)粒成為多拷貝染色體外元件。另一種優(yōu)選的表達(dá)載體是腺病毒，在Stratford-Perricaudet的文獻(xiàn)中有描述，其是E1和E3蛋白缺陷型(J.Clin.Invest.90626-630，1992)。
本發(fā)明還包括所謂的表達(dá)試劑盒，使得技術(shù)人員可以制備所需的表達(dá)載體。這種表達(dá)試劑盒包括至少上述討論的每一個(gè)編碼序列的分離部分。也可以加入其它所需的組分，只要其中含有所需的上述序列。
還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明包括上述SEQ ID NO1和/或3，含有cDNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和細(xì)胞系，如原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)，或真核細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲(chóng)細(xì)胞中的重組桿狀病毒表達(dá))的用途。特別有用的是哺乳動(dòng)物例如小鼠，倉(cāng)鼠，豬，羊，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等的細(xì)胞。它們可以是多種組織類(lèi)型，包括靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞和細(xì)胞系。特定的例子包括樹(shù)突狀細(xì)胞，U293細(xì)胞，外周血白細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了由上述核酸(SEQ ID NO1和3)編碼的分離的多肽(包括整個(gè)蛋白和部分蛋白)，還包括SEQ ID NO2和/或4的多肽，以及它們的獨(dú)特片段。這種多肽可單獨(dú)使用或作為融合蛋白的一部分生成抗體，或者作為免疫檢測(cè)的組分?？梢詮纳飿悠钒ńM織或細(xì)胞勻漿中分離多肽，也可以在多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)多肽，其是通過(guò)構(gòu)建適合于表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體，將表達(dá)載體引入表達(dá)系統(tǒng)，分離重組表達(dá)蛋白。短的多肽，包括抗原性肽(例如由細(xì)胞表面的MHC分子呈遞以進(jìn)行免疫識(shí)別的肽)也可以用已知的肽合成方法化學(xué)合成。
就這里所說(shuō)的多肽而言，術(shù)語(yǔ)“分離的”表示以足夠純的形式從其天然環(huán)境中分離出來(lái)，以使它能夠用于本發(fā)明的任何目的。因此分離的表示足夠純以用于(i)產(chǎn)生和/或分離抗體，(ii)作為檢測(cè)試劑，(iii)測(cè)序，(iv)作為治療劑等。
每一個(gè)上述多肽的獨(dú)特片段都具有如上所述的與核酸相關(guān)的獨(dú)特片段的特征。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，獨(dú)特片段的大小取決于各種因素如該片段是否由若干個(gè)保守蛋白域組成。因此，多肽的某些區(qū)域應(yīng)當(dāng)必須具有比較長(zhǎng)的片段才是獨(dú)特的，而其它區(qū)域只需要短的片段，一般是在5到12個(gè)氨基酸之間(例如5，6，7，8，9，10，11和12個(gè)氨基酸或更多，包括每一個(gè)整數(shù)直至每個(gè)多肽的全長(zhǎng))就可以。
多肽的獨(dú)特片段優(yōu)選是那些能保留該多肽的獨(dú)特功能的片段。獨(dú)特片段所保留的多肽的功能包括與抗體的相互作用，與其它多肽或其片段的相互作用，與其它分子的相互作用等。一種很重要的活性就是作為識(shí)別該多肽的特征。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知選擇獨(dú)特氨基酸序列的方法，通常是基于獨(dú)特片段能夠?qū)⑺信d趣的序列與非家族成員區(qū)分開(kāi)。所需要做的就是將所述片段的序列與已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比較。
本發(fā)明包括上述多肽的變體。這里所說(shuō)的多肽的“變體”是其中含有一個(gè)或多個(gè)天然(例如“野生型”具有選自SEQ ID NO2和4的氨基酸序列的多肽)多肽的初級(jí)氨基酸序列的修飾。能夠產(chǎn)生多肽變體的修飾通常是對(duì)編碼該多肽的核酸進(jìn)行的，可以包括缺失，點(diǎn)突變，截?cái)?，氨基酸取代以及插入氨基酸或非氨基酸分子，其目的?1)降低或消除多肽的活性；(2)增強(qiáng)多肽的一種性質(zhì)，例如蛋白質(zhì)在表達(dá)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性或者蛋白-配體連接的穩(wěn)定性；(3)為蛋白提供一種新的活性或性質(zhì)，例如插入抗原性表位或者插入可檢測(cè)到的分子，或者(4)為多肽受體或其它分子提供同等的或更好的連接。可選擇地，修飾可以是直接針對(duì)多肽的，例如切割，插入連接體分子，插入可檢測(cè)到的分子，例如生物素，插入脂肪酸等。修飾也可以包括含有該多肽全部或部分氨基酸序列的融合蛋白。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)熟悉預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變對(duì)于蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，并可以根據(jù)已知方法“設(shè)計(jì)”一種變體多肽。這種方法的一個(gè)實(shí)例如Dahiyat and Mayoin Science 27882-87，1997所述，其中蛋白是完全新設(shè)計(jì)的。所述方法可以應(yīng)用于已知蛋白，僅改變?cè)摱嚯男蛄械囊徊糠?。使用Dahiyat and Mayo所述的的計(jì)算方法，可以得到任何上述多肽的特異變體，并進(jìn)行檢測(cè)以確定所述變體是否具有所希望的構(gòu)象。
變體可以包括進(jìn)行特定修飾的改變了與其生理活性無(wú)關(guān)的多肽性質(zhì)的多肽。例如半胱氨酸殘基可以被取代或者被刪除以防止產(chǎn)生不希望的二硫鍵。類(lèi)似地，可以改變特定的氨基酸以通過(guò)在表達(dá)系統(tǒng)中消除蛋白酶的蛋白質(zhì)水解作用增強(qiáng)多肽的表達(dá)(例如酵母表達(dá)系統(tǒng)中的二元氨基酸殘基，其中存在KEX2蛋白酶活性)。
編碼多肽的核苷酸的突變優(yōu)選保留了編碼序列的氨基酸閱讀框，優(yōu)選不在核酸中產(chǎn)生可能雜交形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如發(fā)卡或環(huán)的區(qū)域，這不利于表達(dá)變體多肽。
可以通過(guò)選擇氨基酸取代，或者通過(guò)在編碼多肽的核酸的選定位點(diǎn)進(jìn)行任意突變產(chǎn)生突變。然后表達(dá)變體多肽并檢測(cè)其一種或多種活性以確定哪種突變得到的變體多肽具有所希望的性質(zhì)?？梢詫?duì)其中所述多肽的氨基酸序列處于沉默狀態(tài)，但是卻具有在特定宿主中進(jìn)行翻譯的優(yōu)選密碼子的變體(或者非變體多肽)進(jìn)行進(jìn)一步突變。核酸在例如大腸桿菌中翻譯的優(yōu)選密碼子是所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。還可以對(duì)基因的非編碼序列或cDNA克隆進(jìn)行其它突變以增強(qiáng)多肽的表達(dá)。
所述領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)任意上述多肽進(jìn)行保守性氨基酸取代，以提供上述多肽的功能相同的變體，即這些變體保留了每個(gè)多肽的功能。這里所說(shuō)的“保守性氨基酸取代”是指氨基酸取代不顯著改變多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)和/或活性?？梢允褂盟鶎兕I(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的改變多肽序列的方法制備變體，包括那些描述此方法的參考文獻(xiàn)中所述的方法，例如MolecularCloningA Laboratory Manual，J.Sambrook，et a1.，eds.，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York。氨基酸的保守性取代包括在下列各組內(nèi)的氨基酸取代(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。
因此本發(fā)明包括多肽的功能相同的變體，即保留著天然(“野生型”)多肽的功能的多肽變體。產(chǎn)生每個(gè)多肽的功能等同性變體的多肽氨基酸序列的保守性氨基酸取代是通過(guò)改變編碼所述多肽的核酸得到的?？梢杂盟鶎兕I(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的多種方法進(jìn)行這種取代。例如，根據(jù)Kunkel(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82488-492，1985)所述的方法進(jìn)行PCR定向突變，位點(diǎn)定向突變，或者化學(xué)合成編碼多肽的基因以進(jìn)行氨基酸取代。多肽的功能等同性變體的活性可以通過(guò)下述方法檢測(cè)將編碼改變的多肽的基因克隆到細(xì)菌或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，將載體引入合適的宿主細(xì)胞中，表達(dá)改變的多肽，用本文所述的方法檢測(cè)多肽功能。
本發(fā)明如本文所述具有多種用途，其中一些在本文其它部分描述。首先，本發(fā)明使得可以分離多肽?？梢杂盟鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法得到分離的分子。所述多肽可以從天然能產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞中通過(guò)層析方法或免疫識(shí)別純化?？蛇x擇地，可將表達(dá)載體引入細(xì)胞以生產(chǎn)所述多肽。在另一種方法中，可以將mRNA轉(zhuǎn)錄物通過(guò)顯微注射或其它方法引入細(xì)胞中，以生產(chǎn)所述的編碼多肽。mRNA在不含細(xì)胞的提取物例如網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物系統(tǒng)中的翻譯也可以用于生產(chǎn)多肽。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員還可以很容易地用已知的方法分離多肽。這些方法包括但不限于免疫層析，HPLC，排阻層析，離子交換層析和免疫親和層析。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括衍生自多肽的“顯性抑制”多肽。顯性抑制多肽是一種蛋白質(zhì)的無(wú)活性的變體，通過(guò)與細(xì)胞體系的相互作用，取代活性蛋白與細(xì)胞體系的相互作用或者與活性蛋白競(jìng)爭(zhēng)，由此減少了活性蛋白的作用。例如，與配體結(jié)合但在與配體結(jié)合的同時(shí)不傳遞信號(hào)的顯性抑制受體可以減少配體表達(dá)的生物學(xué)作用。同樣地，顯性抑制無(wú)催化活性的激酶可以正常地與靶蛋白相互作用，但是不能磷酸化靶蛋白，這可以減少靶蛋白響應(yīng)細(xì)胞信號(hào)時(shí)發(fā)生的磷酸化。類(lèi)似地，顯性抑制轉(zhuǎn)錄因子可以與基因控制區(qū)域的啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合但是不增加基因轉(zhuǎn)錄，這可以通過(guò)占據(jù)啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)而又不增加轉(zhuǎn)錄來(lái)減少正常轉(zhuǎn)錄作用。
在細(xì)胞中表達(dá)顯性抑制多肽的最終結(jié)果是降低了活性蛋白的功能。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以評(píng)估蛋白質(zhì)顯性抑制變體潛在的功能，并且使用標(biāo)準(zhǔn)的突變技術(shù)產(chǎn)生一種或多種顯性抑制變體多肽。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利序列號(hào)5,580,723和Sambrook etal.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員然后可以檢測(cè)減少了選定的活性和/或保留了此活性的突變多肽群體。其它類(lèi)似的生成和檢測(cè)蛋白質(zhì)的顯性抑制變體的方法對(duì)于所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的cDNA的分離使技術(shù)人員有可能診斷由任何上述cDNA的異常表達(dá)表征的疾病。這些方法包括確定每一個(gè)所識(shí)別的核酸，和/或由其生成的多肽的表達(dá)。在上述情況下，這種確定可以通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)的核酸確定性檢測(cè)，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或者用標(biāo)記的雜交探針來(lái)進(jìn)行，如下文例示。在后者的情況下，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的免疫檢測(cè)，用例如與分泌蛋白結(jié)合的抗體進(jìn)行確定。
本發(fā)明還包括分離的肽結(jié)合試劑，例如，該試劑可以是抗體或者抗體的片段(“結(jié)合多肽”)，具有能選擇性地與本發(fā)明的任何多肽(例如SEQ ID NO2或4)結(jié)合的能力?？贵w包括多克隆和單克隆抗體，可以根據(jù)傳統(tǒng)方法制備。
重要的是，如本領(lǐng)域熟知的，只有抗體的一小部分，抗原決定簇，與抗體與其表位的結(jié)合有關(guān)(參見(jiàn)，一般的，Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern ImmunologyWiley & Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)EssentialImmunology，7th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。pFc’和Fc區(qū)域，例如，是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的效應(yīng)物，但不涉及抗原結(jié)合。其pFc′區(qū)域被酶切了的，或者不含有pFc′區(qū)域的抗體稱(chēng)為F(ab’)2片段，保留有完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。類(lèi)似地，其Fc區(qū)域被酶切了的，或者不含有Fc區(qū)域的抗體稱(chēng)為Fab片段，保留有完整抗體分子的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步，F(xiàn)ab片段由共價(jià)結(jié)合的抗體輕鏈和抗體重鏈的Fd部分組成。Fd片段是抗體特異性的主要決定因素(一個(gè)單獨(dú)的Fd片段可以和多達(dá)十個(gè)不同的輕鏈結(jié)合而不會(huì)改變其抗體特異性)，F(xiàn)d片段在分離過(guò)程中保持了表位結(jié)合能力。
在抗體的抗原結(jié)合部分中，如所屬領(lǐng)域所熟知的，具有可以和抗原的表位直接相互作用的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，以及維持抗原決定簇的三級(jí)結(jié)構(gòu)的框架區(qū)(FR)(參見(jiàn)，一般的，Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈中，具有四個(gè)框架區(qū)域(FR1到FR4)，分別被三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1至CDR3)分隔開(kāi)。CDR，特別是CDR3區(qū)域，更特別的是重鏈CDR3，主要負(fù)責(zé)抗體的特異性。
所屬領(lǐng)域已知哺乳動(dòng)物抗體的非CDR區(qū)域可以被同種或異種抗體的類(lèi)似區(qū)域取代，而還保持原始抗體的表位特異性。這清楚地由“人化的”抗體的研究和使用所證明，其中非人的CDR與人FR和/或Fc/pFc’區(qū)域共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生功能性抗體。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利序列號(hào)4,816,567；5,225,539；5,585,089；5,693,762和5,859,205。因此，例如，PCT國(guó)際
發(fā)明者理查德·T·李 申請(qǐng)人:布賴(lài)漢姆婦女醫(yī)院