專利名稱：干細胞和祖細胞分化的調節(jié)、鑒定及其應用的制作方法
本申請要求2002年4月12日提交的美國臨時申請60/372348，2002年12月31日提交的美國臨時申請60/437348及2002年12月31日提交的美國臨時申請60/437350的優(yōu)先權，在此引用每一篇的全部內容。
1.介紹本發(fā)明涉及調節(jié)哺乳動物干細胞和/或祖細胞分化的方法。本發(fā)明的方法可用于調節(jié)和控制哺乳動物，尤其是人的干細胞沿著特定細胞和組織譜系的分化和成熟。本發(fā)明的方法涉及使用某些小的有機分子來調節(jié)干細胞或祖細胞群沿著特定細胞和組織譜系的分化，尤其是源于產(chǎn)后胎盤的胚胎樣干細胞的分化或沿著特定分化途徑，特別是粒細胞分化途徑的早期造血祖細胞的調節(jié)。本發(fā)明還涉及使用這些有機分子來調節(jié)特定譜系祖細胞，如CD34+，CD45+和CD133+祖細胞的分化。本發(fā)明還涉及祖細胞發(fā)育的時間方面，以及基于這些時間方面的體外模型。本發(fā)明進一步涉及這些得到調節(jié)的細胞在預防和治療方法中，包括在這種細胞和/或小的有機化合物的藥物組合物中的應用。最后，本發(fā)明涉及這種分化的細胞在移植和其他醫(yī)學治療中的應用。
2.發(fā)明背景在人的干細胞和祖細胞的鑒定、分離和增殖上有重要的關注。干細胞是能產(chǎn)生多種成熟細胞譜系的全能或多能前體細胞，前體細胞是能產(chǎn)生特定細胞譜系細胞的細胞。這些能力作為對于器管和組織發(fā)育必需的細胞分化和特化的基礎。
近來在移植干細胞和祖細胞上的成功已經(jīng)提供了新的臨床工具以用于因疾病、暴露于有毒化學物質和/或輻射的骨髓切除后的骨髓重建和/或補充。進一步證據(jù)的存在證明干細胞可用于重建許多，即使不是全部的組織以及修復生理狀況和生理學和解剖學上的功能。干細胞在組織工程、基因治療傳送以及細胞療法中的應用也正迅速地發(fā)展著。
許多不同類型的哺乳動物干細胞和祖干細胞已得到鑒定。例如，已知的有胚胎干細胞、胚胎生殖細胞、成體干細胞、或定向干細胞或祖細胞。某些干細胞還未被分離和鑒定，但已經(jīng)在允許向限定的范圍分化的條件下得到培養(yǎng)。然而，剩下一個基本問題，就是，控制和調節(jié)干細胞和祖細胞，如造血祖細胞的分化是很困難的。目前，現(xiàn)有的調節(jié)這些細胞分化的方法是不成熟的和不可控制的，從而細胞在不需要的時間分化成不需要的細胞類型。而且，細胞產(chǎn)品的產(chǎn)率一般比較低。
此外，獲得足夠數(shù)量的用于治療或研究目的的人干細胞尚有問題。部分地，由于在血或組織中找到的干細胞或祖細胞的有限數(shù)量以及與獲得骨髓吸出物有關的顯著不適，分離成體組織中正常存在的干細胞或祖細胞群體有技術上的困難，且費用昂貴。一般而言，從替代性來源收獲足夠數(shù)量用于治療或研究目的的干細胞或祖細胞通常是很費力的，包括，例如，從供體或患者收獲細胞或組織、體外培養(yǎng)和/或傳播細胞、解離細胞等。至于干細胞尤其是從胚胎或胎兒組織，包括流產(chǎn)兒中獲得這些細胞，已上升到宗教和倫理道德的顧慮。廣泛認定的人胚胎或胎兒就構成獨立生命的信念已促成在如此來源的細胞用于所有目的，包括醫(yī)學研究的用途上政府的禁止。因而，不需要應用從胚胎或胎兒獲得的細胞的替代性來源就期望在干細胞臨床應用中的進一步發(fā)展。然而，很少有可用的干細胞或祖細胞，特別是人干細胞或祖細胞的替代性來源，因此，供給是有限的。
Hu等(WO 00/73421，題為“人羊膜上皮細胞的分離、深低溫保藏的方法以及治療用途”，公開于2000-12-07)公開了源于分娩時胎盤的人羊膜上皮細胞的分離、培養(yǎng)、為了將來使用的深低溫保藏或誘導分化。按照Hu等所述，分娩后立即獲得一胎盤并從絨毛膜分離羊膜，例如通過解剖。羊膜上皮細胞按照標準的細胞分離技術從羊膜分離。該公開的細胞可以在各種培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)、在培養(yǎng)中增殖、冷藏或被誘導分化。Hu等公開了羊膜上皮細胞是全能造血干細胞(也可能是多能造血干細胞)，且能分化為上皮組織，如角膜表皮組織或陰道組織。然而，該方法的缺點是勞動密集，且干細胞的產(chǎn)率非常低。
現(xiàn)有的細胞群體的體外增殖方法也是勞動密集型的。例如，Emerson等(Emerson等，美國專利號6326198，題為“用于體內干細胞的復制、造血祖細胞培養(yǎng)的優(yōu)化以及增強人基質細胞的代謝、GM-CSF分泌和/或IL-6分泌的方法和組分”，公布于2001-12-04)公開了人干細胞分裂和/或人造血祖細胞的優(yōu)化的方法及體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基條件。按照所公開的方法，源于骨髓的人干細胞或祖細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其可被替換，優(yōu)選灌注培養(yǎng)，連續(xù)地或周期性地，以每毫升培養(yǎng)物1毫升培養(yǎng)基的速率，每約24小時至48小時為周期。在生理上可接受的條件下維持培養(yǎng)時，除去代謝產(chǎn)物，補充消耗的養(yǎng)分。
Kraus等(Kraus等，美國專利號6338942，題為“靶細胞群體的選擇性增殖”，公布于2002-01-15)公開了預定的靶細胞群體可選擇性地增殖，通過在生長培養(yǎng)基中引進源于臍帶血或外周血地起始標樣細胞，致使靶細胞群體分裂，以及在生長培養(yǎng)基中用選擇成分接觸細胞，包括對預定的細胞群體(如CD34細胞)有特定親和力的結合分子(例如CD34細胞的單集落抗體)，以在生長培養(yǎng)基中從其他細胞選擇出預定的靶細胞群體。
Rodgers等(美國專利號6335195題為“促進造血和間充質細胞增殖和分化的方法”公布于2002-01-01)公開了造血和間充質細胞體外培養(yǎng)以及通過在有血管緊張素原、血管緊張素I(AI)、AI同功異質體、AI片段和其類似物，血管緊張素II(AII)、AII同功異質體、AII片段和其類似物或AII AT2型2受體激動劑，單獨或與其他生長因子和細胞因子聯(lián)合存在下生長的譜系特異的細胞增殖和分化的誘導方法。該干細胞源于骨髓、外周血或臍帶血。然而，如上面所討論的，該方法的缺點是該體外誘導干細胞增殖和分化的方法耗時，也導致了干細胞的低產(chǎn)量。
干細胞和祖細胞具有用于治療多種病癥的潛能，包括惡性腫瘤、遺傳性代謝缺陷、血紅蛋白病及免疫缺陷。涉及源于臍帶血或胎盤的干細胞的運用或研究的一個主要領域為使用這些細胞生產(chǎn)少量細胞用于骨髓及其他相關的移植術。然而，迄今為止，沒人提出生產(chǎn)大量干細胞或祖細胞，如人CD34+或CD133+祖細胞的方法。尤其是，大量的后者細胞將使使用祖細胞的治療方法變的容易。在此，本發(fā)明公開的方法涉及該需求。
視黃醛衍生物，如維生素A和視黃酸(RA)，已知可影響干細胞的分化。例如，視黃酸已被用于抑制不規(guī)則定向(慢性骨髓性白血病)造血干細胞的增殖(Nadkarni等，1984，Tumori 70503-505)以及在前髓白血病細胞中誘導分化和自我更新潛能的喪失(Melchner等，1985，Blood 66(6)1469-1472)。視黃酸還被用于誘導源于胚胎干細胞的神經(jīng)元的分化以及抑制自發(fā)的中胚層分化(Slager等，Dev.Genet.1993，14(3)212-24，Ray等，1997，J.Biol.Chem.272(30)18702-18708)。視黃酸還進一步被用于誘導轉化的生殖細胞前體(Damjanov等，1993，Labor.Investig，68(2)220-232)、胎盤細胞前體(Yan等，2001，Devel.Biol.235422-432)、及內皮細胞前體(Hatzopoulos等，1998，Development 1251457-1468)的分化。然而，視黃醛衍生物在分化中的作用已十分了解，其可作為控制干細胞分化的調節(jié)手段而使用。
葉酸類似物，如氨基蝶呤和氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)在造血干細胞分化中的作用已得到研究。葉酸類似物作為化學療法試劑用于急性成淋巴細胞貧血和其他血增殖病癥及癌癥，且表明其通過殺光某類干細胞群體來影響干細胞的分化(DeLoia等，1998，Human Reproduction 13(4)1063-1069)，因此，不能成為用于調節(jié)給藥于患者的大量干細胞的分化的有效工具。
一些細胞因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL7、IL-11，與一些蛋白如促紅細胞生成素、Kit配體、M-CSF及GM-CSF，也已被顯示指導干細胞按造血譜系分化為特定細胞類型(Dushnik-Levinson等，1995，Biol.Neonate 6777-83)，但是，這些過程沒有得到充分了解并仍然太粗糙和不精確而不能作為控制干細胞分化的調節(jié)手段。
迄今為止，沒人描述化合物，如下述的免疫調節(jié)劑化合物在干細胞或前體細胞分化中的應用。尤其是，沒人證明這樣的化組合物調節(jié)祖細胞，如CD34+祖細胞，遠離樹突細胞譜系分化的用途，這種分化是用于提高移植免疫耐受性的有益能力。而且，沒人描述在此所述的化合物在為了生產(chǎn)含有該細胞的醫(yī)藥組合物而增殖祖細胞群體中的用途。該增殖的祖細胞培養(yǎng)物在治療移植物抗宿主病和免疫耐受性的提高中是有用的。因為控制干細胞和前體細胞分化可生產(chǎn)在治療上有效的細胞群體，因此，對于控制和調節(jié)髓樣樹突細胞譜系細胞，或早期祖細胞，如人CD34+或CD133+祖細胞的分化的能力有所需要，以控制樹突細胞和/或粒細胞的產(chǎn)生。
3.發(fā)明概述本發(fā)明提供了調節(jié)哺乳動物，特別是人干細胞或祖細胞分化的方法。具體地說，本發(fā)明的方法可用于調節(jié)和控制人干細胞沿著特定的細胞和組織譜系的分化和成熟。本發(fā)明包括影響該調節(jié)和控制的免疫調節(jié)小分子有機物，更優(yōu)選氨基取代的異吲哚啉化合物，尤其是ActimidTM或RevimidTM化合物的用途。本發(fā)明進一步涉及在特定時段這些化合物的給藥于祖細胞，以從特定途徑調節(jié)分化。
本發(fā)明的方法包括干細胞或祖細胞分化成特定細胞譜系的調控，這些細胞譜系包括但不限于，間質的、造血的、生脂的、生肝的、生神經(jīng)的、成膠質的、生軟骨的、生血管的、生肌的、生軟骨的或生骨的譜系。在特定的實施方案中，本發(fā)明的方法包括干細胞分化為造血譜系細胞的調控。
本發(fā)明還包括定向細胞成為特定細胞類型的調控，所述細胞類型是例如間充質細胞、造血細胞、脂肪細胞、肝細胞、成神經(jīng)細胞、成膠質細胞、軟骨細胞、內皮細胞(EC)祖細胞、肌細胞、軟骨細胞或成骨細胞。在特定的實施方案中，本發(fā)明包括定向造血祖細胞分化成紅細胞、血小板或白細胞(白血細胞)，如嗜中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿細胞、肥大細胞、B細胞、T細胞或漿細胞的調控。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及調節(jié)干細胞向造血譜系細胞，尤其是，CD34+、CD133+和CD45+造血譜系的分化，以及生產(chǎn)含有該細胞的預防或治療上有益的藥物組合物的方法。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及調節(jié)早期祖細胞向樹突細胞譜系、或粒細胞譜系、內皮細胞譜系或心肌細胞譜系的分化。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了調節(jié)祖細胞向造血細胞譜系，尤其是樹突細胞譜系或粒細胞譜系、內皮細胞譜系、神經(jīng)細胞譜系或心肌細胞譜系分化的方法。在具體的實施方案中，所述的祖細胞為CD34+或CD133+細胞。該調控通過在培養(yǎng)過程中用本發(fā)明的化合物接觸祖細胞而完成。在一個實施方案中，所述化合物為TNF-α活性抑制因子。在更具體的實施方案中，所述化合物是本文所述的免疫調節(jié)劑化合物，或沙利度胺，或更優(yōu)選地，為氨基取代的異吲哚啉化合物。在更進一步具體的實施方案中，所述化合物為ActimidTM或RevimidTM。
在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明的方法包括祖細胞分化為樹突細胞的抑制。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了調節(jié)在起始六天培養(yǎng)過程中的祖細胞分化的方法，其培養(yǎng)用于生產(chǎn)該祖細胞的增殖培養(yǎng)物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括對早期祖細胞發(fā)育成粒細胞的促進，該粒細胞可能對于抵抗感染是有效的。粒細胞譜系定向祖細胞(CD15+細胞)的增加在減輕中性白細胞減少癥和其隨后的感染并發(fā)癥中具有潛在的用途，該病癥代表了癌癥化學療法最普遍的劑量限制性毒性。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于抑制樹突細胞的分化，其對于緩和移植物抗宿主病的效應是有效的。
本發(fā)明的祖細胞，用本發(fā)明的化合物調節(jié)后，對于移植是有效的(即造血的恢復)，并可作為替代細胞和組織(如胰臟、心臟、肝臟、腎臟、肝、腦、肺、膀胱、腸或肌肉細胞)的可再生來源用于治療正常的衰老、損傷或疾病如心臟病、中風、帕金森病和阿爾茨海默病中的再生藥物。該細胞在測定介導本發(fā)明的化合物的作用的胞內生化途徑中也是有用的。這些細胞對于篩選新的藥物和毒素也是有用的，例如，用于確定抗癌藥物的潛能，理解出生缺陷的起因等。
本發(fā)明的方法可用于特異性地抑制紅血細胞或紅細胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同時增加白細胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高總的集落形成單位的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法不僅可用于調節(jié)干細胞和祖細胞如CD34+祖細胞的分化，還可用于刺激集落形成率，通過提高骨髓移植物移入速度而給造血干細胞移植提供重要的幫助。
任何哺乳動物干細胞可按照本發(fā)明的方法而使用，包括但不限于，從臍帶血、胎盤及其他來源分離的干細胞。干細胞可以從任何哺乳動物種類中分離，例如，大鼠、小鼠、兔、豚鼠、狗、貓、豬、羊、牛、馬、猴等，更優(yōu)選地，人。干細胞可包含多能細胞，即，具有完全的分化多樣性、能自我更新以及在組織中維持休眠或靜止的細胞。干細胞還可以包括多潛能性細胞或定向祖細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明利用活的、靜止的、多能性的干細胞，其存在于或隨后產(chǎn)生于足期的胚胎，就是說，該細胞可隨著成功的分娩和胎盤娩出、放血和胎盤灌注而得到回收，致使多達十億個有核細胞的產(chǎn)生和回收，其有核細胞產(chǎn)生50至100百萬的多潛能性或多能性干細胞。該細胞作為人胎盤干細胞或胚胎樣干細胞在此提及。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，細胞，例如骨髓或產(chǎn)后灌注的胎盤的內源性細胞，包括但不限于，胚胎樣干細胞、祖細胞如CD34+或CD133+細胞、多能細胞或多潛能細胞，暴露于本發(fā)明的化合物并受到誘導分化。該內源性細胞可在體外繁殖。在另一個實施方案中，內源性細胞可從胎盤和培養(yǎng)基中收集得到，并在體外適當?shù)臈l件下培養(yǎng)，且培養(yǎng)一段時間至足以按期望的細胞類型或譜系來誘導分化。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，干細胞或祖細胞源自其它來源如臍帶血、外周血或成人血，并暴露于本發(fā)明的化合物中被誘導分化。在一個優(yōu)選的實施方案中，分化在體外合適的條件下進行一段時間，所述時間足以誘導向所期望的細胞系或細胞類型分化。本發(fā)明的化合物用于通過添加，在原位產(chǎn)生或其他任何允許干細胞或祖細胞與本發(fā)明的化合物接觸的方式用于分化介質/培養(yǎng)基中。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物給藥的時間對CD34+祖細胞的分化有極深的影響。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，CD34+祖細胞分化為樹突細胞通過一種包括使祖細胞在第一天培養(yǎng)時接觸本發(fā)明的化合物的方法而得到延遲或抑制。在另一個實施方案中，從CD34+祖細胞來的CD1a+細胞的發(fā)育通過一種包括使所述祖細胞在第一天培養(yǎng)時接觸本發(fā)明的化合物的方法而得到降低或阻礙。在另一個實施方案中，源于CD34+祖細胞的CD1a+細胞群體的持久性通過在無本發(fā)明的化合物存在下培養(yǎng)所述祖細胞六天后接觸該化合物而得到提高。
本發(fā)明還包括調節(jié)早期祖細胞如人CD34+和CD133+細胞分化的方法，包括使祖細胞在增殖和分化期間的不同時間與一種或多種本發(fā)明的化合物接觸。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種調節(jié)祖細胞分化的方法，包含使所述細胞僅在培養(yǎng)第一天與本發(fā)明的一種或多種化合物接觸。在另一個實施方案中，所述細胞與所述化合物在培養(yǎng)的第一天至第12天中任何一天以一次劑量接觸。在另一個實施方案中，所述細胞在0至12天，包括0天和12天的不同天數(shù)中至少和所述化合物接觸兩次。仍在另一個實施方案中，所述細胞在增殖和/或分化時期與一種或多種化合物接觸一天兩次、一天一次或隔一天一次。在另一個實施方案中，所述接觸在體外進行。仍在另一個實施方案中，所述接觸在受治療者體內進行。在一個更具體的實施方案中，所述受治療者是人、非人的哺乳動物、鳥類或爬行動物。
總而言之，可在產(chǎn)后灌注的胎盤中培養(yǎng)的內源性或外源性干細胞或祖細胞暴露于本發(fā)明的化合物可以在這些細胞被培養(yǎng)于產(chǎn)后灌注的胎盤發(fā)生，或優(yōu)選地，可以將在體外細胞從胎盤中回收或移去后發(fā)生。
本發(fā)明包括具有TNF-α活性的化合物作為干細胞和/或祖細胞發(fā)育調節(jié)劑的用途。在一個具體的實施方案中，該化合物為免疫調節(jié)劑化合物，如已知的IMiDsTM類的化合物，包括但不限于沙利度胺類似物、ActimidTM(Celgene Corp.，Warren，NJ)及RevimidTM(CelgeneCorp.，Warren，NJ)。
本發(fā)明還包括經(jīng)預處理的干細胞或祖細胞用于治療和預防疾病的移植。在一個實施方案中，一需要移植的患者在移植前、中間和/或移植后菌給予化合物的藥物。
本發(fā)明進一步包括由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的祖細胞或特定類型細胞的用途。換言之，本發(fā)明包括由造血祖細胞分化制得的白細胞、粒細胞或樹突細胞的用途，其中所述祖細胞分化用本發(fā)明的化合物調節(jié)或調控。
在另一個實施方案中，本發(fā)明包括干細胞的控制或調控，通過在體內以干細胞和本發(fā)明的小分子化合物給藥于其所需的患者。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含CD34+或CD133+祖細胞和可藥用載體的藥物組合物，其中所述祖細胞已經(jīng)在培養(yǎng)的前6天在促進所述祖細胞增殖和分化的條件下與本發(fā)明的化合物，尤其是移植TNF-α活性的化合物接觸。在一個具體的實施方案中，藥物組合物包含六天培養(yǎng)后收集和深低溫保藏的細胞。在另一具體的實施方案中，藥物組合物中的細胞為CD34+CD38-CD34-或CD34+CD38-CD34+細胞。在另一個具體的實施方案中，與細胞接觸的化合物為本發(fā)明的免疫調節(jié)劑化合物，或沙利度胺或沙利度胺類似物。在另一個具體的實施方案中，與細胞接觸的化合物為ActimidTM或RevimidTM。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了制備藥物組合物的方法，包括用抑制TNF-α活性的化合物接觸CD34+或CD133+祖細胞，其中所述祖細胞在允許增殖的培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)了六天，其中所述祖細胞在允許所述祖細胞增殖和分化的培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)了六天；在培養(yǎng)六天后收集所述細胞；以及將可藥用的載體與所述細胞組合。在該方法的一個具體實施方案中，所述接觸在培養(yǎng)第一天進行。在該方法的另一個具體實施方案中，所述接觸在所述的六天培養(yǎng)中至少進行兩次。在該方法的另一個具體實施方案中，所述化合物為本發(fā)明的小分子免疫調節(jié)劑化合物。在另一個具體實施方案中，與細胞接觸的化合物為ActimidTM或RevimidTM。在仍是該方法的另一個具體實施方案中，所述祖細胞在所述培養(yǎng)前已從其他的血細胞中分離。在該方法的另一個具體實施方案中，所述培養(yǎng)基另外還包含GM-CSF和TNF-α。在該方法的另一個更具體實施方案中，所述ActimidTM或RevimidTM以0.1μM至10.0μM的濃度存在。在該方法的另一個更具體實施方案中，所述ActimidTM或RevimidTM以1.0μM的濃度存在。在該方法的另一個具體實施方案中，將所述細胞在收集后進行深低溫保藏。
本發(fā)明進一步提供在哺乳動物受治療者中增殖祖細胞群體的方法，包括給藥以治療上有效量的CD34+或CD133+祖細胞和ActimidTM或RevimidTM于所述受體哺乳動物受治療者。在該方法的具體實施方案中，所述祖細胞在受體哺乳動物受治療者中分化。在該方法的另一個具體實施方案中，所述祖細胞以基本上無紅血細胞的細胞制備物形式給藥于所述受治療者。在該方法的另一個具體實施方案中，所述祖細胞以包含骨髓細胞、胎盤細胞、臍帶血細胞或PBMC的細胞制備物形式給藥于受體哺乳動物受治療者。在該方法的另一個具體實施方案中，所述祖細胞以與載體聯(lián)合的形式給藥于受體哺乳動物受治療者。在該方法的另一個具體實施方案中，所述祖細胞為CD34+CD133+祖細胞。在該方法的另一個具體實施方案中，所述祖細胞表達摻入的目的遺傳材料。
本發(fā)明還提供由上述方法制備的作為藥物組合物的細胞。
仍在另一個實施方案中，本發(fā)明包括在深低溫保藏和融化后調節(jié)干細胞或祖細胞例如CD34+祖細胞，以消除深低溫保藏和暴露于冷凍保藏劑對于干細胞的有害影響的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了在深低溫保藏和融化后調節(jié)干細胞，以消除暴露于冷凍保藏劑(例如，DMSO)而對干細胞增殖和遷移能力的有害影響的方法。
3.1定義如本文所用的，術語“生物反應器”是指用于繁殖細胞、生產(chǎn)或表達生物材料以及生長或培養(yǎng)細胞組織、類器官、病毒、蛋白、多核苷酸和微生物的體外系統(tǒng)。
如本文所用的，“DC細胞”是指樹突細胞。
如本文所用的，“早期祖細胞”是指CD34+祖細胞、CD133+祖細胞或哺乳動物、禽類或爬行類中的任一等效物。
如本文所用的，術語“胚胎干細胞”是指源于囊胚泡(例如4-5天的人胚胎)內生細胞團的細胞，且具有多能性。
如本文所用的，術語“胚胎樣干細胞”是指非源于囊胚泡內生細胞團的細胞。如本文所用的，“胚胎樣干細胞”還可能是指“胎盤干細胞”。優(yōu)選胚胎樣干細胞是多能性的。然而，可以從胎盤獲得的干細胞包括胚胎樣干細胞、多潛能性細胞及定向祖細胞。按照本發(fā)明的方法，源于胎盤的胚胎樣干細胞可從分離的胎盤中收集，其經(jīng)過了一段時間的放血和灌注，足以除去殘留細胞。優(yōu)選地，胚胎樣干細胞是人源的，雖然可來源于任何哺乳動物。
如本文所用的，術語“放血的”或“放血”，當與胎盤相關使用時，是指從胎盤除去和/或排出基本上所有的臍帶血。按照本發(fā)明，胎盤放血可通過，例如，但并不由此限定，排出、重力誘導的流出、按摩、擠壓、抽吸等等而完成。在一個優(yōu)選的實施方案中，胎盤的放血可進一步通過灌注、漂洗或用含或不含試劑，如抗凝劑的液體沖洗胎盤，以助于胎盤的放血而完成。
如本文所用的，術語“灌注”或“灌注法”是指透過器官或組織流出或排出液體，優(yōu)選地，透過器官或組織的液體的排出具有足夠的力量或壓力以除去任何殘留細胞，即，源于器官或組織的非粘附細胞。如本文所用的，術語“灌注液”是指隨著從器官或組織排出而收集的液體。在一個優(yōu)選的實施方案中，灌注液包含一種或多種抗凝劑。
如本文所用的，術語“內源細胞”指一種“非外源”細胞，即，一種自身的或自體同源的細胞，它源于胎盤。
如本文所用的，術語“外源細胞”是指“外來的”細胞，即，異種細胞(即，源于非胎盤供體來源的“非自我”細胞)或源于非胎盤的器官或組織的自體同源細胞(即，源于胎盤供體的“自我細胞”)。
如本文所用的，術語“免疫調節(jié)劑化合物”是指下文5.3節(jié)公開的化合物。
如本文所用的，術語“類器官”是指以表面外觀形式或如任何器官或哺乳動物體，優(yōu)選人體的腺體的實際結構形式裝配的一種或多種細胞類型的聚集體。
如本文所用的，術語“多潛能性細胞”是指具有生長為哺乳動物體約260種細胞類型任一亞類的能力的細胞。不同于多能性細胞，多潛能性細胞不具有形成所有細胞類型的能力。
如本文所用的，術語“多能性細胞”是指具有完全分化多樣性的細胞，即，生長為哺乳動物體約260種細胞類型的能力。多能性細胞可自我更新，且能在組織中維持休眠或靜止。不同于全能性細胞(例如，受精的二倍體卵細胞)，胚胎樣干細胞通常不能形成新的囊胚泡。
如本文所用的，術語“祖細胞”是指定向分化為特定細胞類型或形成特定組織的細胞。
如本文所用的，術語“干細胞”是指能不確定地再生而形成組織和器官的限定細胞的標準細胞。干細胞是在發(fā)育上具有多能性或多潛能性的細胞。一個干細胞可分裂產(chǎn)生兩個子代干細胞，或一個子代干細胞和一個祖(轉變)細胞，其隨后增殖為組織的成熟的、完全形態(tài)的細胞。
如本文所用的，術語“全能性細胞”是指能形成一個完整胚胎(例如，一個囊胚泡)的細胞。
4.附圖簡述

圖1.柱狀圖顯示了在沙利度胺(THD)、ActimidTM和RevimidTM以濃度1μg/ml和10μg/ml存在下培養(yǎng)臍帶血CD34+細胞的結果。等體積的DMSO作為陰性對照。紅細胞造血爆發(fā)集落形成單位(BFU-E)、紅細胞集落形成單位(CFU-E)、粒巨噬系集落形成單位(CFU-GM)和集落總數(shù)(CFU-Total)在光學顯微鏡下記錄。Y-軸集落數(shù)。詳見6.1節(jié)。
圖2(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM抑制了紅細胞的生成和CD34+CD38-細胞的增殖。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.沙利度胺(“Thal”)(5μg/ml)。E.ActimidTM(5μg/ml)。F.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸Gly-A(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD34(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.1節(jié)。
圖3(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM抑制了在有細胞因子IL3、KL和G-CSF下培養(yǎng)14天的人臍帶血CD34+細胞中CXCR4的表達。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，CD45+細胞。C.DMSO(0.3μg/ml)。D.Thal(0.3μg/ml)。E.ActimidTM(0.3μg/ml)。F.RevimidTM(0.3μg/ml)。X-軸CD34(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CXCR4(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.2節(jié)。
圖4(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM刺激了CD34+和/或CD34+CD38-細胞群體的增殖。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(0.3μg/ml)。D.Thal(0.3μg/ml)。E.ActimidTM(0.3μg/ml)。F.RevimidTM(0.3μg/ml)。X-軸CD38(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD34(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.2節(jié)。
圖5(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM產(chǎn)生了人臍帶血祖細胞的重要的保存。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.ActimidUTM(5μg/ml)。F.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CD38(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD34(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.2節(jié)。
圖6(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM抑制了CD45+細胞的CXCR4的表達和增殖了CD45+細胞群體。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.ActimidTM(5μg/ml)。F.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CD45(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CXCR4(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.2節(jié)。
圖7(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM產(chǎn)生了CD34+祖細胞數(shù)量上的增殖以及提高了粒細胞和單核細胞的產(chǎn)量。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.ActimidTM(5μg/ml)。F.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CD11b(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD34(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.2節(jié)。
圖8(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM增殖了CD34+祖細胞以及消除了DMSO介導的單核細胞產(chǎn)量的抑制。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.ActimidTM(5μg/ml)。F.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CD14表達(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD34(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.3節(jié)。
圖9(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM顯示了在分化為B細胞上的較小的抑制效應。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.ActimidTM(5μg/ml)。F.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CD38(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD19(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.3節(jié)。
圖10(A-F).流式細胞圖。人臍帶血CD45+細胞暴露于ActimidTM和RevimidTM克服了由暴露于DMSO而產(chǎn)生的CXCR5的抑制。臍帶血CD45+細胞在有細胞因子IL3、IL6、G-CSF、Epo和KL下培養(yǎng)14天。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.Thal(5μg/ml)。E.ActimidTM(5μg/ml)。F.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CXCR5(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD34(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.3節(jié)。
圖11(A-E).流式細胞圖。人臍帶血單核細胞(MNCs)暴露于ActimidTM和RevimidTM提高了CD34+CD38+細胞群體數(shù)。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.ActimidTM(5μg/ml)。E.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CD38(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CD34(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.3節(jié)。
圖12(A-E).流式細胞圖。MNCs暴露于ActimidTM和RevimidTM下調CXCR4+CD45+細胞群體數(shù)，但高了CXCR4+CD45-細胞群體數(shù)。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.對照，不加化合物。C.DMSO(5μg/ml)。D.ActimidTM(5μg/ml)。E.RevimidTM(5μg/ml)。X-軸CD45(FL1-H)染色的相對強度。Y-軸CXCR4(FL2-H)染色的相對強度。詳見6.3節(jié)。
圖13(A-E).流式細胞圖。沙利度胺、ActimidTM和RevimidTM在造血祖細胞向臍帶血成分的有核細胞分化的譜系定向化上的影響。流式細胞圖顯示ActimidTM和RevimidTM與對照相比提高了單核譜系細胞的百分比，表明存在分化的調節(jié)，其轉向引起淋巴樣和髓樣細胞的譜系。A.對照，免疫球蛋白(Ig)。B.DMSO(5μg/ml)。C.Thal(5μg/ml)。D.ActimidTM(5μg/ml)。E.RevimidTM(5μg/ml)。詳見6.4節(jié)。
圖14.ActimidTM對CD34+細胞分化和成熟為DC細胞的影響的研究略圖。在增殖和成熟期(第1天至第12天)或成熟期(第6天至第12天)，CD34+細胞在1.0μM ActimidTM和DMSO(二甲基亞砜)存在或缺乏的條件下培養(yǎng)。在第6天或第12天用FITC和PE綴合的單克隆抗體對免疫組織化學標記進行測試。詳見6.6節(jié)。
圖15(A-D).流式細胞圖顯示了6天的CD34+細胞的表型特征，從第1天起暴露于ActimidTM。ActimidTM幾乎完全抑制了CD86+CD1+細胞的發(fā)育。細胞用CD1aFITC和CD14PE或CD1aFITC和CD86PE雙標記。A用DMSO(對照)處理的CD34+細胞產(chǎn)生的CD86+CD1+細胞。B用DMSO(對照)處理的CD34+細胞產(chǎn)生的CD14+CD1+細胞。C用ActimidTM處理的CD34+細胞產(chǎn)生的CD86+CD1+細胞。D用ActimidTM處理的CD34+細胞產(chǎn)生的CD14+CD1+細胞。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定定重組標記的細胞群體的百分比。詳見6.6節(jié)。
圖16(A-D).流式細胞圖顯示了在CD34+細胞增殖期(第1天至第6天)暴露于ActimidTM在第6天的影響。暴露于ActimidTM的CD34+CD38細胞在6天后分化為CD34+CD38-CD33+細胞。細胞用CD33FITC和CD83PE或CD38PE和CD34PE雙標記。A細胞用DMSO處理，且對CD34和CD38標記。B細胞用DMSO處理，且對CD83和CD33標記。C細胞用ActimidUTM處理，且對CD34和CD38標記。D細胞用處理。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞群體的百分比。詳見6.6節(jié)。
圖17.從培養(yǎng)的第0天至第6天ActimidTM誘導CD34+細胞來源的細胞群體的轉變。從第0天至第6天細胞在不同濃度ActimidTM下培養(yǎng)，然后用CD34和CD38或CD1a和CD14雙標記。ActimidTM在CD34+CD38-細胞中引起顯著的提高，在CD1a+CD14-細胞中引起降低。詳見6.6節(jié)。
圖18.在不同時間用ActimidTM處理的CD34+細胞在第6天的表型改變。細胞接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)6天。用ActimidTM僅從第0天至第1天、僅第0天至第2天、僅第0天至第3天、僅第0天至第4天、僅第0天至第5天或第0天至第6天處理細胞。對于少于6天的溫育，ActimidTM在指示的那天洗去，且細胞重懸于DMSO中。在第6天，細胞用CD34和CD38或CD1a和CD14標記。詳見6.6節(jié)。
圖19(A-B).用單劑量或多劑量的ActimidTM處理的CD34+祖細胞在第6天的表型改變。圖19A條件1在第0天單劑量ActimidTM；條件2在第0天和第4天給藥ActimidTM；條件3在第0天、第2天和第4天給藥ActimidTM。Y軸表示表達特定標記或重組標記的細胞的百分比。圖19B條件1在第0天單劑量ActimidTM；條件2在第0天、第4天、第6天、第8天給藥ActimidTM；條件3在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天給藥ActimidTM。細胞由CD11c和CD15的表達而估定，其為粒細胞標記。Y軸表示與ActimidTM或DMSO(對照)接觸的CD11c+CD15-和CD11c-CD15+細胞的百分比。詳見6.6節(jié)。
圖20(A-F).從第1天至第12天暴露于ActimidTM(1μM)的CD34+細胞產(chǎn)生的樹突細胞在第12天的流式細胞圖。與對照相比ActimidTM在第12天引起CD86和CD80分子共刺激的降低。細胞用CD1aFITC和CD86PE抗體、CD1aFITC和CD80PE抗體或CD1aFITC和CD14PE抗體雙標記。A細胞用DMSO處理，且在第12天對CD86和CD1a染色。B細胞用DMSO處理，且在第12天對CD80和CD1a染色。C細胞用DMSO處理，且在第12天對CD14和CD1a染色。D細胞用ActimidTM處理，且在第12天對CD86和CD1a染色。E細胞用ActimidTM處理，且在第12天對CD80和CD1a染色。F細胞用ActimidTM處理，且在第12天對CD14和CD1a染色。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞的百分比。詳見6.6節(jié)。
圖21(A-D).從第1天至第12天暴露于ActimidTM(1μM)的CD34+細胞產(chǎn)生的樹突細胞在第12天的流式細胞圖。暴露于ActimidTM導致CD54粘附分子表達的改變，相對于對照(與圖21D中次屏板E和F比較)，引起CD54bright表達的降低和CD54dim表達的提高。A細胞用DMSO處理，且用IgG1對HLA-DR染色。B細胞用DMSO處理，且對CD54和CD40染色。C細胞用ActimidTM處理，且用IgG1對HLA-DR染色。D細胞用ActimidTM處理，且對CD54和CD40染色。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞的百分比。詳見6.6節(jié)。
圖22(A-B).ActimidTM促進從CD34+祖細胞的粒細胞分化。在DMSO(圖22A)或ActimidTM(圖22B)下生長12天，然后用粒細胞分子標記CD15的抗體標記的CD34+細胞的流式細胞圖。每張細胞圖上顯示的百分比表示表達特定重組標記的細胞的百分比。詳見6.6節(jié)。
圖23(A-D).ActimidTM并不誘導CD1a+或CD14+前體細胞的凋亡。CD1a+CD14-和CD1a CD14+分離細胞(DC祖細胞)的流式細胞圖。CD34+祖細胞在SCF、Fit-3L、GM-CSF和TNF-α下經(jīng)過6天的培養(yǎng)。在第6天，通過磁性細胞分選器(Miltenyi)收集CD1a+CD14-和CD1a-CD14+細胞，在存在GM-CSF和TNF-α以及存在或不存在ActimidTM(1μM)的條件下培養(yǎng)CD1a+CD14-和CD1a-CD14+細胞群額外2天。凋亡細胞隨后用膜聯(lián)蛋白V-FITC，一種凋亡的標記，染色，與碘化丙錠(PI)，一種活性探針，聯(lián)合使用。每張細胞圖上的百分比表示對膜聯(lián)蛋白V-FITC和/或碘化丙錠染色陽性的細胞的百分比。對膜聯(lián)蛋白V-FITC陽性的細胞數(shù)量與ActimidTM處理的和對照的細胞(尤其與每張細胞圖中的B3和B4比較)作比較。A用DMSO處理的CD1a+CD14-細胞。B用ActimidTM處理的CD1a+CD14-細胞。C用DMSO處理的CD1a-CD14+細胞。D用ActimidTM處理的CD1a-CD14+細胞。詳見6.6節(jié)。
圖24(A-D).在由ActimidTM存在或缺乏下生長12天的CD34+細胞的流式細胞圖。ActimidTM引起甘露糖受體介導的胞飲作用的降低，其與DMSO對照比較，通過FITC標記的右旋糖酐攝取的降低而得到證明。ADMSO和4℃。BActimidTM和4℃。CDMSO和37℃。DActimidTM和37℃。每張細胞圖上的百分比表示呈現(xiàn)胞飲作用的細胞分數(shù)。詳見6.6節(jié)。
圖25(A-D).培養(yǎng)12天的CD34+細胞的流式細胞圖，且從第6天至第12天在存在或缺乏ActimidTM下培養(yǎng)。在第1至5天ActimidTM缺乏下培養(yǎng)后，在第6至12天ActimidTM存在下培養(yǎng)，與DMSO對照相比，導致甘露糖受體介導的胞飲作用。每張細胞圖上的百分比表示呈現(xiàn)胞飲作用的細胞分數(shù)。ADMSO和4℃。BActimidTM和4℃。CDMSO和37℃。DActimidTM和37℃。詳見6.6節(jié)。
圖26.ActimidTM降低培養(yǎng)12天的CD34+細胞呈遞抗原的能力。CD34+細胞在存在或缺乏ActimidTM下培養(yǎng)12天；ActimidTM處理的細胞，在第12天，與DMSO對照比較顯示基本上降低的刺激作用指標。
圖27.對從第6天至第12天在ActimidTM存在下培養(yǎng)的CD34+細胞，ActimidTM具有抗原呈遞細胞(APC)減少的活性。CD34+細胞在存在或缺乏ActimidTM下培養(yǎng)5天。處理過的細胞的抗原呈遞能力與對照，DMSO處理的細胞作比較。詳見6.6節(jié)。
圖28.在GM-CSF和TNF-α存在下培養(yǎng)的CD34+造血祖細胞的分化途徑。
圖29.顯示以ActimidTM對于在GM-CSF和TNF-α存在下培養(yǎng)的CD34+造血祖細胞的分化途徑的效果的總結圖表。詳見6.6節(jié)。
圖30.顯示鼠Sca+Lin-造血祖細胞成熟條件的圖表。細胞在存在干細胞因子(SCF)、Flt-3L、粒巨噬集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬集落刺激因子(MCSF)及0.1％DMSO(對照)下生長9天，10μM ActimidTM或10μM全反式視黃酸(ATRA)用以驅動細胞向DC前體細胞表型分化。細胞隨后從第9天至第12天在GM-CSF和TNF-α存在下培養(yǎng)，加入DMSO、ActimidTM或ATRA，以驅動鼠細胞向未成熟的樹突細胞的分化。詳見6.8節(jié)。
圖31(A-E).鼠細胞在普通培養(yǎng)條件下第9天出現(xiàn)(見實施例1，材料和方法，圖30的描述)。細胞用CD80的抗體(圖31A)、CD11的抗體(圖31B)、CD32/16的抗體(圖31C)、MHCII(I-Ab)的抗體(圖31D)、CD14的抗體(圖31E)或Gr-1的抗體(圖31F)標記。細胞在第9天呈現(xiàn)出被CD88、CD11或CD32/16分子標記的抗體標記上，被I-Ab分子標記的抗體少許標記上，未被CD14或Gr-1分子標記的抗體標記上。詳見6.8節(jié)。
圖32(A-I).用DMSO、ActimidTM或ATRA處理的鼠細胞第12天的流式細胞圖。細胞用CD86和CD11b的抗體標記。圖32A-32C(頂行)細胞圖顯示用DMSO(對照)、ActimidTM或全反式視黃酸(ATRA)處理時表達CD86(Y-軸)的細胞百分數(shù)。圖32D-32F(中間行)在如頂行處理時，表達主要的組織相容性復合物II(MHC-II)的細胞百分數(shù)。圖32G-32I(底行)在如頂行處理時，表達CD11b的細胞百分數(shù)。詳見6.8節(jié)。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明部分基于意外的發(fā)現(xiàn)，即干細胞或祖細胞暴露于本發(fā)明的化合物致使產(chǎn)生一種控制干細胞或祖細胞向特定祖細胞群體分化或祖細胞向特定細胞類型，如樹突細胞、粒細胞、內皮細胞或神經(jīng)細胞分化的可調控的方法。尤其是，干細胞或祖細胞暴露于本發(fā)明的化合物致使產(chǎn)生造血細胞特定群體，包括CD34+、CD38+和CD133+細胞的可調控的分化和增殖。這種分化的調控在沒有因細胞死亡或分化為不需要的細胞類型或細胞譜系而造成產(chǎn)量的顯著損失的情況下完成；換言之，本發(fā)明的化合物沒有引發(fā)一種或多種細胞群體的凋亡。進一步地，造血祖細胞暴露于本發(fā)明的化合物導致特定細胞類型的可調控的分化和增殖。
因此，本發(fā)明提供調節(jié)人干細胞分化的方法，特別是CD34+造血祖細胞和CD133+祖細胞的分化。尤其是，本發(fā)明提供使用抑制TNFα活性的小的有機分子調節(jié)祖細胞沿著特定細胞和組織譜系分化的方法。進一步地，本發(fā)明包括增殖早期祖細胞，如人CD133+或CD34+細胞，尤其是CD34+CD38-細胞，以移植入哺乳動物、鳥類或爬行動物中的方法，包括將造血祖細胞暴露于TNF-α抑制劑或拮抗劑，其中抑制劑或拮抗劑是小分子物質。本發(fā)明還提供了從這些早期祖細胞產(chǎn)生其他類型細胞的方法，包括但不限于腦細胞、腎細胞、腸道細胞和肌肉細胞。本發(fā)明的化合物還對抑制從早期祖細胞，如人CD34+祖細胞的樹突細胞分化以及促進粒細胞的分化起作用。
與本發(fā)明相關地使用的小分子化合物的實例包括但不限于，抑制TNF-α活性的化合物。在本發(fā)明的方法中使用的化合物在5.3節(jié)詳細描述。在一個實施方案中，雖然也使用沙利度胺水解產(chǎn)物、代謝物和前體，優(yōu)選的化合物為沙利度胺類似物。在特別優(yōu)選的實施方案中，化合物為ImiDsTMU(Celgene)，如ActimidTM和RevimidTM。
本發(fā)明的方法包括干細胞或祖細胞向特定細胞譜系分化的調控，包括但不限于間充質的、造血的、生脂的、生肝的、生神經(jīng)的、成膠質的、生軟骨的、生血管的、生肌的、生軟骨的或成骨的譜系，其包括優(yōu)選在體外將干細胞或祖細胞和本發(fā)明的化合物溫育足夠的一段時期，致使細胞向期望的細胞譜系的細胞分化。在一個具體的實施方案中，干細胞或祖細胞向造血譜系細胞的分化受到調節(jié)。具體地說，本發(fā)明的方法可用于以一種劑量相關的方式調節(jié)由CD34+、CD133+和CD45+造血祖細胞生成血細胞集落的發(fā)生。
本發(fā)明的方法還包括CD34+祖細胞向樹突細胞分化的調節(jié)，其包括優(yōu)選在體外將祖細胞和本發(fā)明的化合物溫育足夠長的一段時期，致使細胞向期望的細胞譜系的細胞分化。在一個具體的實施方案中，該祖細胞向樹突細胞譜系細胞的分化通過將所述細胞接觸ActimidTM或RevimidTM或其類似物或前藥而調節(jié)。在另一個具體的實施方案中，CD34+祖細胞的分化得到調節(jié)以抑制沿著髓樣譜系的分化并支持沿著粒細胞譜系的分化。在一個更具體的實施方案中，CD34+祖細胞向粒細胞譜系細胞的分化通過包括將CD34+祖細胞和本發(fā)明的化合物在對祖細胞培養(yǎng)的第1天接觸的方法而調節(jié)。
任何哺乳動物干細胞或祖細胞可以按照本發(fā)明的方法使用，包括但不限于，從臍帶血(“CB”細胞)、胎盤和其他來源分離的干細胞。干細胞可包括多能性細胞，即，具有完全的分化多樣性、能自我更新以及在組織中維持休眠或靜止的細胞。干細胞還可包括多潛能性細胞和定向祖細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明利用活的、靜止的、多能性的干細胞，其存在于足期的胚胎中，可隨著導致多潛能性和多能性干細胞的回收的成功的分娩和胎盤娩出、放血和胎盤灌注而得以回收。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，祖細胞為早期祖細胞，尤其是CD34+或CD133+細胞。優(yōu)選地，CD34+或CD133+祖細胞來源于人骨髓、胎盤或臍帶血。從其他哺乳動物來源的這些細胞的等效物也可使用。例如，在小鼠中，Sca+祖細胞可在本發(fā)明的方法中使用。從鳥類或爬行動物來源的等效的早期祖細胞也可使用。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，胎盤內生性的或通過產(chǎn)后灌注胎盤產(chǎn)生的細胞，包括但不限于，胚胎樣干細胞、祖細胞、多能性細胞和多潛能性細胞，在分離的和灌注的胎盤中培養(yǎng)時暴露于本發(fā)明的化合物，且誘導分化。在產(chǎn)后灌注的胎盤中繁殖的內生性細胞可以進行回收，和/或生物活性分子可從灌注液、培養(yǎng)基或從胎盤細胞自身進行回收。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將源于除了后胎盤的其它來源的干細胞或祖細胞在體外培養(yǎng)時暴露于本發(fā)明的化合物并且進行誘導分化。因此，本發(fā)明包括使哺乳動物干細胞分化為特定祖細胞的方法，其包括使干細胞在適于期望的分化的條件和/或培養(yǎng)基的情況下以及在本發(fā)明的化合物存在的情況下將干細胞進行分化。
進一步地，本發(fā)明包括調節(jié)或調控特定祖細胞群體向特定細胞類型分化的方法，其包括使所述祖細胞在適合所述分化的條件下以及在一種或多種本發(fā)明的化合物存在下進行分化?？蛇x擇地，干細胞或祖細胞可暴露于本發(fā)明的化合物，隨后用合適的條件進行分化。合適條件的實例包括用人血清和細胞培養(yǎng)基質補充的營養(yǎng)培養(yǎng)基制劑，如用生長因子補充的MATRIGEL_。
本發(fā)明的方法還涉及不同的細胞群體，其可通過用本發(fā)明的化合物在培養(yǎng)的不同時期，無論是增殖或分化期接觸祖細胞而產(chǎn)生。參見5.4節(jié)，具體為下面的5.4.2節(jié)。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了使用酰胺和酰亞胺小分子，尤其是沙利度胺的氨基結合物來調節(jié)和調控在造血祖細胞移植前調節(jié)時期的血細胞生成的方法。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的小分子物質來調節(jié)和調控在先體外后體內造血祖細胞調節(jié)時期的血細胞生成的方法。本發(fā)明的方法包括干細胞或祖細胞體外分化的調控，包括體外溫育化合物和干細胞或祖細胞，隨后向受治療者直接移植分化的細胞。
本發(fā)明還包括通過將干細胞或祖細胞以及本發(fā)明的化合物給藥于其有需求的患者而在體內對干細胞或祖細胞的控制和調控。
本發(fā)明進一步包括預處理的干細胞或祖細胞的移植以治療或預防疾病。在一個實施方案中，對需要移植的患者在移植前、移植中和/或移植后給藥以本發(fā)明的化合物。在另一個實施方案中，還對需要移植的患者給藥未經(jīng)處理的干細胞或祖細胞，例如臍帶血細胞、成人血細胞、外周血細胞或骨髓細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括對受治療者給藥以化合物，所述受治療者為未調節(jié)的干細胞或祖細胞的受體，以誘發(fā)出對已移植的干細胞的調節(jié)效應。
在某些實施方案中，本發(fā)明包括骨髓移植，其包括移植臍帶血(或從臍帶血獲得的干細胞)、外周(即，成體)血(或從外周血獲得的干細胞)，其中所述臍帶血或干細胞已用本發(fā)明的化合物預處理過。另外，本發(fā)明包括由在本發(fā)明的化合物存在下已分化的造血祖細胞制得的白細胞的用途。例如，通過分化造血祖細胞而產(chǎn)生的白細胞可用于移植或可在移植前與臍帶血或臍帶血干細胞混合。
在其它的實施方案中，本發(fā)明包括骨髓移植，其包括按照本發(fā)明的方法獲得的早期祖細胞，如CD34+或CD133+祖細胞的移植，其中所述祖細胞已用本發(fā)明的化合物預處理過。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述樹突細胞的前體細胞為CD34+CD38-CD33+或CD34+CD38-CD33-前體細胞。進一步地，本發(fā)明包括由已在本發(fā)明的化合物存在下分化的CD34+祖細胞制得的細胞的用途。例如，通過CD34+祖細胞的分化而用本發(fā)明的化合物產(chǎn)生的CD34+CD38-CD33+前體細胞、CD34+CD38-CD33-前體細胞、粒細胞等，可用于移植中。用本發(fā)明的化合物從CD133+細胞分化來的細胞也為本發(fā)明所包括。
本發(fā)明進一步包括在深低溫保藏和融化后調節(jié)干細胞，以消除深低溫保藏和暴露于冷凍保藏劑對干細胞的有害影響的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明提供跟隨深低溫保藏和融化的調節(jié)干細胞，以消除暴露于冷凍保藏劑(例如，DMSO)對干細胞的增殖和遷移能力的有害影響的方法。
5.1干細胞和CD34+或CD133+祖細胞的分化的調節(jié)
5.1.1干細胞本發(fā)明提供調節(jié)人干細胞分化的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法包括在體外干細胞或祖細胞分化的調控，包括體外將干細胞與化合物一起溫育，隨后向受治療者直接移植分化的細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括體內干細胞或祖細胞分化的調控，包括向來調節(jié)的干細胞受體的受治療者遞送化合物，隨后向受治療者直接給藥以化合物。
通過本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細胞可誘導向特定細胞譜系的分化，這些細胞譜系包括但不限于間充質的、造血的、生脂的、生肝的、生神經(jīng)的、成膠質的、生軟骨的、生血管的、生肌的、生軟骨的或成骨的譜系。
在某些實施方案中，將按照本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細胞誘導分化，以用于移植和先體外后體內治療的方案中。在某些實施方案中，通過本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細胞向特殊的細胞類型誘導分化，且受到遺傳操縱以提供基因治療的產(chǎn)品。在一個具體的實施方案中，通過本發(fā)明的方法獲得的胚胎樣干細胞在體外與誘導其分化的化合物如小的有機分子一起溫育，隨后向受治療者直接移植分化的細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于控制和調控干細胞分化的化合物不是多肽、肽、蛋白、激素、細胞因子、寡核苷酸或核酸。
按照本發(fā)明而使用的干細胞包括但不限于，臍帶血(CB)細胞、胎盤細胞、胚胎干(ES)細胞、胚胎樣干細胞、滋養(yǎng)層干細胞、祖細胞、骨髓干細胞及多潛能性、多能性和全能性細胞。
尤其是，本發(fā)明的方法包括除間充質干細胞外的干細胞群體向特定組織譜系分化的調控。例如，通過促進特定肌肉骨骼的再生和修復、新血管的發(fā)生及特定肌肉組織，如心肌和骨骼肌，以及各種器官和組織的血運重建，所述器官和組織包括但不限于腦、脊髓、肝、肺、腎和胰臟，本發(fā)明的方法可用于調控多潛能性干細胞向生軟骨的、生血管的、生肌肉的和成骨譜系細胞的分化。本發(fā)明的方法可用于調控多潛能性干細胞向生脂、生軟骨、成骨、生神經(jīng)或生肝的譜系的分化。
用于調節(jié)分化的試劑可導入產(chǎn)后灌注的胚胎以誘導在胚胎中培養(yǎng)的細胞的分化。選擇性地，該試劑可用于從胎盤中收集或移除細胞后在體外調節(jié)分化。
本發(fā)明的方法包括祖細胞向造血譜系細胞分化的調控，包括在體外將祖細胞和化合物溫育足夠的一段時期，致使細胞向造血譜系的分化。尤其是，本發(fā)明的方法可用于以劑量相關方式調節(jié)由CD34+、CD133+和CD45+造血祖細胞生成血細胞集落的發(fā)生(關于劑量的討論，見5.7節(jié))。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可用于特異性地抑制紅血細胞或紅細胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同時增加白細胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高總的集落形成單位的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法不僅可用于調控干細胞的分化，還可刺激集落形成率，通過提高骨髓植入物的速度和白細胞和/或血小板產(chǎn)物的恢復而給造血干細胞移植提供顯著的益處。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于調控例如神經(jīng)元前體細胞或神經(jīng)母細胞向特定的神經(jīng)細胞類型如感覺神經(jīng)元(例如，視覺細胞、嗅覺細胞、機械感應神經(jīng)元、化學感應神經(jīng)元等)、運動神經(jīng)元、皮質神經(jīng)元或中間神經(jīng)元的分化。在其它的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于調控包括但不限于膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞(包括少突膠質細胞，其產(chǎn)生髓磷脂)和室管膜細胞(其排列于腦室系統(tǒng))細胞類型的分化。仍在其它的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于調控為器官組分的細胞的分化，包括但不限于，心臟的普爾基涅細胞、肝的膽管上皮細胞、胰臟的β胰島細胞、腎皮質或髓細胞及眼睛的視覺感光細胞。
按照本發(fā)明的方法獲得的干細胞分化狀態(tài)的評價可通過細胞表面標記的存在而鑒定。例如，本發(fā)明的胚胎樣干細胞，可通過下面的細胞表面標記OCT-4+和ABC-pt而區(qū)分。進一步地，本發(fā)明包括具有下列標記CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、SH2、SH3、SH4、OCT-4和ABC-p或者如前所描述的缺乏下列細胞表面標記CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4的胚胎樣干細胞。這樣的細胞表面標記可按照本領域熟知的方法常規(guī)測定，例如，通過流式細胞計數(shù)法，伴隨洗滌和用抗細胞表面標記的抗體染色。例如，為測定CD34或CD38的存在，細胞可在PBS中洗滌，然后用抗CD34的藻藍蛋白和抗CD38的異硫氰酸熒光素(Becton Dickinson，Mountain View，CA)雙染色。5.1.2CD34+和CD133+早期祖細胞本發(fā)明還提供調節(jié)人CD34+或CD133+細胞分化的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法包括在體外干細胞或祖細胞的調控，包括體外溫育干細胞和化合物，隨后將分化的細胞直接移植入受治療者。
通過本發(fā)明的方法獲得的祖細胞可沿著特定細胞譜系誘導分化，包括但不限于，對于CD34+祖細胞，沿著髓樣或粒細胞譜系，對于CD133+細胞，沿著內皮或神經(jīng)細胞譜系。在某些實施方案中，祖細胞被誘導分化以用于移植和先體外后體內治療方案。在某些實施方案中，祖細胞向特殊的細胞類型誘導分化，且受到遺傳操縱以提供基因治療的產(chǎn)品。在具體的實施方案中，將祖細胞在體外與誘導其分化的化合物，如小的有機分子一起溫育，隨后向受治療者直接移植分化的細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于控制和調控干細胞分化的化合物不是多肽、肽類、蛋白、激素、細胞因子、寡核苷酸或核酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，祖細胞促成向CD34+CD38-CD33+或CD34+CD38-CD33-祖細胞分化。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可用于特異性地抑制紅血細胞或紅細胞集落(BFU-E和CFU-E)的生成，同時增加白細胞和血小板集落形成(CFU-GM)的生成以及提高總的集落形成單位的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法不僅可用于調控干細胞的分化，還可刺激集落形成率，通過提高骨髓植入物的速度和白細胞和/或血小板產(chǎn)物的恢復而給造血干細胞移植提供顯著的益處。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少CD34+祖細胞向CD1a+細胞，尤其是CD86+CD1a+細胞的分化。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少或防止CD34+祖細胞向CD14+CD1a-細胞的分化。CD14+CD1a-細胞為表皮樹突細胞或單核/巨噬祖細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少在增殖的CD34+祖細胞上CD80和CD86共刺激分子的表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少增殖的CD34+祖細胞向CD54bright細胞的分化，且激勵向CD54dim細胞的分化。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于增加CD133+細胞的數(shù)量，其為內皮細胞祖細胞。仍在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于減少增殖的CD34+細胞向CD11c-CD15+細胞的分化，且增加向CD11c+CD15-細胞的分化，由此分化從髓樣樹突細胞譜系轉變?yōu)榱＜毎V系。
按照本發(fā)明的方法獲得的干細胞分化狀態(tài)的評價可通過細胞表面標記的存在而鑒定。例如，本發(fā)明的祖細胞，可通過CD34+或CD133+細胞表面標記而區(qū)分。進一步地，本發(fā)明包括擁有或顯示相對于對照高表達如前所描述的一種或多種下列標記CD15、CD34、CD33、CD133或CD54dim的增殖的祖細胞。本發(fā)明進一步包括缺乏或顯示相對于對照低表達一種或多種下列標記HLA-DR、CD1a、CD11c、CD38、CD80、Cd86、CD54bright或CD14的增殖的祖細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的增殖的祖細胞呈現(xiàn)CD34+CD38-CD33+或CD34+CD38-CD33-。這樣的細胞表面標記可按照本領域熟知的方法常規(guī)測定，例如，通過洗滌和用抗細胞表面標記的抗體染色，隨后經(jīng)過流式細胞計數(shù)法測定。例如，為測定CD34或CD38的存在，細胞可在PBS中洗滌，然后用抗CD34的藻藍蛋白和抗CD38的異硫氰酸熒光素(Becton Dickinson，MountainView，CA)雙染色。
在某些實施方案中，分化的細胞可通過鑒定分化的細胞吞噬能力而表征。例如，可通過用FITC標記右旋糖酐及用已知的方法測定攝取量而評價已分化的或正在分化的細胞的吞噬作用。分化的或正分化的細胞刺激T細胞的能力可在混合淋巴細胞反應(MLR)中測定，其中假定的負載抗原的細胞與T細胞混合，然后測定T細胞的活性水平。
5.1.3細胞的鑒定和表征在某些實施方案中，已分化的細胞可通過表現(xiàn)差異表達的基因而鑒定(例如，表現(xiàn)未分化的祖細胞來源的基因庫與源于祖細胞的已分化的細胞的基因庫的差別)。例如，核酸擴增方法如聚合酶鏈式反應(PCR)或基于轉錄的擴增方法(例如，體外轉錄(IVT))可用于展現(xiàn)在不同細胞群體中的基因表達，例如，通過使用多核苷酸微陣列。該用于展現(xiàn)差別基因表達的方法在本領域中是熟知的(見，例如，Wieland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872720-2724(1990)；Lisitsyn等，Science 259946-951(1993)；Lisitsyn等Meth.Enzymology254291-304(1995)；美國專利號5,436,142；美國專利號5,501,964；Lisitsyn等，Nature Genetics 657-63(1994)；Hubank和Schatz，1994，Nucleic Acids Research 225640-5648；Zeng等，1994，Nucleic Acids Research 224381-4385；美國專利號5,525,471；Linsley等，美國專利號6,271,002，題為“RNA擴增方法”，公開于2001-08-07；Van Gelder等，美國專利號5,716,785，題為“使用啟動子進行基因操作的過程”，公開于1998-02-10；Stoflet等，Science 239491-494，1988；Sarkarand Sommer，1989，Science244331-334；Mullis等，美國專利號4,683,195；Malek等，美國專利號5,130,238；Kacian和Fultz，美國專利號5,399,491；Burg等，美國專利號5,437,990；R.N Van Gelder等，(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1663；D.J.Lockhart等，1996，NatureBiotechnol.14，1675；Shannon美國專利號6,132,997；Lindemann等，美國專利號6,235,503，題為“削減雜交和差異分析的方法”，公開于2001-05-22)。
商業(yè)上現(xiàn)有的試劑盒對于基因展現(xiàn)是有用的，例如，展示PROFILETM系列試劑盒(Qbiogene，Carlsbad，CA)，其使用基于凝膠的處理方法來展現(xiàn)基因表達。該試劑盒利用限制性片段差異顯示PCR(RFDD-PCR)在真核細胞內比較基因表達模式。PCR-選擇性削減試劑盒(Clontech)和PCR-選擇性差示篩選試劑盒(Clontech)也可使用，其允許削減文庫中差異表達克隆的鑒定。在用PCR+選擇性削減試劑盒產(chǎn)生差異表達基因庫后，PCR-選擇性差示篩選試劑盒得到使用。用直接由檢測和驅動子集群合成的探針與削減文庫與雜交，一種產(chǎn)自削減cDNA的探針，以及一種制自反向削減cDNA(反向進行的第二次削減)的探針。與檢測子而不是驅動子探針雜交的克隆得到差異表達；然而，未削減的探針對于檢測微量信息不夠靈敏。削減的探針為差異表達cDNA而得到大量富集，但可能給出假陽性的結果。按照制造商的(Clontech)指導使用削減的和未削減的探針來鑒定差異表達基因。
在另一個實施方案中，分化的干細胞或祖細胞通過集落形成單位測定法而得到鑒定和表征，其在本領域中是通常所知的，例如MesenCuItTM培養(yǎng)基(干細胞技術，Inc.，Vancouver British Columbia)。
干細胞或祖細胞已分化為特殊的細胞類型的測定可通過本領域熟知的方法完成，例如，使用如流式細胞計數(shù)法或免疫細胞化學(如，用組織特異性或細胞標記特異性抗體對細胞染色)測量形態(tài)學上的和細胞表面標記的變化，通過用光學或共聚焦顯微鏡對細胞形態(tài)學檢查，或使用本領域熟知的技術，如PCR和基因表達展示，測量基因表達的變化。
5.2干細胞和祖細胞群體本發(fā)明提供調節(jié)人干細胞分化的方法。任何哺乳動物干細胞可在本發(fā)明的方法中使用，包括但不限于，分離自臍帶血(CB細胞)、外周血、成體血、骨髓、胎盤、間充質干細胞及其他來源的干細胞。在非優(yōu)選的實施方案中，干細胞為胚胎干細胞或已從非胎盤的來源分離的細胞。
間充質干細胞的來源包括骨髓、胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒和青少年皮膚和血液。例如，骨髓細胞可從髂骨嵴、腿節(jié)、脛節(jié)、肋骨或其他髓的空腔獲得。
按照本發(fā)明的方法使用的干細胞可包括多能性細胞，即，具有完全的分化多樣性、能自我更新以及在組織中維持休眠或靜止的細胞。干細胞還可包括多潛能性細胞、定向祖細胞和成纖維細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明利用的干細胞為從足期的放血灌注的胎盤分離的活的、靜止的、多能性的干細胞。
干細胞群體可以由通過商業(yè)服務獲得的胎盤干細胞而組成，例如LifeBank美國(Cedar Knolls，NJ)、ViaCord(Boston MA)、CordBlood Registry(San Bruno，CA)和Cryocell(Clearwater，F(xiàn)L)。
干細胞群體還包括按照美國申請，
發(fā)明者R·J·哈里里, D·I·斯蒂爾林, K·W·H·陳, L·A·穆托-德帕塞瓦爾 申請人:細胞基因公司