專利名稱：胞苷5'－二磷酸膽堿的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及胞苷5′-二磷酸膽堿的制備方法。
背景技術：
胞苷5′-二磷酸膽堿(以下簡寫為CDP-膽堿)是磷脂的一種磷脂酰膽堿(卵磷脂)的生物合成中間體，用于治療頭部外傷、伴隨腦手術所出現(xiàn)的意識障礙、帕金森病以及腦中風偏癱等。
CDP-膽堿的制備法已知的有化學合成法、利用微生物菌絲體的通過胞苷5′-三磷酸(以下簡寫為CTP)、胞苷5′-二磷酸(以下簡寫為CDP)或胞苷5′-一磷酸(以下簡寫為CMP)等的制備法(特公昭48-2358、特公昭48-40758、特公昭48-2359)，但是無論哪一種方法，都具有收率低、原材料價格高等問題。
利用微生物進行的生產方法中，報道有利用基因重組微生物通過乳清酸以及膽堿或磷酸膽堿的制備方法(特開平5-276974)、通過尿苷5′-一磷酸(以下簡寫為UMP)以及膽堿(或磷酸膽堿)的制備方法(WO99/49073)、通過CMP以及膽堿的制備方法(特開2001-103973)。由于乳清酸的價格較低，以此作為反應底物的制備原料是相當良好，但如果可以利用更廉價的原材料的話，生產成本可以進一步下降。但是，到目前為止利用作為更低價的底物-尿嘧啶的方法并未被人們所了解。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種CDP-膽堿的高效率的制備方法。
本發(fā)明涉及以低價的膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶作為底物的CDP-膽堿的新的制備方法。
即，本發(fā)明涉及以下(1)～(8)個方面。
(1)CDP-膽堿的制備方法，其特征在于將具有通過膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶生成CDP-膽堿活性的生物催化劑在水溶性介質中，接觸膽堿、磷酸膽堿或其鹽以及尿嘧啶，在所述水溶性介質中使CDP-膽堿生成積累，并從所述水溶性介質中回收(獲取)CDP-膽堿。
(2)上述(1)的制備法，其中所述生物催化劑為含有選自由微生物、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞組成的組的細胞、所述細胞的培養(yǎng)液或所述細胞的處理物的生物催化劑。
(3)上述(2)的制備法，其中所述細胞選自屬于由埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、金桿菌屬(Aurebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、脂肪桿菌屬(ピメロバクタ一屬)(Pimerobacter)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)以及假絲酵母屬(Candida)組成的組的1個或2個屬以上的微生物。
(4)上述(2)的制備法，其中所述細胞選自屬于由埃希氏桿菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)以及糖酵母屬(Saccharomyces)組成的組的1個或2個屬以上的微生物。
(5)上述(2)的制備法，其中所述細胞是屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物以及埃希氏桿菌屬(Escherichia)的微生物。
(6)上述(3)～(5)中任一項的制備法，其中所述棒桿菌屬的微生物是產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
(7)上述(3)～(5)中任一項的制備法，其中所述埃希氏桿菌屬的微生物是大腸桿菌(Escherichia coli)。
(8)上述(2)的制備法，其特征在于所述細胞是轉導了編碼具有從尿苷5′-三磷酸(以下簡寫為UTP)生成CTP活性的胞苷5′-三磷酸合成酶(以下簡寫為PyrG)的DNA、編碼具有通過膽堿生成磷酸膽堿的活性的膽堿激酶(以下簡寫為CKI)的DNA、或者編碼具有通過CTP和磷酸膽堿生成CDP-膽堿活性的膽堿磷酸胞苷轉移酶(以下簡寫為CCT)的DNA而得到的轉化體。
本發(fā)明中所使用的生物催化劑，只要是具有通過膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶生成CDP-膽堿的活性(以下簡寫為CDP-膽堿生成活性)的生物催化劑，都可以使用。
如此的生物催化劑可以列舉具有CDP-膽堿生成活性的細胞、所述細胞的培養(yǎng)液、所述細胞的處理物等。
作為細胞，只要是具有CDP-膽堿生成活性的細胞，任何細胞都可以使用。例如，可以列舉微生物、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等，微生物優(yōu)選使用。
微生物可以列舉屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、金桿菌屬(Aurebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、脂肪桿菌屬(Pimerobacter)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤氏酵母(Pichia)以及假絲酵母屬(Candida)等屬的微生物。
屬于埃希氏桿菌屬(Escherichia)的微生物可以列舉大腸桿菌(Escherichiacoli)MM294、大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌GI698、大腸桿菌TB1等屬于大腸桿菌(Escherichiacoli)的微生物。沙雷氏菌屬(Serratia)的微生物可以列舉屬于無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratiafonticola)、解凝(液化)沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)等的微生物。芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物可以列舉屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacines)等的微生物。假單胞菌屬(Pseudomonas)可以列舉屬于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的微生物。鏈球菌屬(Streptococcus)的微生物可以列舉屬于肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)等的微生物。中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)的微生物可以列舉屬于苜宿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)等的微生物。嗜血桿菌屬(Haemophilus)的微生物可以列舉屬于豬流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)等的微生物。節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)的微生物可以列舉屬于檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)等的微生物。金桿菌屬(Aurebacterium)的微生物可以列舉屬于淺黃金桿菌(Aureobacterium flavescens)、天牛金桿菌(Aureobacteriumsaperdae)、磚紅色金桿菌(Aureobacterium testaceum)等的微生物。短桿菌屬的微生物可以列舉屬于短桿菌(Brevibacteriumimmariophilum)、解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)的微生物。纖維單胞菌屬的微生物可以列舉屬于產黃纖維單胞菌(Cellulomonas flavigena)、強壯纖維單胞菌(Cellulomonas carta)等微生物。棍狀桿菌屬的微生物可以列舉屬于密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibacter michiganensis)、拉氏棍狀桿菌(Clavibacter rathayi)等的微生物。棒桿菌屬的微生物可以列舉屬于谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌ATCC13869等的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，產氨棒桿菌ATCC6872、產氨棒桿菌ATCC21170等的產氨酸棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)，嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870等的嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)等的微生物。短小桿菌屬的微生物可以列舉白色短小桿菌(Curtobacterium albidum)、檸檬色短小桿菌(Curtobacteriumcitreum)、藤黃短小桿菌(Curtobacterium luteum)等的微生物。微桿菌屬的微生物可以列舉屬于嗜氨微桿菌ATCC15354等的嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)、乳微桿菌(Microbacteriumlacticum)、蛾微桿菌(Microbacterium imperiale)等微生物。脂肪桿菌屬的微生物可以列舉屬于簡單脂肪桿菌(Pimerobacter simplex)等的微生物。
糖酵母屬的微生物可以列舉屬于啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)等的微生物。裂殖糖酵母屬的微生物可以列舉屬于栗酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等的微生物?？唆斁S氏酵母屬的微生物可以列舉屬于乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)等的微生物。絲孢酵母屬的微生物可以列舉屬于茁芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)等的微生物。許旺氏酵母屬的微生物可以列舉屬于河岸許旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)等的微生物。畢赤氏酵母的微生物可以列舉屬于金合歡畢赤氏酵母(Pichia acaciae)等的微生物。假絲酵母屬的微生物可以列舉屬于產朊假絲酵母(Candidautilis)等的微生物。
微生物可以列舉上述的微生物，但優(yōu)選使用屬于埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、糖酵母屬的微生物，更優(yōu)選使用屬于棒桿菌屬或短桿菌屬的微生物。
動物細胞可以列舉人細胞的Namalwa細胞、猴細胞的COS細胞、中國倉鼠細胞的CHO細胞或HBT5637(特開昭63-299)等。
昆蟲細胞可以列舉，例如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞Sf9、Sf21(棒狀病毒表達載體，實驗室手冊(BaculovirusExpression Vectors，A Laboratory Manual)W.H.Freeman andCompany，New York，1992)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的卵巢細胞High 5(Invitrogen公司制造)等。
植物細胞可以列舉為煙草、馬鈴薯、西紅柿、胡蘿卜、大豆、甘藍、苜宿、稻、小麥、大麥等的植物細胞。
當細胞不具有CDP-膽堿生成活性時，在所述細胞中通過常規(guī)方法轉導編碼與CDP-膽堿生成活性有關的酶的DNA，或者可以通過與具有所述活性的其它細胞進行融合，制備成具有所述活性的細胞，并可以使用該細胞。優(yōu)選使用通過以下所示方法在細胞中轉導編碼與CDP-膽堿生成活性有關的酶的DNA而得到的轉化體。
與CDP-膽堿生成活性有關酶可以列舉為，例如，具有從尿嘧啶反應生成尿苷活性的尿苷磷酸化酶(EC 2.4.2.3)、具有從尿苷生成UMP活性的尿苷激酶(EC 2.7.1.48)、具有從UMP生成尿苷5′-二磷酸(以下簡寫為UDP)活性的尿苷酸·胞苷酸激酶(EC 2.7.4.14)、具有從UDP生成UTP活性的核苷二磷酸激酶(EC 2.7.4.6)、具有從UTP生成CTP活性的胞苷5′-三磷酸合成酶(EC 6.3.4.2)(PyrG)、具有從膽堿生成磷酸膽堿活性的膽堿激酶(EC 2.7.1.32)(CKI)、具有從CTP和磷酸膽堿生成CDP-膽堿活性的膽堿磷酸胞苷轉移酶(EC 2.7.7.15)(CCT)等。
作為編碼與CDP-膽堿生成活性有關的酶的DNA，可以列舉編碼上述酶的DNA，適合使用編碼PyrG、CKI或CCT的DNA。
編碼PyrG的DNA是由大腸桿菌染色體被克隆化，其全部堿基序列已被確定(J.Biol.Chem.，261，5568(1986))。編碼PyrG的DNA的來源可以列舉為在大腸桿菌載體pUC8(Gene，19，259(1982))的多克隆位點的SmaI-PstI位點上插入包含編碼大腸桿菌由來的PyrG的DNA的2426bpNruI-PstI片段的質粒pMW6。
編碼CCT的DNA其全部堿基序列是已確定的(Eur.J.Biochem.，169，477(1987))。作為編碼CCT的DNA的供應源，可以列舉為在大腸桿菌載體pUC18(Gene，33，103(1985))的多克隆位點SmaI位點上插入含有編碼酵母由來的CCT的DNA 1296堿基對(以下簡寫為bp)的DraI片段的質粒pCC41((日本)生化學，60，701(1988))等。
編碼CKI的DNA也同樣通過酵母染色體克隆化而得到，其全部堿基序列是已確定的(J.Biol.Chem.，264，2053(1989))。作為編碼CKI的DNA的供應源，可以列舉酵母以及大腸桿菌的穿梭載體YEpM4(Mol.Cell.Biol.，7，29(1987))中插入含有編碼酵母由來的CKI的DNA 2692bp的PstI-HindIII片段的質粒pCK1D。
根據(jù)上述編碼有關CDP-膽堿生成活性酶的DNA的堿基序列的信息，例如，根據(jù)《分子克隆實驗手冊》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第3版，Sambrook等編輯，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)(以下簡寫為分子克隆第3版)，獲得這樣的DNA，并在表達載體中整合所述DNA，制備重組體DNA，以上述細胞作為宿主細胞進行轉化，通過獲得的轉化體可以容易地獲得具有CDP-膽堿生成活性的生物催化劑。
例如，通過上述質粒pMW6、質粒pCC41或質粒pCK1D獲得編碼PyrG、CCT或CKI的DNA，以所得到的DNA為基礎，根據(jù)需要制備包括編碼該多肽部分的合適長度的DNA片段。
另外，根據(jù)需要，制備堿基取代的DNA，使其編碼有關CDP-膽堿生成活性的酶部分的堿基序列成為在宿主細胞的表達中最適合的密碼子。將所述DNA在有關CDP-膽堿生成活性酶的有效表達中是有用的。
通過將編碼與CDP-膽堿生成活性有關酶的DNA片段、或全長DNA插入到合適的表達載體的啟動子的下游，制備成重組載體。這時，各DNA片段可以分別各自插入到表達載體中，也可以將多個DNA插入同一個表達載體中。
將所述重組載體轉導到適合所述表達載體的宿主細胞中。
宿主細胞可以列舉為上述的細胞。
作為表達載體，由于所述宿主細胞中可以自我復制以致可以整合至染色體中，也可以使用在編碼與CDP-膽堿生成活性有關酶的DNA的可轉錄位置中含有啟動子的表達載體。
當使用細菌等原核生物作為宿主細胞時，由含有編碼本發(fā)明多肽的DNA組成的重組載體在原核生物中可以自我復制，同時，優(yōu)選由啟動子、核糖體結合序列、本發(fā)明的DNA、轉錄終止序列構成的載體。也可以含有控制啟動子的基因。
表達載體可以列舉，例如，pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由BoehringerMannheim公司市售)、pKK233-2(Pharmacia公司生產)、pSE280(Invitrogen公司生產)、pGEMEX-1(Promega公司制造)、pQE-8(QIAGEN公司制造)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200(Agric.Biol.Chem.，48，669(1984))、pLSA1(Agric.Biol.Chem.，53，277(1989))、pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985))、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30(由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備)、pTrs32(由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制備)、pGHA2(由大腸桿菌IGHA2(FERM B-400)制備，特開昭60-221091)、pGKA2(由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)制備，特開昭60-221091)、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400(J.Bacteriol.，172，2392(1990))、pGEX(Pharmacia公司制造)、pET系統(tǒng)(Novagen公司制造)等。
作為啟動子只要在宿主細胞中發(fā)揮功能的都可以。可以使用例如，trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子、T7啟動子等的來自大腸桿菌或噬菌體等的啟動子。此外，也可以使用如將Ptrp成為2個直列的啟動子(Ptrp×2)、tac啟動子、lacT7啟動子、letI啟動子那樣的人為設計改變的啟動子等。
優(yōu)選使用將核糖體結合序列Shine-Dalgarno序列與起始密碼子間距調節(jié)為適當距離(如6-18堿基)的質粒。
本發(fā)明的重組載體中，編碼CDP-膽堿生成活性有關的酶的DNA的表達中，轉錄終止序列并不一定是必要的，但優(yōu)選在結構基因的正下方設置有轉錄終止序列。
作為轉導重組載體的方法，只要是將DNA轉導入上述宿主細胞的方法均可以使用，可以列舉如，使用鈣離子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972))、原生質體法(特開昭63-248394)、或Gene，17，107(1982)或Molecular & General Genetics，168，111(1979)中記載的方法等。
當使用酵母細胞作為宿主細胞時，表達載體可以列舉為YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。
作為啟動子，只要在酵母菌株中可以表達的都可以使用，例如可以列舉己糖激酶等的糖降解體系基因的啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal1啟動子、gal10啟動子、熱休克多肽啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等。
作為重組載體的轉導法，只要是將DNA轉導至酵母中的方法都可以使用，例如可以列舉電穿孔術(Methods Enzymol.，194，182(1990))、原生質球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))、乙酸鋰法(J.Bacteriology，153，163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中所記載的方法等。
當使用動物細胞作為宿主細胞時，作為表達載體可以列舉為例如，pcDNAI、pcDM8(フナコシ公司制造)、pAGE107(特開平3-22979、Cytotechnology，3，133(1990))、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8(Nature，329，840(1987))、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE103(J.Biochem.，101，1307(1987))、pAGE210等。
作為啟動子，只要在動物細胞中能行使功能的均可以使用，可以列舉例如，細胞肥大病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的啟動子、SV40的初期啟動子、逆轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子等。另外，人CMV的IE基因的增強子也可以與啟動子一起使用。
向動物細胞中轉導重組載體的方法，只要是將DNA轉導至動物細胞的方法均可以使用，可以列舉例如，電穿孔術法(Cytotechnology，3，133(1990))、磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質轉染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))、Virology52，456(1973)等。
當使用昆蟲細胞作為宿主細胞時，根據(jù)如現(xiàn)代分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)、桿狀病毒表達載體實驗手冊(Baculovirus Expression Vectors，A LaboratoryManual)，W.M.Freeman and Company，New York(1992)、Bio/Technology，6，47(1988)等記載的方法，可以表達多肽。
即，可以在昆蟲細胞中共同轉導重組基因載體以及桿狀病毒，在昆蟲細胞培養(yǎng)上清液中得到重組病毒后，進一步將該重組病毒在昆蟲細胞中感染，從而表達多肽。
可以在該方法中使用的基因轉導載體可以列舉為，如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII等(均為Invitrogen公司制造)。
桿狀病毒可以使用例如，夜盜蛾科昆蟲中感染的病毒-苜宿銀紋夜蛾多核型多角體病毒等。
為制備重組病毒，在昆蟲細胞中將上述重組基因轉導載體以及上述桿狀病毒的共同轉導法，可以列舉為如，磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質轉染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))等。
當使用植物細胞作為宿主細胞時，表達載體可以列舉，如T1質粒、煙草花葉病病毒等。
作為啟動子可以列舉，如花椰菜病毒(CaMV)35S啟動子、稻肌動蛋白1啟動子等。
重組載體的轉導方法，只要將DNA轉導至植物細胞的方法均可以使用，例如，可以列舉使用農桿菌屬(Agrobacterium)(特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977)、電穿孔法(特開昭60-251887)、基因槍(日本特許第2606856，特許第2527813)等方法。
當細胞不具有CDP-膽堿生成活性時，為獲得CDP-膽堿生成活性，可以將適當?shù)牟煌?種以上細胞進行組合，將其作為具有CDP-膽堿生成活性的細胞使用。
即使當細胞具有CDP-膽堿生成活性時，也可以通過常規(guī)方法在該細胞中轉導編碼與CDP-膽堿生成活性有關的酶的DNA，從而獲得CDP-膽堿生成活性增強的細胞。
此外，即使當細胞具有CDP-膽堿生成活性時，也可以組合使用不同的2種以上的細胞。
組合可以列舉為，例如，組合屬于棒桿菌屬的微生物和埃希氏桿菌屬的微生物。
當上述細胞是細菌等的原核生物或酵母等的真核生物時，作為所述細胞進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要是含有可以使所述細胞同化的碳源、氮源、無機鹽類等，使所述細胞的培養(yǎng)能夠有效地進行的培養(yǎng)基，無論天然培養(yǎng)基還是合成培養(yǎng)基均可使用。
作為碳源物質，只要可以使所述細胞同化的的均可以使用，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖的糖蜜、淀粉或淀粉加水分解物質等的碳水化合物、乙酸、丙酸等的有機酸、乙醇、丙醇等的醇類等。
作為氮源物質，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨等的無機酸或有機酸銨鹽；其它的含氮化合物胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆粕以及大豆粕的水解物、各種發(fā)酵菌體以及其消化物質等。
無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)是在振蕩培養(yǎng)或深部通氣攪拌培養(yǎng)等的好氧條件下進行。培養(yǎng)溫度以15-50℃為合適，培養(yǎng)時間通常為16小時-7天，培養(yǎng)中的pH值優(yōu)選保持在3.0～9.0。使用無機或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨水等進行pH的調整。
當細胞為動物細胞時，可以使用一般常用的RPMI1640培養(yǎng)基(TheJournal of the American Medical Association，199，519(1967))、Eagle氏的MEM培養(yǎng)基(Science，122，501(1952))、Dulbecco改良MEM培養(yǎng)基(Virology，8，396(1959))、199培養(yǎng)基(Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine，73，1(1950))或者在這些培養(yǎng)基中添加胎牛血清等的培養(yǎng)基。
通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在等的條件下進行1～7天的培養(yǎng)。
當所述細胞是昆蟲細胞時，可以使用一般常用的TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen公司制造)、Sf-900 II SFM培養(yǎng)基(Life Technologies公司制造)、ExCel1400、ExCel1405(均由JRH Biosciences公司制造)以及Grace氏昆蟲培養(yǎng)基(Nature，195，788(1962))等。
通常在pH6～7、25～30℃等條件下進行1～5天的培養(yǎng)。
當所述細胞是植物細胞時，可以使用一般常用的MS培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、或在這些培養(yǎng)基中添加生長激素、細胞分裂素等、植物激素的培養(yǎng)基。
通常在pH5～9、20～40℃等條件下進行3～60天的培養(yǎng)。
當所述細胞為轉化體，且為轉化所述細胞所使用的重組體DNA持有抗生素抗性基因的情況下，在培養(yǎng)所述細胞的培養(yǎng)基中可以添加對應于所述重組體DNA所持有的抗生素抗性基因的抗生素。
作為生物催化劑，使用2種以上不同的細胞，所述細胞培養(yǎng)液或處理物的情況下，可以使用按照上述方法各自的細胞分別或者同一的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的細胞。
2種以上不同細胞在同一培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的情況下，可以這些細胞同時培養(yǎng)，也可以1種細胞培養(yǎng)或者培養(yǎng)結束后將剩余的細胞置于所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2種以上細胞的組合，可以選自微生物、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞的任何細胞的組合，優(yōu)選與微生物細胞的組合。例如，可以列舉微生物與微生物、微生物與動物細胞、微生物與昆蟲細胞、或微生物與植物細胞、微生物和動物細胞和植物細胞、微生物和動物細胞和昆蟲細胞的組合等，優(yōu)選微生物與微生物的組合。
例如，微生物與微生物的組合可以是上述微生物的任何組合，可以列舉選自屬于由埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、中華根瘤菌屬、嗜血桿菌屬、節(jié)桿菌屬、金桿菌屬、短桿菌屬、纖維單胞菌屬、棍狀桿菌屬、棒桿菌屬、短小菌屬、微桿菌屬、脂肪桿菌屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、絲孢酵母屬、許旺氏酵母屬、畢赤氏酵母屬以及假絲酵母屬組成的2種以上的微生物的組合。
例如，可以列舉屬于棒桿菌屬的微生物與屬于埃希氏桿菌屬的微生物的組合。
作為一種具有CDP-膽堿生成活性的生物催化劑，上述細胞的處理物，可以列舉用濃縮機或干燥機等濃縮或干燥處理上述獲得的細胞的培養(yǎng)液而獲得所述細胞的培養(yǎng)液的濃縮物或干燥物；用過濾或離心分離等方法固液分離所述細胞的培養(yǎng)液而獲得的細胞，用干燥機等干燥處理所述細胞而獲得所述細胞干燥物；用表面活性劑或有機溶劑等處理所述細胞而獲得所述細胞的表面活性劑或有機溶劑處理物；用溶菌酶等細胞溶解酶處理所述細胞而獲得的所述細胞的細胞溶解酶處理物等。
可以將所述細胞處理物進一步進行鹽析處理、等電點沉淀處理、有機溶劑沉淀處理、透析處理、各種色譜處理等常用的酶純化手段所得到的粗酶或純化酶作為細胞處理物來使用。
在使用2種以上細胞的情況時，可以從2種以上的細胞中分別制備獲得的細胞處理物分別作為具有CDP-膽堿生物合成活性的生物催化劑使用，也可以將這些細胞處理物混合，其混合物作為具有CDP-膽堿生物合成活性的生物催化劑使用。
此外，也可以將上述細胞或細胞處理物固定在水不溶性的載體或凝膠等上，作為生物催化劑使用。
以下，對CDP-膽堿的制備方法進行描述。
可以通過將上述生物催化物與底物在水溶性介質中進行接觸，在所述水溶性介質中生成蓄積CDP-膽堿，從所述水溶性介質中獲得CDP-膽堿。
具體地，上述生物催化劑與底物(膽堿或磷酸膽堿或它們的鹽，以及尿嘧啶)在水溶性介質中進行混合獲得混合物，根據(jù)需要，在其混合物中添加其它的成分，pH保持在5～10，優(yōu)選為pH6～8，在20～50℃保持2～48小時。
生物催化劑的使用量根據(jù)所述生物催化劑的比活性等而有所不同。例如，使用細胞培養(yǎng)液或細胞處理物作為生物催化劑的情況下，以離心分離所述培養(yǎng)液或細胞處理物而得到的濕菌體計，相對于尿嘧啶1mg，使用所得到的濕菌體為5～500mg，優(yōu)選為10～300mg。
膽堿或磷酸膽堿或它們的鹽，可以列舉例如，膽堿、氯化膽堿、溴化膽堿、碘化膽堿等鹵化膽堿、重碳酸膽堿、重酒石酸膽堿、硫酸甲基膽堿、檸檬酸二氫膽堿、磷酸膽堿、氯化磷酸膽堿等磷酸膽堿的鹵化物等。優(yōu)選使用膽堿或磷酸膽堿的鹵化物，更優(yōu)選使用氯化膽堿、氯化磷酸膽堿。
膽堿或磷酸膽堿或它們的鹽、以及尿嘧啶可以由化學合成獲得，也可以通過發(fā)酵法等由微生物制備獲得。此外，并不一定要純粹純化而獲得的，只要不抑制CDP-膽堿生成反應，即使含有鹽等的雜質也可以使用。此外也可以使用市售的。
優(yōu)選膽堿或磷酸膽堿或它們的鹽、以及尿嘧啶的濃度為1mmol/L～1mol/L，更優(yōu)選10～200mmol/L。
根據(jù)需要添加的其它成分，可以列舉為能量的供體、磷酸離子、鎂離子、銨離子、表面活性劑以及有機溶劑等。如果從生物催化劑等能帶入這些成分的必要量的情況下，就不需要再添加。
作為能量供體，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖等的糖類、糖蜜、淀粉水解物、有機酸(丙酮酸、乳酸、乙酸、α-酮戊二酸等)、氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸等)等。優(yōu)選使用0.02～2.0mol/L的濃度。
磷酸離子，可以使用正磷酸、焦磷酸、三磷酸、四磷酸等的多聚磷酸、聚偏磷酸、磷酸鉀、磷酸二鉀、磷酸一鈉、磷酸二鈉等無機磷酸鹽等。這些磷酸離子優(yōu)選在10～500mmol/L的濃度使用。
鎂離子，可以使用硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等的無機鎂鹽、檸檬酸鎂等的有機鎂鹽等。鎂離子的濃度優(yōu)選使用5～200mmol/L。
銨離子，可以使用氨水、氨氣、各種無機或有機的氨鹽、酵母提取物、玉米漿等中含有的銨離子。另外，可以使用谷氨酸或酪蛋白氨基酸等含有銨離子的有機營養(yǎng)源來代替銨離子。優(yōu)選使用這些銨離子的濃度為10mmol/L～2mol/L。
表面活性劑，可以使用二辛基磺基琥珀酸鈉(例如，ラビゾ一ルB-80、日本油脂公司制造)、十二烷酰肌氨酸等的陰離子表面活性劑、聚氧乙烯十六烷基醚(例如，ノニオンP-208，日本油脂公司制造)等的非離子表面活性劑、烷基二甲基胺(例如，三級胺FB，日本油脂公司制造)等的叔胺類等，只要是促進CDP-膽堿生成的都可以使用。使用的濃度通常為0.1～100g/L，優(yōu)選為1～50g/L。
有機溶劑，可以列舉二甲苯、甲苯、脂肪醇(甲醇、乙醇、丁醇等)、丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜等。使用的濃度通常為0.1～100ml/L，優(yōu)選為1～50ml/L。
水溶性介質，可以列舉水、磷酸緩沖液、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-乙磺酸)緩沖液、Tris(三羥甲基氨基甲烷)的鹽酸緩沖液等緩沖液。
另外，水溶性介質，可以使用培養(yǎng)作為生物催化劑使用的細胞的培養(yǎng)基、所述細胞的培養(yǎng)液、所述培養(yǎng)液的培養(yǎng)上清液等。用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液以及培養(yǎng)上清液等作為水溶性介質，使用細胞作為生物催化劑時，所述細胞的培養(yǎng)中或培養(yǎng)結束后的任一情況中，使所述細胞與膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶接觸就可以。所述細胞的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件為上述所列舉的。
進行如此的操作，可以在水溶性介質中生成蓄積CDP-膽堿。生成蓄積的CDP-膽堿可以通過離子交換色譜、吸附色譜、鹽析等常規(guī)的分離純化方法進行分離純化。
以下描述本發(fā)明的實施例。
具體實施例方式
實施例1將重組有來自酵母的CCT基因和CKI基因與來自的PyrG基因的質粒pCKG55轉導入大腸桿菌MM294菌株中，轉化獲得的大腸桿菌MM294/pCKG55菌株(特開平5-276974、FERM BP-3717)接種于200ml含有50mg/L氨芐青霉素的L培養(yǎng)基[含有10g/L細菌胰蛋白胨(Difco公司制造)、5g/L酵母提取物(Difco公司制造)、5g/L氯化鈉、pH調節(jié)到7.2]的2L具塞三角瓶中，25℃下，220rpm轉速下旋轉振蕩培養(yǎng)24小時。取該培養(yǎng)液20ml接種于2.5L含有5g/L葡萄糖(另行滅菌)、5g/L胨(極東制藥工業(yè)公司制造)、6g/L磷酸二鈉、3g/L磷酸二氫鉀、1g/L氯化銨、250mg/L硫酸鎂.7水合物(另行滅菌)以及4mg/L維生素B1(另行滅菌)的液體培養(yǎng)基(未調節(jié)pH)的5L的培養(yǎng)罐中，在培養(yǎng)溫度為28℃、600rpm下攪拌、通氣量為2.5L/分的培養(yǎng)條件下，并用14％(v/v)氨水將pH調節(jié)至7.0的同時進行培養(yǎng)。
培養(yǎng)中，取樣培養(yǎng)液，測定經(jīng)離心分離取樣培養(yǎng)液所得到的上清液中的葡萄糖的濃度。當所述上清液中的葡萄糖的濃度達到0時，無菌地采集培養(yǎng)液250ml。
將采集的培養(yǎng)液接種于裝有2.5L包含5g/L葡萄糖(另行滅菌)、5g/L胨(極東制藥工業(yè)公司制造)、6g/L磷酸二鈉、3g/L磷酸二氫鉀、1g/L氯化銨、250mg/L硫酸鎂·7水合物(另行滅菌)以及4mg/L維生素B1(另行滅菌)的液體培養(yǎng)基(不調節(jié)pH)的5L培養(yǎng)罐中，在培養(yǎng)溫度為28℃、600rpm下攪拌、通氣量為2.5L/分的培養(yǎng)條件下，并用14％(v/v)氨水將pH調節(jié)至7.0的同時進行培養(yǎng)。
自培養(yǎng)第11小時至第24小時的時間段內，在此培養(yǎng)液中用蠕動移液泵以30ml/小時的添加速度添加含有167g/L葡萄糖和167g/L胨的加料液。
此外，產氨棒桿菌ATCC21170菌株接種于裝有200ml含有50g/L葡萄糖、10g/L聚胨(大五營養(yǎng)化學公司制造)、10g/L酵母提取物(大五營養(yǎng)化學公司制造)、5g/L尿素、5g/L硫酸銨、1g/L磷酸二氫鉀、3g/L磷酸氫二鉀、1g/L硫酸鎂·7水合物、0.1g/L氯化鈣·2水合物、10mg/L硫酸鐵·7水合物、10mg/L硫酸鋅·7水合物、20mg/L硫酸錳·4～6水合物、20mg/L L-半胱氨酸、10mg/L D-泛酸鈣、5mg/L維生素B1、5mg/L煙酸以及30μg/L生物素的液體培養(yǎng)基(用氫氧化鈉調節(jié)pH至7.2)的2L具塞三角瓶中，28℃下，以220rpm轉速旋轉振蕩培養(yǎng)24小時。將該培養(yǎng)液20ml接種于裝有2.5L含有100g/L葡萄糖、10g/L聚胨、1g/L磷酸二氫鉀、1g/L磷酸氫二鉀、1g/L硫酸鎂·7水合物、0.1g/L氯化鈣·2水合物、20mg/L硫酸鐵·7水合物、10mg/L硫酸鋅.7水合物、20mg/L硫酸錳·4～6水合物、15mg/Lβ-丙氨酸、20mg/L L-半胱氨酸、0.1mg/L生物素、2g/L尿素(另行滅菌)以及5mg/L維生素B1(另行滅菌)的液體培養(yǎng)基(用氫氧化鈉調節(jié)pH至7.2)的5L培養(yǎng)罐中，在培養(yǎng)溫度為32℃、600rpm下攪拌、通氣量為2.5L/分的培養(yǎng)條件下，并用濃氨水將pH調節(jié)至6.8的同時進行培養(yǎng)。
培養(yǎng)中，取樣培養(yǎng)液，測定經(jīng)離心分離取樣培養(yǎng)液所得到的上清液中的葡萄糖的濃度。當所述上清液中的葡萄糖的濃度達到0時，無菌地采集350ml培養(yǎng)液，并將所述培養(yǎng)液接種于裝有2.5L的含有180g/L葡萄糖、10g/L磷酸二氫鉀、10g/L磷酸氫二鉀、10g/L硫酸鎂·7水合物、0.1g/L氯化鈣·2水合物、20mg/L硫酸鐵·7水合物、10mg/L硫酸鋅·7水合物、20mg/L硫酸錳·4～6水合物、15mg/Lβ-丙氨酸、1g/L谷氨酸鈉、20mg/L L-半胱氨酸、0.1mg/L生物素、2g/L尿素(另行滅菌)以及5mg/L維生素B1(另行滅菌)的液體培養(yǎng)基(用氫氧化鈉調節(jié)pH至7.2)的5L培養(yǎng)罐中，在培養(yǎng)溫度為32℃、600rpm下攪拌、通氣量為2.5L/分的培養(yǎng)條件下，并用濃氨水將pH調節(jié)至6.8的同時進行培養(yǎng)。培養(yǎng)中，取樣培養(yǎng)液，測定經(jīng)離心分離取樣培養(yǎng)液所得到的上清液中的葡萄糖的濃度。當所述上清液中的葡萄糖的濃度達到0時，培養(yǎng)結束。
由此得到的大腸桿菌MM294/pCKG55菌株的培養(yǎng)液500ml和產氨棒桿菌ATCC21170菌株的培養(yǎng)液185ml分別注入2個2L體積的培養(yǎng)罐中，并在培養(yǎng)罐中分別添加60％(w/v)葡萄糖溶液80ml、25％(w/v)硫酸鎂·7水合物25ml、25％(w/v)磷酸二氫鉀160ml、并進一步添加二甲苯(使其濃度達到20ml/L)以及氯化膽堿(使其濃度達到8.4g/l(60mM))。
在2個培養(yǎng)罐中之一(罐1)添加尿嘧啶(Sigma公司制造)，使其濃度達到44mmol/l，另一罐(罐2)中添加乳清酸(Sigma公司制造)，使其濃度達到44mmol/l。各自的培養(yǎng)罐在32℃、800rpm、通氣量為0.2L/分的條件下，并用10當量的氫氧化鈉將其pH保持在7.2。22小時后，當用HPLC測定混合液中的CDP-膽堿濃度時，顯示為罐1中所生成的CDP-膽堿的濃度為12.1g/l(24.8mmol/l)，罐2中的濃度為11.5g/l(23.6mmol/l)。作為底物，尿嘧啶比乳清酸可以得到更良好的結果。
工業(yè)實用性通過本發(fā)明，提供了由膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶制備工業(yè)上有用的CDP-膽堿方法。
權利要求
1.CDP-膽堿的制備方法，其特征在于，將具有通過膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶生成CDP-膽堿活性的生物催化劑在水溶性介質中與膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶接觸，在所述水溶性介質中生成蓄積CDP-膽堿，并從所述水溶性介質中回收CDP-膽堿。
2.根據(jù)權利要求1的制備方法，其中所述生物催化劑為選自由微生物、動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞組成的組的細胞、所述細胞的培養(yǎng)液、或含有所述細胞的處理物的生物催化劑。
3.根據(jù)權利要求2的制備法，其中所述細胞選自屬于由埃希氏桿菌屬(Escherichia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、金桿菌屬(Aurebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、棍狀桿菌屬(Clavibacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、脂肪桿菌屬(Pimerobacter)、糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)以及假絲酵母屬(Candida)組成的組的1個或2個以上屬的微生物。
4.根據(jù)權利要求2的制備法，其中所述細胞選自屬于由埃希氏桿菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)以及糖酵母屬(Saccharomyces)組成的組的1個或2個以上屬的微生物。
5.根據(jù)權利要求2的制備法，其中所述細胞是屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)的微生物以及埃希氏桿菌屬(Escherichia)的微生物。
6.根據(jù)權利要求3～5中任一項的制備法，其中所述棒桿菌屬的微生物是產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
7.根據(jù)權利要求3～5中任一項的制備法，其中所述埃希氏桿菌屬的微生物是大腸桿菌(Escherichia coli)。
8.根據(jù)權利要求2的制備法，其特征在于所述細胞是轉導了編碼具有從尿苷5′-三磷酸生成胞苷5′-三磷酸活性的胞苷5′-三磷酸合成酶的DNA、編碼具有通過膽堿生成磷酸膽堿的活性的膽堿激酶的DNA、或者編碼具有通過胞苷5′-三磷酸和磷酸膽堿生成CDP-膽堿活性的膽堿磷酸胞苷轉移酶的DNA而得到的轉化體。
全文摘要
本發(fā)明涉及CDP－膽堿的制備法，其特征在于，將具有通過膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶生成CDP－膽堿活性的生物催化劑在水溶性介質中與膽堿、磷酸膽堿或它們的鹽以及尿嘧啶接觸，在所述水溶性介質中生成蓄積CDP－膽堿，并從所述水溶性介質中回收CDP－膽堿。
文檔編號C12P19/30GK1653188SQ0381043
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月8日 優(yōu)先權日2002年5月8日
發(fā)明者橋本信一, 小田秀樹 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社