專利名稱：Redk基因的破壞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有被破壞的REDK基因的遺傳修飾的非人哺乳動物和動物細胞。
背景技術：
貧血是血液的氧運輸能力降低的一種病癥，它由例如血紅細胞濃度降低引起。貧血可導致身體活動受損，器官衰竭，和最終死亡。
調節(jié)性紅細胞激酶(Regulator erythroid kinase)(REDK)看來在紅細胞生成中起作用。在體外集落試驗中，已經證明在人CD34+造血干細胞中反義寡核苷酸對REDK的抑制可以增加紅細胞爆裂型集落生成單位(BFU-E)和紅細胞集落生成單位(CFU-E)的頻率。Lord等(2000)。這些結果提示REDK參與多能干細胞向紅細胞系的定向。備選地，REDK可以作為紅細胞生成的抑制劑。
REDK屬于哺乳動物DYRK激酶家族。如同DYRK家族的其它成員，據信REDK是催化在絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化和在酪氨酸殘基自磷酸化的雙特異性激酶(見Lord等(2000)；和Kentrup，Heiner等(1996))。
Genbank登記號Y12735，AF186773和AF186774中公開了人REDK的cDNA序列。GenBank登記號BC006704公開了小鼠REDK cDNA序列。
調節(jié)REDK功能的療法可以為紅細胞生成相關病癥，如貧血提供治療手段。具有破壞的REDK基因的遺傳修飾的哺乳動物和細胞可能對定義REDK的生理作用和理解與REDK活性之調節(jié)相關的治療含義具有價值。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面提供了遺傳修飾的非人哺乳動物或其哺乳動物后代，其中所述修飾包括破壞的REDK基因。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述哺乳動物或其哺乳動物后代是嚙齒動物，優(yōu)選小鼠。在另一個優(yōu)選實施方案中，對于所述修飾，所述哺乳動物或其哺乳動物后代是純合的。
本發(fā)明的另一方面涉及遺傳修飾的動物細胞或其子代細胞，其中所述修飾包括破壞的REDK基因。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述動物細胞或其子代細胞是胚胎干(ES)細胞或ES樣細胞。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述細胞或其子代細胞分離自遺傳修飾的非人哺乳動物或其后代哺乳動物，這些動物含有導致REDK基因破壞的修飾。在再一個優(yōu)選實施方案中，所述細胞或其子代細胞是造血細胞或睪丸細胞。在另外的實施方案中，所述細胞或其子代細胞是哺乳動物細胞，優(yōu)選是鼠或人來源的。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述細胞或其子代細胞在所述修飾方面是純合的。
在另一方面，本發(fā)明涉及鑒定與REDK活性降低或消除相關的生物學特征的方法。該方法包括將包含破壞的REDK基因的遺傳修飾的非人哺乳動物或動物細胞的生物學特征與適當野生型對照的特征進行比較。優(yōu)選，生物學特征選自形態(tài)學、組織學、代謝、發(fā)育或行為特征。
本發(fā)明的另一方面提供了鑒定基因的方法，該基因由于動物細胞中REDK活性的降低而顯示出表達改變，所述方法包括將至少一個不是REDK的基因在本發(fā)明細胞中的表達與在野生型動物細胞中的表達進行比較。在一個優(yōu)選實施方案中，使用微陣列生成所述表達譜。
本發(fā)明的另一個方面涉及鑒定蛋白的方法，該蛋白由于動物細胞中REDK活性的降低而顯示出水平或翻譯后加工的改變，所述方法包括將本發(fā)明細胞的蛋白質組譜與野生型動物細胞的進行比較。
本領域技術人員將完全理解說明書和所附權利要求書中使用的用于描述本發(fā)明的術語。盡管如此，除非這里另行指出，下列術語如緊接下面描述的那樣。
“破壞的REDK基因”是指被遺傳修飾的REDK基因，所述修飾使得在正常表達野生型REDK基因的細胞中該破壞的基因編碼的REDK多肽的細胞活性降低或優(yōu)選地消除。當遺傳修飾有效消除了細胞中的所有野生型REDK基因拷貝(如，遺傳修飾的非人哺乳動物或動物細胞在REDK基因破壞方面是純合的或最初存在的唯一野生型REDK基因拷貝現在被破壞)時，與表達野生型REDK基因的對照細胞相比，該遺傳修飾導致REDK多肽活性降低。REDK多肽活性的這種降低可以由REDK基因表達降低(即REDK mRNA水平有效降低導致REDK多肽水平降低)引起和/或由該破壞的REDK基因編碼與野生型REDK多肽相比功能改變(如降低)的突變多肽引起。優(yōu)選，在遺傳修飾的非人哺乳動物或動物細胞中，REDK多肽的活性降低至野生型水平的50％或更低，更優(yōu)選地降低至25％或更低，和甚至更優(yōu)選地降至野生型水平的10％或更低。最優(yōu)選，該REDK基因破壞導致不能檢測到REDK活性。
含有破壞的REDK基因的“遺傳修飾的非人哺乳動物”是指由基因工程創(chuàng)造的含有破壞的REDK基因的非人哺乳動物，以及繼承了該破壞的REDK基因的這種非人哺乳動物的后代?？梢酝ㄟ^例如創(chuàng)建攜帶此期望的遺傳修飾的胚泡或胚胎并接著將該胚泡或胚胎植入代孕母體進行宮內發(fā)育而產生遺傳修飾的非人哺乳動物。在小鼠的情況下，可以通過將遺傳修飾的胚胎干(ES)細胞植入小鼠胚泡或通過將ES細胞與四倍體胚胎聚集在一起來制備遺傳修飾的胚泡或胚胎?？晒┻x擇地，可以通過核轉移獲得各種物種的遺傳修飾的胚胎。在核轉移的情況下，供體細胞是體細胞或多能干細胞，并且它被工程改造而含有破壞了REDK基因的期望遺傳修飾。這個細胞的細胞核接著被轉移到去核的受精或單性生殖卵母細胞中；生成的胚胎經重建并發(fā)育為胚泡。之后可以根據本領域技術人員熟知的標準方法將任一上面方法產生的遺傳修飾的胚泡接著植入代孕母體中?！斑z傳修飾的非人哺乳動物”包括利用上述方法產生的非人哺乳動物的所有后代，只要該后代繼承了至少一個拷貝的破壞REDK基因的遺傳修飾。優(yōu)選遺傳修飾的非人哺乳動物的所有體細胞和生殖系細胞均含有該修飾。被遺傳修飾而含有破壞的REDK基因的優(yōu)選的非人哺乳動物，包括嚙齒類動物，如小鼠和大鼠，貓，狗，兔，豚鼠，倉鼠，綿羊，豬和雪貂。
含有破壞的REDK基因的“遺傳修飾的動物細胞”是指由基因工程改造產生的含有破壞的REDK基因的動物細胞(優(yōu)選哺乳動物細胞)，包括人細胞，以及繼承了破壞的REDK基因的子代細胞。這些細胞可以根據本領域已知的任何標準方法在培養(yǎng)中被遺傳修飾。作為遺傳修飾培養(yǎng)細胞的一種替代方案，非人哺乳動物細胞也可以分離自含有破壞的REDK基因的遺傳修飾的非人哺乳動物。本發(fā)明的動物細胞可以從原代細胞或組織制品以及適應培養(yǎng)的(culture-adapted)、致瘤的或轉化的細胞系獲得。這些細胞和細胞系來自例如內皮細胞、上皮細胞、胰島(islet)、神經元和其它神經組織來源的細胞、間皮細胞、骨細胞、淋巴細胞、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要腺體或器官(如睪丸、肝、肺、心臟、胃、胰腺、腎和皮膚)的細胞、肌細胞(包括來自骨骼肌、平滑肌和心肌的細胞)、外分泌或內分泌細胞、成纖維細胞，和胚胎干細胞和其它全能或多能干細胞(如ES細胞、ES樣細胞、胚胎生殖系細胞和其它干細胞，如祖先細胞和組織來源的干細胞)。優(yōu)選的遺傳修飾細胞是ES細胞，更優(yōu)選，小鼠或大鼠ES細胞，最優(yōu)選人ES細胞。
“遺傳修飾”的非人哺乳動物或動物細胞就通過基因工程導入非人哺乳動物或動物細胞或導入祖先非人哺乳動物或動物細胞的修飾而言是雜合或純合的?，F有的用于導入修飾的基因工程標準方法包括同源重組、病毒載體基因捕獲、輻射、化學誘變和編碼反義RNA的核苷酸序列單獨或與催化性核酶聯合的轉基因表達。優(yōu)選的用于破壞基因的遺傳修飾方法是通過將“外來核酸序列”插入基因座位，如通過同源重組或病毒載體基因捕獲來修飾內源基因的那些方法。“外來核酸序列”是基因中非天然存在的外源序列。外來DNA的這種插入可以發(fā)生在REDK基因的任何區(qū)域，如在增強子、啟動子、調節(jié)區(qū)域、非編碼區(qū)、編碼區(qū)、內含子或外顯子中。用于基因破壞的最優(yōu)選基因工程方法是同源重組，其中外來核酸序列以定向方式單純地插入或插入時伴隨部分內源基因序列的缺失。
“純合”，當指非人哺乳動物或動物細胞中的REDK基因破壞時，是指全部REDK等位基因被破壞的非人哺乳動物或動物細胞。然而，這些等位基因的每一個的REDK序列并無需相同。例如，非人哺乳動物的REDK破壞可以是純合的，其中一個REDK等位基因由于一個區(qū)域的基因序列缺失被破壞，而另一個等位基因由于另一個區(qū)域的基因序列缺失被破壞。
“ES細胞”或“ES樣細胞”是指來自胚胎、來自原始生殖細胞、或來自畸胎瘤的多能干細胞，它能夠無限地自我更新以及分化出代表全部三個胚層的細胞類型。
“微陣列”是指不同的多核苷酸在基質上的排列，參見本文更充分的描述。
“REDK活性降低”是指由于REDK基因的遺傳操作引起細胞中功能性REDK多肽的水平降低而造成的REDK酶活性降低，或由于給予抑制REDK活性的藥物抑制劑而造成的REDK酶活性降低。
“野生型”，當指非人哺乳動物或動物細胞時，是指視具體情況而定不包含破壞的REDK基因的非人哺乳動物或動物細胞。例如，在本發(fā)明非人哺乳動物的特定特征與野生型哺乳動物的相應特征進行比較時，該術語野生型是指不包括破壞的REDK基因的非人哺乳動物(即REDK基因是野生型的哺乳動物)。優(yōu)選，野生型非人哺乳動物基本上類似于，且更優(yōu)選地基本上等同于本發(fā)明的非人哺乳動物，除了兩者的REDK基因分別是未被破壞的或被破壞的。同樣，例如，在本發(fā)明的動物細胞的特定特征與野生型哺乳動物細胞的相應特征進行比較時，該術語野生型是指不包括破壞的REDK基因的動物細胞(即REDK基因是野生型的細胞)。優(yōu)選，野生型動物細胞基本上類似于，且更優(yōu)選地基本上等同于本發(fā)明的動物細胞，除了兩者的REDK基因分別是未被破壞的或被破壞的?！耙吧汀币部梢灾笡]有被破壞的REDK等位基因，例如在具有一個破壞的REDK等位基因和一個野生型REDK等位基因(即REDK破壞是雜合的)的動物細胞或非人哺乳動物中。
從下列詳細說明和權利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是明顯的。當結合具體實施方案描述本發(fā)明時，應該理解可以實踐的其它改變或修改也是本發(fā)明的一部分并且也包括在所附權利要求的范圍內。本申請意欲覆蓋一般地遵循本發(fā)明原則的本發(fā)明的任何等同方案、變化、應用或適應性改變，包括在本領域已知或慣用實踐內無需過度實驗可確定的自本發(fā)明公開內容的偏離。在分子生物學、蛋白質科學和免疫學的標準教科書中可以找到關于制備和使用核酸和多肽的另外指導(如見Davis等(1986)；Hames等(1985)；Sambrook，J.等(1989)；Ausubel，F.M.等(2001)；Dracopoli，等(1994)；Coligan，John E.，等(2002)；和Coligan，John E.，等(1994))。這里提及的所有出版物，包括公開的專利申請和頒發(fā)的專利的全部內容并入作為參考。
縮寫詞這里使用下列縮寫詞“BFU-E”是指紅細胞爆裂型集落生成單位“cDNA”是指互補DNA“CFU-E”是指紅細胞集落生成單位“DMEM”是指Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基“DNA”是指脫氧核糖核酸“IRES”非依賴型核糖體進入位點“LIF”白血病抑制因子“MEM”是指改良的Eagle氏培養(yǎng)基“nm”是指納米“nM”是指納摩爾“PCR”是指聚合酶鏈式反應“PEF”是指原代胚胎成纖維細胞“REDK”是指調節(jié)性紅細胞激酶“RFLP”是指限制性片段長度多態(tài)性“RNA”是指核糖核酸
“mRNA”是指信使RNA。
附圖簡述

圖1A是描述主鏈載體pJNS2的圖。圖1B描述了本發(fā)明的基因尋靶載體。
圖2A和2B顯示了在內源小鼠REDK基因中載體同源重組的位置。
圖3是REDK(+/-)和REDK(-/-)小鼠基于PCR的基因分型的Southern印跡。
圖4比較了REDK破壞的ES細胞和野生型ES細胞的紅細胞集落形成水平。
發(fā)明詳述本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和遺傳修飾的動物細胞，包括人細胞，在破壞REDK基因的修飾方面是雜合或純合的。該動物細胞可以由基因工程改造培養(yǎng)的細胞得到，或在非人哺乳動物細胞的情況下，該細胞可以分離自遺傳修飾的非人哺乳動物。
REDK基因的破壞為了產生本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞，可以使用本領域已知的遺傳修飾技術，包括化學誘變(Rinchik(1991)；Russell(1994))、輻射(Russell，(1994))、REDK基因反義RNA的轉基因表達(單獨或與催化性RNA核酶序列一起)(Luyckx等(1999)；Sokol等，(1996)；Efrat等，(1994)；Larsson等(1994))和如下進一步討論的將外來核酸序列插入REDK基因座位而破壞REDK基因的方式來破壞REDK基因座位。優(yōu)選，通過插入外來核酸序列，更優(yōu)選依靠同源重組或通過插入病毒載體來破壞REDK基因。甚至更優(yōu)選地，REDK基因破壞方法是同源重組并包括缺失一部分內源REDK基因序列。
外源序列的整合通過一種或多種下列機制破壞REDK基因通過干擾REDK基因轉錄或翻譯過程(如通過干擾啟動子識別，或通過將轉錄終止位點或翻譯終止密碼子導入REDK基因)；通過扭曲REDK基因編碼序列，使得它不再編碼具有正常功能的REDK多肽(如通過將外來編碼序列插入REDK基因編碼序列，通過導入移框突變或氨基酸置換；或，在雙交換事件情況下，通過刪除一部分對于表達功能性REDK蛋白所必需的REDK基因編碼序列)。
為了將外來序列插入細胞基因組中的REDK基因座位而產生本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞，根據本領域已知標準方法將外來DNA序列導入細胞，如電穿孔、磷酸鈣沉淀、逆轉錄病毒感染、顯微注射、生物轟擊(biolistics)、脂質體轉染、DEAE-葡聚糖轉染或轉移感染(transferrinfection)(見如Neumann等(1982)；Potter等(1984)；Chu等(1987)；Thomas和Capecchi(1987)；Baum等(1994)；Biewenga等，(1997)；Zhang等，(1993)；Ray和Gage(1992)；Lo(1983)；Nickoloff等(1998)；Linney等(1999)；Zimmer和Gruss，(1989)；和Robertson等，(1986))。實施本發(fā)明用于將外來DNA導入細胞的優(yōu)選方法是電穿孔。
1.同源重組同源重組方法通過將REDK基因尋靶載體導入含REDK基因的細胞中來定向對REDK基因進行破壞。該載體使用載體中與REDK基因同源的核苷酸序列靶向REDK基因。這個同源區(qū)域促進載體和內源REDK基因序列之間的雜交。一旦雜交，尋靶載體和基因組序列之間的交換事件的可能性將大大增加。這種交換事件導致載體序列整合進入REDK基因座位及可能的REDK基因功能破壞。
Bradley等(1992)綜述了關于用于尋靶的載體的構建的一般原則?？梢杂糜谕ㄟ^同源重組插入DNA的兩種類型載體是插入載體和置換載體。用于通過同源重組產生本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞的優(yōu)選載體是置換載體。
插入載體是具有雙鏈斷裂的包括REDK基因同源區(qū)域的環(huán)狀DNA分子。同源區(qū)域和內源REDK基因之間雜交后，雙鏈斷裂處的單交換事件導致全部載體序列在交換部位插入到內源基因中。
置換載體是共線性的而不是環(huán)狀的。置換載體整合進入REDK基因需要雙交換事件，即在尋靶載體和REDK基因之間的兩個雜交位點發(fā)生交換。這個雙交換事件導致夾在兩個交換位點之間的載體序列整合進入REDK基因而起初位于兩個交換位點之間的相應內源REDK基因序列發(fā)生缺失(見例如Thomas和Capecchi(1987)；Mansour等(1988)；Mansour等(1990)；和Mansour(1990))。
用于產生本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和動物細胞的尋靶載體中的同源區(qū)域長度通常至少100個核苷酸。最優(yōu)選，同源區(qū)域長度至少1-5千個堿基(kb)。盡管尚未闡明同源區(qū)域所需的最小長度和最小相關程度，但是同源重組的尋靶效率通常與長度和尋靶載體與REDK基因座位之間的相關程度相應。在使用置換載體，且同源重組后一部分內源REDK基因缺失的情況下，另一要考慮的是內源REDK基因的缺失部分的長度。如果內源REDK基因的這個部分長度大于1kb，那么推薦具有長于1kb的同源區(qū)域的尋靶盒來增加重組效率。基于本說明書，關于有效進行同源重組的序列選擇和序列使用的更多指導在文獻中描述(見例如Deng和Capecchi(1992)；Bollag等(1989)；和Waldman和Liskay(1988))。
基于本發(fā)明，本領域技術人員將認識到，各種克隆載體均可以用作本發(fā)明REDK基因尋靶載體構建中的載體主鏈，包括pBluescript相關質粒(如Bluescript KS+11)，pQE70，pQE60，pQE-9，pBS，pD10，phagescript，phix174，pBK Phagemid，pNH8A，pNH16a，pNH18Z，pNH46A，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，和pRIT5 PWLNEO，pSV2CAT，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，PBPV，PMSG，和pSVL，pBR322和基于pBR322的載體，pMB9，pBR325，pKH47，pBR328，pHC79，phage Charon28，pKB11，pKSV-10，pK19相關質粒，pUC質粒，和pGEM系列質粒。這些載體可從各種商業(yè)來源獲得。(如Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN；Qiagen，Valencia，CA；Stratagene，La Jolla，CA；Promega，Madison，WI；和New England Biolabs，Beverly，MA)。然而，任何其它載體，如質粒、病毒，或其部分，都可以使用，只要它們在期望的宿主中可復制和可存活。載體也可以包含使其能夠在基因組待修飾的宿主中復制的序列。這種載體的使用可擴大重組發(fā)生過程中相互作用的時間，增加打靶效率(見Ausubel等，(2001)，Unit 9.16，Fig.9.16.1)。
擴增本發(fā)明尋靶載體所采用的具體宿主并不關鍵。實例包括大腸桿菌K12 RR1(Bolivar等，(1977))，大腸桿菌K12 HB101(ATCC No.33694)，大腸桿菌MM21(ATCC No.336780)，大腸桿菌DH1(ATCC No.33849)，大腸桿菌菌株DH5a和大腸桿菌STBL2?？晒┻x擇地，可以使用宿主如C.cerevisiae或枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)。商業(yè)上(如Stratagene，La Jolla，CA；和Life Technologies，Rockville，MD)可獲得上面提及的宿主。
為了產生尋靶載體，將REDK基因尋靶構建體添加到載體主鏈上，例如上述載體主鏈。本發(fā)明的REDK基因尋靶構建體具有至少一個REDK基因同源區(qū)域。
優(yōu)選，本發(fā)明的尋靶構建體也包括編碼陽性標記蛋白的外源核苷酸序列。載體整合后陽性標記的穩(wěn)定表達賦予細胞可鑒定的特征，理想地，且不損害細胞活力。因此，在置換載體的情況下，將該標記基因置于兩個側翼同源區(qū)域之間，使其可以在雙交換事件之后整合進入REDK基因而該標記基因處于整合后可以表達的位置。
優(yōu)選該陽性標記蛋白提供可選擇表型特征，例如，增加細胞在否則會致死的條件下的存活的特征。因此，通過施加選擇條件，可以基于生存力將穩(wěn)定表達編碼該陽性選擇標記的載體序列的細胞與未成功整合該載體序列的其它細胞分離開來。陽性選擇標記蛋白(和它們的選擇試劑)的實例包括neo(G418或卡那霉素)，hyg(潮霉素)，hisD(組氨醇)，gpt(黃嘌呤)，ble(博萊霉素)，和hprt(次黃嘌呤)(見例如，美國專利5,464,764，和Capecchi(1989))。也可以用作選擇標記的備選的其它陽性標記包括報道基因如β-半乳糖苷酶，螢火蟲螢光素酶或GFP(見例如Robinson，J.Paul(1997)，Unit9.5，和Ausubel，F.M.等(2001)，Unit 9.6)。
上述陽性選擇步驟不能區(qū)分通過定向同源重組在REDK基因座位整合了載體的細胞和在任何染色體位置隨機非同源整合了載體序列的細胞。因此，當使用置換載體進行同源重組產生本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和動物細胞時，還優(yōu)選包括編碼陰性選擇標記蛋白的核苷酸序列。當細胞接觸某些試劑時，陰性選擇標記的表達引起表達該標記的細胞喪失生活力(即在某些選擇條件下，該標記蛋白對細胞是致死的)。陰性選擇標記(和它們的致死試劑)的實例包括單純皰疹病毒胸苷激酶(丙氧鳥苷(gancyclovir)或1，2-脫氧-2-氟-α-d-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶)，Hprt(6-硫代鳥嘌呤或6-硫代黃嘌呤)，和白喉毒素，蓖麻毒素，和胞嘧啶脫氨酶(5-氟胞嘧啶)。
將編碼該陰性選擇標記的核苷酸序列置于置換載體的兩個同源區(qū)域的外部。給定這個位置，如果隨機、非同源重組進行整合，則細胞將僅整合和穩(wěn)定表達該陰性選擇標記；而REDK基因和尋靶構建體中兩個同源區(qū)域之間的同源重組將編碼該陰性選擇標記的序列排除在整合之外。因此，通過施加陰性條件，已經通過隨機、非同源重組整合了尋靶載體的細胞將喪失生活力。
優(yōu)選上述陽性和陰性選擇標記組合存在于用于產生本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞的尋靶構建體中，因為可以通過設計一系列陽性和陰性選擇步驟更有效地僅選擇出通過同源重組經歷載體整合并由此具有潛在破壞的REDK基因的那些細胞。在例如美國專利5,464,764，WO94/06908(對應于美國專利5,859,312)和Valancius和Smithies(1991)中描述了陽性-陰性選擇方案、選擇標記和尋靶構建體的其它實例。
為了載體整合時標記蛋白穩(wěn)定表達，可以設計尋靶載體使得載體整合時，編碼該標記的序列可操作連接內源REDK基因啟動子。然后在正常表達REDK基因的細胞中REDK基因啟動子驅動該標記的表達。可供選擇地，載體的尋靶構建體中的每個標記都可以含有不依賴REDK基因啟動子而驅動表達的其自身啟動子。這后一方案具有允許標記在典型不表達REDK基因的細胞中表達的優(yōu)點(Smith和Berg(1984)；Sedivy和Sharp(1989)；Thomas和Capecchi(1987))。
可用于驅動標記基因表達的外源啟動子包括細胞特異性或階段特異性啟動子、組成型啟動子和誘導型或調節(jié)型啟動子。這些啟動子的非限制性實例包括單純皰疹胸苷激酶啟動子，巨細胞病毒(CMV)啟動子/增強子，SV40啟動子，PGK啟動子，PMC1-neo，金屬硫蛋白啟動子，腺病毒晚期啟動子，痘苗病毒7.5K啟動子，鳥β珠蛋白啟動子，組蛋白啟動子(如小鼠組蛋白H3-614)，β肌動蛋白啟動子，神經元特異性烯醇化酶啟動子，肌肉肌動蛋白啟動子和花椰菜花葉病毒35S啟動子(通常見Sambrook等(1989)，和Ausubel，F.M.等(2001)；Stratagene，La Jolla，CA)。
為了證實產生本發(fā)明遺傳修飾的非人哺乳動物和動物細胞的同時，細胞是否已經將載體序列整合到靶REDK基因座位，可以使用對期望的載體整合事件是特異性的引物或基因組探針與PCR或Southern印跡分析組合來鑒定REDK基因座位中期望的載體整合的存在(Erlich等(1991)；Zimmer和Gruss(1989)；Mouellic等(1990)；和Shesely，等(1991)。
2.基因捕獲基于本說明書，使外來核酸序列插入REDK基因座位來破壞REDK基因的另一可利用方法是基因捕獲。這個方法利用所有哺乳動物細胞中存在的剪接外顯子成mRNA的細胞機器將基因捕獲載體編碼序列以隨機方式插入基因。一旦插入，該基因捕獲載體產生可以破壞該捕獲的REDK基因的突變。與同源重組相比，這個誘變系統(tǒng)產生了大量隨機的突變。因此，為了獲得含有破壞的REDK基因的遺傳修飾細胞，必須鑒定含此特定突變的細胞并將其從在各種基因中含隨機突變的細胞庫中選擇出來。
已經描述了基因捕獲系統(tǒng)和載體用于遺傳修飾小鼠細胞和其它細胞類型(見例如Allen等(1988)；Bellen等(1989)；Bier等(1989)；Bonnerot等(1992)；Brenner等(1989)；Chang等(1993)；Friedrich和Soriano(1993)；Friedrich和Soriano(1991)；Goff(1987)；Gossler等(1989)；Hope(1991)；Kerr等(1989)；Reddy等(1991)；Reddy等(1992)；Skarnes等(1992)；von Melchner和Ruley(1989)；和Yoshida等(1995)。
啟動子捕獲載體(或5’載體)，從5’至3’，含有剪接受體序列，之后是外顯子，其典型特征是翻譯起始密碼子和開放閱讀框架和/或內部核糖體進入位點。通常，這些啟動子捕獲載體不含有啟動子和可操作連接的剪接供體序列。所以，整合到宿主細胞的細胞基因組之后，啟動子捕獲載體序列將攔截上游基因的正常剪接并成為末端外顯子。載體編碼序列的表達依賴于載體以正確閱讀框架整合到被破壞的基因的內含子中。在這種情況下，細胞剪接機器將來自所捕獲的基因的外顯子拼接到載體編碼序列上游(如WO 99/50426和美國專利6,080,576)。
產生類似于上述啟動子捕獲載體的效果的可供選擇方法是在啟動子捕獲載體的剪接受體和翻譯起始密碼子或聚腺苷酸化序列之間的區(qū)域中存在或經工程改造加入了一組嵌套終止密碼子的載體。該編碼序列也可以經工程改造而含有獨立的核糖體進入位點(IRES)，這使得該編碼序列可以以很大程度上不依賴于宿主細胞基因組內的整合位點的方式表達。典型但不是必須的，IRES與一組嵌套終止密碼子聯合使用。
另一類型的基因捕獲方案使用3’基因捕獲載體。這類型載體可操作地組合含有介導相鄰編碼序列表達的啟動子區(qū)域、編碼序列和限定編碼序列外顯子3’末端的剪接供體序列。在整合到宿主細胞基因組中后，從載體啟動子表達的轉錄物與來自捕獲基因(位于整合的基因捕獲載體序列下游)的剪接受體序列拼接。因此，載體整合導致融合轉錄物表達，此轉錄物包括3’基因捕獲盒的編碼序列和任何下游細胞外顯子，包括末端外顯子及其聚腺苷酸化信號。當這種載體整合到基因中，細胞剪接機器將載體編碼序列拼接到所捕獲的基因的3’外顯子上游。這種載體的一個優(yōu)點是3’基因捕獲載體的表達是由基因捕獲盒內的啟動子驅動的因此不需要整合到正常在宿主細胞中表達的基因中(WO 99/50426和美國專利6,080,576)。可以加入到3’基因捕獲載體中的轉錄啟動子和增強子的實例包括上面涉及尋靶載體時討論的那些。
用作啟動子或3’基因捕獲載體的結構成分的病毒載體主鏈可以從可插入到靶細胞基因組的廣泛載體中選擇。合適的主鏈載體包括但不限于單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、假狂犬病病毒、α皰疹病毒載體等等。Caplitt和Loewy(1995)中可找到病毒載體的全面綜述，尤其是適用于修飾非復制性細胞的病毒載體和如何與外源多核苷酸序列的表達聯合來使用這種載體的方法。
優(yōu)選，逆轉錄病毒載體用于基因捕獲。這些載體可以與逆轉錄病毒包裝細胞系如美國專利5,449,614中描述的那些聯合使用。當非小鼠哺乳動物細胞用作遺傳修飾的靶細胞時，兼嗜性或泛嗜性包裝細胞系可用于包裝合適的載體(見例如Ory等1996)。例如美國專利5,521,076中描述了可適應性修改而產生剛才描述的3’基因捕獲載體的代表性逆轉錄病毒載體。
基因捕獲載體可以含有在上面用于同源重組的尋靶載體中討論的一個或多個陽性標記基因。類似于它們在尋靶載體中的應用，這些陽性標記用于基因捕獲載體來鑒定和選擇已經將載體整合到細胞基因組中的細胞。該標記基因可以經工程改造含有IRES，這使得該標記可以很大程度上不依賴于載體整合到靶細胞基因組中的位置來進行表達。
如果基因捕獲載體以相當隨機的方式整合到被感染的宿主細胞的基因組中，則必須從經歷隨機載體整合的細胞群中鑒定具有破壞的REDK基因的遺傳修飾細胞。優(yōu)選，細胞群中的遺傳修飾具有足夠的隨機性和頻率，這樣該群體在細胞基因組的基本上每個基因中都表現出突變，從而使得具有破壞的REDK基因的細胞可能從該群體中被鑒定出來(見WO 99/50426；WO98/14614和美國專利6,080,576)。
可以使用例如反轉錄和PCR鑒定REDK基因序列中的突變，從而鑒定突變細胞群中含有破壞的REDK基因的各個突變細胞系。這個方法可以通過合并克隆來簡化。例如，為了找到含有破壞的REDK基因的單克隆，使用錨定于基因捕獲載體中的一個引物和位于REDK基因序列中的另一個引物實施RT-PCR。陽性RT-PCR結果表明載體序列編碼在REDK基因轉錄物中，表明REDK基因已經被基因捕獲整合事件破壞(如見WO98/14614，美國專利6,080,576)。
3.時間、空間和誘導型REDK基因破壞在本發(fā)明的某些實施方案中，內源REDK基因的功能性破壞發(fā)生在特殊發(fā)育或細胞周期階段(時間破壞)或發(fā)生在特殊細胞類型(空間破壞)。在其它實施方案中，當某些條件存在時，REDK基因破壞是可誘導的。重組酶切除系統(tǒng)，如Cre-Lox系統(tǒng)，可以用于在特定發(fā)育階段，在特定組織或細胞類型，或在特定環(huán)境條件下活化或滅活REDK基因。通常，如Torres和Kuhn(1997)所述實施利用Cre-Lox技術的方法。類似于Cre-Lox系統(tǒng)的方法學也可以利用FLP-FRT系統(tǒng)實施。例如美國專利5,626,159，美國專利5,527,695，美國專利5,434,066，WO 98/29533，美國專利6,228,639，Orban等(1992)；O′Gorman等(1991)；Sauer等(1989)；Barinaga(1994)；和Akagi等(1997)中提供了關于使用重組酶切除系統(tǒng)通過同源重組或病毒插入有條件地破壞基因的更多指導?？梢允褂靡粋€以上重組酶系統(tǒng)遺傳修飾本發(fā)明的非人哺乳動物或哺乳動物細胞。
當使用重組酶系統(tǒng)如Cre-Lox系統(tǒng)通過同源重組以時間、空間或誘導方式破壞REDK基因時，一部分REDK基因編碼區(qū)被包含側接loxP位點的REDK基因編碼區(qū)的尋靶構建體置換。攜帶這個遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞含有側接loxP的功能性REDK基因。REDK基因的時間、空間或誘導破壞由非人哺乳動物或哺乳動物細胞中分別處于期望的空間調節(jié)性、時間調節(jié)性或誘導型啟動子控制下表達的另一轉基因——Cre重組酶轉基因的表達模式引起。Cre重組酶對準loxP重組位點。因此當Cre表達被活化時，LoxP位點發(fā)生重組切除夾在中間的REDK基因編碼序列，導致REDK基因的功能性破壞(見例如Rajewski等(1996)；St.-Onge等(1996)；Agah等(1997)；Brocard等(1997)；Feil等(1996)；和khn等(1995))。
通過標準轉基因技術，或在遺傳修飾的非人哺乳動物的情況下，通過遺傳修飾的非人哺乳動物的雜交(其中一個親本含有側接loxP的REDK基因而另一個含有在期望啟動子控制下的Cre重組酶轉基因)，可產生同時含有Cre重組酶轉基因和側接loxP的REDK基因的細胞。在例如Sauer等(1993)，Gu等(1994)，Araki等(1997)，Dymecki(1996)，和Meyers等(1998)中可找到關于使用重組酶系統(tǒng)和特殊啟動子進行時間、空間或有條件地破壞REDK基因的更多指導。
使用四環(huán)素效應二元系統(tǒng)也可完成REDK基因的誘導型破壞(Gossen和Bujard(1992))。這個系統(tǒng)涉及遺傳修飾細胞，將Tet啟動子導入內源REDK基因調節(jié)元件和表達可受到四環(huán)素控制的阻遏物(TetR)的轉基因。在這種細胞中，給予四環(huán)素將活化TetR，它又抑制REDK基因表達并因此破壞REDK基因(見例如St.-Onge等(1996)和美國專利5,922,927)。
如WO 98/29533和美國專利6,288,639所述，當使用基因捕獲作為遺傳修飾方法時，也可以采用對REDK基因進行時間、空間和誘導型破壞的上述系統(tǒng)來產生本發(fā)明的遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞。
遺傳修飾的哺乳動物細胞的制備上述遺傳修飾方法可用于破壞來自動物(優(yōu)選哺乳動物)的實質上任何類型的體細胞或干細胞中的REDK基因，產生本發(fā)明的遺傳修飾的動物細胞。本發(fā)明的遺傳修飾動物細胞包括但不限于哺乳動物細胞，包括人細胞和鳥類細胞。這些細胞可以通過遺傳修飾任何哺乳動物細胞系，如適應培養(yǎng)的、致瘤的或轉化的細胞系產生，或它們可以分離自攜帶期望的REDK基因修飾的遺傳修飾的非人哺乳動物。
該細胞可以是雜合或純合的REDK基因被破壞的細胞。為了獲得純合的REDK基因被破壞的細胞(-/-)，可對兩個等位基因進行直接相繼打靶。重復使用陽性選擇標記可以利于這個過程。根據這個方案，使用Cre-LoxP系統(tǒng)在破壞一個等位基因后可以去除編碼陽性選擇標記的核苷酸序列。這樣，在定向破壞第二個REDK等位基因的隨后循環(huán)中可使用相同的載體(Abuin和Bradley(1996)；Sedivy等(1999)；Cruz等(1991)；Mortensen等(1991)；te Riele等(1990))。
獲得REDK(-/-)的ES細胞的可供選擇策略為Mortensen等(1992)中描述的方法。在這個方法中，以很高藥物濃度選擇表達選擇性耐藥標記的REDK(+/-)靶克??；這種選擇有利于表達兩個拷貝的耐藥標記編碼序列并由此REDK基因破壞是純合的細胞。此外，遺傳修飾的哺乳動物細胞可由生殖系細胞是REDK(+/-)的非人哺乳動物交配產生的遺傳修飾的REDK(-/-)非人哺乳動物得到，如下詳細討論。
期望的細胞或細胞系的遺傳修飾之后，可以根據本領域已知的標準PCR(用PCR分析)或Southern印跡方法，證實REDK基因座位是修飾部位(見例如美國專利4,683,202；和Erlich等(1991))。如果正常表達REDK基因的細胞中，REDK基因信使RNA(mRNA)水平和/或REDK多肽水平降低，也可以進一步證實REDK基因的功能性破壞。使用反轉錄酶介導的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、Northern印跡分析或原位雜交可獲得REDK基因mRNA水平的測定結果。用例如本領域已知的標準免疫試驗方法可進行細胞產生的REDK多肽水平的定量。這種免疫試驗包括但不限于競爭性和非競爭性試驗系統(tǒng)，其使用技術如RIAs(放射免疫試驗)、ELISAs(酶聯免疫吸附試驗)、“夾心”免疫試驗、免疫放射分析、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散實驗、原位免疫試驗(使用例如膠體金、酶或放射性同位素標記)、Western印跡、2-二維凝膠分析、沉淀反應、免疫熒光試驗、蛋白A試驗和免疫電泳試驗。
本發(fā)明優(yōu)選的遺傳修飾哺乳動物細胞是ES細胞和ES樣細胞。這些細胞源自各物種，例如小鼠(見例如Evans等(1981)；Martin(1981)、豬和綿羊(見例如Notanianni等(1991)；Campbell等(1996))和靈長類動物，包括人(見例如美國專利5,843,780和Thomson et al(1995))的植入前胚胎和胚泡。
這些類型的細胞是多能的，也就是說，在適當條件下，它們能分化成來自所有三個胚層外胚層、中胚層和內胚層的各種細胞類型。依賴于培養(yǎng)條件，ES細胞樣品可如同干細胞一樣進行無限培養(yǎng)，允許在單一樣品內分化出各種不同細胞類型，或定向分化為特定細胞類型，如巨噬細胞樣細胞、神經元細胞、心肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、骨骼肌細胞、角質細胞和造血細胞如嗜酸性細胞、肥大細胞、紅細胞祖先細胞或巨核細胞。可以通過在培養(yǎng)條件中包括特殊生長因子或基質成分完成定向分化，參見例如Keller等(1995)，Li等(1998)，Klug等(1996)，Lieschke等(1995)，Yamane等(1997)，和Hirashima等(1999)的進一步描述。
用于遺傳修飾的具體ES細胞系并不關鍵。例如，對于本發(fā)明使用小鼠ES細胞系的那些實施方案，這種細胞可以包括AB-1(McMahon和Bradley(1990))，E14(Hooper等(1987))，D3(Doetsehman等(1985))，CCE(Robertson等(1986))，RW4(Genome Systems，St.Louis，MO)和DBA/1lacJ(Roach等(1995))。
遺傳修飾的非人哺乳動物的制備本發(fā)明的遺傳修飾哺乳動物細胞可以用于產生本發(fā)明遺傳修飾的非人哺乳動物。在一個實施方案中，根據公開的步驟(見例如Robertson(1987)，71-112頁；Zjilstra等(1989)；和Schwartzberg，等(1989))，本發(fā)明遺傳修飾的ES細胞可以用于產生遺傳修飾的非人哺乳動物。
在優(yōu)選實施方案中，所述ES細胞是小鼠ES細胞并且所述遺傳修飾的非人哺乳動物是小鼠。例如，在產生這種遺傳修飾的小鼠時，使用含有期望的功能性破壞的REDK基因的小鼠ES細胞。首先證實待使用的小鼠ES細胞含有期望的功能性破壞的REDK基因，如上所述。
根據本領域已知方法，REDK破壞的ES細胞接著可以用于產生嵌合小鼠(見例如Capecchi(1989))。例如，該REDK破壞的ES細胞可以注射到合適的胚泡宿主中。實施本發(fā)明所采用的具體小鼠胚泡并不關鍵。根據本說明書，本領域技術人員將知曉這種胚泡的實例，包括來自C57BL6小鼠、C57BL6白化小鼠、Swiss遠交系小鼠、CFLP小鼠和MFI小鼠的胚泡?？晒┻x擇地，ES細胞可以在聚集孔中夾在四倍體胚胎之間(參見Nagy等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908424-8428)。
含遺傳修飾的ES細胞的胚泡或胚胎接著被植入代孕雌性小鼠并允許在子宮中發(fā)育(見例如Hogan，等(1988)；和E.J.Robertson(1987))?？梢院Y選代孕母體所生的后代以鑒定REDK基因被破壞的嵌合后代。通常，這種后代含有來自遺傳修飾的供體ES細胞的一些細胞以及來自最初胚泡的其它細胞。在這種情況下，在已經利用皮毛顏色選擇策略時，最初可以以馬賽克皮毛顏色篩選后代，以區(qū)分來自供體ES的細胞與來自胚泡的其它細胞。可供選擇地，來自后代尾組織的DNA可用于鑒定含有遺傳修飾細胞的小鼠。
可以通過生殖系細胞中含有REDK基因破壞的嵌合小鼠的交配，產生所有生殖系細胞和體細胞均具有REDK基因破壞的后代。REDK基因破壞的雜合小鼠接著可雜交產生純合體(見例如美國專利5,557,032，和美國專利5,532,158)。
作為上述ES細胞技術的一個替代方案，可以使用核轉移將來自一個細胞的遺傳修飾轉移給整個動物?？刹捎眠@個方法產生除小鼠之外的其它遺傳修飾的非人哺乳動物，例如綿羊(見例如McCreath等(2000)；Campbell等(1996)；和Schnieke等(1997))和小牛(Cibelli等(1998))。簡言之，選擇體細胞(如成纖維細胞)或多能干細胞(如ES樣細胞)作為核供體并遺傳修飾使其含有功能性破壞的REDK基因。當將DNA載體插入體細胞使REDK基因突變時，優(yōu)選載體中使用無啟動子的標記，這樣該載體整合到REDK基因中將導致該標記在REDK基因啟動子控制下表達(Sedivy等(1999)；McCreath等(2000))。具有適當被破壞的REDK基因的來自供體細胞的核接著轉移到去核的受精或單性生殖卵母細胞中(Campbell等(1996)；Wilmut等(1997))。胚胎被重建，培養(yǎng)發(fā)育至桑葚胚/胚泡階段，然后轉移到代孕母體中在子宮中進行足月發(fā)育。
本發(fā)明也包括遺傳修飾的非人哺乳動物和遺傳修飾的哺乳動物細胞的后代。無論后代在破壞REDK基因的遺傳修飾方面是雜合的或純合的，由于傳代過程中可能發(fā)生的除了最初的REDK基因遺傳破壞外的突變或環(huán)境影響，它們在遺傳上可能不等同于親代非人哺乳動物和哺乳動物細胞。
使用本領域技術人員已知的技術，可從組織或器官分離非人遺傳修飾動物的細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明遺傳修飾的細胞被無限增殖化。根據這個實施方案，可以通過基因工程將端粒酶基因、癌基因，如mos或v-src，或細胞凋亡抑制基因、如bcl-2基因引入細胞，使細胞無限增殖化?？晒┻x擇地，可以利用本領域技術人員已知的技術，通過與雜交伙伴融合使細胞無限增殖。
本發(fā)明含有破壞的內源REDK基因的遺傳修飾的非人哺乳動物和動物細胞可進一步修飾而表達人REDK序列(這里稱作“人源化”)。人源化細胞的優(yōu)選方法包括通過同源重組用編碼人REDK序列的核苷酸序列(見例如，Jakobsson等(1999))取代內源REDK序列。該載體在5’和3’同源臂和陽性/陰性選擇方案上類似于傳統(tǒng)用作尋靶載體的那些載體。然而，該載體還包括重組后能以人REDK編碼序列置換內源序列或能實現改變內源序列使其編碼人REDK的堿基對改變、外顯子置換或密碼子置換的序列。一旦鑒定到同源重組體，可以使用Cre或Flp介導的定點重組(Dymecki(1996))切除任何選擇序列(如neo)。
當用人REDK序列置換內源序列時，優(yōu)選將此改變導入內源翻譯起始位點的直接下游。此定位可以保存REDK基因的內源時間和空間表達模式。人序列可以是為了正確加工而在3’末端連接polyA尾巴的全長人cDNA序列或整個基因組序列(見例如Shiao等(1999))。在例如Sullivan等(1997)，Reaume等(1996)和美國專利5,777,194中提供了關于如何遺傳修飾細胞和非人哺乳動物以將內源基因表達置換為其人對應物的這些方法的更多指導。
本領域已知的用于產生這種“人源化”生物的另一種方法是兩步法，包括破壞內源基因，隨后通過原核顯微注射將編碼人序列的轉基因導入剔除胚胎中。
遺傳修飾的非人哺乳動物和動物細胞的用途通過調查本發(fā)明REDK(-/-)非人哺乳動物和動物細胞的表型特征，可以進一步說明REDK基因的功能和治療相關性。例如，遺傳修飾的REDK(-/-)非人哺乳動物和哺乳動物細胞可用于確定REDK是否對某些疾病(如貧血)模型中出現的癥狀或表型有引起或預防的作用。如果REDK(-/-)非人哺乳動物或動物細胞與野生型(REDK+/+)或REDK(+/-)非人哺乳動物或動物細胞相比，癥狀或表型不同，那么REDK多肽在調節(jié)與該癥狀或表型相關的功能方面起作用。
通過比較REDK破壞的ES細胞或REDK(-/-)小鼠與野生型ES細胞或小鼠的生物學特征可以調查REDK功能，所述特征如形態(tài)學、組織學、代謝、發(fā)育或行為特征(如適用的話)?？梢杂糜谘芯縍EDK功能的REDK(-/-)ES細胞的示例性生物學特征是REDK破壞對紅細胞分化的影響。例如，通過從培養(yǎng)基中除去白血病抑制因子(LIF)，本發(fā)明的REDK(-/-)ES細胞和野生型細胞可以用于制備胚狀體。接著在紅細胞生成素存在下培養(yǎng)此胚狀體的細胞，通過評估紅色的紅細胞集落的形成，可以比較REDK(-/-)和野生型細胞中紅細胞分化的水平。如圖4所示，與野生型細胞相比，REDK(-/-)ES細胞中紅細胞分化的水平實質上增加。
此外，在一種試劑被鑒定為REDK激動劑或拮抗劑(如，當將該試劑施用于REDK(+/+)或REDK(+/-)非人哺乳動物或動物細胞時，該試劑顯著改變一種或多種REDK多肽活性)的情況下，本發(fā)明的遺傳修飾的REDK(-/-)非人哺乳動物和動物細胞可用于表征由該試劑引起的(除了已知由REDK拮抗作用造成的作用以外的)任何其它作用(即非人哺乳動物和動物細胞可以用作陰性對照)。例如，如果施用該試劑對REDK(+/+)非人哺乳動物或動物細胞引起了未知是否與REDK多肽活性相關的作用時，那么通過將該試劑給予相應的REDK(-/-)非人哺乳動物或動物細胞，可以確定該試劑是否唯一或主要通過調節(jié)REDK來發(fā)揮此作用。如果在REDK(-/-)非人哺乳動物或動物細胞中，這個作用缺乏或明顯降低，那么該作用至少部分受REDK介導。然而，如果REDK(-/-)非人哺乳動物或動物細胞表現出可以與REDK(+/+)或REDK(+/-)非人哺乳動物或動物細胞相比較程度的效應，那么該作用由不涉及REDK信號傳導的途徑來介導。
此外，如果一種試劑被懷疑可能主要通過REDK途徑發(fā)揮作用，那么REDK(-/-)非人哺乳動物和哺乳動物細胞可用作陰性對照來檢驗這個假說。如果該試劑確實通過REDK起作用，那么施用該試劑后，試劑在REDK(-/-)非人哺乳動物和哺乳動物細胞中應該不表現出在REDK(+/+)非人哺乳動物或哺乳動物細胞中觀察到的相同作用。
本發(fā)明遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞也可以用于鑒定在REDK(+/-)或REDK(-/-)非人哺乳動物或哺乳動物細胞中相對于在其野生型對照中表達被差異調節(jié)的基因?；诒景l(fā)明說明書，本領域技術人員已知的技術可用于鑒定這種基因。例如，微陣列可用于鑒定在REDK(+/-)或REDK(-/-)小鼠中表達被差異調節(jié)以補償REDK表達缺陷的基因。使用本領域已知方法可以制備、使用本領域技術人員已知的微陣列和進行結果分析(見例如Aigner，等(2001)；美國專利5,965,352；Schena，等(1995-A)；DeRisi，等(1996)；Shalon，等(1996)；和Schena，等(1995-B)；美國專利5,474,796；Schena，M.，等(1996)；WO 95/251116；WO 95/35505；Heller，R.A.等(1997)；和美國專利5,605,662)。
化學偶聯法和噴墨裝置可以用于在基質表面上合成陣列元件(見如Baldeschweiler，前述引文)。使用熱、UV、化學或機械結合法，類似于點或狹縫印跡的陣列也可以用于在基質表面排列和連接元件。典型的陣列可以手工或使用現有方法及機器來制備，其可以含有任何適當數量的元件。雜交后，除去未雜交的探針，掃描儀用于確定熒光的水平和模式。與微陣列上元件雜交的每個探針的互補性程度和相對豐度可以通過掃描圖像的分析來估計。
全長cDNA、已表達序列標志(EST)或其片段可以構成微陣列的元件?？梢允褂帽绢I域已知的軟件如LASERGENE軟件(DNASTAR)選擇適于雜交的片段。將對應于本發(fā)明核苷酸序列之一的或從本發(fā)明相關cDNA文庫中隨機選擇的全長cDNA、已表達序列標志(ESTs)或其片段排列在適當的基質，如玻片上。使用如紫外線交聯，之后熱和化學處理和隨后干燥(見如Schena，M.等(1995-A)；Shalon，等(1996))將cDNA固定到玻片上。制備熒光探針并用于與基質上的元件雜交。通過本領域熟知方法，例如通過掃描和分析微陣列圖像來分析該基質。
此外，本發(fā)明遺傳修飾的非人哺乳動物和哺乳動物細胞可以用于鑒定在REDK(+/-)或REDK(-/-)非人哺乳動物或哺乳動物細胞中相對在于其各自的野生型對照中，表達或翻譯后修飾發(fā)生改變的蛋白。基于本說明書，本領域技術人員已知的技術可以用于鑒定這種蛋白。例如，蛋白質組陣列可以用于鑒定在REDK(+/-)或REDK(-/-)小鼠中表達譜或翻譯后修飾發(fā)生改變以補償REDK表達缺陷的蛋白質。蛋白質組試驗是本領域技術人員已知的(見例如Conrads等(2002)；Dongre，等(2001)；Van Eyk(2001)；Cole，等(2000)；Araki，等(2000))。
實施例實施例1REDK尋靶載體的制備含有小鼠REDK cDNA序列(Genbank BC006704)第1121-2092位堿基對的1Kb小鼠REDK基因組片段用作探針鑒定來自129/SvJ基因組λ噬菌體文庫(Stratagene)的基因組克隆。分離了含有重疊的12kb和17kb片段的兩個陽性λ克隆。
用EcoRI切割含有12kb片段的克隆得到待用作尋靶載體5’同源臂的5.4Kb片段。接著該5.4Kb片段插入主鏈載體pJNS2frt的EcoRI位點(圖1)。使用Nsil切割含有17kb片段的克隆得到8kb片段。該8kb片段插入pBluescriptllSK+(Stratagene)的Pst位點。用Notl/XhoI限制性酶切此pBluescriptllSK+克隆得到8kb片段，它接著作為3’同源臂插入已經含有5’同源臂5.4kb片段的pJNS2frt主鏈載體的NotI/XhoI位點。如圖2A和2B所示，選擇標記與同源臂處于相反方向。
所得尋靶載體用于制備REDK被破壞的ES細胞，見如下實施例2所述，其中，用新霉素基因PGK-NEO置換大約3kb基因組座位(對應于小鼠REDK肽序列(GenBank登記號BC006704)的氨基酸64-586位)。這導致天然蛋白中從64位異亮氨酸至586位絲氨酸的缺失。
實施例2REDK被破壞的ES細胞的制備步驟A——培養(yǎng)條件。得自129svJ純系小鼠的多能RW4 ES細胞在培養(yǎng)中維持在含Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(#10829-018，Invitrogen Life Technologies，Inc.，Carlsbad，CA)的干細胞培養(yǎng)基(SCML)中絲裂霉素C處理的原代胚胎成纖維細胞(PEF)飼養(yǎng)層上，該培養(yǎng)基補充了15％合乎ES細胞的胎牛血清(#10439-024，InvitrogenLife Technologies)、0.1mM 2-巰基乙醇(#M-7522，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、0.2mM L-谷氨酰胺(#25030-081，Invitrogen LifeTechnologies)、0.1mM改良的Eagle氏培養(yǎng)基(MEM)非必需氨基酸(#11140-050，Invitrogen Life Technologies)、1000u/ml重組小鼠白血病抑制因子(LIF)(ESGRO#ESG-1107，Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)和50μg/ml慶大霉素(#15710-064，Invitrogen Life Technologies)。
步驟B-REDK(+/-)ES細胞的制備。實施例1的REDK尋靶載體(25μg)被線性化并使用BTX Electro Cell操作器600(BTX，Inc.，San Diego，CA)以260V電壓、50μF電容和360歐姆電阻在1×107個RW4 ES細胞和400μl SCML中進行電穿孔。電穿孔后，細胞鋪在四個100mm組織培養(yǎng)皿的SCML中于絲裂霉素C處理的PEF上。電穿孔后二十四小時，向SCML中添加200μg/ml G418(#10131-035，Invitrogen Life Technologies)和2μM丙氧鳥苷開始陽性/陰性選擇。選擇7-9天后，用拉制的微量吸管將G418抗性菌落挑取到24孔組織培養(yǎng)皿的各個孔中并擴增為克隆ES細胞系。
步驟C-REDK(-/-)ES細胞的制備。融解本實施例步驟B的REDK(+/-)ES細胞并在200μg/ml G418/SCML中于PEF上維持2天。接著G418(#11811-031，Invitrogen Life Technologies)的濃度增加到2.5mg/ml。7-10天后，分離存活的ES細胞集落，將2-5×105細胞/ml鋪到2.5mg/mlG418/SCML中的新PEF上。4-7天后，用拉制的微量吸管挑取抗性集落并轉移到24孔組織培養(yǎng)皿的各個孔中并擴增為克隆ES細胞系。
步驟D-基因尋靶的證實。
使用來自8.0kb同源臂下游區(qū)域的1.0kb長的探針，通過SpeI消化的ES細胞DNA的Southern分析，在存活的ES細胞克隆中確定通過同源重組發(fā)生的基因尋靶。內源野生型等位基因產生大約17kb雜交條帶，而被打靶的(破壞的)等位基因由于導入了來自REDK尋靶載體的新SpeI位點而給出10kb預期的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。在5’側通過用來自6.0kb同源臂上游區(qū)域的650bp長探針探測BamHl/Notl雙消化的ES細胞DNA來證實通過同源重組進行的基因尋靶。這種消化對于野生型等位基因產生了17kb條帶而在破壞的等位基因中產生了10kb條帶。使用NEO探針的Southern分析證實了發(fā)生同源尋靶的ES細胞克隆中無一含有多個插入。核型分析證實了無染色體異常發(fā)生。
實施例3REDK被破壞的小鼠的產生將實施例2的REDK(+/-)ES細胞顯微注射到根據Hogan等(1988)從超排卵雌性小鼠(Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington，MA)制備的2.5日齡的C57BL/6胚泡中。所得嵌合小鼠與C57BL/6配偶回交以鑒定種系傳遞。REDK(-/-)小鼠來源于REDK(+/-)雄性和雌性小鼠的雜交。根據Pfizer Institutional Animal Care and Use Committee批準的方案實施所有動物工作。使用根據上面實施例2的Southern分析，以及通過組合兩個PCR反應完成第二代(F2)REDK小鼠的基因分型，其中，一個PCR反應對尋靶載體具特異性，用于擴增500bp片段(接合處PCR正向引物5′-GCCAGCTCATTCCTCCACTCA-3′(引物A)(SEQ ID NO1)，反向引物5′-ATTTCTTTGAGACAGAGACTGC-3′(引物B)(SEQ ID NO2))；第二PCR反應對所破壞的區(qū)域具特異性，用于擴增700bp片段(破壞的區(qū)域的PCR正向引物5′-AGGTCATCGACTTTGGCTCC-3′(引物C)(SEQ ID NO3)，反向引物5′-CACTAGCTAATCAGCTTTGGC-3′(引物D)(SEQ ID NO4))。兩個反應的循環(huán)條件都是30個循環(huán)的94℃30秒、65℃30秒和72℃1分鐘，使用標準PCR反應方案。結果示于圖3中。REDK(-/-)小鼠有生活力并且總的觀察顯示無明顯表型。
實施例4REDK被破壞的和野生型的哺乳動物細胞的表型比較——分化為紅細胞來自129svJ的野生型RW4 ES細胞和根據實施例2制備的REDK(-/-)ES細胞如實施例2的步驟A所述進行培養(yǎng)。從它們各自的PEF飼養(yǎng)層取出野生型和REDK(-/-)ES細胞并在組織培養(yǎng)皿中于補充了15％合乎ES細胞的胎牛血清、0.1mM 2-巰基乙醇(#M-7522，Sigma-Aldrich)、0.2mM L-谷氨酰胺(#25030-081，Invitrogen Life Technologies)、0.1mM MEM非必需氨基酸(#11140-050，Invitrogen Life Technologies)、1000u/ml重組小鼠LIF(ESGRO#ESG-1107，Chemicon International)和50μg/ml慶大霉素(#15710-064，Invitrogen Life Technologies)的Iscove氏改良的Dulbeccoo氏培養(yǎng)基(IMDM)(#31980-030，Invitrogen Life Technologies)中生長兩天。接著分離細胞并在補充了15％合乎ES細胞的胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、300μg轉鐵蛋白(#13008-016，Invitrogen Life Technologies)、50μg/ml L-抗壞血酸(#A-4403，Sigma-Aldrich)、5％PFHM-II(#12040-093，Invitrogen Life Technologies)、4×10-4M一硫代甘油(MTG)和50μg/ml慶大霉素(#15710-064，Invitrogen Life Technologies)的IMDM中懸浮培養(yǎng)生長。細胞在懸液中生長六天(第0天開始)形成細胞聚集的胚樣體(EB)。在第5，6，7和8天用0.05％胰蛋白酶EDTA分離EB并以1×105細胞/35mm皿鋪在IMDM和1％甲基纖維素的培養(yǎng)基(StemCell Technologies，British Columbia，Canada)中，其中培養(yǎng)基補充了10％合乎ES細胞的胎牛血清、5％無蛋白的雜交瘤培養(yǎng)基(PFHM-II)(#12040-093，Invitrogen Life Technologies)、2mM L-谷氨酰胺、5u/ml Epogen(Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA)、100ng/ml干細胞因子(StemCell Technologies)和50μg/ml慶大霉素(#15710-064，Invitrogen LifeTechnologies)。在分化第12-15天計數紅色的紅細胞集落。圖4比較了野生型和REDK(-/-)ES細胞中的紅細胞分化。
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1.遺傳修飾的非人哺乳動物，其中該修飾包括破壞的REDK基因。
2.權利要求1的哺乳動物，其中所述哺乳動物是小鼠。
3.遺傳修飾的動物細胞，其中該修飾包括破壞的REDK基因。
4.權利要求3的動物細胞，其中所述細胞是ES細胞或ES樣細胞。
5.權利要求3的動物細胞，其中所述細胞分離自權利要求1的遺傳修飾的非人哺乳動物。
6.權利要求3的動物細胞，其中所述細胞是造血細胞或睪丸細胞。
7.權利要求3的動物細胞，其中所述細胞是小鼠或人的。
8.鑒定與REDK活性降低或消除相關的生物學特征的方法，包括將權利要求1的遺傳修飾的非人哺乳動物的生物學特征，或權利要求3的遺傳修飾的動物細胞的生物學特征，與適當野生型非人哺乳動物或動物細胞對照的生物學特征進行比較。
9.鑒定由于REDK活性降低或消除而顯示出表達改變的基因的方法，包括將權利要求3的動物細胞中至少一個不是REDK的基因的表達水平與適當野生型動物細胞對照中的該基因表達進行比較。
10.鑒定由于動物細胞中REDK活性降低而顯示出水平改變或翻譯后加工改變的蛋白質的方法，包括將權利要求3的動物細胞中該蛋白質的水平或翻譯后特征與適當野生型動物細胞對照中該蛋白質的水平或翻譯后特征進行比較。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有定向破壞的REDK基因的非人哺乳動物和動物細胞。
文檔編號C12N5/08GK1646906SQ03807632
公開日2005年7月27日 申請日期2003年3月17日 優(yōu)先權日2002年3月30日
發(fā)明者W·H·布里塞特, K·S·紐特, J·E·汗伯, M·R·愛倫, M·L·羅奇 申請人:輝瑞產品公司