專利名稱：一種提高輪枝鏈霉菌產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種提高輪枝鏈霉菌產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，又稱谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(Transglutaminase，EC2.3.2.13，簡稱TGase)，是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。它能催化酪蛋白、乳球蛋白、肌球蛋白、面筋蛋白等蛋白質(zhì)發(fā)生分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)反應(yīng)，從而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，因此在食品工業(yè)中有良好的應(yīng)用前景，但動物和植物組織來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶成本較高，阻礙了它在食品工業(yè)中的進一步推廣。
1989年日本味之素公司和天野制藥公司合作從5000多株放線菌中篩選出產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力較高的輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)，開創(chuàng)了微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的發(fā)酵法生產(chǎn)。隨后許多學(xué)者致力于微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的發(fā)酵生產(chǎn)研究1996年Zhu等運用黑箱模型設(shè)計優(yōu)化了輪枝鏈霉菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基；1997年Junqua等運用試驗設(shè)計方法優(yōu)化了培養(yǎng)基；1996年吳介文提出添加蛋氨酸或甘氨酸有利于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的產(chǎn)生；1998年Zhu等運用質(zhì)量平衡理論分析了輪枝鏈霉菌發(fā)酵過程中氨基酸的代謝情況，提出流加硫酸銨促進產(chǎn)酶的方法；2001年常中義等提出人造沸石可解除銨離子的阻遏作用，從而提高產(chǎn)酶；2002年鄭美英等研究了pH控制在微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
在對輪枝鏈霉菌SK4.001(江南大學(xué)食品科學(xué)研究室保存)產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的研究中，發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)酶不穩(wěn)定的問題。在分別研究了菌種(包括菌種的傳接代數(shù)、保存方式、接種量等)、氮源、水質(zhì)等對SK4.001發(fā)酵生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶穩(wěn)定性的影響后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中金屬離子的含量是影響產(chǎn)酶穩(wěn)定性的主要因素。研究金屬離子在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)中的作用在國內(nèi)外尚屬首次，本發(fā)明重點研究了Zn2+對菌株SK4.001生長及產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的影響，并運用螯合劑EDTA對酶液進行透析的方法初步研究了Zn2+的作用機理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高輪枝鏈霉菌產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的方法，首次提出在液體培養(yǎng)基中添加一定濃度Zn2+離子，可提高菌體生長量和提高酶活力。
本發(fā)明的技術(shù)方案以輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)為生產(chǎn)菌種，如以輪枝鏈霉菌SK4.001為生產(chǎn)菌種，在液體培養(yǎng)基中添加Zn2+離子，添加量為3ug/mL-50ug/mL。
當培養(yǎng)基中Zn2+添加量由Oug/mL增加到3ug/mL，菌體生長量由10.23mg/mL增為16.99mg/mL。Zn2+含量繼續(xù)增加，菌體生長量改變不明顯。當液體培養(yǎng)基中Zn2+添加量由3ug/mL增加到8ug/mL時，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活迅速提高，由2.289U/mL提高至4.723U/mL，提高了2.06倍。
1.菌種輪枝鏈霉菌SK4.001(江南大學(xué)食品科學(xué)研究室保存)2.培養(yǎng)基組成斜面培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(g/L)甘油16-25蛋白胨15-30酵母浸膏1.6-2.5硫酸鎂1.6-2.5磷酸氫二鉀1.6-2.53.培養(yǎng)方法以上各培養(yǎng)基均于121℃滅菌20min后使用，取一環(huán)新鮮斜面菌種，接入裝有25mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的條件下培養(yǎng)24h。以4％的接種量接入裝有25mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。在30℃、210rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)36-72h。
4.液體培養(yǎng)基中Zn2+的添加利用原子吸收分光光度法測得起始液體培養(yǎng)基中Zn2+的含量在0.15ug/mL左右，分別加入不同量的ZnSO4，使Zn2+添加量為3ug/mL-50ug/mL，則液體培養(yǎng)基中Zn2+的含量達到3.15ug/mL-50.15ug/mL。
5.乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)透析室溫下，25mL酶液在含10mmol/LEDTA、pH7.0的0.05mol/L三(羥甲基)氨基甲烷-HCL(Tris-HCL)緩沖液中透析2h，再在含1mmol/LEDTA的pH7.0、0.05mol/LTris-HCL緩沖液中于4℃透析過夜，然后在不含EDTA的pH7.0、0.05mol/LTris-HCL緩沖液中反復(fù)透析，脫去多余的EDTA和EDTA的螯合物。
分析方法
1.菌體量的測定取5mL發(fā)酵液，離心，將沉淀部分加入30倍水和6mL 1M鹽酸，激烈攪拌后，加4mL 1M氫氧化鈉，離心(2500rpm，10min)，用水洗沉淀，用已恒重的濾紙過濾。置于100℃烘箱中加熱至恒重。在干燥器中降至室溫后稱重，減去濾紙重量即為菌體干重。以mg/mL計。
2.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活測定比色法測定以CBZ-Gln-Gly為作用底物，以L-谷氨酸-γ-單羥氨酸作標準曲線.
酶活的定義37℃、1min生成1umol L-谷氨酸-γ-單羥氨酸的量定義為一個酶活單位。
3.殘余甘油測定改進的多元醇比色法Zn2+對輪枝鏈霉菌SK4.001培養(yǎng)的影響1.對輪枝鏈霉菌SK4.001菌體生長的影響表1.Zn2+添加量對細胞生長量的關(guān)系

由上表可以看出Zn2+的添加量由0ug/mL增加到1ug/mL時，最大生物量增加很快，從10.23mg/mL增加到15.60mg/mL，超過50％。當Zn2+添加量加到3ug/mL時，最大生物量略有增長，達到16.99mg/mL。再進一步增加Zn2+濃度，最大生物量的改變并不明顯。
2.對甘油消耗量的影響Zn2+缺乏時，甘油的利用并不十分完全。發(fā)酵60h后，殘余甘油的含量為2.56mg/mL。在起始液體培養(yǎng)基中加入Zn2+后，甘油的代謝利用率明顯增加，Zn2+添加量為1ug/mL時，發(fā)酵36h后殘余甘油的含量為0.076mg/mL。之后殘余甘油含量相對穩(wěn)定，維持在0.078mg/mL左右。Zn2+添加量為3、6、8、9ug/mL時的甘油代謝沒有明顯的區(qū)別，殘余甘油含量均在32h左右達到最低，最低殘余甘油含量維持在0.045mg/mL左右。
3.對pH的影響
Zn2+缺乏時，pH呈下降趨勢，改變幅度不大。含有Zn2+時，發(fā)酵液的pH變化規(guī)律表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，不同Zn2+含量間的區(qū)別并不明顯。
4.對輪枝鏈霉菌SK4.001產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的影響表2.Zn2+添加量對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響

當Zn2+缺乏時，輪枝鏈霉菌SK4.001對甘油的利用不完全，pH變化異常，SK4.001的代謝是病態(tài)的，不產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。Zn2+添加量為1ug/mL時，SK4.001代謝正常，但酶活很低，隨著Zn2+含量的增加，酶活也隨之增加。當Zn2+添加量達到8ug/mL時，酶活達到最高。進一步增加Zn2+含量，酶活的改變并不很明顯。
5.螯合劑EDTA透析對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響表3.EDTA透析對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響

結(jié)果表明EDTA對酶活并無明顯負面影響，酶活的稍許下降與發(fā)酵液的不同保存環(huán)境及檢測時的誤差有關(guān)。
綜上結(jié)果，欲保證SK4.001的正常生長，并獲得較高的生物量，發(fā)酵培養(yǎng)基中Zn2+的含量不應(yīng)低于3ug/mL。進一步增加Zn2+的含量可提高轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活。8ug/mL的添加量可獲得最高的酶活，達到4.723U/mL。
Zn2+在SK4.001發(fā)酵生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的作用可分為二其一，作為一種營養(yǎng)成分滿足SK4.001菌體生長的需要；其二，具有促進SK4.001產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶的作用。
金屬離子常在酶蛋白中起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和作為活性中心的作用，或兼而有之。Zn2+在生物大分子中與肽鏈作用形成穩(wěn)定的共價化合物十分常見。但發(fā)酵液的EDTA透析表明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶活并沒有受到EDTA的明顯影響，即Zn2+并不是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的構(gòu)成部分或活性中心。
Zn2+能抑制轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶的活性，酶液中含有1mmol/L的Zn2+時，85％的酶活被抑制。故而推測發(fā)酵培養(yǎng)中酶活的增加是因為酶產(chǎn)量的增加，而非Zn2+對酶活性的調(diào)控。
本發(fā)明的有益效果Zn2+在輪枝鏈霉菌SK4.001生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶的液體培養(yǎng)基中含量為3.15ug/mL時，即可獲得較高菌體量，為16.9.9mg/mL。進一步提高Zn2+的含量，相對于Zn2+含量為3.15ug/mL時而言，菌體量增加不明顯，但轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶的酶活迅速提高。發(fā)酵培養(yǎng)基中Zn2+的添加量為8ug/mL時，轉(zhuǎn)谷氨酰氨酶的酶活可達到4.723U/mL，是Zn2+添加量為3ug/mL時的2.06倍。其它金屬離子的拮抗作用對Zn2+的吸收及產(chǎn)酶的促進作用沒有負面影響，可以確定Zn2+不是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的組成部分或活性中心，其對SK4.001產(chǎn)微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的促進機理有待進一步研究。
具體實施例方式
實施例1輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)SK4.001為生產(chǎn)菌種，液體培養(yǎng)基組成為上述組成，添加ZnSO4于液體培養(yǎng)基中，使其中Zn2+添加量為3ug/mL，培養(yǎng)基于121℃滅菌20min后使用，取一環(huán)新鮮斜面菌種，接入裝有25mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的條件下培養(yǎng)24h。以4％的接種量接入25mL液體培養(yǎng)基中，在30℃、210rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)60h，得最大細胞干重16.99mg/mL，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活為2.289U/mL。
實施例2添加ZnSO4于液體培養(yǎng)基中，使其中Zn2+添加量為8ug/mL，其余操作同實施例1，得最大細胞干重17.11mg/mL，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活為4.723U/mL。
權(quán)利要求
1.一種提高輪枝鏈霉菌(Streptoverticillim)產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的方法，其特征是以輪枝鏈霉菌(Straptoverticillim)為生產(chǎn)菌種，在液體培養(yǎng)基中添加Zn2+離子，添加量為3ug/mL-50ug/mL，Zn2+添加量為3ug/mL，菌體生長量為16.99mg/mL，Zn2+添加量大于3ug/mL時，菌體生長量改變不明顯，當液體培養(yǎng)基中Zn2+添加量由3ug/mL增加到8ug/mL時，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活迅速提高，由2.289U/mL提高至4.723U/mL，提高了2.06倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是輪枝鏈霉菌為SK4.001，江南大學(xué)食品科學(xué)研究室保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述培養(yǎng)基組成為斜面培養(yǎng)基高氏一號培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基(g/L)甘油16-25，蛋白胨15-30，酵母浸膏1.6-2.5，硫酸鎂1.6-2.5，磷酸氫二鉀1.6-2.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是培養(yǎng)方法為各培養(yǎng)基均于121℃滅菌20min后使用，取一環(huán)新鮮斜面菌種，接入裝有25mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30℃、210rpm的條件下培養(yǎng)24h，以4％的接種量接入裝有25mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中.在30℃、210rpm的條件下連續(xù)培養(yǎng)36-72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述液體培養(yǎng)基中添加Zn2+離子，分別加入不同量的ZnSO4使液體培養(yǎng)基中Zn2+的添加量達到3ug/mL-50ug/mL。
全文摘要
一種提高輪枝鏈霉菌產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。以輪枝鏈霉菌(Streptoverticillium)為生產(chǎn)菌種，如以輪枝鏈霉菌SK4.001為生產(chǎn)菌種，在培養(yǎng)基中加入不同添加量的Zn
文檔編號C12N9/78GK1492044SQ0315291
公開日2004年4月28日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月2日
發(fā)明者江波, 王璋, 曾新, 江 波 申請人:江南大學(xué)