專利名稱：發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)及其培養(yǎng)產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)特別涉及一種發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及發(fā)菜多糖的生產(chǎn)技術(shù)。
背景技術(shù)：
發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)是一種陸生性藍(lán)藻，富含多糖、氨基酸和微量元素，長期以來作為一種名貴食品受到人們的喜愛。近年來，發(fā)菜的藥用價(jià)值日益受到重視，發(fā)菜中所含多糖物質(zhì)可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，發(fā)菜熱水抽提物經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具有抗腫瘤活性。從發(fā)菜中提取出一種多糖Nostoflan，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對一些具封套的病毒如1型單純皰疹病毒、人巨細(xì)胞病毒和流感病毒等具有抗病毒活性，并可殺死離體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞。國外已開發(fā)出以發(fā)菜為主要原料的保健品，市場十分暢銷。
目前發(fā)菜多糖是從發(fā)菜藻體中提取。發(fā)菜多糖的生產(chǎn)及一些功能性食品、藥物的生產(chǎn)和開發(fā)均需要大量的發(fā)菜作為原料。發(fā)菜迄今不能人工種植生產(chǎn)，而發(fā)菜有著特殊的生態(tài)環(huán)境要求和地理分布，主要生長在荒漠——半荒漠草原地帶，生長極為緩慢，自然蘊(yùn)藏量相當(dāng)有限。對發(fā)菜無節(jié)制地大量采收已使發(fā)菜資源遭受嚴(yán)重破壞，以致瀕臨枯竭。寧夏是我國發(fā)菜主產(chǎn)地之一，據(jù)調(diào)查，寧夏20世紀(jì)60年代發(fā)菜生長地面積約360.7萬公頃，至80年代中期減少到173.3萬公頃，到20世紀(jì)90年代未已減至不足100萬公頃，發(fā)菜的產(chǎn)量則從70年代的每公頃3-7.5公斤下降至目前的每公頃約0.1公斤。對發(fā)菜的不合理采收還對發(fā)菜生長地的植被造成嚴(yán)重破壞，致使土地沙化，生態(tài)環(huán)境日益惡化。鑒于這一局面，我國政府從2000年7月起全面禁止發(fā)菜的采收、加工和銷售，以發(fā)菜為原料的生產(chǎn)因此而無法進(jìn)行，發(fā)菜多糖作為一種具有良好應(yīng)用前景的生物活性物質(zhì)，其開發(fā)和生產(chǎn)因沒有原料來源而難以開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對上述問題進(jìn)行的研究，其目的是改變發(fā)菜多糖只能從發(fā)菜藻體中提取的現(xiàn)狀，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離得到發(fā)菜細(xì)胞，對發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)物、培養(yǎng)液中提取發(fā)菜多糖或直接作為功能性食品、藥物生產(chǎn)的原料，從根本上解決了原料問題對發(fā)菜多糖應(yīng)用的制約。
本發(fā)明的技術(shù)方案是以發(fā)菜細(xì)胞為培養(yǎng)材料，步驟如下(1)取少許發(fā)菜藻體經(jīng)表面消毒沖洗后，從中進(jìn)行細(xì)胞分離，得到具有旺盛生命力的發(fā)菜細(xì)胞；(2)將發(fā)菜細(xì)胞接入培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)得到發(fā)菜細(xì)胞種，細(xì)胞種置8-12℃，弱光下保藏，一月轉(zhuǎn)接一次，或采用冷凍干燥保藏法長期保藏；(3)用發(fā)菜細(xì)胞種擴(kuò)培，再接入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)收集得到細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明得到的細(xì)胞培養(yǎng)物、培養(yǎng)液可直接提取發(fā)菜多糖或直接作為功能性食品、藥物生產(chǎn)的原料。
發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)具體方法如下(1)分離發(fā)菜細(xì)胞稱取少量發(fā)菜于三角瓶中，表面消毒沖洗后，用酶解法或機(jī)械分離法進(jìn)行細(xì)胞分離。酶解法無菌條件下加入過濾除菌的離析酶溶液30mL，轉(zhuǎn)速120r/min振蕩1-2小時(shí)，最后一次更換酶液后加入玻璃珠，使細(xì)胞分散，經(jīng)過濾后，過濾液離心收集發(fā)菜細(xì)胞；機(jī)械分離法加適量生理鹽水或培養(yǎng)基，充分研磨，過濾，過濾液離心收集發(fā)菜細(xì)胞。
(2)培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞種將少量發(fā)菜細(xì)胞接入培養(yǎng)基中，pH8.5-9.0，溫度24-32℃，時(shí)間為15-18天培養(yǎng)得到發(fā)菜細(xì)胞種，細(xì)胞種置8-12℃，弱光下保藏，一月轉(zhuǎn)接一次，或采用冷凍干燥保藏法長期保藏；(3)擴(kuò)培——培養(yǎng)——培養(yǎng)物將少量保藏的發(fā)菜細(xì)胞種擴(kuò)培后，接入培養(yǎng)基中，pH8.5-9.0，培養(yǎng)溫度為24-32℃，光照培養(yǎng)時(shí)間為10-15天。培養(yǎng)液離心處理后，棄上清液，得細(xì)胞培養(yǎng)物。
從本發(fā)明得到的細(xì)胞培養(yǎng)物、培養(yǎng)液中提取發(fā)菜多糖具體方法如下培養(yǎng)物加水，沸水浴后，離心，或培養(yǎng)液離心，上清液濃縮，加入乙醇，沉淀離心，沉淀物用無水乙醇洗滌，真空干燥，得到發(fā)菜多糖或直接作為食品、保健品或藥物生產(chǎn)的原料。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是由于采用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)發(fā)菜多糖，改變了只能從發(fā)菜藻體中提取多糖的現(xiàn)狀；發(fā)菜細(xì)胞種可長期保藏，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)直接用于生產(chǎn)，不消耗野生發(fā)菜資源，不破壞發(fā)菜生長地生態(tài)環(huán)境；通過調(diào)整培養(yǎng)基組成及控制培養(yǎng)條件，可改變細(xì)胞培養(yǎng)物成分組成，使某些特定細(xì)胞產(chǎn)物得到積累；細(xì)胞培養(yǎng)物、培養(yǎng)液可提取發(fā)菜多糖或直接作為食品、保健品或藥物生產(chǎn)的原料。解決了因禁止發(fā)菜的采收、加工和銷售，而使發(fā)菜為原料的生產(chǎn)無法進(jìn)行，從而限制了發(fā)菜多糖作為一種具有良好應(yīng)用前景的生物活性物質(zhì)其應(yīng)用開發(fā)研究受到制約的問題等。節(jié)省了發(fā)菜自然資源，使發(fā)菜資源免受破壞，保護(hù)了生態(tài)環(huán)境。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)分離發(fā)菜細(xì)胞稱取1g發(fā)菜于三角瓶中，表面消毒，無菌水沖洗。無菌條件下加入過濾除菌的離析酶溶液30mL，酶溶液中含果膠酶0.5％，甘露醇0.8％，硫酸葡聚糖鉀1％。三角瓶置于搖床上，轉(zhuǎn)速120r/min，沖程4-5cm，溫度25℃，時(shí)間2小時(shí)，其間每30min更換一次酶液，第三次更換酶液后三角瓶中加入直徑2mm的玻璃珠。兩小時(shí)后酶解液用800目金屬網(wǎng)過濾，過濾液3000r/min離心15分鐘，收集發(fā)菜細(xì)胞。
(2)培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞種發(fā)菜細(xì)胞用培養(yǎng)基沖洗3次后，接入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成碳酸氫鈉1.2％，硝酸鈉0.12％，硝酸銨0.03％，添加磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅、鉬酸鈉、硼酸、氯化鈷，pH8.5，24℃，4000lux光強(qiáng)靜置培養(yǎng)10天，光暗比12∶12，得發(fā)菜細(xì)胞種。細(xì)胞種置8℃，500lux弱光下保藏，一月轉(zhuǎn)接一次，或采用冷凍干燥保藏法長期保藏。
(3)擴(kuò)培——培養(yǎng)——培養(yǎng)物先將發(fā)菜細(xì)胞種擴(kuò)培，然后以15％接種量接入15L氣升式光反應(yīng)器中，其培養(yǎng)基的組成是碳酸氫鈉1.2％，硝酸鈉0.18％，添加磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂，pH8.5，培養(yǎng)溫度為28℃，光照培養(yǎng)10天。培養(yǎng)液4000r/min離心30分鐘，棄上清液，得發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物。
實(shí)施例2稱取1g發(fā)菜，表面滅菌后置于研缽中，加入約30mL無菌生理鹽水或培養(yǎng)基，無菌條件下充分研磨，800目金屬網(wǎng)過濾，過濾液離心，收集發(fā)菜細(xì)胞，培養(yǎng)得發(fā)菜細(xì)胞種。細(xì)胞種置10℃保藏，或擴(kuò)培后接入培養(yǎng)基中，接種量20％，pH9，培養(yǎng)溫度為30℃，光照培養(yǎng)15天，其余同實(shí)施例1。
實(shí)施例3發(fā)菜細(xì)胞種置12℃保藏。細(xì)胞種擴(kuò)培后以15％接種量接入反應(yīng)器中，培養(yǎng)基組成碳酸氫鈉1.6％，硝酸鈉0.12％，硝酸銨0.03％，添加磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂，pH8.75，32℃，4500lux光強(qiáng)，光暗比16∶8，光照培養(yǎng)12天。其余同實(shí)施例1或?qū)嵤├?。
實(shí)施例4發(fā)菜細(xì)胞種擴(kuò)培后以15％接種量接入反應(yīng)器中，培養(yǎng)基組成碳酸氫鈉1.6％，添加磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸鎂，硝酸鈉，硫酸亞鐵。光照培養(yǎng)12天。其余同實(shí)施例1或?qū)嵤├?。
實(shí)施例5提取發(fā)菜多糖培養(yǎng)物加水，置沸水浴中1小時(shí)，3000r/min離心30分鐘，上清液80℃濃縮4倍，加入2倍體積的95％乙醇，沉淀8h，4000r/min離心15分鐘，沉淀物用無水乙醇洗滌，55℃，750mmHg真空干燥，得到發(fā)菜多糖，其余同實(shí)施例1或2、或3、或4。
實(shí)施例6培養(yǎng)液3000r/min離心30分鐘，取上清液，濃縮4倍，加入2倍體積的95％乙醇，沉淀8小時(shí)，4000r/min離心15分鐘，沉淀物用無水乙醇洗滌，55℃，750mmHg真空干燥，提取發(fā)菜多糖，其余同實(shí)施例1或2、或3、或4。
實(shí)施例7培養(yǎng)液膜式蒸發(fā)器蒸發(fā)濃縮，所得藻泥60℃，750mmHg真空干燥，得發(fā)菜藻粉，用于生產(chǎn)保健品或藥品。其余同實(shí)施例1或2、或3、或4。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)，其特征是以發(fā)菜細(xì)胞為培養(yǎng)材料，具體包括如下步驟(1)取少許發(fā)菜經(jīng)表面消毒沖洗后，從中進(jìn)行細(xì)胞分離，得到具有旺盛生命力的發(fā)菜細(xì)胞；(2)將發(fā)菜細(xì)胞接入培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)得到發(fā)菜細(xì)胞種，細(xì)胞種置8-12℃，弱光下保藏，一月轉(zhuǎn)接一次，或采用冷凍干燥保藏法長期保藏；(3)發(fā)菜細(xì)胞種經(jīng)擴(kuò)培，再接入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)收集得到細(xì)胞培養(yǎng)物；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)，其特征是從發(fā)菜藻體中進(jìn)行細(xì)胞分離得到的發(fā)菜細(xì)胞是用酶解法或機(jī)械分離法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)，其特征在于將分離得到的發(fā)菜細(xì)胞接入培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基以碳酸鹽為碳源，以一種或兩種硝酸鹽或銨鹽為氮源，添加磷酸鹽、鉀鹽、硫酸鹽、鎂鹽、鐵鹽、鉬酸鈉、硼酸、氯化鈣、氯化鈷中的部分或全部；培養(yǎng)溫度為24-32℃，光照培養(yǎng)時(shí)間10-15天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)，其特征在于將發(fā)菜細(xì)胞種擴(kuò)培后，接入培養(yǎng)基中采用光反應(yīng)器對發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；以碳酸鹽或二氧化碳為碳源，不加氮源或以一種或兩種硝酸鹽和銨鹽為氮源，添加礦質(zhì)元素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所得到的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物，其特征是從細(xì)胞培養(yǎng)物、培養(yǎng)液中直接提取發(fā)菜多糖或直接作為食品、保健品或藥物生產(chǎn)的原料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)及其培養(yǎng)產(chǎn)物。解決了發(fā)菜多糖只能從發(fā)菜藻體中提取的問題。技術(shù)方案是從發(fā)菜藻體中進(jìn)行細(xì)胞分離，得到具有旺盛生命力的發(fā)菜細(xì)胞，將其接入培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)得到發(fā)菜細(xì)胞種，置8－12℃，500lux弱光下保藏，一月轉(zhuǎn)接一次，或用冷凍干燥保藏法長期保藏；細(xì)胞種擴(kuò)培后進(jìn)行培養(yǎng)，得到發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物；從細(xì)胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)液中提取發(fā)菜多糖。本發(fā)明改變了只能從發(fā)菜藻體中提取發(fā)菜多糖的現(xiàn)狀；細(xì)胞種可長期保藏，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)直接用于生產(chǎn)，不消耗野生發(fā)菜資源，不破壞發(fā)菜生長地生態(tài)環(huán)境；調(diào)整培養(yǎng)基組成及控制培養(yǎng)條件，可改變細(xì)胞培養(yǎng)物成分，使某些特定細(xì)胞產(chǎn)物得到積累；細(xì)胞培養(yǎng)物可直接作為生產(chǎn)功能性食品或藥物的原料。
文檔編號C12P19/00GK1530439SQ0311910
公開日2004年9月22日 申請日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月14日
發(fā)明者賈士儒, 蘇建寧, 喬長晟 申請人:天津科技大學(xué)