專利名稱：一種抗水稻紋枯病和稻瘟病的鏈霉菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鏈霉菌屬的菌株，特別是涉及一種利用鏈霉菌的篩選技術(shù)，通過(guò)PAD和YPTG平板應(yīng)用點(diǎn)接法初篩，獲得對(duì)水稻紋枯病病原菌和水稻稻瘟病病原菌具有強(qiáng)烈拮抗作用的鏈霉菌菌株。
背景技術(shù)：
水稻紋枯病(Thanatephorus cucumeris)、稻瘟病(Pyricularia)是我國(guó)稻區(qū)的兩大病害。四川稻區(qū)高溫、高濕，自1987年以來(lái)，水稻紋枯病、水稻稻瘟病的發(fā)生情況就年年達(dá)到偏重程度。由于目前推廣的水稻品種缺乏高抗紋枯病基因，而且利用抗病品種尚未獲得較滿意的防病效果，加之，隨著矮桿品種和雜交水稻的大面積推廣及受稻田管理等措施的影響，因此水稻紋枯病的發(fā)生面積正在逐年擴(kuò)大，由此導(dǎo)致我國(guó)水稻年產(chǎn)量的損失率在10％以上。當(dāng)前，在實(shí)際生產(chǎn)中主要是用井岡霉素來(lái)防治該病，雖然其效果較好，但因其單一性、長(zhǎng)期使用，已導(dǎo)致紋枯病菌產(chǎn)生抗藥性。而在四川稻區(qū)，水稻稻瘟病以ZB15生理小種的危害性最強(qiáng)，但目前從水稻植株克隆該抗稻瘟病的基因還有一段很長(zhǎng)的距離，所以，轉(zhuǎn)抗稻瘟病水稻的基因工程受限，而一般的化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人類健康和環(huán)境都會(huì)造成極大的危害。眾所周知，鏈霉菌菌類是產(chǎn)生小分子抗生素物質(zhì)的重要菌類，但利用微生物進(jìn)行農(nóng)作物病蟲害的防治中，對(duì)球孢鏈霉菌的研究和利用還沒(méi)有見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用四川水稻紋枯病病原菌AG-1及水稻稻瘟病病原菌ZB15作為指示菌株，從土壤中分離鏈霉菌菌株，以獲得對(duì)水稻紋枯病、水稻稻瘟病具有強(qiáng)拮抗作用的菌株。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下本發(fā)明屬于鏈霉菌屬的菌種，該菌株為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus H50)(以下簡(jiǎn)稱為H50菌株)，是從我國(guó)四川省生態(tài)地區(qū)的土壤中分離、篩選出的，已于2003年5月2日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 203034。
本發(fā)明所述的H50菌株具有下述性質(zhì)A、形態(tài)特征在高氏一號(hào)瓊脂和葡萄糖天門冬素瓊脂上28℃培養(yǎng)7～70天后，用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡分別觀察菌絲的形態(tài)和孢子形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該菌株基內(nèi)菌絲體無(wú)橫隔，不斷裂；該菌的氣生菌絲分枝較多，孢子絲直立或柔曲；孢子球形或卵圓形，表面光滑。
B、培養(yǎng)特征菌株在八種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果a、高氏合成一號(hào)瓊脂氣生菌絲為黃白色，基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素，呈無(wú)色，不產(chǎn)生可溶性色素。
b、葡萄糖天門冬素瓊脂氣生菌絲為淡灰色，基內(nèi)菌絲為淺黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。
c、蔗糖硝酸鹽瓊脂氣生菌絲為微黃綠色，基內(nèi)菌絲為淺黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。
d、淀粉銨鹽瓊脂氣生菌絲為秸草色，基內(nèi)菌絲為灰黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。
e、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂氣生菌絲為米黃色，基內(nèi)菌絲為淺黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。
f、酵母精麥芽精瓊脂氣生菌絲為米黃色，基內(nèi)菌絲為米黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。
g、燕麥粉瓊脂氣生菌絲為淺灰黃綠色，基內(nèi)菌絲為淺淺褐色，不產(chǎn)生可溶性色素。
h、馬鈴薯浸汁瓊脂氣生菌絲為淺黃褐色，基內(nèi)菌絲為淺褐色，不產(chǎn)生可溶性色素。
C、細(xì)胞胞壁化學(xué)成分分析菌株全細(xì)胞水解液含有LL-二氨基庚二酸(LL-DAP)、甘氨酸；無(wú)特征性糖(糖型C)；菌株含有磷脂酰乙醇胺(PE)為II型。
D、生理生化特征在明膠液化、牛奶凍化、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)中呈陽(yáng)性，而不能使牛奶凝固，不能在纖維素上生長(zhǎng)，不產(chǎn)生H2S，不能利用酪氨酸。但能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、L-鼠李糖、D-木糖和半乳糖，不能利用肌醇和棉子糖。
E、菌種鑒定結(jié)果根據(jù)形態(tài)特征與化學(xué)分類相結(jié)合的定屬原則，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明“H50菌株”基內(nèi)菌絲無(wú)橫隔，不斷裂，無(wú)孢囊，氣生菌絲分枝較多，孢子絲直或柔曲，細(xì)胞壁化學(xué)組分為I型，糖型C，磷酸類脂II型(含PE)，其基本特征符合鏈霉菌屬(Streptomyces)。根據(jù)培養(yǎng)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)定種原則，其特征與球孢鏈霉菌特征相符，定名為球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)。
本發(fā)明能拮抗水稻紋枯病和稻瘟病的病原菌，尤其是對(duì)四川稻區(qū)立枯絲核病原菌融合菌絲群AG-1和危害嚴(yán)重的ZB15稻瘟病生理小種具有強(qiáng)烈的拮抗作用，其防治效果好，抑菌率達(dá)到65％以上，有效地解決了危害水稻的兩大病蟲害。


圖1為H50菌株的形態(tài)(包括A和B)圖2為H50菌株對(duì)水稻紋枯病、稻瘟病病原菌的拮抗作用(包括C、D和E)圖3為H50菌株對(duì)病原菌的致畸效應(yīng)(包括F和G)其中，A為菌株的孢子表面特征(×10000)，B為菌株的菌絲體形態(tài)(×750)，C為菌株對(duì)水蹈紋枯病菌的拮抗，D為菌株對(duì)水稻蹈瘟病菌的拮抗，E為CK紋枯病菌，F(xiàn)為H50菌絲縊縮將斷裂(2780×)，G為H50原生質(zhì)正在溢出(2500×)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1H50菌株的篩選方法將從四川溫江各試驗(yàn)地采集的土壤挑取適量置于裝有無(wú)菌水的250毫升錐形瓶中，25℃下以120轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12小時(shí)，然后分別吸取1ml菌液，用濃度梯度法涂布于PDA平板上(馬鈴薯200克、蔗糖10～20克、瓊脂17～20克、水1000毫升)，置于26～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待48小時(shí)后，挑取培養(yǎng)特征相異的單個(gè)菌落，經(jīng)反復(fù)純化后待測(cè)。先用點(diǎn)接法初選，然后把對(duì)水稻紋枯病和稻瘟病病原菌有抑菌圈的菌株采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法。
實(shí)施例2拮抗菌抗生性研究A、拮抗菌對(duì)紋枯病菌和稻瘟病病原菌的抑菌率測(cè)定將同齡菌絲塊置于經(jīng)過(guò)微孔濾膜的細(xì)菌發(fā)酵液中浸5分鐘，然后應(yīng)用點(diǎn)接法置于PDA和YPTG平板上28℃培養(yǎng)，清水對(duì)照，計(jì)算抑菌率。
通過(guò)對(duì)在PAD液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后收集的含拮抗物質(zhì)的上清液作用的紋枯病菌絲塊生長(zhǎng)情況的測(cè)定，得出H50菌株的抑菌率為67.3％；在YPTG培養(yǎng)基上，H50菌株的抑菌率達(dá)到62.5％。
B、拮抗菌對(duì)紋枯病菌絲和稻瘟病的致畸作用測(cè)定將拮抗菌用對(duì)峙法接種，挑取對(duì)峙邊緣的紋枯病菌絲體和正常菌絲體于普通光學(xué)鏡下觀察，并經(jīng)過(guò)電鏡掃描檢測(cè)。
可以看出，應(yīng)用對(duì)峙培養(yǎng)方法，表現(xiàn)抑菌帶，抑菌寬度分別達(dá)到9.0毫米和8.7毫米。同時(shí)，對(duì)照正常菌絲的原生質(zhì)均勻，菌絲呈圓形，健壯，菌絲節(jié)較長(zhǎng)。H50紋枯病菌絲節(jié)間縮短，生長(zhǎng)點(diǎn)膨大，原生質(zhì)體凝集，菌絲頂端膨大，菌絲有斷裂現(xiàn)象，菌絲體扭曲現(xiàn)象嚴(yán)重，空殼較多。
C、拮抗菌對(duì)紋枯病菌核萌發(fā)的影響將無(wú)菌載玻片浸入融化的無(wú)菌PAD培養(yǎng)基中，使之表面附上一層培養(yǎng)基瓊脂，取出放在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2片，皿內(nèi)加5毫升無(wú)菌水保濕。從預(yù)先培養(yǎng)紋枯病菌的平板上篩選大小、形成時(shí)間一致的菌核，置于濃度為108個(gè)/毫升的發(fā)酵菌液中處理10秒，然后放在載玻片的瓊脂上，每片3粒，粒距為1.5厘米，每次處理8片(24粒)，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后鏡檢菌核的萌發(fā)情況。
D、拮抗菌株對(duì)菌核形成的影響將通齡直徑為5毫米的紋枯病菌絲塊置于收集液體(發(fā)酵濾液經(jīng)過(guò)微孔濾膜反復(fù)過(guò)慮)與PDA混合的培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，檢測(cè)菌核形成的時(shí)間。
結(jié)果表明經(jīng)菌液處理后的菌核萌發(fā)菌絲指數(shù)比對(duì)照都降低了。H50比用清水處理的菌核對(duì)照降低了66.7％。在對(duì)菌核形成影響上，清水對(duì)照形成需60小時(shí)，H50需84小時(shí)，差異明顯。
E、菌液浸種小區(qū)生防試驗(yàn)結(jié)果將各拮抗細(xì)菌于YSP培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)48小時(shí)后，稀釋成濃度約為108個(gè)/毫升的菌液，在28℃下浸種48小時(shí)，種子催芽2天，播于育秧田中，地膜覆蓋。以井崗霉素、對(duì)水稻紋枯病菌有拮抗效果的黃綠木霉的孢子懸液及清水作為對(duì)照，木霉孢子濃度為109個(gè)/毫升，井岡霉素的濃度為40微克/毫升。待25天后，移載于水泥池中，單株插載，株、行距為23.3厘米×26.6厘米，小區(qū)隨機(jī)排列，小區(qū)之間以保護(hù)行隔離，試驗(yàn)田按常規(guī)管理。分蘗盛期接種紋枯病菌。距收獲期20天隨機(jī)抽取50株調(diào)查水稻植株的株高、分蘗數(shù)及病情指數(shù)。
用H50菌株的發(fā)酵產(chǎn)物處理，對(duì)紋枯病的防效可達(dá)60.75％，高于井岡霉素的處理防效53.14％；對(duì)稻瘟病的防效達(dá)到74.8％，高于稻瘟凈的防效68.3％。表明H50菌株在防治水稻兩大病害上具有較大應(yīng)用潛力。
實(shí)施例3菌株的鑒定A、形態(tài)特征蛋白胨培養(yǎng)基、牛肉浸汁瓊脂上30℃培養(yǎng)2～4天后用電子顯微鏡及光學(xué)顯微鏡進(jìn)行常規(guī)的菌體形態(tài)觀察并照相。
B、培養(yǎng)特征高氏合成一號(hào)瓊脂、葡萄糖天冬素瓊脂、蔗糖硝酸鹽瓊脂、淀粉銨鹽瓊脂、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂酵母精麥芽瓊脂、燕麥粉瓊脂、馬鈴薯浸汁瓊脂培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2～4天后觀察其菌落形狀及菌體顏色。
C、化學(xué)分類細(xì)胞壁化學(xué)組分分析按H asegawa改進(jìn)的快速薄板層析法(TCL)進(jìn)行全細(xì)胞水解液的氨基酸和糖型分析。
D、生理生化實(shí)驗(yàn)參照《Bergeys Manual of SustematicBacteriology》VO1.II的內(nèi)容對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。磷酸類脂型按Lechevalier實(shí)驗(yàn)方法。
權(quán)利要求
1.一種抗水稻紋枯病和稻瘟病的鏈霉菌菌株，其特征在于球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)H50 CCTCC NOM 203034。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗水稻紋枯病和稻瘟病的鏈霉菌菌株，其特征在于所述的H50菌株具有下述性質(zhì)A、形態(tài)特征在高氏一號(hào)瓊脂和葡萄糖天門冬素瓊脂上28℃培養(yǎng)7～70天后，用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡分別觀察菌絲的形態(tài)和孢子形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該菌株基內(nèi)菌絲體無(wú)橫隔，不斷裂；該菌的氣生菌絲分枝較多，孢子絲直立或柔曲；孢子球形或卵圓形，表面光滑。B、培養(yǎng)特征菌株在八種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)結(jié)果a、高氏合成一號(hào)瓊脂氣生菌絲為黃白色，基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素，呈無(wú)色，不產(chǎn)生可溶性色素。b、葡萄糖天門冬素瓊脂氣生菌絲為淡灰色，基內(nèi)菌絲為淺黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。c、蔗糖硝酸鹽瓊脂氣生菌絲為微黃綠色，基內(nèi)菌絲為淺黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。d、淀粉銨鹽瓊脂氣生菌絲為秸草色，基內(nèi)菌絲為灰黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。e、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂氣生菌絲為米黃色，基內(nèi)菌絲為淺黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。f、酵母精麥芽精瓊脂氣生菌絲為米黃色，基內(nèi)菌絲為米黃色，不產(chǎn)生可溶性色素。g、燕麥粉瓊脂氣生菌絲為淺灰黃綠色，基內(nèi)菌絲為淺淺褐色，不產(chǎn)生可溶性色素。h、馬鈴薯浸汁瓊脂氣生菌絲為淺黃褐色，基內(nèi)菌絲為淺褐色，不產(chǎn)生可溶性色素。C、細(xì)胞胞壁化學(xué)成分分析菌株全細(xì)胞水解液含有LL-二氨基庚二酸(LL-DAP)、甘氨酸；無(wú)特征性糖(糖型C)；菌株含有磷脂酰乙醇胺(PE)為II型。D、生理生化特征在明膠液化、牛奶凍化、淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)中呈陽(yáng)性，而不能使牛奶凝固，不能在纖維素上生長(zhǎng)，不產(chǎn)生H2S，不能利用酪氨酸。但能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、L-鼠李糖、D-木糖和半乳糖，不能利用肌醇和棉子糖。E、菌種鑒定結(jié)果根據(jù)形態(tài)特征與化學(xué)分類相結(jié)合的定屬原則，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明“H50菌株”基內(nèi)菌絲無(wú)橫隔，不斷裂，無(wú)孢囊，氣生菌絲分枝較多，孢子絲直或柔曲，細(xì)胞壁化學(xué)組分為I型，糖型C，磷酸類脂II型(含PE)，其基本特征符合鏈霉菌屬(Streptomyces)。根據(jù)培養(yǎng)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)定種原則，其特征與球孢鏈霉菌特征相符，定名為球孢鏈霉菌(Streptomyces globisporus)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用鏈霉菌的篩選技術(shù)，通過(guò)PAD和YPTG平板應(yīng)用點(diǎn)接法初篩，獲得對(duì)水稻紋枯病病原菌和水稻稻瘟病病原菌具有強(qiáng)烈拮抗作用的鏈霉菌菌株，該菌株為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus H50)，是從我國(guó)四川省生態(tài)地區(qū)的土壤中分離、篩選出的，已于2003年5月2日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 203034，本發(fā)明能拮抗水稻紋枯病和稻瘟病的病原菌，尤其是對(duì)四川稻區(qū)立枯絲核病原菌融合菌絲群AG－1和危害嚴(yán)重的ZB15稻瘟病生理小種具有強(qiáng)烈的拮抗作用，其防治效果好，抑菌率達(dá)到65％以上，有效地解決了危害水稻的兩大病蟲害。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1519310SQ03117910
公開日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2003年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月22日
發(fā)明者鄭愛(ài)萍, 李平 申請(qǐng)人:鄭愛(ài)萍