專利名稱：一種源于水稻的病原菌侵染和傷害誘導性基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體的講涉及一種源于水稻的稻瘟菌侵染可誘導性蛋白酶抑制劑基因5’端調(diào)控序列，更具體地說涉及稻瘟菌侵染和傷害誘導表達型的一種水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因啟動子序列，該序列的核苷酸組成如SEQ ID NO1所示，本發(fā)明還進一步涉及使用上述啟動子或由該啟動子衍生的一個、幾個片段或其組合(衍生變體)，啟動相關DNA序列表達所進行的抗病抗蟲基因工程的應用。
背景技術：
水稻是世界上最主要的糧食作物之一。在我國，稻米的生產(chǎn)和供應是關系國計民生的大事，因此提高水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量十分重要。病害是限制水稻增產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的重要原因之一，而其中由稻瘟病造成的減產(chǎn)可高達30％(Baker B，Zambryski P等Science，1997.276726～728)，所以控制稻瘟病的危害是提高水稻產(chǎn)量和質(zhì)量的重要方面。盡管殺菌劑的應用可以成功控制一些病害，但是長期和過量的使用農(nóng)藥可以影響人類的健康并帶來環(huán)境污染；傳統(tǒng)的高產(chǎn)與抗病育種在提高水稻產(chǎn)量和質(zhì)量方面的重要性雖然勿容置疑，但也存在抗病非持久性等問題，即大面積種植、推廣單一品種往往造成對病原菌的選擇壓力，會導致病害的流行(IanR.Crute等，The Plant Cell，1996，81747～1755，Baker B，Zambryski P等Science，1997.276726～728)。
隨著分子植物病理學和分子生物技術的發(fā)展，利用植物抗病基因、防衛(wèi)基因與信號傳導基因或其它來源的基因，通過轉(zhuǎn)化植物的方法可以獲得抗病或耐病植株，但這些基因的表達大多采用組成型表達的啟動子(如35S啟動子)(Rommens CM等，Curr.Opin.Biotechol.，2000，11120～125；Bol，J.F等，Annu.Rev.Phytopatholo.1990，28113～138)。組成型啟動子可以超量表達某些基因(如防衛(wèi)基因)，但這些基因(如HR基因)的組成型表達往往對植物具有破壞性(de Wit P.J.G.M.，Annu.Rev.Phytopatholo.，1992，30391～418)。理想的抗病分子操作應該是植物只有在受到病原菌侵染危害時快速表達防衛(wèi)反應，從而阻止病原菌擴展，甚至將其殺死。Peng(Integrated Resource Management for SustainableAgriculture，1994，pp450～453)設想利用稻瘟菌誘導型啟動子驅(qū)動抗病相關基因表達，以緩解抗病表達過程中植物受害的程度。迄今為止利用上述策略進行抗病的工作大多僅限在實驗階段(P.Coutos-Thévenot等，J.Exper.Bot.，2001，52901～910)，其中主要原因是缺乏可供應用的病原菌侵染可誘導表達的有效啟動子，因此，要開展分子抗病育種關鍵任務之一是從植物中獲得病菌侵染非特異誘導表達基因的啟動子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種由稻瘟菌侵染誘導表達的水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因5’端調(diào)控序列，并且該序列或由其一部分、幾部分或組合可用于調(diào)控目的基因或有用基因在水稻葉片受破壞或病蟲危害或化學物質(zhì)刺激時的表達。
本發(fā)明的另一個目的是提供由蛋白酶抑制劑基因5’端調(diào)控序列或其衍生變體驅(qū)動的相關目的基因表達的雙元載體，一種含有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或由該DNA序列的部分片段或片段經(jīng)缺失、堿基改變、堿基添加或再次分離的一部分、幾部分或其組合構建的雙元表達載體，是一種具有啟動子活性的片段在病原菌侵染誘導下能夠驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達的雙元表達載體。具體的講是由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或由該DNA序列的部分片段或片段經(jīng)缺失、堿基改變、堿基添加的衍生變體或再次分離的一部分、幾部分或其組合的序列，任選其中之一DNA序列片段嵌合到去掉35S具有相關目的基因的雙元表達載體pCAMBIA1301上構建的一種雙元表達載體。本發(fā)明還提供了一種由含有上述任意一DNA序列的雙元表達載體轉(zhuǎn)化微生物獲得的重組微生物。具體涉及一種重組微生物是由雙元表達載體轉(zhuǎn)化了的根癌農(nóng)桿菌。以及它們這些重組微生物在植物抗病抗蟲育種中的應用。由以上所述的具有啟動子活性的DNA序列片段構建的，含有任選其一的DNA序列片段的雙元表達載體轉(zhuǎn)化微生物獲得重組微生物，這種獲得重組微生物的技術是本領域一般技術人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。
本發(fā)明提供了從水稻中克隆的一段DNA片段，該片段或其衍生的變體與報告基因相連構成融合基因，經(jīng)重新導入水稻時可以啟動報告基因的病原菌、傷害以及化學物質(zhì)刺激下的誘導性表達，該序列包含在SEQ IDNO1所示的核苷酸序列中。根據(jù)本發(fā)明首選的是水稻蛋白酶抑制劑5′端調(diào)控序列中1到2051bp的片段以及在此序列基礎上由漸變?nèi)笔Й@得的具有啟動子活性的片段，報告基因選取的是GUS基因。
本發(fā)明的進一步提供的調(diào)控序列驅(qū)動的與將要表達的感興趣的目的基因嵌合的DNA序列，以及含該融合序列的雙元載體。本發(fā)明的感興趣目的基因嵌合DNA序列中，首選的所要表達的基因是直接抑制、破壞病原菌與害蟲生存的基因，抗性基因、防衛(wèi)基因、信號傳導基因以及能在水稻等植物中表達的可有效控制病蟲害的異源基因(如無毒基因，反義RNA等)。
本發(fā)明還提供一種培育抗病植株的方法，依據(jù)本發(fā)明所提供的雙元載體嵌合感興趣的基因(如上述選取的基因)構建一種含有所述的雙元表達載體的重組微生物，所述重組的微生物其中是重組根癌農(nóng)桿菌。通過所述的含有雙元表達載體轉(zhuǎn)化了的微生物導入植物中而獲得抗病的或耐病的植株，一個首選的實施方案是利用農(nóng)桿菌EHA105介導的方法轉(zhuǎn)化水稻。這種利用重組微生物轉(zhuǎn)化的途徑都是本領域一般技術人員可以做到的。
本發(fā)明提供了從水稻中克隆的一種蛋白酶抑制劑基因5’端調(diào)控序列，該序列的啟動子活性首選的由稻瘟菌侵染誘導，并基本首先在受害葉片表達。表達的時間動態(tài)大致為活體接種4小時的葉片開始有相關mRNA的轉(zhuǎn)錄，8-12小時開始上升，36小時達到最高。在一個優(yōu)選實施例中，該序列包含在SEQ ID NO1中。
本說明書中術語5’端調(diào)控序列為從轉(zhuǎn)錄起始位點(如堿基為A，并記為1)開始的5’端上游序列，這段序列包含控制下游基因表達的重要順式調(diào)控元件。同時包括從轉(zhuǎn)錄起始位點A到下游翻譯起始位點ATG之間的序列，其堿基的改變對啟動子的功能沒有明顯影響，為方便其與相關基因的連接可改變部分堿基的種類和數(shù)目(如設計合適的酶切位點)，在一個較佳的實施例中，從A到ATG之間的序列為ACCCCCCAGTACAACCATGGTGA中.....指示部分。矩形框指示部分為添加的NcoI酶切位點。
本發(fā)明中DNA片段的“克隆”是指從自然界天然水稻基因組中分離出的，可以不經(jīng)任何改變直接單獨利用的一段啟動子序列。依據(jù)本發(fā)明的序列，可以設計上下游一對引物，通過PCR技術簡單再次獲得，也可以利用其標記探針從水稻基因組文庫中篩選獲得，甚至可以用經(jīng)典的酶法或化學方法合成獲得，這些途徑都是本領域一般技術人員可以做到的。
本發(fā)明中的蛋白酶抑制劑基因5’端調(diào)控序列的“衍生變體”指在SEQID NO1序列中1到2051bp之間序列的基礎上，經(jīng)片段缺失、堿基改變、堿基添加或再次分離的一部分、幾部分或其組合。本發(fā)明給出了MPP2026、MPP 1284、MPP 1131、MPP 1030、MPP 931、MPP 774、MPP 714、MPP 641、MPP 406系列具有不同特點的啟動子活性的衍生變體本發(fā)明中的蛋白酶抑制劑基因5′端調(diào)控序列及其衍生變體的啟動子活性可以通過在啟動子下游嵌合報告基因GUS，以GUS的表達情況得以確認。一個較佳的實施例是利用Jerfferson等(EMBO J.，1987，63901～3907)建立的成熟的方法。
本發(fā)明提供的一種雙元表達載體，這種載體含有病原菌侵染和傷害誘導型啟動子，啟動子下游可以嵌合使用者所感興趣的將要表達的目的基因。這些基因根據(jù)來源可以是水稻中既存的，也可以是水稻之外的可表達的異源基因(如無毒基因等)，或是植物中分離的抗病基因、信號傳導基因、防衛(wèi)基因及其相關基因，或者防衛(wèi)過程中的關鍵酶類或蛋白的基因，或者具有直接或間接殺菌作用的植保素合成基因或關鍵酶類基因，也可以是從稻瘟菌中分離的無毒基因或和稻瘟菌寄生密切相關的基因的反義RNA，進一步可以是動物或微生物中分離的具有抗病或抗蟲性的活性物質(zhì)的基因或合成它們的酶類的基因。根據(jù)功能主要是直接抑制病原菌或害蟲生長的蛋白或抗性物質(zhì)的基因、以及一般實驗者均可以從相關方向的科技文獻、數(shù)據(jù)庫或手冊中選取這些感興趣的目的基因。構建本發(fā)明中的表達載體技術是本領域的普通技術人員容易掌握的，可依據(jù)Maniatis等(分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室，1990)或Sambrook等(分子克隆實驗指南，1989)等文獻的相關內(nèi)容進行操作。
本發(fā)明還提供了啟動子順式元件所在的大致區(qū)段范圍，為此構建了從其5端逐級缺失的衍生變體，并嵌合到去掉35S的雙元載體pCAMBIA1301(Jerfferson教授提供)的GUS基因之前，以上操作都是本領域技術人員常用的基本方法，優(yōu)選的方案是設計攜帶合適的方便連接的酶切位點的引物，用PCR技術從原始序列中擴增獲得。
本發(fā)明中抗病雙元表達載體的導入水稻的方法在本領域是簡單易行的，也是本領域一般技術人員可做到的。上述啟動子或其衍生變體的活性檢測以及利用該啟動子進行有針對性的抗病分子操作，都不可避免的要在植物系統(tǒng)中進行，一個優(yōu)選的實施方案是采用農(nóng)桿菌介導的方法(Hiei等，Plant J.1994，6271～282；Hiei等，Plant Mol.Biol.，1997，35205～218)將其導入水稻中；實驗者也可根據(jù)自己的熟練程度靈活的選用以下轉(zhuǎn)化方法原生質(zhì)體融合法、基因槍法轟擊法、電激法、PEG法、葉盤法等(Horsch等，Science，1984，234496；Barton等，Cell，1983，321033；Liu等Acta Phytophysiol.Sin，21195～205；Horsch等Science，2271229)根據(jù)本發(fā)明的啟動子有活性的其它衍生變體，在轉(zhuǎn)基因完成后，從抗性愈傷到生根后移入自然環(huán)境(如田間)的組織培養(yǎng)期間，轉(zhuǎn)化組織或個體有類似組成型表達的活性，這是由于組織培養(yǎng)基中激發(fā)活性成分或組培期間其同自然植株的差異(如類似損傷)所致，在移入田間恢復后即基本失去。
本發(fā)明提供的各種序列可以用作分子標記探針，可以用作在水稻中再分離該序列，也可以用于其它植物的相關調(diào)控序列，這些都是本發(fā)明的范圍。
根據(jù)本發(fā)明的5′端調(diào)控序列的特點，可進行培育具有廣譜的抗病抗蟲的植物。
根據(jù)本發(fā)明的5′端調(diào)控序列的特點，可利用SEQ ID NO1中-931至-774的序列抑制目的基因的表達，從而有針對性的對目的基因進行功能開發(fā)。
以下通過附圖進一步說明本發(fā)明


附圖1，健康水稻葉片與接種稻瘟菌后水稻葉片的BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因表達的DD-PCR結果。圖示說明泳道1、3、5是以健康水稻葉片為材料的DD-PCR結果，泳道2、4、6是以接種稻瘟菌后水稻葉片為材料的DD-PCR結果。箭頭A為差異條帶。
附圖2，水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因受稻瘟菌侵染后的表達動態(tài)的Northern分析。圖示說明0、4、8、12、36為接種時間，單位為小時(h)，A為接種稻瘟菌非親合小種131、B為接種稻瘟菌親合小種007的BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因表達動態(tài)。
附圖3，水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因5′端調(diào)控序列及其衍生變體與報告基因GUS嵌合的雙元載體示意圖。
附圖4，構建水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因5′端調(diào)控序列及其從5′端漸變?nèi)笔У难苌凅w所需PCR引物對。P135、p136、p137、p138、p139、p140分別為擴增MPP2026、MPP1030、MPP931、MPP774、MPP714、MPP641 BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因5′端調(diào)控序列及其漸變?nèi)笔w的引物對。MPP2026～MPP406代表啟動子或5′端調(diào)控序列的名稱，其中數(shù)字為5′端起始位置。在本說明書中啟動子及其5′端調(diào)控序列衍生變體或含有這些片段的轉(zhuǎn)基因植株均以相應符號表示。
附圖5，水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因從5′缺失的衍生變體的電泳分析。圖示說明M為DNA分子量標準，其它從左向右依次為MPP 2026、MPP 1284、MPP 1131、MPP 1030、MPP 931、MPP 774、MPP714、MPP 641、MPP 406。
附圖6，侵染誘導型BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因啟動子驅(qū)動的可嵌合感興趣基因病原菌、害蟲危害可誘導表達型雙元載體結構示意圖。
附圖7，病原菌侵染和傷害誘導型啟動子驅(qū)動的GUS基因表達的轉(zhuǎn)基因水稻葉片在接種稻瘟菌等處理后GUS表達活性柱狀示意圖。圖示說明各種處理為零時間處理和水、SA、JA、傷害、稻瘟菌處理后12小時的葉片和上部未處理葉片。
附圖8，稻瘟菌侵染誘導型啟動子驅(qū)動的GUS基因表達的轉(zhuǎn)基因水稻葉片在接種稻瘟菌后GUS表達的組織染色照片。圖示說明MPP2026～MPP406為轉(zhuǎn)基因水稻接種后8到36小時的GUS染色照片，MPP-W為無啟動子空載體的轉(zhuǎn)基因水稻GUS染色照片。
具體實施方案為了更好地理解本發(fā)明，以下結合具體的實施例作以說明，但并非用來限制本發(fā)明。
實施例1稻瘟菌侵染誘導的水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因及其5′端上游調(diào)控片段的克隆1.稻瘟菌侵染可誘導型水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑cDNA的克隆準備愛知旭品種水稻，待4-5葉抽出時，活體接種稻瘟菌，分別在0、4、8、12、36取發(fā)病葉片，立即液氮冷凍后保存，并做Northern分析確認誘導動態(tài)(附圖2)，根據(jù)Northern分析的誘導動態(tài)留取36小時的樣品(記為P樣品)。同時，取未接種的健康植株葉片(記為H樣品)同樣方法保存?zhèn)溆谩?br> 分別抽取P和H的總RNA，經(jīng)DNA酶消化混雜的DNA后，用SuperscripII Kit合成cDNA，cDNA再用RNAse H除去殘存的RNA，即可以用作PCR擴增的模板。
擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯電泳后可以壓膜并放射自顯影(附圖1)，然后切取在接種葉片中的差異表達cDNA條帶，經(jīng)二次PCR擴增后回收并克隆到T-easy載體上，測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中作BLAST處理，推測為一種水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因的部分片段，如序列表SEQ IDNO2所示
2.5′端上游調(diào)控片段的克隆用放射性同位素P32標記上述克隆的蛋白酶抑制劑cDNA，篩選水稻基因組文庫。經(jīng)亞克隆，酶切鑒定以及測序確認，克隆獲得了5′端上游DNA片段，該DNA片段的核甘酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
實施例2稻瘟菌侵染可誘導型水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因5′端上游調(diào)控片段的一系列衍生變體的獲得蛋白酶抑制劑基因5′端上游調(diào)控片段放入數(shù)據(jù)庫進行檢索，并用軟件分析，推測其潛在的順式元件位置，然后在這些位置之前設計攜帶合適酶切位點的PCR引物(附圖4)，以克隆的原始序列為膜板擴增出5′端上游調(diào)控片段的一系列衍生變體(附圖5)實施例35′端上游調(diào)控片段及其一系列衍生變體的與GUS基因嵌合的雙元載體構建上述5′端上游調(diào)控片段及其一系列衍生變體的PCR產(chǎn)物進一步克隆到T-easy載體中，分別對雙元載體pCAMBIA1301和克隆到T-easy上的衍生變體用相同的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，限制性內(nèi)切酶的選擇按照PCR引物上設計攜帶的雙酶切位點進行。兩組雙酶切后的產(chǎn)物經(jīng)葡聚糖凝膠電泳分開后，切取目標DNA片段的凝膠塊，分別用回收試劑盒回收(1)雙元載體pCAMBIA1301是切去原來35S的剩余部分，(2)T-easy載體是回收切下的啟動子和其衍生變體部分。最后按一定比例分別將回收的(1)(2)兩部分混合并用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，并經(jīng)酶切鑒定和測序確認。獲得的啟動子及其衍生變體為MPP2026(-2026bp，轉(zhuǎn)錄起始位點A記為1，其上游第一個堿基為-1以下同)，MPP 1030(-1030bp)，MPP 910(-910bp)，MPP 774(-774bp)，MPP 714(-714bp)MPP 641(-641bp)。MPP 1284(-1284bp)，MPP 1131(-1131bp)和MPP 406(-406bp)從MPP 2026出發(fā)，并分別經(jīng)EcoI、SalI和XbaI單酶切，經(jīng)自連獲得(附圖5)。
實施例4稻瘟菌侵染誘導型水稻蛋白酶抑制劑基因啟動子驅(qū)動GUS表達的嵌合基因轉(zhuǎn)化水稻1.雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105分別將上述雙元載體質(zhì)粒DNA用電激法導入EHA105感受態(tài)細胞，28℃培養(yǎng)到形成單菌落。挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50μg/mlKanamycin的YM液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm搖培16hr，直接對菌液進行PCR鑒定。
2.根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化準備水稻未成熟種子，經(jīng)表面消毒后擠出水稻幼胚置于固體誘導培養(yǎng)基(NB)上，暗培養(yǎng)誘導愈傷組織。約5-7天后剝下愈傷組織，轉(zhuǎn)入新鮮配制的繼代培養(yǎng)基(NB)上，在相同條件下繼代培養(yǎng)5天左右；或者準備水稻成熟胚愈傷組織，挑選繼代培養(yǎng)5-7天、色澤淡黃的愈傷組織共培養(yǎng)。挑選狀態(tài)較好的愈傷組織與適量農(nóng)桿菌懸浮液(OD 0.3-0.5)共培養(yǎng)15-20分鐘，轉(zhuǎn)入固體共培養(yǎng)基上，26℃黑暗培養(yǎng)2-3天。將共培養(yǎng)后的愈傷組織放在含有50mg/lHygromycin的篩選培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)14天，轉(zhuǎn)到新鮮配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選14天至長出抗性愈傷組織。從經(jīng)兩輪篩選后長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50mg/LHygromycin的分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)至15h/d光照條件下培養(yǎng)，經(jīng)過15-25天左右，長出綠點。30-40天后進一步分化出小苗。當抗性愈傷組織分化的芽長至約2cm時，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右，在溫室內(nèi)移栽入土。
實施例55′端上游調(diào)控片段及其一系列衍生變體啟動子活性的鑒定及分析GUS活性的檢測采用組織染色法和表達量確定法將選取的轉(zhuǎn)基因材料進行無菌水表面清洗，用無菌吸水紙吸干后浸入GUS染色液(Jefferson，EMBO J.，1987，63901～3907)，抽氣5分鐘后放28℃，200rpm搖床上反應30分鐘到過夜，然后在70％或100％的乙醇內(nèi)脫色漂洗直至顯色。
材料的準備分抗性愈傷、生根培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因苗、移入大田中7到15天的轉(zhuǎn)基因苗三種情況分別進行前兩種情況不經(jīng)處理直接染色；大田中的苗采用稻瘟菌接種處理，接種方法一是在剪取上部幼嫩葉片上點接稻瘟菌懸浮液，另一是選取一部分單株的一片幼嫩葉片在活體上接種(為防止稻瘟菌的傳播或?qū)е罗D(zhuǎn)基因苗整株死亡，具體做法為將無菌小濾紙片浸在稻瘟菌懸浮液中，然后取出帶菌的濾紙片并立即貼于水稻葉片正面并用保鮮膜封好)。對接種12小時的葉片進行GUS染色，以確定稻瘟菌的侵染誘導性于GUS的表達關系。結果顯示所有結構的轉(zhuǎn)基因材料在移入大田之前都表現(xiàn)出一定的GUS表達，但當移入大田7-10天后則失去這種類似組成型的表達，原因可能和抗性愈傷處于脫分化狀態(tài)或培養(yǎng)基中的某些成分影響所致。
為了精確了解各調(diào)控片段與病原菌、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、傷害等誘導因素處理的關系，選取轉(zhuǎn)基因水稻苗分別進行處理(每處理至少選取5個獨立轉(zhuǎn)化植株)，并在處理12小時后采樣抽提蛋白進行GUS活性定量。GUS表達量的確定采用Martin T等的方法(InGallagher SR(ed)GUS protocol Using the GUS gene as a reporter of gene expression.SanDiegoAcademic Press，23～43)。具體做法為取50mg葉片試樣，加入200μl抽提緩沖液，冰浴中充分研磨，8000g離心10分鐘，留取上清液。然后一部分用Bradford法確定總蛋白含量，另一部分取10μl加90μl4MUG(2mM)在200rpm搖床上37℃反應2小時，最后添加碳酸鈉溶液(0.2M)終止反應并放4℃以備GUS活性測定。
綜合克隆的水稻BowmanBirk蛋白酶抑制劑基因的表達動態(tài)(Northern分析)(圖2)以及GUS組織染色與定量的兩方面結果可以得出離體接種稻瘟菌的葉片中，所有產(chǎn)生GUS表達的葉片都表現(xiàn)4小時有一定表達，8小時表達增加，48表達最高，表現(xiàn)出GUS表達與稻瘟菌侵染誘導性的關系，但不同的基衍生變體結構表現(xiàn)出以下不同的類型(1)MPP2026與MPP1284的GUS表達沒有明顯的區(qū)別，都表現(xiàn)一定表達，但表達量較低(2)含MPP1131和MPP1030結構的轉(zhuǎn)基因苗在離體接種時其GUS表達較(1)的要弱，說明其缺少了和稻瘟菌誘導有關的順式調(diào)控元件。(3)MPP910的GUS活性已經(jīng)降到痕量水平，但是MPP774、MPP714、MPP641卻表現(xiàn)出GUS的稻瘟菌侵染誘導性高水平表達，只是表達有減小的趨勢。這里著重強調(diào)兩個方面，一是MPP910的上游區(qū)段可能存在抑制基因表達的序列；一是MPP774、MPP714或MPP641可能含有啟動子活性的主要成分，明顯的特征是在稻瘟菌侵染誘導12小時MPP774的表達量大約是35S啟動子的3倍，如果根據(jù)Northern分析結果分析(附圖2)，其在36小時的表達量要更高.(4)MPP406的表達對于稻瘟菌誘導關系較小，接種與否基本不影響GUS的表達，說明與稻瘟菌誘導有關的調(diào)控元件基本在-406的上游，而在-406到-1存在基本的啟動子調(diào)控元件(附圖7和附圖8)。
實施例6抗病雙元載體的構建該雙元載體是在實施例3的基礎上構建的。此處僅以由MPP2026而來的抗病雙元載體的構建過程為例，其它一系列啟動子的衍生變體均可按此法獲得。將MPP2026質(zhì)粒用BstEII酶切6小時，然后用T4 DNApolymerase補平，酚仿抽提后溶于雙蒸無菌水中用NcoI酶切，即獲得可嵌合抗病相關基因的雙元載體。即將嵌合的基因在5′端可以帶有既有的或后來增加的NcoI位點接頭，其3′端應該是平滑末端。另外，為了可以嵌合各類基因，可以用BstEII和NcoI雙酶切后補平，即將嵌合的基因應不含ATG密碼子，并鑒定連入方向(附圖6)。
序列表<110> 中國農(nóng)業(yè)大學<120> 一種源于水稻的病原菌侵染和傷害誘導性基因啟動子及其應用<130> 彭友良2003<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 2051<212> DNA<213> Oryza sativa<400> 1cttgaggatg cacgttgtgc tattggcgat gcacacaacg agttctaccc tgaccctctg60agcgaccaca atttaagtta taacacgtat gtctcggacc ggtccaacga tgtgagtcaa 120aatagtggcg tgtctatgat ggagcataat tttgggaggg tgcctacaat ggcctccggt 180cctgctgcac gataaaaaga ctttcttccc atttggtgta gagaccgttt gatacgtcat 240ccgtgtaaga gatccataca tctagcctgt taattgagtt tgtcttagtt aaatcaatgc 300aaatacacaa attccagaca ttcgatttct ttactacttt ttctaggttt tagaatgaaa 360tgcaaataaa tgcacattat tcacattatt tttacaactc ggaatgcagt aattagatta 420atttctaatt tttcctgttc ttcctccact gtgaagtgct atggtgccat tgatgttgga 480aatataaacc cataatttga actagcgcaa aattaaggtc aatgtttggc acaactacaa 540atcttaaata gaaggtaggt ttgaagttta tacacgttaa attatagtgg tttaaaattt 600taatttttat ttaaaataaa aacaaaatga tttattgcat atttatatca tggatttgag 660gcatgtcgaa gagggccggt gtacgttcat gggacttcta ctcatgacca gacctacatg 720agttgctcta agcctctctg aattcgctgg ccgctcacct ccaccatcgg agattcctct 780ccgacgaggc gacgacgacg tacgactcct acccttagca tgcggcgcgt gcgtgcgtct 840tgcgcgctgc tgcgcgcgtg cacgtgcttg tgttgggcat ccacttgtgc tcgtcgacca 900
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權利要求
1.一種從水稻克隆的具有病原菌侵染和傷害誘導性啟動子活性的一段蛋白酶抑制劑基因5’端上游的調(diào)控DNA序列，具有如SEQ ID NO1所示的核甘酸序列，當植物組織受病原菌侵染或病蟲危害或物理傷害、化學物質(zhì)刺激時，該序列或其中部分片段能調(diào)控目的基因或有用基因的轉(zhuǎn)錄、表達。
2.一種按照權利要求1所述DNA序列，由該序列中分離的一個或幾個片段，或者這些片段序列中的一個或幾個堿基的缺失、替換或添加，以及上述序列的重新組合獲得的衍生變體。
3.根據(jù)權利要求2所述的衍生變體，是指從5′端進行的不同漸變?nèi)笔У玫降模渲杏蠱PP 2026、MPP 1284、MPP 1131、MPP 1030、MPP 931、MPP 774、MPP 714、MPP 641、MPP 406調(diào)控片段，它們是在感應病原菌侵染和傷害刺激下具有不同特點的啟動子活性的衍生變體。
4.根據(jù)權利要求3所述MPP774衍生變體，其特征在于MPP774衍生變體直接驅(qū)動目的基因病菌侵染誘導性快速高效表達，其DNA序列位于SEQ ID NO1中的-774到1之間的部分。
5.根據(jù)權利要求3所述MPP714衍生變體，其特征在于MPP714衍生變體直接用于驅(qū)動目的基因的傷害誘導性快速高效表達，其DNA序列位于SEQ ID NO1中的-714到1之間的部分。
6.根據(jù)權利要求3所述MPP641衍生變體，其特征在于MPP641直接用于驅(qū)動目的基因的誘導性快速高效表達，其DNA序列位于SEQ IDNO1中的-641到l之間的部分。
7.根據(jù)權利要求3所述MPP931衍生變體，其特征在于MPP931具有影響或抑制啟動子活性的作用，它分布于SEQ ID NO1中的-931到-774之間的部分。
8.根據(jù)權利要求7所述的抑制啟動子活性的DNA序列，在培育轉(zhuǎn)基因植物中控制有害基因或減弱目的基因的表達中的應用。
9.根據(jù)權利要求1至3所述序列，其啟動子活性和表達部位限定在被侵染的損傷葉片或其附近的幼嫩及新生葉片。
10.一種含有由權利要求1或2或3所述序列任選其中之一的DNA序列片段構建的，具有啟動子活性的該片段在病原菌侵染誘導下能夠驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達的雙元表達載體。
11.根據(jù)權利要求10所述的雙元表達載體，是由權利要求1或2或3所述的序列任選其中之一DNA序列片段嵌合到去掉35S具有相關目的基因的雙元表達載體pCAMBIAl301上構建的一種雙元表達載體。
12.一種含有權利要求10或11所述的雙元表達載體的重組微生物。
13.據(jù)權利要求12所述的重組微生物，是一種由權利要求10或11所述的雙元表達載體轉(zhuǎn)化了的根癌農(nóng)桿菌。
14.根據(jù)權利要求1、4、5、6、8、10、11所述的目的基因，其特征在于是由植物中分離的抗病基因、防衛(wèi)基因及其相關基因，或者防衛(wèi)過程中的關鍵酶類或蛋白的基因，或者具有直接或間接殺菌作用的植保素合成基因或關鍵酶類基因，也可以是從稻瘟菌中分離的無毒基因或和稻瘟菌寄生密切相關的基因的反義RNA，進一步可以是動物或微生物中分離的具有抗病或抗蟲性的活性物質(zhì)的基因或合成它們的酶類的基因。
15.一種抗水稻病害和蟲害的育種途徑，其特征在于由權利要求11至13所述的雙元表達載體，任選雙元表達載體其中之一或由含有該雙元表達載體的微生物轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因的水稻植株。
16.一種抗植物病害和蟲害的育種途徑，其特征在于根據(jù)權利要求12至14所述的雙元表達載體或含該雙元表達載體的重組微生物轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因的抗病、抗蟲的經(jīng)濟作物。
17.根據(jù)權利要求l或2或3所述的DNA序列，在制備分子標記探針用于水稻再分離具有不同特點的啟動子活性的衍生變體和獲得植物的相關調(diào)控序列中的應。
18.根據(jù)權利要求1至3所述的DNA序列，在培育植物抗病抗蟲危害中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了從水稻中克隆的一種蛋白酶抑制劑基因啟動子片段，該啟動子具有病原菌侵染和傷害，以及化學物質(zhì)可誘導表達特點。本發(fā)明同時提供了含有該啟動子驅(qū)動的可嵌合感興趣基因的雙元表達載體，及其在抗病抗蟲危害中的應用。
文檔編號C12N15/29GK1513994SQ0311044
公開日2004年7月21日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權日2003年4月15日
發(fā)明者彭友良, 張世宏, 范軍, 孫宗修 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學