專利名稱：誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明涉及一種獲得負(fù)載(loaded with)至少五種癌/睪丸抗原，不負(fù)載譜系(lineage)特異性分化抗原或基本上不負(fù)載譜系特異性分化抗原的自體樹突狀細(xì)胞(dendritic cell)的方法。在其他方面，本發(fā)明涉及分離的黑素瘤細(xì)胞系。進(jìn)一步，本發(fā)明涉及組合物作為免疫治療疫苗的應(yīng)用以及自體樹突狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞在藥物組合物或疫苗中的應(yīng)用。更進(jìn)一步，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
晚期癌癥是人類死亡的主要原因之一。至今還沒有有效的治療方法。癌癥免疫治療目的在于通過免疫學(xué)機(jī)制破壞腫瘤細(xì)胞。免疫治療與傳統(tǒng)的癌癥治療方法如外科手術(shù)、放射以及化學(xué)療法相比較，具有更小的毒性并且至今沒有嚴(yán)重的并發(fā)癥記錄。此外，免疫治療具有針對(duì)疾病不同階段進(jìn)行施治的潛能。在初期階段，它是經(jīng)手術(shù)去除早期腫瘤時(shí)的很好的補(bǔ)充治療方法，其目的在于防止轉(zhuǎn)移腫瘤擴(kuò)散。在疾病的晚期階段，當(dāng)傳統(tǒng)方法無效時(shí)，往往它是唯一的治療方法。
免疫系統(tǒng)的主要功能是識(shí)別和破壞侵入機(jī)體的外源物質(zhì)(抗原)。免疫系統(tǒng)能夠區(qū)別“自我”和“非自我”，并且在正常情況下只對(duì)外源或“非自我”抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。盡管癌細(xì)胞起源于機(jī)體自身細(xì)胞，它們被自然免疫系統(tǒng)作為外來物質(zhì)對(duì)待。然而，該自然免疫應(yīng)答系統(tǒng)并沒有強(qiáng)大到足以阻止腫瘤的出現(xiàn)和生長。免疫治療的任務(wù)在于增加免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力以及開發(fā)有效的腫瘤消除機(jī)制。在任何特異免疫療法中的兩個(gè)主要問題是哪些抗原用作目標(biāo)以及尋找對(duì)免疫系統(tǒng)來說最佳的抗原呈遞。
能被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)所識(shí)別的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)是在已知的抗腫瘤免疫效應(yīng)子(effector)機(jī)制中作為目標(biāo)的最有效的成分。有兩種主要的TAA類型獨(dú)特抗原，僅在很少的腫瘤細(xì)胞中顯現(xiàn)因而不能作為一般目標(biāo)而起作用，共有(shared)或者普通(common)TAA存在于許多腫瘤當(dāng)中。三組主要的共有抗原通常被認(rèn)為是免疫療法的潛在目標(biāo)并且都已顯示出可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。這三組抗原是癌/睪丸抗原(CT抗原)，腫瘤超表達(dá)抗原，以及譜系特異分化抗原。
CT抗原由腫瘤或種系(germ line)特異基因編碼，代表了共有腫瘤相關(guān)抗原的最大組群之一。CT抗原最早發(fā)現(xiàn)在黑素瘤細(xì)胞中，但是在許多其他人類惡性腫瘤中也已被發(fā)現(xiàn)。在正常組織中它們僅被表達(dá)于睪丸中并且在一些病例中表達(dá)于胎盤。表達(dá)這些抗原的正常細(xì)胞由于缺少M(fèi)HC分子的表達(dá)，因此這些抗原正常情況下不被T淋巴細(xì)胞所識(shí)別。
這使得CT抗原成為特異癌癥免疫療法中非常引人注目的目標(biāo)。最近的臨床試驗(yàn)顯示通過靶向特異CT抗原的治療，大量黑素瘤和膀胱癌病人的腫瘤發(fā)生了衰退(Nishiyama et al.，2001，Clin.Cancer Res.，v.7，pp.23-31；Thurner et al.，1999，J.Exp.Med.，v.190，pp.1669-1678)。只對(duì)某些CT抗原和相關(guān)肽決定表位報(bào)道了通過T細(xì)胞的CT抗原識(shí)別。然而，所有的CT抗原都可以被考慮作為免疫療法的潛在目標(biāo)。MAGE-A抗原的表達(dá)和腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性在許多的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)(Brasseur et al.，1995，Int.J.Cancer，v.63，pp.375-380；Eura et al.，1995，Int.J.Cancer，v.64，pp.304-308；Katano et al.，1997，J Surg.Oncol.，v.64，pp.195-201；Patard et al.，1995，Int.J.Cancer，v.64，pp.60-64)。另一組CT抗原，MAGE-B抗原，顯示出比MAGE-A抗原明顯低的腫瘤特異性表達(dá)。第三組，MAGE-C抗原，顯示出與MAGE-A抗原相類似的表達(dá)模式。針對(duì)于MAGE-C抗原的CTL反應(yīng)還沒有被報(bào)道過。
被描述過的幾個(gè)具有CT抗原特征的非MAGE蛋白中，NY-ESO-1是目前被識(shí)別的最具免疫原性的腫瘤抗原之一。黑素瘤病人的多肽免疫臨床試驗(yàn)證明出疾病的穩(wěn)定性和在一些病人中轉(zhuǎn)移的衰退(Jgeret al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，v.97，pp.12198-12203)。
與CT抗原相反，腫瘤過表達(dá)抗原缺少嚴(yán)格的腫瘤特異表達(dá)，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)能夠在一些正常組織類型而不是睪丸中以低水平被檢測到。針對(duì)這些抗原中的某些抗原的免疫療法的進(jìn)展對(duì)癌癥病人來說是有利的。目前這些抗原，如CEA，p53，HER-2/Neu，MUC-1以及α-胎蛋白正在臨床試驗(yàn)中被作為可能的目標(biāo)而加緊研究。腫瘤過表達(dá)抗原組只是近來才被用作臨床試驗(yàn)中的目標(biāo)，因而還缺少引起治療性免疫應(yīng)答的有效性的數(shù)據(jù)。
譜系特異抗原，黑素瘤細(xì)胞分化抗原以及前列腺相關(guān)抗原到目前為止只被用來描述兩種類型的人類癌癥黑素瘤和前列腺癌。這一組抗原在正常分化組織和兩種人類癌癥中都有表達(dá)。在正常分化組織中這些抗原很少誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但是，這些蛋白在癌細(xì)胞中產(chǎn)生免疫原性，在黑素瘤病例中，有可能檢測到針對(duì)黑素瘤細(xì)胞分化抗原的T殺傷細(xì)胞反應(yīng)。針對(duì)黑素瘤和前列腺癌的臨床試驗(yàn)絕大多數(shù)使用分化抗原作為目標(biāo)。
在腫瘤相關(guān)抗原組中，使用TAA作為免疫療法目標(biāo)，從一些MAGE蛋白中獲得了最有希望的數(shù)據(jù)。但是，尤其在黑素瘤病例中，療效并不穩(wěn)定，一些轉(zhuǎn)移病灶在繼續(xù)生長。這些轉(zhuǎn)移對(duì)于用于免疫的MAGE抗原表達(dá)是負(fù)面的(Thurner et al.，1999，J.Exp.Med.，v.190，pp.1669-1678)。
誘導(dǎo)多價(jià)免疫應(yīng)答的一種可能是使用完整腫瘤細(xì)胞或者源于完整細(xì)胞的物質(zhì)。WO9003183，US5,840,317以及US6,187,306描述了一些以黑素瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗制備過程。US4108983公開了來源于通過牛痘病毒裂解的黑素瘤細(xì)胞的第一代黑素瘤疫苗。
US5,635,188和US5,030,621公開了一種來自黑素瘤細(xì)胞表面抗原的疫苗，黑素瘤細(xì)胞通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后被用作抗黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原疫苗。類似地，US5,484,596揭示了治療癌癥的一種方法，其中受輻射過的腫瘤細(xì)胞被作為疫苗注射到病人體內(nèi)。US6,187,306涉及表達(dá)共有免疫顯性黑素瘤抗原的黑素瘤細(xì)胞系及其應(yīng)用方法。
任何疫苗治療的重要方面是疫苗的給藥方式。最近幾年人們認(rèn)識(shí)到，最有效的抗原到T細(xì)胞遞送方式，特別是對(duì)于初生T細(xì)胞，是通過樹突狀細(xì)胞遞送的方式。樹突狀細(xì)胞(DC)是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，以DC為基礎(chǔ)的免疫療法已經(jīng)以不同的方式用于癌癥治療(Kugler et al.，2000，Nat Met.，v.6，pp.332-336；Nestle et al.，1998，Nature(Med.)，v.4，pp.328-332；Thurner et al.，1999，J.Exp.Med.，v.190，pp.1669-1678)，顯示出該免疫療法的極大潛力。
DC的獨(dú)特性質(zhì)之一是它的通過細(xì)胞內(nèi)吞方式攝取外源蛋白的能力，被攝取的外源蛋白然后被加工并作為多肽表位連同MHC-I類抗原一起被呈遞于DC細(xì)胞表面?？乖蔬f樹突狀細(xì)胞可以被細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別。當(dāng)腫瘤細(xì)胞抗原以腫瘤裂解物或外源加入的凋亡小體(apoptotic bodies)的形式被應(yīng)用時(shí)，這一特性是極為重要的。通過對(duì)未成熟與成熟DC的比較，高的內(nèi)吞活性被確信與DC分化的未成熟狀態(tài)有關(guān)(Sallusto et al.，1995，J.Exp.Med.，v.182，pp.389-400)。在未成熟DC中存在內(nèi)吞活性差異的可能性一直未被加以考慮。
WO0127245披露了通過標(biāo)準(zhǔn)的白細(xì)胞除去法、浮力密度梯度離心以及在缺少外加細(xì)胞因子條件下，將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中以間接體內(nèi)(ex vivo)方式培養(yǎng)40小時(shí)，從而從外周血中獲得樹突狀前體細(xì)胞的方法。
WO0146389涉及通過使用缺乏非人蛋白的培養(yǎng)基，在封閉系統(tǒng)中從白細(xì)胞去除法產(chǎn)物中產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞的方法。在培養(yǎng)基中使用臨床級(jí)別的細(xì)胞因子(IL-4和GM-CSF)以及添加用于DC負(fù)載的TAA。
Thurner et al.，1999，J.of Immunological Methods 2231-15，涉及通過一天之后加入細(xì)胞因子的兩步法可再生地從CD14+單核細(xì)胞產(chǎn)生大量成熟DC的方法。
樹突狀細(xì)胞和TAA’s的結(jié)合在WO0128583中也有披露，其涉及一種提供抗原呈遞細(xì)胞的免疫治療疫苗，該抗原呈遞細(xì)胞與被破碎的細(xì)胞制備物一起經(jīng)受脈沖作用，其中制備物包含經(jīng)編碼至少一種免疫刺激分子的重組牛痘病毒浸染的癌細(xì)胞的細(xì)胞膜。也包括自體DC，它呈遞來自受到編碼IL-2的重組牛痘病毒浸染的黑素瘤細(xì)胞系的抗原混合物。在WO0129192中公開了誘導(dǎo)病人腫瘤特異免疫應(yīng)答的方法，其中，來自病人的抗原呈遞細(xì)胞和至少擁有一種腫瘤抗原的死亡細(xì)胞部分被孵育，并且將最終獲得的負(fù)載抗原呈遞細(xì)胞給病人施用。
盡管近幾年對(duì)于用于治療癌癥的免疫治療疫苗有所改進(jìn)，但是用于癌癥免疫治療的更加安全、更加有效的組合物的需求依然存在。那些靶向某些CT抗原的疫苗應(yīng)該是多價(jià)的以避免抗原喪失變異體的派生。它們應(yīng)該更安全，沒有潛在的靶向在正常組織中表達(dá)的抗原的危險(xiǎn)。它們應(yīng)針對(duì)呈遞(presentation)和遞送(delivery)抗原到T細(xì)胞而得到最優(yōu)化，同時(shí)，也應(yīng)該小心謹(jǐn)慎地選擇最有效的TAA作為標(biāo)靶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了這些問題，方法是仔細(xì)選擇黑素瘤細(xì)胞系以提供最有效的TAA，接著，通過隨后的篩選以避免任何可能對(duì)病人的產(chǎn)生潛在危害的抗原。在使DC負(fù)載完整黑素瘤細(xì)胞裂解物之前，抗原呈遞細(xì)胞的內(nèi)吞作用活性也得到優(yōu)化。
在第一方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物組合物，包括呈遞癌/睪丸抗原多樣性的樹突狀細(xì)胞，其中a)至少五種癌/睪丸抗原，無譜系特異分化抗原或基本上無譜系特異分化抗原通過樹突狀細(xì)胞呈遞。
b)癌/睪丸抗原由至少一種癌細(xì)胞系所提供，所述癌細(xì)胞系表達(dá)了至少五種不同的癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原。
c)樹突狀細(xì)胞在負(fù)載癌/睪丸抗原期間是非成熟的(CD1a陽性，CD14陰性，和CD83陰性)。
在第二方面，本發(fā)明涉及一種獲得負(fù)載至少五種癌/睪丸抗原，不負(fù)載譜系特異分化抗原或基本上不負(fù)載譜系特異分化抗原的人或動(dòng)物自體樹突狀細(xì)胞的方法，包括步驟a)提供至少一種癌細(xì)胞系，所述癌細(xì)胞系表達(dá)至少五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原，b)提供來自上述人或動(dòng)物的自體樹突狀細(xì)胞，c)使用每25cm2接種5×106-20×106個(gè)單核細(xì)胞的接種密度，d)在初始生長階段沒有任何細(xì)胞因子的條件下，在生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)上述的樹突狀細(xì)胞，接著在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，以及e)使來自d)中的樹突狀細(xì)胞負(fù)載癌/睪丸抗原，該癌/睪丸抗原從a)中的至少一種癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物中獲得。
在第三方面，本發(fā)明涉及一種分離的黑素瘤細(xì)胞系，該黑素瘤細(xì)胞系表達(dá)至少五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原或基本上不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原。
在第四方面，本發(fā)明涉及癌/睪丸抗原的多樣性(multiplicity)在藥物組合物或疫苗制劑中的應(yīng)用，癌/睪丸抗原可從分離的權(quán)利要求28中的腫瘤細(xì)胞系中獲得。
在第五方面，本發(fā)明涉及樹突狀細(xì)胞在藥物組合物或疫苗中作為抗原呈遞細(xì)胞的應(yīng)用，其中的樹突狀細(xì)胞在它們的非成熟狀態(tài)負(fù)載抗原，在所述狀態(tài)時(shí)樹突狀細(xì)胞的CD1a呈陽性，CD14呈陰性，CD83呈陰性。其中，在初始生長階段沒有任何細(xì)胞因子的條件下在生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞，接著在樹突狀細(xì)胞負(fù)載至少五種癌/睪丸抗原之前，在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)。
在第六方面，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟a)提供至少一種癌細(xì)胞系，該細(xì)胞系至少表達(dá)五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原，b)提供來自上述人或動(dòng)物的自體樹突狀細(xì)胞，c)在初始生長階段在沒有任何細(xì)胞因子的條件下，在生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)上述的樹突狀細(xì)胞，接著在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，以及d)使來自c)中的樹突狀細(xì)胞負(fù)載癌/睪丸抗原，該癌/睪丸抗原從a)中的至少一種癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物中獲得。
e)給所述人或動(dòng)物施用負(fù)載樹突狀細(xì)胞。
附圖簡述下面對(duì)本發(fā)明有關(guān)附圖作詳細(xì)解釋，其中，附

圖1通過gp100和MART-1/Melan特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)克隆，顯示了一些DDM-1黑素瘤克隆對(duì)裂解的敏感性。
附圖2顯示通過RT-PCR分析，黑素瘤細(xì)胞分化抗原，gp100和MART-1/Melan A在三個(gè)黑素瘤細(xì)胞克隆DDM-1.7、DDM-1.13和DDM-1.29中的表達(dá)。
附圖3顯示通過免疫染色測定的黑素瘤細(xì)胞分化抗原gp100在DDM-1.7、DDM-1.29細(xì)胞中的表達(dá)。
附圖4顯示通過RT-PCR分析，MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、NY-ESO-1和GAPDH，在三個(gè)黑素瘤細(xì)胞克隆DDM-1.7、DDM-1.13和DDM-1.29中的表達(dá)。
附圖5顯示在用DNA脫甲基試劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine)處理后，MAGE-A和NY-ESO-1在DDM-1.13細(xì)胞中的表達(dá)。
附圖6顯示四種未成熟樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物通過熒光團(tuán)(fluorospheres)的內(nèi)吞作用的吸收量。
附圖7顯示通過一個(gè)gp100特異性CTL克隆與載有DDM-1.29細(xì)胞裂解物的四種樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物(同附圖6)相互作用之后的IFN-γ的產(chǎn)量。
附圖8顯示供體ANBI的免疫淋巴細(xì)胞針對(duì)黑素瘤細(xì)胞、EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞以及K562細(xì)胞的細(xì)胞裂解活性。
附圖9顯示供體19/00的免疫淋巴細(xì)胞針對(duì)乳房和鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的細(xì)胞裂解活性。
附圖10顯示通過RT-PCR分析的MAGE-A和GAPDH基因在乳房癌細(xì)胞系中的表達(dá)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳實(shí)施方式在討論本發(fā)明的具體實(shí)施方案之前，首先提供涉及本發(fā)明主要方面的專業(yè)術(shù)語的定義。
定義細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞是存在于淋巴組織、循環(huán)血液和淋巴腺的小的單核白細(xì)胞。有兩種主要功能類型，B-淋巴細(xì)胞和T-淋巴細(xì)胞，在抗原特異免疫應(yīng)答中起作用。T-淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞)是小的抗原特異性淋巴細(xì)胞，起源于胸腺(哺乳動(dòng)物)和存在于次級(jí)淋巴組織(如，淋巴腺，脾)以及血液，它參與細(xì)胞免疫應(yīng)答和輔助抗體產(chǎn)生。T淋巴細(xì)胞表面具有抗原特異性受體并且只對(duì)呈遞到細(xì)胞表面的外源抗原起反應(yīng)。主要的T淋巴細(xì)胞類型有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，它識(shí)別和殺死以某種方式產(chǎn)生抗原性改變的體細(xì)胞(如，通過病毒感染)；輔助T細(xì)胞，它在抗原呈遞細(xì)胞表面通過外源抗原而被激活并反過來激活適當(dāng)B細(xì)胞；抑制性T細(xì)胞，參與抑制免疫應(yīng)答和免疫系統(tǒng)的一般調(diào)節(jié)。
癌/睪丸抗原(CT-抗原)通過癌或種系特異基因編碼的抗原，代表共有的腫瘤相關(guān)抗原最大組群之一。CT-抗原起初在黑素瘤中被發(fā)現(xiàn)，但是也被發(fā)現(xiàn)于很多其他人類惡性腫瘤中。在正常組織中它們僅在睪丸和某些胎盤病例中表達(dá)。表達(dá)這些抗原的正常細(xì)胞缺少M(fèi)HC分子的表達(dá)，因而這些抗原正常情況下不能夠被T-淋巴細(xì)胞識(shí)別。
譜系特異分化抗原一組分化抗原，至今只對(duì)黑素瘤和前列腺癌做了描述。這些抗原僅在癌細(xì)胞中具有免疫原性，并且這一組包括黑素瘤細(xì)胞分化抗原gp100，Melan-A/MART-1，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MC1R，AIM-1和前列腺相關(guān)抗原PSA(前列腺特異抗原)，PSMA(前列腺特異膜抗原)，PAP(前列腺相關(guān)磷酸酯酶)和PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原)。
黑素瘤細(xì)胞分化抗原在正常分化的黑素瘤細(xì)胞和黑素瘤中表達(dá)都有表達(dá)的一組抗原。在正常分化的黑素瘤細(xì)胞中這些抗原極少誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，但是，這些蛋白在癌細(xì)胞中變得具有免疫原性，并且就黑素瘤來說，檢測到對(duì)黑素瘤細(xì)胞分化抗原反應(yīng)的T-殺傷細(xì)胞是可能的。該蛋白被認(rèn)為負(fù)責(zé)黑色素合成。
樹突狀細(xì)胞在某些淋巴組織中的非淋巴細(xì)胞型，外源蛋白先經(jīng)過細(xì)胞的內(nèi)吞作用，然后與MHC I類和II類抗原結(jié)合在一起被加工、并作為抗原決定簇被呈遞到細(xì)胞表面。呈遞樹突狀細(xì)胞的抗原能夠被細(xì)胞毒性T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞識(shí)別。樹突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài)對(duì)于它們的吞噬/內(nèi)吞活性是非常重要的。未成熟樹突狀態(tài)細(xì)胞是最有效的負(fù)載抗原細(xì)胞。
未成熟樹突狀細(xì)胞是其中某些細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)記CD1a、CD14和CD83，以高表達(dá)CD1a(在群體中超過50％的DC是CD1a陽性的)，不表達(dá)或低表達(dá)CD14(在群體中低于15％的DC是CD14陽性)以及低表達(dá)CD83(在群體中少于25％的DC是CD83陽性)為特征的樹突狀細(xì)胞。
核外體(exosome)核外體是直徑為30-100nm的膜囊，由內(nèi)吞作用起源，并且通過不同起源的活細(xì)胞在體外生成和分泌。
細(xì)胞因子作為生物反應(yīng)修飾成分的免疫系統(tǒng)蛋白。它們協(xié)調(diào)抗體和T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的相互作用，并且增強(qiáng)免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子包括由激活的T淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞和淋巴因子合成的單核因子。單核因子包括白細(xì)胞介素(IL)-1，腫瘤壞死因子(TNF)，α和β干擾素(IFN)和集落刺激因子。淋巴因子包括IL’s，γ-IFN，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及淋巴毒素。內(nèi)皮細(xì)胞和纖維原細(xì)胞以及被選擇的其它細(xì)胞型也可以合成細(xì)胞因子。根據(jù)本發(fā)明，合適的細(xì)胞因子例子包括IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，F(xiàn)lt31，SCF，TNF-α。
黑素瘤一種不同嚴(yán)重程度的惡性癌癥或腫瘤，在疾病的深度階段趨向于擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移。
負(fù)載樹突狀細(xì)胞通過內(nèi)吞作用吸收外源蛋白和在樹突狀細(xì)胞表面上呈遞多肽表位。有時(shí)候也稱作“脈沖(pulsing)”。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語“基本上無(不表達(dá))譜系特異性/黑素細(xì)胞分化抗原”是指用于制備完整細(xì)胞裂解物的癌/黑素瘤細(xì)胞系不會(huì)表達(dá)其含量會(huì)誘發(fā)針對(duì)譜系特異性/黑素細(xì)胞分化抗原免疫應(yīng)答的譜系特異性/黑素細(xì)胞分化抗原。實(shí)際上，這意味著癌/黑素瘤細(xì)胞對(duì)于特異于譜系特異性/黑素瘤細(xì)胞分化抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致的裂解是不敏感的(在4小時(shí)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，裂解少于10％，尤其少于5％，更少于2％。)，并且只有1-2％的細(xì)胞通過針對(duì)譜系特異性/黑素瘤細(xì)胞分化抗原的抗體呈現(xiàn)陽性染色。此外，在這些細(xì)胞系里的來自編碼譜系特異性/黑素瘤細(xì)胞分化抗原基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量，當(dāng)由半定量RT-PCR測定時(shí)，與在高敏感性細(xì)胞系中的RNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量相比較至少低大約100倍。
免疫應(yīng)答脊椎動(dòng)物免疫細(xì)胞具有的選擇性反應(yīng)，其中，特異抗體和/或細(xì)胞毒性細(xì)胞針對(duì)侵入的微生物、寄生蟲，移植組織以及許多其他被機(jī)體識(shí)別為外來物的物質(zhì)而產(chǎn)生。在血液中循環(huán)的抗體的產(chǎn)生被稱作體液免疫應(yīng)答，毒性細(xì)胞的產(chǎn)生被稱作細(xì)胞間接或細(xì)胞免疫應(yīng)答。
免疫治療疫苗一種用于治療和/或防止已在宿主中被確診疾病的進(jìn)一步發(fā)展的疫苗。
自體細(xì)胞個(gè)體自身的細(xì)胞。
同種異源(allogeneic)遺傳上相區(qū)別的，但屬同一物種的。
抗原呈遞細(xì)胞專化淋巴細(xì)胞，如誘導(dǎo)T細(xì)胞激活的樹突狀細(xì)胞，B細(xì)胞以及單核細(xì)胞。
單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相關(guān)的吞噬細(xì)胞的白血細(xì)胞。單核細(xì)胞代表著另一種抗原呈遞細(xì)胞類型，它重新激活原先被激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
前體樹突狀細(xì)胞存在于外周血中的CD14+單核細(xì)胞或者呈現(xiàn)于骨髓或外周血中(尤其是在活動(dòng)化之后)的CD34+細(xì)胞。
免疫顯性抗原存在于與其它抗原一起的混合物中，主要刺激針對(duì)其自身的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明涉及改進(jìn)的例如作為免疫治療疫苗的治療組合物?？乖蔬f至T細(xì)胞，特別是初生T細(xì)胞的最有效的方式是通過自體樹突狀細(xì)胞。來自三組不同腫瘤相關(guān)抗原CT抗原、腫瘤過表達(dá)抗原、譜系特異抗原之一的幾種腫瘤相關(guān)抗原已被應(yīng)用在臨床試驗(yàn)中并且到目前為止，最有前途的結(jié)果顯現(xiàn)于來自癌/睪丸抗原組中的抗原。
腫瘤過表達(dá)抗原與CT抗原相比，缺少嚴(yán)格的腫瘤特異表達(dá)，因?yàn)樗鼈兊谋磉_(dá)可以在某些正常組織而不是睪丸中檢測到，僅管與腫瘤細(xì)胞相比處在一個(gè)明顯很低的水平。這種分布防止了強(qiáng)烈的腫瘤排斥免疫性的發(fā)展(由于高反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞在耐受性誘導(dǎo)中的消除)以及一旦反應(yīng)產(chǎn)生，潛在的發(fā)展成自身免疫的危險(xiǎn)性將會(huì)上升。該組中包括大量抗原并且其中一些在最近臨床試驗(yàn)中作為靶目標(biāo)。
上面所提及的限制相同也適用于包括分化抗原的譜系特異抗原，該抗原組也在相應(yīng)的正常分化組織中表達(dá)，并且在健康個(gè)體中它們由于對(duì)“自我”蛋白的耐受而很少誘導(dǎo)攻擊。由于未知的原因，這些正常蛋白在癌細(xì)胞中產(chǎn)生免疫原性，在黑素瘤病例中，T殺傷細(xì)胞針對(duì)黑素瘤細(xì)胞分化抗原的反應(yīng)能夠很容易在病人中檢測到，而在健康個(gè)體中不會(huì)被檢測到。絕大多數(shù)直接針對(duì)黑素瘤或前列腺癌的臨床試驗(yàn)是利用分化抗原作為目標(biāo)。
本發(fā)明的目標(biāo)之一是特意的地避免在用于免疫的抗原混合物中出現(xiàn)過表達(dá)和譜系特異性分化抗原。就黑素瘤細(xì)胞系而言，過表達(dá)抗原組極少能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因而排除了對(duì)抗原組進(jìn)行陰性篩選的需要。至于黑素瘤細(xì)胞分化抗原，它們不應(yīng)該出現(xiàn)，如果出現(xiàn)，其量應(yīng)該不足以導(dǎo)致誘導(dǎo)針對(duì)它們的免疫應(yīng)答(實(shí)際上，這意味著通過RT-PCR半定量測定，來自編碼黑素瘤細(xì)胞分化抗原基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的量與在高敏感性細(xì)胞系中的RNA轉(zhuǎn)錄物量相比較至少低大約100倍)。那些免疫顯性蛋白的存在應(yīng)該被避免，特別是不應(yīng)該出現(xiàn)gp100，Melan A/MART-1和酪氨酸酶。
提供表達(dá)免疫顯性的至少三種抗原，特別是至少五種CT抗原，更特別的是提供盡可能多的CT抗原的細(xì)胞系也是本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)。令人驚奇的是，這些細(xì)胞系能夠從移走III期或IV期腫瘤后具有長的無疾病周期(超過五年)的黑素瘤病人中獲取，表明了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的免疫原性。來自這些細(xì)胞系的個(gè)體亞克隆因?yàn)槿鄙偃魏魏谒亓黾?xì)胞分化抗原，尤其是缺少gp100，Melan A/Mart-1和酪氨酸酶而被隨后篩選。
除了黑素瘤免疫療法，本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)針對(duì)人或動(dòng)物體內(nèi)其他類型癌癥的免疫應(yīng)答的方法。要求作為靶的抗原是共有抗原并且在其他類型惡性腫瘤中出現(xiàn)，主要地在實(shí)體瘤中出現(xiàn)。尤其是這些類型腫瘤可以包含結(jié)腸直腸癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，汗腺癌，腎細(xì)胞癌，肝細(xì)胞瘤，宮頸癌，肺癌，小細(xì)胞肺癌或膀胱癌。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中涉及一種用于誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物組合物，包括呈現(xiàn)癌/睪丸抗原多樣性的樹突狀細(xì)胞，其中，a)至少五種癌/睪丸抗原，無譜系特異分化抗原或基本上無譜系特異分化抗原通過樹突狀細(xì)胞呈遞。
b)癌/睪丸抗原通過表達(dá)至少五種分化癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原的至少一種癌細(xì)胞系提供。
c)樹突狀細(xì)胞在負(fù)載癌/睪丸抗原期間是未成熟的(CD1a陽性，CD14陰性，和CD83陰性)。
有利的是負(fù)載的樹突狀細(xì)胞可以隨著成熟因子的加入而成熟。
如上所討論，樹突狀細(xì)胞是最有效的抗原呈遞細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供樹突狀細(xì)胞尤其是產(chǎn)生于外周血中分離的CD14+單核細(xì)胞或者是來自外周血或骨髓中的CD34+細(xì)胞的自體樹突狀細(xì)胞，它們的細(xì)胞內(nèi)吞/吞噬活性以及CD1a表達(dá)均已被優(yōu)化。該活性被確信與樹突狀細(xì)胞的非成熟狀態(tài)有關(guān)。為了獲得那些被激活的細(xì)胞，許多報(bào)道利用了Sallusto和Lanzavecchia的“GM-CSF+IL-4方法”(1994，J.Exp.Med.1791109)。其他適合的細(xì)胞因子包括IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，F(xiàn)lt-31，SCF，TNF-α(Alters et al.，1999，J.Immunother.，v.22，pp.229-236)，尤其是涉及本發(fā)明的細(xì)胞因子選自GM-CSF和IL-4。
現(xiàn)在我們吃驚地發(fā)現(xiàn)，如下面實(shí)施例2所示，這一方法能夠被進(jìn)一步優(yōu)化，在初始生長階段沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)，接著，使樹突狀細(xì)胞負(fù)載之前在包含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，將會(huì)得到細(xì)胞內(nèi)吞活性增強(qiáng)的DC’s。根據(jù)本發(fā)明，初始生長階段從6-48小時(shí)，特別是從12-34小時(shí)，更特別的是從20-28小時(shí)。
以前人們認(rèn)為所有非成熟樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)吞活性是同樣的，與培養(yǎng)方法無關(guān)?，F(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)，通過使用報(bào)道的方法來生產(chǎn)穩(wěn)定的成熟樹突狀細(xì)胞以及通過在加入成熟因子之前，使樹突狀細(xì)胞在它們的非成熟狀態(tài)負(fù)載，從而獲得細(xì)胞內(nèi)吞活性優(yōu)化的非成熟樹突狀細(xì)胞是可能的。
因而，在本發(fā)明另一實(shí)施方案中涉及一種如上提及的藥物組合物，其中樹突狀細(xì)胞在初始生長階段沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)，接著在使樹突狀細(xì)胞負(fù)載至少一種癌/睪丸抗原之前，通過在包含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基的進(jìn)行第二階段培養(yǎng)。
由于要提供CT抗原的多樣性，尤其是要提供超過五種的CT-抗原，在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中涉及如上所描述的藥物組合物，其中提供來自至少一種不表達(dá)譜系特異性分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異性分化抗原的癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物中的至少五種癌/睪丸抗原。完整細(xì)胞裂解物能夠通過幾種方式從細(xì)胞中獲得，如腫瘤細(xì)胞或其他類型細(xì)胞，通過細(xì)胞裂解，再如，通過幾個(gè)冷凍和解凍周期而獲得。在包括可溶性物質(zhì)的細(xì)胞裂解物中粒子通常通過離心和/或過濾被移走。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，涉及如上所描述的組合物，其中癌細(xì)胞系是黑素瘤細(xì)胞系并且譜系特異性分化抗原是黑素細(xì)胞分化抗原。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，黑素細(xì)胞分化抗原包括gp100，MelanA/Mart-1，和酪氨酸酶。
根據(jù)本發(fā)明體外培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞將在它們的內(nèi)吞活性和CD1表達(dá)方面將被優(yōu)化，并且它們能夠方便地被用于任何用于免疫治療的組合物或疫苗中的抗原呈遞。因此在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中涉及一種自體樹突狀細(xì)胞在藥物組合物或疫苗中作為抗原呈遞細(xì)胞的使用方法，其中所述自體樹突狀細(xì)胞已經(jīng)過在初始生長階段沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)，接著在使樹突狀細(xì)胞在它們的未成熟階段負(fù)載至少五種癌/睪丸抗原之前，在包含細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明其他獲得呈遞抗原的樹突狀細(xì)胞的方法也是可能的，例如完整細(xì)胞融合。這可以通過使用攜帶有根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的樹突狀細(xì)胞融合實(shí)現(xiàn)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，抗原呈遞通過核外體的使用而實(shí)現(xiàn)。核外體是小的細(xì)胞內(nèi)吞起源的膜囊泡，它們由大部分培養(yǎng)細(xì)胞所分泌，并且最近在抗原呈遞細(xì)胞中被描述，它們能夠誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答(Thery et al.，2002，Nature Reviews Immunology 2569-579)。
更在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及獲得負(fù)載至少五種癌/睪丸抗原，不負(fù)載譜系特異性分化細(xì)胞或者基本上不負(fù)載譜系特異性分化抗原的自體樹突狀細(xì)胞的方法，包括步驟a)提供至少一種表達(dá)至少五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原的癌細(xì)胞系，b)提供來自于上述的人或動(dòng)物的自體樹突狀細(xì)胞，c)在初始生長階段沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)所述樹突狀細(xì)胞，接著通過在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基的進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，d)使來自c)所述樹突狀細(xì)胞負(fù)載癌/睪丸抗原，該抗原獲自至少一種來自a)的癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物。
有利的是樹突狀細(xì)胞在步驟d)之后通過加入成熟因子，像IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2而成熟。
在另外一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過實(shí)施步驟a)到步驟d)，接著通過成熟步驟而獲得的藥物組合物。
使用已知的方法從單核細(xì)胞群體中產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞，很難獲得理想的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量。有報(bào)道來自單核細(xì)胞起始群體的樹突狀細(xì)胞平均產(chǎn)量大約是5％(Marovitch et al.，2002，J.Infect.Dis.1861242-1252)。為了得到一個(gè)完整接種周期所需的50×106數(shù)目的樹突狀細(xì)胞，必需從109個(gè)單核細(xì)胞開始。
假定在吸附期間細(xì)胞濃度通常是5×106/ml，該細(xì)胞量需要0.2L培養(yǎng)基用于吸附步驟，同樣量的培養(yǎng)基用于進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)。為制備樹突狀細(xì)胞將需要大約60μg GM-CSF和30μg的IL-4以及大量的組織培養(yǎng)塑料器皿。這將導(dǎo)致每個(gè)疫苗的凈值(net price)是非常高的。此外，為了從血液中分離109個(gè)單核細(xì)胞將需要1L血液，從病人中獲取幾乎是不可能的，考慮到病人的極差的健康狀況，即使分兩次單獨(dú)抽取也是不可能的。一種可能性是使用準(zhǔn)許大量單核細(xì)胞分離的白細(xì)胞去除法。該程序常常被用于生產(chǎn)大量的樹突狀細(xì)胞(例如參見Thurner et al.，1999，J.Immunol.Methods 2231-15)但是，白細(xì)胞去除法的程序非?；ㄙM(fèi)時(shí)間并且成本高，反過來它將增加疫苗制備的總成本。此外，在一臺(tái)白細(xì)胞去除設(shè)備上只能處理一名病人的血樣。這將限制制備程序的生產(chǎn)能力。
可以選擇的是，從單核細(xì)胞中生產(chǎn)樹突狀細(xì)胞的效率能夠增加。例如Tuyaerts等2002(J.Immunol.Methods 264135-151)報(bào)道了Nnuc細(xì)胞生產(chǎn)廠生產(chǎn)樹突狀細(xì)胞的改進(jìn)方法，并且報(bào)道其樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)到了起始單核細(xì)胞量的40％(或起始單核細(xì)胞量的13％，當(dāng)平均起來單核細(xì)胞代表了單核細(xì)胞的三分之一時(shí))。但是，產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞缺少可以指示其不完全分化的CD1a標(biāo)記的表達(dá)。因?yàn)镃D1a的表達(dá)是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所必需的，該方法不能被用來實(shí)現(xiàn)我們的目的。
因此，我們代之以優(yōu)化了的從血液單核細(xì)胞中產(chǎn)生未成熟樹突狀細(xì)胞的程序，嚴(yán)密監(jiān)測單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為樹突狀細(xì)胞的增加效率以及完全感受態(tài)未成熟樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生，作為感受態(tài)未成熟樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的讀出系統(tǒng)，我們已經(jīng)選擇下列標(biāo)準(zhǔn)CD1a標(biāo)記高表達(dá)(超過50％)，CD14沒有或低表達(dá)(低于15％)以及CD83低表達(dá)(低于25％)。
如在下面實(shí)施例中所描述的，本發(fā)明最優(yōu)化的結(jié)果已經(jīng)證明延遲細(xì)胞因子的加入的重要性，特別是在CD1a標(biāo)記表達(dá)方面。
我們的研究進(jìn)一步揭示通過在單核細(xì)胞的接種群體中控制單核細(xì)胞起始濃度，獲得大約50％帶有從單核細(xì)胞產(chǎn)生的CD1a標(biāo)記的未成熟樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量是可能的。
因而本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及一種優(yōu)化產(chǎn)生自單核細(xì)胞樣品的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量的方法，在該方法中，單核細(xì)胞的接種密度是在6-8ml培養(yǎng)基中接種5×106-20×106細(xì)胞/25cm2。當(dāng)使用T25瓶時(shí)，這意味著單核細(xì)胞的起始數(shù)量在5×106-20×106細(xì)胞之間。在具體實(shí)施方案中密度在6×106-15×106細(xì)胞/25cm2之間，特別是在8×106-12×106細(xì)胞/25cm2之間。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中至少兩個(gè)同種異源黑素瘤細(xì)胞系在步驟a)中被提供。同種異源細(xì)胞系的數(shù)量取決于由于缺少黑素瘤細(xì)胞分化抗原而被分離以及篩選出的適宜的亞克隆數(shù)量。提供的細(xì)胞系越多一些免疫顯性癌/睪丸抗原在完整細(xì)胞裂解物中被代表的機(jī)會(huì)就越大。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，從至少兩種同種異源細(xì)胞系中提供至少五種CT-抗原。在一個(gè)具體實(shí)施方案中同種異源細(xì)胞系選自DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)(兩種細(xì)胞系保藏在European Collection of Animal Cell Cultures，CAMR，GB-Salisbury，Wiltshire SP40JG，(大不列顛)聯(lián)合王國，2001年11月23日)。
本發(fā)明的另一方面涉及上面具體的細(xì)胞系，也涉及表達(dá)至少五種CT抗原，不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原或基本上不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原的其它細(xì)胞系。因此本發(fā)明涉及至少表達(dá)五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原或基本上不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原分離的黑素瘤細(xì)胞系，尤其是分離的細(xì)胞系DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。因此本發(fā)明也涉及一種藥物組合物或本發(fā)明的一種方法，其中至少一種黑素瘤細(xì)胞系選自同種異源細(xì)胞系DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。
當(dāng)藥物組合物被施用于人或動(dòng)物時(shí)，將在所述人或動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致刺激人或動(dòng)物產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。因此本發(fā)明進(jìn)一步的目的涉及一種在人或動(dòng)物體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括步驟a)提供至少一種表達(dá)了至少五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原的癌細(xì)胞系，b)提供來自于所述人或動(dòng)物的自體樹突狀細(xì)胞，c)初始生長階段在沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)所述樹突狀細(xì)胞，接著在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二生長階段培養(yǎng)，d)使來自c)所述樹突狀細(xì)胞負(fù)載癌/睪丸抗原，該抗原來自a)的至少一個(gè)癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物中。
e)施用所述來自d)的負(fù)載樹突狀細(xì)胞于人或動(dòng)物。
在上述方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，癌細(xì)胞系是黑素細(xì)胞系，譜系特異性分化抗原是黑素細(xì)胞分化抗原。
在一些情況下從病人體內(nèi)獲取足夠量的自體樹突狀細(xì)胞是困難的。這種情況下，在步驟b)之前給與誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞動(dòng)員(mobilization)的物質(zhì)是可能的。所述物質(zhì)包括G-CSF和/或GM-CSF。
樹突狀細(xì)胞前體，CD14+單核細(xì)胞或CD34+細(xì)胞能夠從血液樣品中獲得，如從外周血中獲得。它也可能但是并沒有必要從剝離(apheresis)細(xì)胞開始。
也可以預(yù)期的是根據(jù)本發(fā)明該方法進(jìn)一步包括施用于人或動(dòng)物的步驟，在步驟e)之后誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞激活的物質(zhì)。這可以通過施用例如IL-2或IL-12完成。
本發(fā)明期望在制備至少來源于一種黑素瘤細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物之前，應(yīng)用一種能夠增加癌/睪丸抗原表達(dá)水平的試劑。建議通過DNA甲基化影響某些睪丸特異性基因的表達(dá)。已證實(shí)去甲基化試劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5azaCdR)能夠在MAGE-A1陰性黑素瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)MAGE-A1基因的表達(dá)(De Smet et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，v.93，pp.7149-7153；Weber et al.，1994，Cance Res.，v.54，pp.1766-1771)。當(dāng)5azaCdR在DNA甲基化，CpG二核苷酸靶位點(diǎn)摻入DNA時(shí)，5azaCdR是起到DNA轉(zhuǎn)甲基酶自殺底物作用的胞嘧啶類似物。在真核細(xì)胞中去甲基化一般導(dǎo)致體內(nèi)基因表達(dá)增加。已有建議說MAGE-A1的激活產(chǎn)生于啟動(dòng)子區(qū)的去甲基化，接著是發(fā)生在很多腫瘤中的全面的去甲基化過程。5azaCdR在基因表達(dá)方面的激活效應(yīng)也在MAGE家族(Lucas et al.，1998，Cancer Res.，v.58，pp.743-752；Lurquin et al.，1997，Genomics，v.46，pp.397-408)，以及GAGE家族(DeBacker et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.3157-3165；Li et al.，1996，Clin.Cancer Res.，v.2，pp.1619-1625)，以及LAGE基因家族(Li et al.，1996，Clin.Cancer Res.，v.2，pp.1619-1625))的其他成員中顯現(xiàn)。去甲基化在腫瘤細(xì)胞的MAGE基因表達(dá)中的作用由下列事實(shí)支持其他很多在腫瘤細(xì)胞中檢測不到其存在的睪丸特異性基因的表達(dá)，不能通過5azaCdR的處理而上調(diào)節(jié)(De Smet et al.，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.，v.241，pp.653-657)，在MAGE-B基因中只有通過5azaCdR處理被激活的那些基因的腫瘤表達(dá)才能被檢測到(Lurquin et al.，1997，Genomics，v.46，pp.397-408)。此外，MAGE-A1基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)的去甲基化與基因表達(dá)之間的好的相關(guān)性已經(jīng)被觀察到(De Smetet al.，1999，Mol.Cell Biol.，v.19，pp.7327-7335)。
因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，CT抗原表達(dá)的上調(diào)節(jié)能夠通過編碼CT抗原的DNA的去甲基化實(shí)現(xiàn)。尤其是該去甲基化能夠通過5azaCdR的處理而誘導(dǎo)。但是CT抗原表達(dá)的上調(diào)節(jié)的另一個(gè)方式可以被組蛋白的脫乙酰化作用抑制。這兩種處理類型可以分別或一起使用。這種處理方式只有在癌/睪丸抗原保持免疫顯性時(shí)才可以被使用。
許多CT抗原能夠被分成包括一些成員的亞家族(參見表1)。它們是MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE和SSX亞家族。對(duì)于其它抗原至今只有一個(gè)個(gè)體成員被發(fā)現(xiàn)。它們是BAGE，SCP-1，TSP50，TRAG-3，SAGE，IL13Rα，CT9和CTp11抗原。所有CT抗原可以考慮作為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之目的的潛在的免疫治療之目標(biāo)。
表1.人癌/睪丸抗原家族 成員MAGE-A MAGE-A1， MAGE-A2， MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5， MAGE-A6， MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12MAGE-B MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17MAGE-C MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4GAGE GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAG E-7，GAGE-8PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3LAGE LAGE-1a，LAGE-1b，Ny-ESO-1SSX SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5單獨(dú)成員 BAGE，SCP-1，TSP50，TRAG-3，SAGE，IL13Rα，CT9，CTp11CT抗原的最大組之一是MAGE蛋白組，包括三個(gè)家族，MAGE-A，MAGE-B和MAGE-C。
MAGE-A基因代表了15個(gè)位于染色體X(Xq28區(qū))長臂的緊密相關(guān)的基因家族(Chomez et al.，2001，Cancer Res，v.61，pp.5544-5551；De Plaen et al.，1994，Immunogenetics，v.40，pp.360-369)，包括第一個(gè)被識(shí)別的編碼MAGE-A1抗原的基因(原先被指定為MAGE-1)(vander Bruggen et al.，1991，Science，v.254，pp.1643-1647)。在大多數(shù)研究的腫瘤中只有MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6和-A12基因已經(jīng)被證實(shí)。最近其他MAGE-A基因的表達(dá)，包括MAGE-A11(Jurk et al.，1998，Int.J，Cancer，v.75，PP.762-766)，MAGE-A10(Huang et al.，1999，J.Immunol.，v.162，pp.6849-6854)，MAGE-A5，MAGE-A8和MAGE-A9(Serrano et al.，1999，Int.J.Cancer，v.83，pp.664-669)在某些腫瘤中也已經(jīng)被檢測到。
呈遞被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別的肽表位的能力由MAGE-A1(van der Bruggen et al.，1991，Science，v.254，pp.1643-1647)，MAGE-A2(Visseren et al.，1997，Int.J.Cancer，v.73，pp.125-130)，MAGE-A3(Gaugler et al.，1994，J.Exp.Med.，v.179，pp.921-930)，MAGE-A4(Duffour et al.，1999，Eur.J.Immunol.，v.29，pp.3329-3337)，MAGE-A6(Tanzarella et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.2668-2674)，MAGE-A10((Huang et al.，1999，J.Immunol.，v.162，pp.6849-6854))和MAGE-A12((Panelli et al.，2000，J.Immunol.，v.164，pp.4382-4392))表現(xiàn)。T-輔助細(xì)胞也能夠識(shí)別MAGE抗原，并且MAGE-A1和MAGE-A3抗原的相關(guān)表位也已被識(shí)別出來(Chaux et al.，1999，J.Exp.Med.，v.189，pp.767-778；Chaux et al.，2001，Eur J Immunol，v.31，pp.1910-1916；Manici et al.，1999，J.Exp.Med.，v.189，pp.871-876)。
MAGE表達(dá)在很多類型的人惡性腫瘤中被檢測到。皮膚黑素瘤具有最高水平的MAGE表達(dá)(MAGE-A3達(dá)到65％的水平)(De Planenet al.，1994，Immunogenetics，v.40，pp360-369)，盡管眼黑素瘤對(duì)于MAGE表達(dá)是陰性的(Mulcahy et at.，1996，Int.J.Cancer，v.66，pp.738-742)。MAGE抗原在其它腫瘤中以相對(duì)較低的程度表達(dá)，如乳腺癌，頭頸腫瘤，肺癌，惡性腫瘤和膀胱癌(其綜述參見(van Pel et al.，1995，Immunol.Rev.，v.145，pp.229-250))。MAGE-A1的高表達(dá)(80％)在肝癌中被發(fā)現(xiàn)((Yamashita et al.，1996，Hepatology，v.24，pp.1437-1440))。與其它MAGE抗原相比，MAGE-A4在大部分淋巴細(xì)胞中表達(dá)，包括Hodgkin淋巴細(xì)胞，其中它的表達(dá)被限制在Reed-Sternberg細(xì)胞中(Chambost et al.，2000，Blood，v.95，PP.3530-3533)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤樣品是MAGE-A4陽性時(shí)，基因通常以非常高的水平表達(dá)。
MAGE-B基因代表X染色體上位于p21.3和p22區(qū)的17個(gè)基因家族，其中的8個(gè)是假基因(Chomez et al.，2001，Cancer Res，v.61，pp.5544-5551；Lucas et al.，2000，Int.J.Cancer，V87，pp.55-60；Lurquinet al.，1997，Genomics，v.46，pp.397-408)。只有兩個(gè)基因MAGE-B1和MAGE-B2在各種組織學(xué)類型腫瘤的重要部分中表達(dá)。MAGE-B5和MAGE-B6的表達(dá)在有限的腫瘤樣品數(shù)量中被檢測到(Lucas et al.，2000，Int.J.Carcer，v.87，pp.55-60)。
MAGE-C家族中的七個(gè)成員位于Xq26-q27區(qū)。MAGE-C1基因通過在睪丸和黑素瘤中的選擇性基因表達(dá)分析而被識(shí)別(Lucas et al.，1998，Cancer Res.，v58，pp743-752)。它們的表達(dá)模式與MAGE-A基因的表達(dá)模式極為相像。另一條基因CT7(Chen et al.，1998，Proc.Natl.Acas.Sci.U.S.A.，v.95，pp6919-6923)有可能代表不同的MAGE-Cl等位基因。MAGE-C2/CT10局限于Xq27區(qū)，但是與MAGE-Cl相比，該蛋白沒有重復(fù)部分。第三和第四個(gè)成員MAGE-C3和MAGE-C4，通過數(shù)據(jù)庫搜索而得以識(shí)別(chomez et al.，2001，cancer Res，v.61，pp.5544-5551；Lucas et al.，2000，Int.J.Cancer，v.87，pp.55-60)。
一些具有癌/睪丸抗原特征的非MAGE蛋白已經(jīng)被描述。其中一個(gè)是BAGE抗原( et al.，1995，Immunity，v.2，pp.167-175)。它們在腫瘤樣品中的表達(dá)模式非常近似于MAGE抗原的表達(dá)模式，具有更低的表達(dá)率(在黑素瘤中22％，在膀胱癌中15％，在乳腺癌中10％，在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中8％)，至于MAGE抗原，BAGE的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展的階段相關(guān)聯(lián)。BAGE抗原能夠被CTL識(shí)別，并且抗原的肽表位被識(shí)別。
另外一個(gè)抗原被作為HLA-Cw6-限定的由GAGE-1基因編碼的表位得以識(shí)別(Van den Eynde et al.，1995，J.Exp.Med.，v.182，pp.689-698)。該基因?qū)儆诖蟮幕蚣易?，包括GAGE-1至GAGE-8基因(Chenet al.，1998，J.Bjol.Chem.，v.273，pp.17618-17652；De Backer et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.3157-3165；Van den EVnde et al.，1995，J.Exp.Med.，v.182，pp.689-698)，PAGE-1到PAGE-4基因((Brinkmann eta1.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，v.95，pp.10757-10762；Chen et al.，1998，J.Biol.Chem.，v.273，pp.17618-17625)，和XAGE-1至XAGE-3基因(Brinkmann et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.1445-1448)。編碼蛋白的GAGE家族的兩個(gè)基因GAGE-1和GAGE-2在大部分黑素瘤(24％)，肉瘤(25％)，非小肺癌(19％)，頭頸腫瘤(19％)和膀胱腫瘤(12％)中表達(dá)。
一些CT抗原最近通過使用SEREX方法得以識(shí)別(人類腫瘤重組cDNA文庫血清表達(dá)克隆)(Sahin et al.，1995，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.，v.92，pp.11810-11813)。其中之一，NY-ESO-1，由CTAG基因編碼(Chen et al.，1997，Cytogenet.Cell Genet.，v.79，pp.237-240)，表達(dá)于67個(gè)黑素瘤樣本中的23個(gè)樣本中，33個(gè)乳腺癌樣本中的10個(gè)樣本中，16個(gè)前列腺癌樣本的4個(gè)樣本中，5個(gè)膀胱癌樣本中的4個(gè)樣本中，同樣在其他一部分腫瘤類型中也有表達(dá)，但是在11個(gè)培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞系中僅有兩個(gè)表達(dá)(Chen et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，v.94，pp.1914-1918)。在黑素瘤病人中，CTL反應(yīng)受限于HLA-A2，并且由黑素瘤特異CTL系識(shí)別的三種肽已經(jīng)被鑒別。也已發(fā)現(xiàn)該抗原在一例黑素瘤病人中誘導(dǎo)HLA-A31-限制的CTL反應(yīng)(Wang et al.，1998，J.Immunol.，v.161，pp.3596-3606)。此外，隨著三種肽表位的鑒別，通過CD4+T淋巴細(xì)胞的MHC II類限制已經(jīng)得到描述(Jger et al.，2000，J.Exp.Med.，v.191，pp.625-630)。最近針對(duì)于CTAG的基因同源性已經(jīng)得到了描述。這一基因LAGE-1(Lehtéet al.，1998，Int.J.Cancer，v.76，pp.903-908)在類似于NY-ESO-1的不同腫瘤中分布。兩個(gè)基因都位于X染色體的q28帶，接近于MAGE基因(Lehtéet al.，1998，Int.J.Cancer，v.76，pp.903-908)。NY-ESO-1是目前被鑒別的最具免疫原性的腫瘤抗原之一。
由此本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中癌/睪丸抗原包括選自MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE，SSX亞家族的抗原。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中CT抗原中包括的抗原選自MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，NY-ESO-1，LAGE，PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4，XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3，SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，CT抗原所包括的抗原選自SCP-1，TSP-50，TRAG-3，SAGE，IL-13Rα，CTp11。
在更進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，CT抗原中所包括的抗原選自MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1。
以上抗原代表了被認(rèn)為是本發(fā)明內(nèi)容中特別有用的抗原，但是，其它沒有被專門提及的抗原只要其癌/睪丸抗原多樣性得到應(yīng)用，則也可以被使用，并且特別為至少五種，更特別為至少六種，更進(jìn)一步為至少七種CT抗原。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及上述組合物作為癌癥免疫治療疫苗的應(yīng)用。
使用以黑素瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的組合物或疫苗的一個(gè)情形是黑素瘤存在于疾病的晚期階段。另一種情形是原發(fā)腫瘤的存在，在這種情況下，治療的目的不僅僅是誘導(dǎo)對(duì)原發(fā)腫瘤的排斥，也防止轉(zhuǎn)移，因?yàn)橐唤MCT抗原主要在轉(zhuǎn)移中表達(dá)。還有一種情形是通過其他方式(外科手術(shù)，放射)移走原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤，在這種情況下，治療的目的是防止腫瘤復(fù)發(fā)。
表達(dá)幾個(gè)CT抗原的腫瘤比沒有或僅有一種CT抗原的腫瘤有更多的機(jī)會(huì)被抑制或限制生長。因此，腫瘤活體組織中的CT抗原表達(dá)測定在預(yù)測使用通用的以黑素瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗效力上具有重要意義。
實(shí)施例接下來將進(jìn)一步通過某些非限制性實(shí)施方案闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1DDM-1黑素瘤細(xì)胞系的黑素細(xì)胞分化抗原缺陷克隆的分離DDM-1黑素瘤細(xì)胞系獲自疾病長期未發(fā)作的病人?？寺DM-1黑素瘤細(xì)胞，篩選出酪氨酸酶表達(dá)陰性的8個(gè)克隆。酪氨酸酶是已知的黑素瘤細(xì)胞分化抗原之一。進(jìn)一步對(duì)這些克隆(DDM-1.5，DDM-1.6，DDM-1.7，DDM-1.10，DDM-1.11，DDM-1.13，DDM-1.24和DDM-1.25)進(jìn)行了表達(dá)兩種免疫顯性黑素細(xì)胞分化抗原，gp100和MelanA/MART-1的檢測。
在T75組織培養(yǎng)瓶中用補(bǔ)充了10％胎牛血清的20ml RPMI 1640培養(yǎng)基(BioWhittaker)進(jìn)行黑素瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。為了在誘導(dǎo)針對(duì)負(fù)載黑素瘤細(xì)胞裂解物的樹突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)中使用，用包含2％的人血清(HuS)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。在培養(yǎng)瓶中移走培養(yǎng)基，在Ca、Mg缺失的PBS(Bio Whittaker)中加入5ml 0.02％EDTA，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-20分鐘，加入10ml PBS并且轉(zhuǎn)移分離細(xì)胞至離心管從而收集細(xì)胞。以200g離心5分鐘之后，丟棄上清液，粒狀沉淀重新懸浮于培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將1.5×106個(gè)細(xì)胞放入含有20ml培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中。
Gp100和Melan-A/MART-1抗原的表達(dá)通過測定黑素瘤細(xì)胞對(duì)于由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)克隆引起的裂解敏感性而得以檢測，其細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是特異性針對(duì)這些抗原的。我們以前描述了這些CTL克隆的性質(zhì)(Kirkin et al.，1999，Cancer Immunol.Immunother.，v.48，pp.239-246)，其完整內(nèi)容因此被并入作為參考。如上描述，收集黑素瘤細(xì)胞，重懸于培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)克隆的0.5×106個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至11ml圓錐試管(Nunc)。細(xì)胞以200g離心5分鐘，丟棄上清液，粒狀沉淀重新懸浮在0.1ml的培養(yǎng)基中。加入0.1mlNa2CrO4溶液(0.1mCi，Amersham)，細(xì)胞以37℃水浴60分鐘。用RPMI-1640洗滌三次之后，使目標(biāo)物在含有10％FCS的RPMI-1640中濃度調(diào)節(jié)至5×104細(xì)胞/ml。使用濃度為5×105細(xì)胞/ml的毒性淋巴細(xì)胞。CTLs和目標(biāo)黑素瘤細(xì)胞以100μl等分試樣一式三份接種在96U型底的微量滴定板中(Nunc)，以200g離心2分鐘，隨后在5％CO2，37℃條件下溫育。4小時(shí)后鋪板以250g離心3分鐘，收集100μl上清液，測定放射能(Cobra 5005，Packard Instruments，Meriden，Conn.，USA)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算特異性裂解。一個(gè)代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在附圖1中表示。這些結(jié)果顯示被研究的黑素瘤克隆中只有兩種黑，DDM1.7和DDM1.13對(duì)于CTLs引起的溶胞攻擊是完全耐性的，表明在這些黑素瘤克隆中有可能缺少所指出的黑素瘤細(xì)胞分化抗原的表達(dá)。
為了獲得缺少抗原表達(dá)的其他證據(jù)，我們通過RT-PCR對(duì)這些蛋白的RNA譯碼的表達(dá)進(jìn)行了分析。離心2×106個(gè)細(xì)胞，丟棄上清液，粒子沉淀溶解在0.3ml細(xì)胞裂解液中(PurescriptRRNA isolation kit，Gentra)。根據(jù)廠商說明書分離RNA，加入兩體積的100％異丙醇至裂解液中使之沉淀，用70％乙醇洗滌并且在10μl無RNAase蒸餾水中再水化。分離的RNA用DNAase處理以破壞任何制備中的痕量DNA。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，使用了DNA-freeTM試劑盒中的試劑(Ambion)。1μl 10×DNAase緩沖液和μl DNAase(2個(gè)單位)被加入樣品中，混合物以37℃溫育30分鐘，加入1.2μl DNAase鈍化試劑終止反應(yīng)。在20μl總體積中使用10μl RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄從而完成cDNA合成。為了這一目的，根據(jù)廠商方案使用含有oligo(dT)引物的Super Script II RT(Gibco BRL)。42℃溫育30分鐘，接著以45℃溫育30分鐘，72℃溫育2分鐘。1μl cDNA用于PCR擴(kuò)增，該擴(kuò)增的1xPCR緩沖液中含有50mM KCL，10mM Tris/HCL(pH9.0)，1.5mMMgCl2,0.2mM甲酚，12％蔗糖，0.005％牛血清白蛋白胨，每一引物2.5pmol，40μM dNTPs(Pharmacia LKB)，以及1.25U(1μl)AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer)。通過下述方式選擇引物擴(kuò)增的產(chǎn)物能夠在同樣反應(yīng)條件下被有效地累積，使我們能夠在同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)條件下比較各種被選擇的抗原在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)以及下面要描述的試驗(yàn)中使用的引物序列列于表2。在所有反應(yīng)中，使用“熱啟動(dòng)”程序，其中在第一循環(huán)周期中的變性和退火步驟之間，80℃溫度下加入Taq聚合酶和dNTP至反應(yīng)試管中。用于擴(kuò)增的參數(shù)是30-38個(gè)循環(huán)(94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，40秒)，接下來72℃，10分鐘并且冷卻至4℃。擴(kuò)增在Perkin-Elmer GeneAmp PCR系統(tǒng)9600中完成。陰性對(duì)照含有代替了cDNA的水的等分試樣。GAPDH作為反應(yīng)的陽性對(duì)照被擴(kuò)增，同時(shí)也給出了對(duì)于持家基因相關(guān)抗原表達(dá)率的評(píng)價(jià)。對(duì)于陰性結(jié)果隨著循環(huán)次數(shù)的增加至少重復(fù)兩次。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2％瓊脂糖膠以100v電泳分離，使用溴乙啶染色，在UV照射下顯現(xiàn)，并由圖像報(bào)告系統(tǒng)記錄。當(dāng)進(jìn)行半定量RT-PCR時(shí)，循環(huán)的次數(shù)降低到22次以確保被篩選序列的量隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)呈線性增加。PCR反應(yīng)通過使用3或5倍cDNA模板稀釋液來進(jìn)行。結(jié)果產(chǎn)物的條帶強(qiáng)度在電泳分離之后通過圖像進(jìn)行分析，通過使用同樣模板和同樣稀釋液而獲得的GAPDH產(chǎn)物的強(qiáng)度來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，與RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的水平在不同細(xì)胞系中得以比較。
表2寡核苷酸序列5’-3’基因引物GADPH 有義AGGGGGGAGCCAAAAGGG反義GAGGAGTGGGTGTCGCTGTGp100 有義GGCTGGTGAAGAGACAAGTCC反義AGAGATGCAAGGACCACAGCCMart-1 有義GAAGGTGTCCTGTGCCCTGACCC反義GGCTTGCATTTTTCCTACACCATTCCMAGE-A1 有義GATTCCCTGGAGGCCACAG反義CCTCACTGGGTTGCCTCTGTCMAGE-A3 有義ACCAGAGGCCCCCGGAGGAG反義CTGCCAATTTCCGACGACACTCCMAGE-A4 有義GAGCAGACAGGCCAACCG反義AAGGACTCTGCGTCAGGCMAGE-A6 有義AGGACCAGAGGCCCCC反義GGATGATTATCAGGAAGCCTGTMAGE-A10有義CACAGAGCAGCACTGAAGGAG反義CTGGGTAAAGACTCACTGTCTGGMAGE-A12有義TGGAAGTGGTCCGCATCG反義GCCCTCCACTGATCTTTAGCAANY-ESO-1有義GGCACAGGGGGTTC反義GCTTAGCGGCCTCTGCCCT在3個(gè)黑素瘤細(xì)胞克隆DDM-1.7，DDM-1.13和DDM-1.29中的黑素細(xì)胞分化抗原gp100，MART-1表達(dá)測定的結(jié)果顯示如圖2，清楚地證實(shí)在生長于10％FCS中的DDM-1.7，DDM-1.13黑素瘤克隆的RNA轉(zhuǎn)錄水平也大大低于DDM-1.29中的水平，并且與DDM-1.29相比DDM-1.7，DDM-1.13相關(guān)產(chǎn)物的條帶強(qiáng)度隨著cDNA模板連續(xù)稀釋降低得更快。根據(jù)半定量RT-PCR分析結(jié)果以及通過持家GAPDH轉(zhuǎn)錄水平標(biāo)準(zhǔn)化之后數(shù)據(jù)表明，在DDM-1.7，DDM-1.13中黑素細(xì)胞抗原的RNA轉(zhuǎn)錄水平與DDM-1.29中與之相關(guān)的抗原轉(zhuǎn)錄水平相比較低1％。在調(diào)整細(xì)胞生長至2％人血清中之后，黑素細(xì)胞分化抗原表達(dá)的微弱增加(未列出)能夠通過RT-PCR分析顯示，其不超過DDM-1.29中相關(guān)抗原轉(zhuǎn)錄水平1％。
調(diào)整至2％人血清中生長的細(xì)胞中的gp100表達(dá)也通過免疫染色進(jìn)行研究。對(duì)此，細(xì)胞被培養(yǎng)在置于皮氏培養(yǎng)皿中的玻璃蓋片上。用冷PBS漂洗后，細(xì)胞用冰冷的甲醇-丙酮混合物(1∶1)固定15分鐘。干燥之后，蓋片在PBS中孵育1分鐘并且根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)程序使用作為第一抗體的HMB45和HMB50抗體混合物(NeoMarkers)，作為第二抗體的生物素化的綿羊抗鼠Ig抗體(Amersham)，作為第三試劑的鏈霉親和素-Texas紅(Amersham)染色。如附圖3中所示，與在DDM-1.29細(xì)胞中檢測到的強(qiáng)烈染色相比較，在DDM-1.7細(xì)胞中未見染色。大量細(xì)胞的顯色表明在DDM-1.7培養(yǎng)物中非常少量的細(xì)胞群體(少于1％)是陽性的(未列出)。在生長于同樣條件下的DDM-1.13細(xì)胞之中，大約細(xì)胞的1％是gp100染色陽性的(未列出)。
為確定MAGE-A和NY-ESO-1抗原的表達(dá)水平，我們使用用于這些抗原的引物(引物序列列于表2)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1蛋白的mRNA譯碼表達(dá)的比較結(jié)果列于圖4中。DDM-1.29表達(dá)了所有被檢測的抗原，而DDM-1.7，DDM-1.13僅表達(dá)它們之中的4-5個(gè)。
已知CT抗原表達(dá)可以通過用DNA脫甲基試劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷對(duì)細(xì)胞處理而呈現(xiàn)上調(diào)節(jié)。我們決定進(jìn)行檢測DDM-1.13黑素瘤細(xì)胞克隆中MAGE-A和NY-ESO-1蛋白的表達(dá)是否也能夠通過這種處理方式而上調(diào)節(jié)。細(xì)胞被接種于T25培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)后，以1μM終濃度加入5-氮雜-2’-脫氧胞苷。培養(yǎng)細(xì)胞3天，然后改變培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)兩天之后，通過如上所描述的方法收集細(xì)胞。通過如上所描述的方法確定抗原表達(dá)。結(jié)果顯示于附圖5，證實(shí)在用5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理細(xì)胞之后，所有被檢測的CT抗原的表達(dá)增加了。
實(shí)施例2產(chǎn)生呈遞外源蛋白能力提高的樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)是它們能夠呈遞被CD8+CTLs識(shí)別的外源蛋白。吸收外源蛋白的最大能力與DC分化的未成熟階段相關(guān)，但是，在表明DC吞噬活性和它們呈遞已吸收抗原的能力之間直接聯(lián)系的有關(guān)數(shù)據(jù)是缺失的，其中已吸收抗原由特異性針對(duì)這些抗原的CTLs識(shí)別。因此我們進(jìn)行了如下目的實(shí)驗(yàn)a)優(yōu)化產(chǎn)生具有高吸收外源蛋白能力的未成熟的樹突狀細(xì)胞，b)證實(shí)樹突狀細(xì)胞的吞噬活性和其呈遞抗原的能力之間的相關(guān)性，其中抗原來自外源黑素瘤裂解物。
在第一批實(shí)驗(yàn)中，我們通過改變細(xì)胞因子加入的時(shí)間以及使用TGF-β1從而使具有吞噬活性的樹突狀細(xì)胞的生產(chǎn)得到優(yōu)化，其顯示出來自于外周血單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生得到改進(jìn)(Yang et al.，1999，J.Immunol.，V.163，pp.1737-1741)。樹突狀細(xì)胞典型地產(chǎn)生自具有25IU/ml肝素的HLA-A2陽性供體的50ml外周血中。血液被分在兩個(gè)含有12.5ml的鈣、鎂缺失的PBS(以下稱為PBS)的50ml試管中，并且在淋巴準(zhǔn)備中使用(12.5ml被放置在兩個(gè)50ml的試管中)。在離心(800g，25分鐘)之后，10ml的上層物質(zhì)被導(dǎo)入注射器，通過0.2μm濾紙后作為血漿的來源。單核細(xì)胞被從中間相層中收集，并且在用PBS稀釋至少兩倍之后，離心6次，首先為650g，10分鐘，然后450g，7分鐘，以后250g，5分鐘，每次離心之后，丟棄上清液。粒子沉淀被重懸于5ml的PBS中，直至細(xì)胞聚集完全消失。加入新鮮的PBS至試管頂部，重復(fù)離心。最后一次離心之后，粒子沉淀被重懸于5ml包含了加入2％血漿的RPMI 1640培養(yǎng)基的粘附培養(yǎng)基中。細(xì)胞計(jì)數(shù)之后，細(xì)胞濃度調(diào)整到5×106/ml。將3ml的細(xì)胞上清液置入6孔板的加樣孔中(Falcon，非TC處理的)，總共4個(gè)加樣孔加樣，然后在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5小時(shí)，培養(yǎng)之后收集非粘附細(xì)胞，用溫RPMI 1640培養(yǎng)基以及3ml包含添加了1％血漿的RPMI培養(yǎng)基(DC培養(yǎng)基)洗滌兩次單層粘附細(xì)胞。重組人GM-CSF和IL-4，以1000U/ml的濃度加入到兩個(gè)加樣孔中(培養(yǎng)物1和3)。過夜培養(yǎng)之后，在兩個(gè)加樣孔中培養(yǎng)基被完全改變(培養(yǎng)物2和4)。對(duì)此，培養(yǎng)基被收集在一個(gè)離心管中，2.5ml新的預(yù)熱DC培養(yǎng)基被加入到每一個(gè)加樣孔中，離心收集的細(xì)胞(250g，5分鐘)。丟棄上清液，沉淀粒子重懸于1ml的預(yù)熱DC培養(yǎng)基。0.5ml的細(xì)胞上清液放回至培養(yǎng)物2和4，對(duì)于培養(yǎng)物3和4，以100ng/ml的終濃度加入TGF-β1。
再經(jīng)過5天之后，檢測產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞吞噬活性。含有10％FCS(胎牛血清)的RPMI 1640培養(yǎng)基被放入平底非TC處理過的96孔板(Faccon)的加樣孔以及離心管中30-60分鐘，每0.5ml DC培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到預(yù)處理的離心管中，離心(200g，5分鐘)之后丟棄上清液，粒子沉淀被重懸于0.5ml DC培養(yǎng)基中。從96孔板加樣孔中移走培養(yǎng)基，加入每種細(xì)胞上清液0.2ml于加樣孔中，每種類型的培養(yǎng)使用兩個(gè)加樣孔。加入10μl FluoSpheres儲(chǔ)備液至每個(gè)試管，將平板放入CO2培養(yǎng)箱。4小時(shí)之后，培養(yǎng)物收集至如上所描述的預(yù)處理離心管中，通過在含有10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基中以200g，5分鐘離心洗滌兩次后，粒子沉淀被重懸于25μl的RPMI培養(yǎng)基。放置試管于冰上。5μl細(xì)胞上清液被置于顯微鏡載玻片上，載玻片置于潮濕房間內(nèi)(通常使用覆有潮濕紙的大型皮氏培養(yǎng)皿)并且在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10-15分鐘。之后，用13mm的蓋玻片覆蓋一滴細(xì)胞上清液，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。使用Leica DC100數(shù)字相機(jī)，將圖像轉(zhuǎn)換到計(jì)算機(jī)中并儲(chǔ)存為位圖文件。
一個(gè)測定在研究條件下產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞的吞噬活性的試驗(yàn)結(jié)果列于附圖6中?？汕宄乜吹皆谂囵B(yǎng)起始之后第二天與完全培養(yǎng)基改變一起添加GM-CSF和IL-4同從培養(yǎng)一開始就添加GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)相比具有顯著的好處。應(yīng)該注意到在大部分描述有關(guān)構(gòu)建與腫瘤細(xì)胞裂解物相結(jié)合并應(yīng)用于免疫的樹突狀細(xì)胞方面的文章中，細(xì)胞因子是從培養(yǎng)的一開始就被加入的(參見例如(Chakraborty et al.，1998.Cancer Immunol.Immunother.，v.47，pp.58-64；Nestle et al.，1998，NatureMed.，v.4，pp.328-332))。
附圖6的結(jié)果也證實(shí)在產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞期間被研究人員作為另一種細(xì)胞因子使用的TGF-β1(Yang et al.，1999，J.Immunol.，v.163，pp.1737-1741)對(duì)樹突狀細(xì)胞的吞噬活性沒有加強(qiáng)的效果，并且事實(shí)上，在一些實(shí)驗(yàn)中降低了吞噬活性(未列出)。
通過使用負(fù)載高水平表達(dá)黑素瘤細(xì)胞分化抗原gp100的DDM1.29細(xì)胞裂解物的樹突狀細(xì)胞識(shí)別模式，借助我們建立的(Kirkin et al.，1999，Cancer Immunol.Immunother.，v.48，pp.239-246)并且在實(shí)施例1中被用于檢測在不同黑素瘤細(xì)胞克隆中g(shù)p100抗原表達(dá)的gp100特異性CTLs，對(duì)于呈遞來自外源加入蛋白的抗原多肽的能力進(jìn)行了研究。
DDM1.29細(xì)胞的裂解物通過如下描述的方法制備。如實(shí)施例1中所描述的方式培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞，并用PBS洗滌兩次，然后以107細(xì)胞/ml重懸于RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)中。細(xì)胞經(jīng)受5個(gè)冷凍(液氮)-解凍周期，在超聲浴中超聲破碎15分鐘(Metason 200，Struer)，然后離心，首先在800g，4℃條件下離心15分鐘，然后4℃條件下，以13000g，離心60分鐘。收集上清液，通過0.2μm的濾紙過濾，根據(jù)廠商提供的程序使用bicinchoninic acid蛋白分析試劑(Pierce)檢測蛋白濃度。該蛋白濃度在3.5-5mg/ml之間。上清液等分試樣被冷凍保藏在-80℃條件下。
為使樹突狀細(xì)胞負(fù)載腫瘤裂解物，不同的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到離心管中，經(jīng)離心，丟棄上清液后，粒子沉淀被重懸于2ml DC培養(yǎng)基中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞上清液稀釋到5×105/ml。1.8ml細(xì)胞上清液被置于非TC處理的Falcon 24孔板，0.2ml腫瘤裂解物連同GM-CSF和IL-4(1000U/ml)被同時(shí)加入。過夜培養(yǎng)之后，加入20ng/ml的TNF-α。經(jīng)過另一個(gè)24小時(shí)培養(yǎng)之后，通過強(qiáng)烈抽吸后收集培養(yǎng)物，培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移至預(yù)處理的離心管，然后以200g離心5分鐘，輕輕倒出上清液，粒子沉淀重懸于2ml DC培養(yǎng)基。細(xì)胞計(jì)數(shù)之后，細(xì)胞上清液被稀釋至3×105細(xì)胞/ml，將1ml上清液置于24孔TC板(Nunc)的加樣孔中，每種類型的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物使用兩個(gè)加樣孔。其中一個(gè)加樣孔添加1ml培養(yǎng)基，另一個(gè)加樣孔添加1ml CTL上清液(106/ml)。培養(yǎng)物經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)之后，將1ml的上清液被轉(zhuǎn)移到eppendorf管，經(jīng)離心后，上清液被轉(zhuǎn)移到另一個(gè)eppendof管，通過如下的ELASA方法分析產(chǎn)生的γ-干擾素(IFN-γ)量。在包被緩沖液(PBS，pH7.4)中，免疫平板MaxiSorp板(Nunc)被周稀釋至2μg/ml的100μl抗人IFN-γ的純化單克隆抗體(Endogen)包被，室溫過夜。移走包被溶液，加入200μl封閉液(在PBS中4％BSA)，室溫培養(yǎng)1小時(shí)，用補(bǔ)加了0.05％Tween-20(洗滌緩沖液)的PBS沖洗平板4次，并且在培養(yǎng)基中加入50μl、濃度范圍從15-1000pg/ml的重組INF-γ(Engogen)的兩倍標(biāo)準(zhǔn)稀釋液作為副本。收集的上清液以3000g離心5分鐘，50μl樣品和兩個(gè)兩倍稀釋液作為三份使用。平板在4℃條件下培養(yǎng)過夜。不洗滌平板，在封閉液中加入50μl稀釋至0.5μl/ml的生物素標(biāo)記的檢測抗體(抗INF-γ生物素標(biāo)記的，Endogen)，在室溫下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。用洗滌緩沖液洗滌4次之后，以每個(gè)加樣孔100μl的量在封閉液中加入按1∶1000稀釋的HRP偶聯(lián)鏈霉親和素(Genzyme)，然后平板在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。平板用洗滌緩沖液洗滌四次，并用紙巾擦吸。100μl底物溶液(5mg OPD溶解于11ml檸檬酸鹽緩沖液中并補(bǔ)充5μl的過氧化氫)被加入至每個(gè)加樣孔中。該反應(yīng)在室溫下進(jìn)行15-40分鐘，然后通過添加50μl的10％硫酸終止反應(yīng)。有差別的吸收值隨著ELASA讀數(shù)器上490-650nm之間不同的讀數(shù)值而得以測定?？鄢齼H加入細(xì)胞培養(yǎng)基代替INF-γ的對(duì)照值，在實(shí)驗(yàn)中釋放的INF-γ濃度通過使用繪自于同一試驗(yàn)并以pg/ml表示的INF-γ制圖曲線而加以測定。
附圖7顯示了這些實(shí)驗(yàn)中一個(gè)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)?？梢钥吹綐渫粻罴?xì)胞培養(yǎng)物1和3的特異性INF-γ的產(chǎn)量是最大的，該產(chǎn)量表示出負(fù)載了裂解物的樹突狀細(xì)胞與“空”樹突狀細(xì)胞面前的INF-γ產(chǎn)量的不同，同樣也是這兩種培養(yǎng)物具有最大吞噬活性。
概括講，樹突狀細(xì)胞用攝取自腫瘤裂解物的抗原特異性地刺激CTL的能力與樹突狀細(xì)胞的吞噬活性相關(guān)，并不依賴DC分化期間TNF-α的存在，該能力達(dá)到最大化是在DC培養(yǎng)物中，其中GM-CSF和IL-4的添加推遲一天并且該添加與完全培養(yǎng)基改變相結(jié)合。
實(shí)施例3經(jīng)負(fù)載黑素瘤細(xì)胞衍生裂解物的自體樹突狀細(xì)胞對(duì)正常供體的外周血淋巴細(xì)胞刺激之后，具有廣泛抗腫瘤活性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的形成(development)。
負(fù)載黑素瘤細(xì)胞裂解物的樹突狀細(xì)胞刺激針對(duì)于腫瘤抗原的毒性T淋巴細(xì)胞形成的能力，在體外混合的淋巴細(xì)胞樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行檢測。樹突狀細(xì)胞來自于如實(shí)施例2中所描述HLA-A2呈陽性的正常供體的外周血。經(jīng)過單核細(xì)胞吸附的起始步驟之后，收集沒有被吸附的淋巴細(xì)胞冷凍于加有10％DMSO的自體血漿中待用。收集負(fù)載有腫瘤裂解物的樹突狀細(xì)胞，輻射照射(6000Rad)，洗滌，以3×105/ml重懸于補(bǔ)充有1％自體血漿的X-VIVO15培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中，然后放入24孔板中的5個(gè)加樣孔，每個(gè)加樣孔1ml。其余的樹突狀細(xì)胞冷凍于含有10％DMSO的總體人血清中。解凍被冷凍的自體非粘附淋巴細(xì)胞，洗滌一次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，15×106細(xì)胞經(jīng)另外洗滌之后被重懸于5ml含有IL-7(20ng/ml)和IL-12(100pg/ml)的完全培養(yǎng)基中。1ml淋巴細(xì)胞懸浮液被加入至含有樹突狀細(xì)胞的加樣孔中。7天之后，移走1ml培養(yǎng)基，加入1ml含有IL-7(20ng/ml)的新鮮培養(yǎng)基，5天之后，收集細(xì)胞，活細(xì)胞在Lymphoprep(NycomedNorway)上被分離，洗滌之后以1.5×106/ml的濃度重懸于完全培養(yǎng)基中。1ml淋巴細(xì)胞懸浮液置于24孔板的加樣孔中。被冷凍、受輻射且負(fù)載有裂解物的樹突狀細(xì)胞被解凍，洗滌一次，以105/ml的濃度重懸于完全培養(yǎng)基中。將1ml加入至含有淋巴細(xì)胞的加樣孔中。兩天之后，移走1ml培養(yǎng)基，加入1ml含有IL-2(20IU/ml)的新鮮培養(yǎng)基。每周重復(fù)一次再刺激的步驟，每次培養(yǎng)需要刺激2-4次。
淋巴細(xì)胞的裂解活性在3-5輪刺激之后得以測定。此時(shí)，在第4-5輪的刺激之后的一周里每一次達(dá)到70-90％的再刺激之后，隨著增加的CD8+細(xì)胞比例，增值的淋巴細(xì)胞代表了幾乎是純的CD3陽性細(xì)胞群體(細(xì)胞的表型通過現(xiàn)有技術(shù)已知的FACS分析法使用特異于某些表面標(biāo)記的抗體測定)。
除了上面提到的黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)物之外，下面的黑素瘤細(xì)胞系被使用FM28，F(xiàn)M55p，F(xiàn)M60，(HLA-A2陽性)，F(xiàn)M45，F(xiàn)M48(HLA-A2陰性)。這些細(xì)胞系在其他地方被描述(Bartkova et.al.，1996，CancerRes.，v.56，pp 5475-5483；Kirkin et al，1995，Caner Immunol.Immunother.，v.41.pp71-81)其內(nèi)容因此被引入作為參考。DDB-1和ANBI-EBV是我們實(shí)驗(yàn)室通過現(xiàn)有技術(shù)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建的被EBV轉(zhuǎn)化的類淋巴母細(xì)胞系。K-562紅白血病細(xì)胞用作NK介導(dǎo)的裂解的目標(biāo)。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，CAMA-1，HBL-100，MDA-MB-231(HLA-A2陽性)和BT-20(HLA-A2陰性)是由丹麥癌癥協(xié)會(huì)(Danishcancer society)的Per Briand博士饋贈(zèng)的禮物。SCC4和SCC9HLA-A2陽性鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系獲自ATCC。所有細(xì)胞系在補(bǔ)充了10％FCS的RPMI-1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞毒素的活性由實(shí)施例1所述的方法測定。在封閉抗體試驗(yàn)中，特異性針對(duì)HLA I類分子共同決定簇的W6/32單克隆抗體以10μg/ml的濃度被加入到加樣孔中。
在第一實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞毒性通過針對(duì)一組黑素瘤細(xì)胞，以及被EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞和K562紅白血病細(xì)胞得以檢測。NK樣細(xì)胞裂解酶活性，當(dāng)通過K562紅白血病細(xì)胞裂解所測定時(shí)，在兩輪刺激之后表現(xiàn)明顯，但是在隨后的刺激之后逐漸下降。為了檢測起初的特異CTL介導(dǎo)的裂解，所有裂解活性方面的試驗(yàn)在存在20倍過剩的未標(biāo)記K562細(xì)胞中進(jìn)行。在用負(fù)載DDM1.13細(xì)胞裂解物的樹突狀細(xì)胞刺激四輪之后，來自ANBI供體的淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性方面的代表性試驗(yàn)結(jié)果顯示于附圖8。HLA-A2陽性黑素瘤細(xì)胞被裂解至不同的程度，而K562，ANBI-EBV(從同樣的供體構(gòu)建的EBV-B細(xì)胞)，DDB-1(對(duì)于DDM-1黑素瘤細(xì)胞來說是自體同源的)，黑素瘤細(xì)胞系FM45和FM48(與ANBI供體的細(xì)胞沒有共同的MHC I類抗原)是相對(duì)裂解耐性的。值得注意的是除了與ANBI供體共有的HLA-A1(未列出)外，F(xiàn)M9、HLA-A2陰性黑素瘤細(xì)胞系也是對(duì)裂解敏感的，表明HLA裂解的限制是復(fù)雜的，不僅僅受到HLA-A2抗原的限制。使用未處理的樹突狀細(xì)胞也會(huì)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖，盡管處于較低強(qiáng)度下，但是只有非特異性細(xì)胞毒性的形成在這些培養(yǎng)物中可見(未列出)。針對(duì)產(chǎn)生自黑素瘤病人的PBMCs(外周血單核細(xì)胞)的DDM-1黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性的缺失顯示有可能存在于裂解制備物中的同種抗原不能誘導(dǎo)有意義的免疫應(yīng)答，作為結(jié)果的免疫應(yīng)答主要是腫瘤特異性的。針對(duì)MHC I類分子的W6/32抗體明顯的抑制顯示出細(xì)胞毒性的MHCI類受限的本質(zhì)。類似的結(jié)果從分離自DDM1.7黑素瘤克隆(未列出)的裂解物中獲得。
為檢測識(shí)別屬于在不同類型的人惡性腫瘤之間共有的一組癌/睪丸抗原的抗原，我們研究了許多乳腺癌和鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系對(duì)于由產(chǎn)生的CTLs引發(fā)的裂解作用的敏感性。一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于附圖9。四種HLA-A2陽性乳腺癌細(xì)胞系中的三個(gè)具有對(duì)裂解作用中度至高度的敏感性，而一種HLA-A2陰性細(xì)胞系是完全耐裂解的。兩個(gè)被研究的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的一個(gè)也是裂解敏感性的。乳腺癌細(xì)胞系的裂解作用對(duì)于HLA I類特異性抗體W6/32的抑制作用是敏感的。這些數(shù)據(jù)證實(shí)用負(fù)載DDM1.7DDM或1.13黑素瘤細(xì)胞系的自體樹突狀細(xì)胞體外免疫正常供體的PBLs(外周血淋巴細(xì)胞)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了CTL，該CTL能夠特異識(shí)別在幾種類型的人類腫瘤中都存在的腫瘤相關(guān)抗原。
一種可能的可以由以這種方法產(chǎn)生的CTLs來識(shí)別的抗原組是MAGE-A抗原。要使這些抗原的表達(dá)與靶細(xì)胞對(duì)于產(chǎn)生的CTLs的敏感性相關(guān)，我們比較了在三種顯示不同裂解敏感性的乳腺癌細(xì)胞系中這些抗原的表達(dá)水平。結(jié)果顯示于附圖10。在HBL-100細(xì)胞中表達(dá)的被研究抗原最多，而在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)的被研究抗原最少。這些結(jié)果證實(shí)在被表達(dá)的MAGE-A組基因數(shù)量與對(duì)于裂解作用的敏感性之間確實(shí)存在相關(guān)性，指示這些或者相類似的被調(diào)節(jié)抗原可能是這種免疫類型的主要目標(biāo)。
實(shí)施例4分化抗原免疫顯性的檢測根據(jù)Herin et al.，1987，Int，J.Cancer，v.39，pp390-396描述的方法，通過體外刺激帶有自體腫瘤細(xì)胞的體外周血淋巴細(xì)胞，兩種黑素瘤細(xì)胞系，表達(dá)高水平分化抗原的DDM1.29和表達(dá)低水平分化抗原細(xì)胞系DDM1.P(DDM-1細(xì)胞系的變體)，被使用在有關(guān)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中。用受輻射的腫瘤細(xì)胞(10,000Rad)經(jīng)過三輪每周一次的淋巴細(xì)胞刺激之后，細(xì)胞培養(yǎng)物通過限制性稀釋被克隆，生長克隆的裂解活性首先通過在Cr51釋放試驗(yàn)中的原始黑素瘤細(xì)胞系被測定。如果它們具有比之原始黑素瘤細(xì)胞超過20％的裂解活性，則細(xì)胞克隆被認(rèn)為具有細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的特異性然后用T2細(xì)胞檢測，T2細(xì)胞負(fù)載來自gp100和MART-1抗原的不同的HLA-A2限制性多肽。不用多肽處理的T2細(xì)胞作為對(duì)照。使用大約100個(gè)克隆對(duì)每種黑素細(xì)胞系進(jìn)行分析分析。裂解物被負(fù)載到如原先所描述的樹突狀細(xì)胞，賦予自體淋巴細(xì)胞免疫性。在免疫方面識(shí)別分化抗原gp100和MART-1的CTL克隆的比例已經(jīng)被計(jì)算出來并將結(jié)果列于下表3。
表3識(shí)別分化抗原的CTL克隆比例(產(chǎn)生克隆總數(shù)的％)

數(shù)據(jù)顯示分化抗原是免疫顯性的。就高水平表達(dá)的分化抗原來說，免疫應(yīng)答主要針對(duì)分化抗原gp100和MART-1，而當(dāng)表達(dá)低水平分化抗原的細(xì)胞系被用于免疫時(shí)未有可見的免疫應(yīng)答誘導(dǎo)。值得注意的是隨著大量細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆的產(chǎn)生，兩種細(xì)胞系都會(huì)誘導(dǎo)自體淋巴細(xì)胞強(qiáng)烈的增殖。
實(shí)施例5在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞的表型為了研究與第一天中的培養(yǎng)基改變相結(jié)合的不同的淋巴因子加入特征如何影響產(chǎn)生的未成熟樹突狀細(xì)胞的表型特征，研究了四種不同的生長條件1)終止吸附步驟之后在第0天的時(shí)候迅速加入細(xì)胞因子(GM-CSF和IL-4)并且在第1天的時(shí)候在沒有培養(yǎng)基改變情況下添加另外的細(xì)胞因子；2)類似于組1，除了在第1天的時(shí)候在完全培養(yǎng)基改變情況下添加另外的細(xì)胞因子；3)細(xì)胞因子的添加被推遲至沒有培養(yǎng)基改變的第1天；4)同組3，除了添加細(xì)胞因子是在完全培養(yǎng)基改變的第1天。
組4的條件與Turner et al.，1999描述的從白細(xì)胞除去法中產(chǎn)生成熟樹突狀細(xì)胞的條件一致(根據(jù)Turner，最優(yōu)化結(jié)果僅來自從白細(xì)胞除去法產(chǎn)物而來的樹突狀細(xì)胞，而不是來自提取的新鮮血液樣品中)。
培養(yǎng)5天之后，收集細(xì)胞，大量細(xì)胞通過Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)(Beckmen，Z2型)，然后細(xì)胞被冷凍于添加了10％DMSO的自體血漿中以進(jìn)一步通過FACS分析表面標(biāo)記的表達(dá)。下面的單克隆抗體被使用(所有來自BD Biosciences)CD1a-PE，CD14-FITC，CD83-PE，與之匹配的對(duì)照抗體。
細(xì)胞計(jì)數(shù)證實(shí)，在細(xì)胞產(chǎn)量方面沒有差別(在數(shù)量和尺寸上)，這與Turner et al.，1999的數(shù)據(jù)有很好的相關(guān)性(J.Immunol，Methods，2231-15)，因?yàn)樗鼈儍H使用了形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)并且以產(chǎn)量作為生長最優(yōu)化的指標(biāo)。相比之下，在本研究中，當(dāng)測定表面標(biāo)記時(shí)(其中的一個(gè)試驗(yàn)結(jié)果列于表4)，其差異明顯可見。
表4在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞表型

從添加細(xì)胞因子開始的第1天起，CD1a標(biāo)記的表達(dá)就呈現(xiàn)明顯的上調(diào)節(jié)，而并不明顯影響其它標(biāo)記的表達(dá)。也能夠看到，在第一天培養(yǎng)基的改變，如原先Turner et al.，1999建議的，事實(shí)上并沒有必要，因?yàn)橥瑯拥男Ч谟信囵B(yǎng)基改變和沒有培養(yǎng)基改變的兩種情形下同樣獲得。事實(shí)上，在第1天培養(yǎng)基的改變明顯地降低了未成熟階段樹突狀細(xì)胞的內(nèi)吞活性。細(xì)胞因子被拖延加入一天并且沒有任何培養(yǎng)基改變的這些條件被選用在進(jìn)一步的試驗(yàn)中。
實(shí)施例6可產(chǎn)自單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)量的最優(yōu)化在如上所描述的最優(yōu)化過程中，我們驚訝地發(fā)現(xiàn)獲自單核細(xì)胞的群體的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量取決于吸附過程中的單核細(xì)胞的密度。盡管在早先大多數(shù)公開的方法中注意到，當(dāng)進(jìn)行吸附步驟時(shí)，要考慮單核細(xì)胞濃度而不是單核細(xì)胞濃度。但是，單核細(xì)胞代表了兩種群體的混合物，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，并且每一群體的比例明顯的不同，吸附至塑料制品的以單核細(xì)胞為主。
為評(píng)價(jià)單核細(xì)胞在單核細(xì)胞群體中的濃度，我們使用Coulter計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，因?yàn)檫@也可以用來觀察細(xì)胞大小分布(BeckmenZ2型)。可以看到兩種主要細(xì)胞群體，具有7nm(淋巴細(xì)胞)和9nm(單核細(xì)胞)的平均大小。用適當(dāng)?shù)姆椒梢栽u(píng)價(jià)這兩種群體的比例。
我們原先發(fā)現(xiàn)以大約15×106密度在每個(gè)T25瓶中接種單核細(xì)胞，單核細(xì)胞的吸附幾乎是完全的(超過90％)。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)中使用在12×106至20×106之間變化的細(xì)胞密度。觀察到樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量上的明顯變化，在試圖理解那種變化的原因中，我們決定將在不同試驗(yàn)中的樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)量與單核細(xì)胞的原始密度相聯(lián)系，5個(gè)產(chǎn)生自不同供體的培養(yǎng)物分析結(jié)果清楚地表明在樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生效率和單核細(xì)胞接種密度之間呈現(xiàn)相反的相關(guān)性。
設(shè)計(jì)試驗(yàn)以評(píng)價(jià)這種相關(guān)性，以不同密度接種同一供體的單核細(xì)胞。通過在Lymphoprep梯度上離心，單核細(xì)胞被從淡黃層分離(從健康供體血液中制備)出來。分離界面層細(xì)胞之后，強(qiáng)烈洗滌以移走血小板，單核細(xì)胞懸浮于包含添加了1％自體肝素化血漿的RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上，然后以每瓶不同的單核細(xì)胞數(shù)量(從每瓶10×106至20×106單核細(xì)胞)接種單核細(xì)胞于每瓶含7ml培養(yǎng)基的T25瓶中(25cm2的表面積)。1小時(shí)吸附之后，通過使用預(yù)熱的培養(yǎng)基洗滌兩次移走未吸附的細(xì)胞。加入7ml新鮮培養(yǎng)基至每瓶中。第二天，GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)被加入培養(yǎng)基中，在第三天，細(xì)胞因子被重復(fù)加入。在第五天，一半的培養(yǎng)基被改變，加入新的GM-CSF和IL-4，在第六天加入濃度為20ng/ml的TNF-α。在第七天收集培養(yǎng)物，計(jì)算了所有細(xì)胞數(shù)之后，將它們冷凍在10％DMSO的自體血清中直至使用FACS進(jìn)行分析。FACS分析通過使用CD1和CD14抗體進(jìn)行。
一些與樹突狀細(xì)胞(大量具有在14nm-16nm之間的中等大小的細(xì)胞)產(chǎn)量相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表5。
表5在具有不同單核細(xì)胞起始密度的培養(yǎng)物中樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)量和表型

隨著單核細(xì)胞接種密度的增加樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)量明顯下降，為最低細(xì)胞密度的50％。在同樣樹突狀細(xì)胞上進(jìn)行的FACS分析結(jié)果列于表中，指示沒有觀察到在單核細(xì)胞的初始密度不同的情況下產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞的性狀有明顯的不同。
降低單核細(xì)胞的初始細(xì)胞密度至每個(gè)T25瓶中10×106個(gè)細(xì)胞以下導(dǎo)致CD1標(biāo)記表達(dá)的降低(數(shù)據(jù)未列出)。因此，要獲得具有最大感受態(tài)(這通過主要的DC標(biāo)記表達(dá)來判斷)的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量的最大效率，初始單核細(xì)胞群體的最佳細(xì)胞密度是大約每25cm2培養(yǎng)表面10×106個(gè)細(xì)胞。
在這些數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，現(xiàn)在有可能計(jì)算出采血所需要的血液的體積。如果所希望的樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)量是初始單核細(xì)胞數(shù)量的大約50％，那麼獲得50×106個(gè)樹突狀細(xì)胞將只需要300ml的血液。這意味著，單一的300ml的血液樣品將足夠制備用于接種兩輪疫苗的疫苗。細(xì)胞因子的需要量(GM-CSF 21ng，IL-410.5ng)以及其他物質(zhì)的需要量低于標(biāo)準(zhǔn)的，非最優(yōu)化方法的三倍。
因此，DC生產(chǎn)所需要的物質(zhì)成本也降至少三倍，此外，將不需要進(jìn)行昂貴的白細(xì)胞去除法程序。
實(shí)施例7以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的疫苗的應(yīng)用用負(fù)載有根據(jù)本發(fā)明制備的兩種黑素瘤細(xì)胞系裂解物的樹突狀細(xì)胞給癌癥病人接種的周期將優(yōu)選地設(shè)計(jì)為下述方式病人接受第一周期的五次皮下免疫接種，每次間隔三周，每次使用5×106個(gè)樹突狀細(xì)胞。如果在初次免疫接種周期之后可見臨床反應(yīng)，進(jìn)行第二個(gè)相似周期的免疫。整個(gè)試驗(yàn)周期總共需要50×106個(gè)細(xì)胞?？紤]到病人的狀況(大部分病人處于疾病的晚期階段，沒有任何其他治療在進(jìn)行)，使抽取血液的次數(shù)降到最低，限制在一次或兩次是重要的。
盡管本發(fā)明描述了某些專門的實(shí)施方案作為參考，涉及其他癌/睪丸抗原以及其他譜系特異性分化抗原的對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的其他實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物組合物，包括呈遞癌/睪丸抗原多樣性的樹突狀細(xì)胞，其特征在于a)至少五種癌/睪丸抗原，無譜系特異性分化抗原或基本上無譜系特異性分化抗原被樹突狀細(xì)胞呈遞，b)癌/睪丸抗原來自至少一種癌細(xì)胞系，該癌細(xì)胞系表達(dá)至少五種不同的癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異性分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異性分化抗原，和c)樹突狀細(xì)胞在負(fù)載癌/睪丸抗原期間是未成熟的(CD1a陽性，CD14陰性，CD83陰性)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中樹突狀細(xì)胞負(fù)載抗原后通過添加成熟因子而成熟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中樹突狀細(xì)胞在初始生長階段被間接體內(nèi)培養(yǎng)在不含任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中，接著，在使樹突狀細(xì)胞負(fù)載至少五種癌/睪丸抗原之前，在含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段生長。
4.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的藥物組合物，其中樹突狀細(xì)胞是自體樹突狀細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中至少一種不表達(dá)譜系特異性分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異性分化抗原的癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物被用于負(fù)載樹突狀細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中樹突狀細(xì)胞上的至少五種癌/睪丸抗原的呈遞是通過完整細(xì)胞融合完成的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中至少五種癌/睪丸抗原的呈遞是通過使用核外體實(shí)現(xiàn)的。
8.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的藥物組合物，其中癌細(xì)胞系是黑素瘤細(xì)胞系，譜系特異性分化抗原是黑素細(xì)胞分化抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其中黑素細(xì)胞分化抗原包括gp100，Melan A/Mart-1和酪氨酸酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的藥物組合物，其中以單核細(xì)胞的形式存在的樹突狀細(xì)胞前體從人或動(dòng)物的外周血中獲取。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的藥物組合物，其中以單核細(xì)胞的形式存在的樹突狀細(xì)胞前體從人或動(dòng)物的骨髓中獲取。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的藥物組合物，其中沒有白細(xì)胞去除產(chǎn)物作為樹突狀細(xì)胞或單核細(xì)胞的來源。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的藥物組合物，其中樹突狀細(xì)胞來源于CD14+單核細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的藥物組合物，其中樹突狀細(xì)胞來源于CD34+細(xì)胞。
15.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的藥物組合物，其中癌/睪丸抗原包括選自MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE，SSX亞家族的抗原。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其中癌/睪丸抗原包括選自MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，NY-ESO-1，LAGE，PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4，XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3，SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5的抗原。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的藥物組合物，其中癌/睪丸抗原包括選自SCP-1，TSP-50，TRAG-3，SAGE，IL-13Rα，CTp11的抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物組合物，其中癌/睪丸抗原包括選自MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1的抗原。
19.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的藥物組合物，其中至少五種癌/睪丸抗原來自至少兩種同種異源黑素瘤細(xì)胞系。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，其中同種異源黑素瘤細(xì)胞系選自DDM-1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC01112338)。
21.根據(jù)權(quán)利要求5-20任一項(xiàng)的藥物組合物，其中在提供至少一種癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物之前，在所述至少一種癌細(xì)胞系中至少五種癌/睪丸抗原的表達(dá)得到進(jìn)一步增加。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，其中至少一種癌/睪丸抗原的表達(dá)通過DNA脫甲基化而增加。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，其中，所述脫甲基化通過5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理完成。
24.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的藥物組合物，其中細(xì)胞因子選自IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，F(xiàn)lt-31，SCF，TNF-α。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的藥物組合物，其中細(xì)胞因子包括IL-4和GM-CSF。
26.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的藥物組合物，其中初始生長階段是6-48小時(shí)，特別是12-34小時(shí)，更特別是20-28小時(shí)。
27.根據(jù)權(quán)利要求2-26任一項(xiàng)的藥物組合物，其中成熟因子包括IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2。
28.一種獲得負(fù)載至少五種癌/睪丸抗原，不負(fù)載譜系特異性分化抗原或基本上不負(fù)載譜系特異性分化抗原的人或動(dòng)物自體樹突狀細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)提供表達(dá)至少五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原的至少一種癌細(xì)胞系，b)提供來自于所述人或動(dòng)物的自體單核細(xì)胞/樹突狀細(xì)胞，c)使用5×106-20×106細(xì)胞/25cm2的單核細(xì)胞接種密度，d)在初始生長階段，在沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)所述樹突狀細(xì)胞，接著在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，e)使來自d)中的樹突狀細(xì)胞負(fù)載癌/睪丸抗原，該癌/睪丸抗原從a)中的至少一種癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物中獲得。
29.一種分離的黑素瘤細(xì)胞系，其表達(dá)至少五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原或基本上不表達(dá)黑素細(xì)胞分化抗原。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的分離的黑素瘤細(xì)胞系，其選自細(xì)胞系DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。
31.來源于根據(jù)權(quán)利要求28或29的分離的細(xì)胞系的核外體。
32.樹突狀細(xì)胞在藥物組合物或疫苗中作為抗原呈遞細(xì)胞的應(yīng)用，其中所述樹突狀細(xì)胞在它們的未成熟階段負(fù)載抗原，此時(shí)樹突狀細(xì)胞是CD1a陽性，CD14陰性，CD83陰性，其中，樹突狀細(xì)胞在初始生長階段在沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)，接著在使樹突狀細(xì)胞負(fù)載至少五種癌/睪丸抗原之前在包含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的應(yīng)用，其中樹突狀細(xì)胞是自體樹突狀細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的應(yīng)用，其中自體樹突狀細(xì)胞從新鮮血液中獲得。
35.癌/睪丸抗原多樣性在藥物組合物或疫苗制劑中的應(yīng)用，所述癌/睪丸抗原可以從權(quán)利要求29或30的分離的癌細(xì)胞系中獲得。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的應(yīng)用，其中分離的癌細(xì)胞系至少是權(quán)利要求30的細(xì)胞系之一。
37.用于制備治療癌癥的藥物組合物的分離的細(xì)胞系DDM-1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。
38.誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟a)提供至少一種表達(dá)至少五種癌/睪丸抗原，不表達(dá)譜系特異分化抗原或基本上不表達(dá)譜系特異分化抗原的癌細(xì)胞系，b)提供來自于所述人或動(dòng)物的自體樹突狀細(xì)胞，c)在初始生長階段在沒有任何細(xì)胞因子的生長培養(yǎng)基中間接體內(nèi)培養(yǎng)所述樹突狀細(xì)胞，接著在包含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行第二階段培養(yǎng)，d)使來自c)的樹突狀細(xì)胞負(fù)載癌/睪丸抗原，該癌/睪丸抗原得自a)的至少一種癌細(xì)胞系的完整細(xì)胞裂解物，和e)給所述人或動(dòng)物施用來自d)的負(fù)載樹突狀細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中在給所述人或動(dòng)物施用樹突狀細(xì)胞以前，負(fù)載了癌/睪丸抗原之后的樹突狀細(xì)胞通過加入如IL-1β，IL-6，TNF-α，PGE2的成熟因子而成熟。
40.根據(jù)權(quán)利要求38-39任一項(xiàng)的方法，其中免疫應(yīng)答刺激人或動(dòng)物中的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。
41.根據(jù)權(quán)利要求38-40任一項(xiàng)的方法，其中至少一種癌細(xì)胞系是黑素瘤細(xì)胞系，譜系特異性分化抗原是黑素細(xì)胞分化抗原。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中黑素細(xì)胞分化抗原包括gp100、Melan A/Mart-1和酪氨酸酶。
43.根據(jù)權(quán)利要求38-42任一項(xiàng)的方法，其中自體樹突狀細(xì)胞從人或動(dòng)物的外周血中獲取。
44.根據(jù)權(quán)利要求38-42任一項(xiàng)的方法，其中自體樹突狀細(xì)胞從人或動(dòng)物的骨髓中獲取。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中自體樹突狀細(xì)胞來源于CD14+單核細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求43或44的方法，其中自體樹突狀細(xì)胞來源于CD34+細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求38-46任一項(xiàng)的方法，其中癌/睪丸抗原包括選自MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE，SSX亞家族的抗原。
48.根據(jù)權(quán)利要求38-47任一項(xiàng)的方法，其中癌/睪丸抗原包括選自MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，NY-ESO-1，LAGE，PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4，XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3，SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5的抗原。
49.根據(jù)權(quán)利要求38-46任一項(xiàng)的方法，其中癌/睪丸抗原包括選自SCP-1，TSP-50，TRAG-3，SAGE，IL-13Rα，CTp11的抗原。
50.根據(jù)權(quán)利要求38-46任一項(xiàng)的方法，其中癌/睪丸抗原包括選自MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1的抗原。
51.根據(jù)權(quán)利要求38-50任一項(xiàng)的方法，其中在至少一種癌細(xì)胞系中至少五種癌/睪丸抗原的表達(dá)在裂解前被進(jìn)一步增加。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中至少一種癌/睪丸抗原的表達(dá)通過DNA脫甲基化增加。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述脫甲基化是通過5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理來完成。
54.根據(jù)權(quán)利要求38-53任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)中提供至少兩種同種異源癌細(xì)胞系。
55.根據(jù)權(quán)利要求38-54任一項(xiàng)的方法，其中同種異源黑素瘤細(xì)胞系選自DDM-1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC01112338)。
56.根據(jù)權(quán)利要求38-55任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞因子選自IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，F(xiàn)lt-31，SCF，TNF-α。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中細(xì)胞因子包括IL-4和GM-CSF。
58.根據(jù)權(quán)利要求38-57任一項(xiàng)的方法，其中初始生長階段是6-48小時(shí)，特別是12-34小時(shí)，更特別是20-28小時(shí)。
59.根據(jù)權(quán)利要求38-58任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在步驟b)之前給人或動(dòng)物施用誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞動(dòng)員的物質(zhì)的步驟。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中所述誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞動(dòng)員的物質(zhì)包括G-CSF和/或GM-CSF。
61.根據(jù)權(quán)利要求38-60任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在步驟e)之后給人或動(dòng)物施用誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞激活的物質(zhì)的步驟。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞激活的物質(zhì)包括IL-2或IL-12。
全文摘要
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物組合物，該組合物包括負(fù)載了至少由一種癌細(xì)胞系提供的至少五種癌/睪丸抗原，不負(fù)載譜系特異性分化抗原或基本上不負(fù)載譜系特異性分化抗原的樹突狀細(xì)胞，本發(fā)明涉及表達(dá)癌睪丸抗原而非分化抗原的多樣性的分離細(xì)胞系，也涉及使用本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)人或動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK1723038SQ02827663
公開日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月29日
發(fā)明者A·柯金, K·賈恩尤加齊安, J·佐伊滕 申請(qǐng)人:丹德里特生物科技公司