專利名稱：玉米萌發(fā)類似蛋白基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因的啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別是涉及植物萌發(fā)類似蛋白編碼基因的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
桶狀蛋白(cupin)是一類含有β-折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，廣泛分布于原核及真核生物體內(nèi)，包括一些酶以及與糖和其它化合物結(jié)合的蛋白，種類繁多。高等植物中(主要發(fā)現(xiàn)于作物中)的萌發(fā)蛋白(Germins)和萌發(fā)類似蛋白(Germin-likeproteins，GLPs)即屬于桶狀蛋白家族。小麥萌發(fā)蛋白(wheat germin)是桶壯蛋白中研究最透徹的一種，是一種糖蛋白，由于在小麥種子萌發(fā)時(shí)合成，所以命名為萌發(fā)蛋白。小麥萌發(fā)蛋白具有草酸氧化酶和過氧化物歧化酶活性，在植物細(xì)胞中分布于外質(zhì)體(apoplast)及細(xì)胞壁，除了在草酸代謝中具有重要作用外，還可能為細(xì)胞壁形成中的分子交聯(lián)提供過氧化氫。又因?yàn)樗€有過氧化物歧化酶活性，所以有人推測(cè)萌發(fā)蛋白參與了植物對(duì)抗非生物脅迫的反應(yīng)。萌發(fā)類似蛋白是一類不同于萌發(fā)蛋白，但又有相似之處的蛋白質(zhì)，和萌發(fā)蛋白有比較高的同源性，最高90％，平均50％左右。自從1991年在大麥根中發(fā)現(xiàn)萌發(fā)類似蛋白以來，科學(xué)家已經(jīng)在水稻、大麥、擬南芥等植物中克隆到了多種萌發(fā)類似蛋白基因。除了少數(shù)幾個(gè)以外，大部分萌發(fā)類似蛋白的功能現(xiàn)在還不清楚。功能已經(jīng)清楚的幾個(gè)萌發(fā)類似蛋白是1998年Neutelings，G.，J.M.Domon等發(fā)現(xiàn)的松樹GLP蛋白(Neutel ings，G.，J.M.Domon，and H.David 1998Plant Mol.Biol.381179-1190)，具有草酸氧化酶活性；1999年Toshiaki Yamahara，Tadahiko Shiono等發(fā)現(xiàn)的蘚類GLP蛋白(BuGLP)(Toshiaki Yamahara，TadahikoShiono，and Toshio Satoh 1999.J.Biol.Chem.Vol 274 No.47 33274-33278)，具有過氧化物歧化酶活性；大麥glp1基因(Hvg lp1)，編碼核苷酸-糖磷酸二酯酶(Milagros Rodriguez-Lopez，Edurne Baroja- Fernandez，and JavierPozueta-Romero 2001 FEBS Letters 490 44-48)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供來自玉米的萌發(fā)類似蛋白的啟動(dòng)子序列。玉米萌發(fā)類似蛋白基因啟動(dòng)子命名為ZMp1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
ZMp1是玉米萌發(fā)類似蛋白編碼基因ZMglp1的啟動(dòng)子。Northern雜交證明ZMglp1基因只在玉米特異器官表達(dá)。
序列表中的DNA序列1是由1400個(gè)堿基組成的核苷酸序列。其保守啟動(dòng)子區(qū)為自5’端第1347到第1396位堿基。
含有本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)載體、細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和其功能的闡明，在植物特別是玉米育種中具有重要的意義。


圖1為基因組DNA文庫的篩選，顯示噬均斑。
圖2為Southern雜交圖。
圖3為cDNA-AFLP指紋圖譜。
圖4為cDNA-AFLP指紋圖譜。
圖5為Northern雜交的印跡。
圖6為Northern雜交的印跡。
圖7為Southern雜交的印跡。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明選取雜交玉米品種中單306作材料。5月份室外栽培，采取3周齡的玉米根、莖、葉提總RNA，做第一次Northern雜交，采取抽穗期的根、莖、老葉片、抽穗前的最后一片未完全伸展的幼嫩葉片、授粉兩周后的種子和雌花序軸提取總RNA作第二次Northern雜交。
實(shí)施例1、玉米基因組DNA文庫篩選為了得到完整的基因及其啟動(dòng)子，發(fā)明人從stratagene公司購買了玉米基因組DNA Lambda FIX II文庫，該文庫以野生密蘇里17株系DNA構(gòu)建，插入片段的長(zhǎng)度約為9-23Kb。以BG840509去est數(shù)據(jù)庫比對(duì)，最后根據(jù)這些cDNA片段拼接出了一段長(zhǎng)度1131堿基的玉米cDNA，1131片段的5’端25個(gè)堿基來自BG842559正鏈上的1-25號(hào)堿基，1131中間部分來自BG840509，其3’端331個(gè)堿基來自BG841903負(fù)鏈上的331-1號(hào)堿基，根據(jù)1131序列在其兩端設(shè)計(jì)引物A和B，A為5’-CACACTCGGGTAAAGCTATCTC-3’，B為5’-CAGATTAACAGCATGCGGCACT-3’，利用這兩個(gè)引物，從我國品種中單306的基因組DNA以及cDNA中分別成功擴(kuò)增出一段序列Fab，分別克隆到PUCTM載體上測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們完全一樣，長(zhǎng)1064個(gè)堿基，利用隨機(jī)引物標(biāo)記的Fab片段篩選玉米基因組文庫(具體方法見文庫的說明和《分子克隆》)。和這些書上不同之處在于每個(gè)平皿轉(zhuǎn)一張尼龍膜(hybond)，轉(zhuǎn)膜的時(shí)間是40秒，然后浸沒在1.5M NaCl，O.5M NaOH中變性2分鐘，在1.5M NaCl，0.5Tris-HCl(pH8.0)中中和5分鐘，最后在0.2M Tris-HCl(pH7.5)，2XSSC溶液中淋洗25秒。紫外光交聯(lián)45秒。經(jīng)過多次篩選，得到了一個(gè)陽性克隆，如圖1所示，頭一輪篩選中得到的陽性噬菌體克隆以合適的濃度在NZY板上恢復(fù)和培養(yǎng)。噬菌斑轉(zhuǎn)移到雜交尼龍膜上，用放射性標(biāo)記的Fab片段雜交。提取了噬菌體DNA，并用噬菌體多克隆位點(diǎn)上的酶XbaI和NotI單切，NotI可將插入片段切出，電泳可見其長(zhǎng)度在10K以上，XbaI則可將插入片段切成幾段，便于作亞克隆。之后，做southern雜交以確定攜帶該基因的片段結(jié)果如圖2所示，圖中泳道1是經(jīng)Not I消化的λDNA，泳道2是經(jīng)XbaI消化的λDNA，并利用32P標(biāo)記的Fab片段雜交。該片段是利用引物A和引物B(B)擴(kuò)增出來的，A為5’-CACACTCGGGTAAAGCTATCTC-3’，B為5’-CAGATTAACAGCATGCGGCACT-3’。M是λDNA Hind III分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖片A中泳道1和泳道2的上部帶(a)是λ噬菌體的左臂；下部的帶(b)是插入DNA；帶c是λ噬菌體的右臂；其余的帶(d，e，f)是插入DNA經(jīng)消化后的片段。用低熔點(diǎn)瓊脂糖法回收陽性克隆片段并將其克隆到XbaI單切的PBS質(zhì)粒上，用T3引物測(cè)序，最終將ZMglp1基因及其啟動(dòng)子ZMp1(序列表中的序列1)的序列測(cè)出。
實(shí)施例2、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄采用熱酚法提取總RNA，抽提緩沖液成分為0.1MliCl，1M Tris-HCl pH8.0，0.1MEDTA，1％SDS，用前加等體積Tris飽和酚pH8.0，80℃預(yù)熱，取2克組織在液氮中研磨，然后加入到15毫升預(yù)熱的抽提緩沖液中，混勻，80℃反應(yīng)5分鐘，加7.5毫升氯仿異戊醇，振蕩，離心12000rpm 5分鐘取上清，加等體積氯仿異戊醇再抽提一遍，最后上清加等體積4MLiCl，4℃沉淀1小時(shí)，12000rpm離心10分鐘。以總RNA做轉(zhuǎn)錄模板，轉(zhuǎn)錄前，用DNaseI除去RNA中殘存的DNA。利用德國保林曼公司(boehringer Mannheim biochemical)的cDNA合成試劑盒(Cat.No.1117831)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個(gè)反應(yīng)加50微克總RNA做模板，反應(yīng)步驟見試劑盒說明。反應(yīng)完后，加RNaseA除去RNA，以備下一步分析。
實(shí)施例3、cDNA酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(CDNA-AFLP)購買了life technologies公司的AFLPTMAnalysis SystemI和AFLP StarterPrimer試劑盒(Cat.No.10544-013，10483-014)來做AFLP，詳細(xì)步驟見試劑盒說明。分別取250ng根、莖、葉cDNA在25微升體系中用EcoRI和MseI 37℃雙切2小時(shí)，70℃變性內(nèi)切酶，加24微升EcoRI和MseI接頭及緩沖液，再加1微升連接酶，20℃連接2小時(shí)。產(chǎn)物稀釋10倍，取5微升作模板，做第一輪PCR，引物依據(jù)EcoRI和MseI接頭設(shè)計(jì)，在3’端帶有一個(gè)選擇性堿基，這樣只有大約1/16的cDNA片段被擴(kuò)增，第一輪的PCR產(chǎn)物經(jīng)過稀釋，又作為模板進(jìn)行第二輪PCR，此次兩端接頭引物各帶有3個(gè)選擇性堿基，之前EcoRI引物用γ-32p標(biāo)記，PCR產(chǎn)物用genomyxLRTMDNA半自動(dòng)測(cè)序儀在6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，60W，50℃，3.5小時(shí)，電泳結(jié)束后，干膠半小時(shí)，然后在壓片夾內(nèi)于-70℃暴光48小時(shí)。結(jié)果如圖3、圖4所示，圖3中C為對(duì)照。葉(泳道4，7，10，13，16)、莖(泳道2，5，8，11，14，17)和根(泳道3，6，9，12，15，18)的cDNA通過含有3個(gè)選擇性核苷酸AGG的EcoR I引物及含有3個(gè)選擇性核苷酸的Mse I引物擴(kuò)增出來。Mse I引物所含的選擇性核苷酸分別為CTT(泳道1，2，3)，CTG(泳道4，5，6)，CTC(泳道7，8，9)，CTA(泳道10，11，12)，CAT(泳道13，14，15)和CAG(泳道16，17，18)。圖4中，根(泳道1，4，7，10，13，16)、莖(泳道2，5，8，11，14，17)和葉(3，6，9，12，15，18)的cDNA通過含有3個(gè)選擇性核苷酸ACC的EcoR I引物及含有3個(gè)選擇性核苷酸的Mse I引物擴(kuò)增出來。Mse I引物所含的選擇性核苷酸分別為CAT(泳道1，2，3)，CTA(泳道4，5，6)，CTC(泳道7，8，9)，CTG(泳道10，11，12)，CTT(泳道14，15，16)和CAC(泳道16，17，18)。差異顯示帶自圖中可以看出。在放射自顯影照片上，找到了8條葉片cDNA特異擴(kuò)增的條帶，比對(duì)照片將它們切下來，溶于50微升TE，在100℃煮10分鐘。
用第二次PCR引物再次擴(kuò)增，產(chǎn)物分別克隆到pUCTMT-vector上，用藍(lán)白斑和PCR方法篩選。
實(shí)施例4、Northern雜交分析幼苗根、莖、葉總RNA各20微克，在1.2％變性瓊脂糖膠電泳，20XSSC轉(zhuǎn)到Hybond尼龍膜上，用紫外光交聯(lián)儀(Vilber Lourmat UV crosslinker)將RNA和膜交聯(lián)在一起。用PCR方法標(biāo)記回收片段做探針(模板DNA0.25ng，EcoRI和MseI引物各30ng，dATP，dTTP，dGTP各0.5mM，Taq酶0.5U，總體積25微升)。雜交結(jié)果如圖5所示，圖中泳道1，玉米幼苗根；泳道2，莖；泳道3，葉；上述部位的總RNA與32P標(biāo)記的ZMglp1及18S rRNA(b)雜交，結(jié)果表明ZMglp1在幼苗葉片特異表達(dá)。在另一個(gè)Northern雜交分析中，將抽穗期前后的根、莖、幼嫩葉片、老葉片、雄蕊花序、雌蕊花序軸、未成熟種子總RNA各20微克上樣電泳，轉(zhuǎn)至Hybond尼龍膜，交聯(lián)方法同上，用同樣的探針雜交，結(jié)果如圖6所示，圖中，泳道1根；泳道2莖；泳道3幼葉；泳道4老葉；泳道5雄蕊；泳道6穗軸；泳道7未熟種子，將它們的總RNA與32P標(biāo)記的ZMglp1片段(a)及18S rRNA(b)雜交證明，ZMglp1在幼嫩葉片大量表達(dá)，在老葉、雄蕊花序、雌蕊穗軸少量表達(dá)，而在根、莖和未成熟種子中不表達(dá)。
原位雜交結(jié)果表明，ZMglp1基因在柵欄組織和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，而在表皮細(xì)胞中不表達(dá)。
實(shí)施例5、Southern雜交為了確定玉米ZMglp1基因及其啟動(dòng)子ZMp1的拷貝數(shù)，提取了玉米基因組DNA，并用BamHI、EcoR V、Hind III和XbaI酶切，各上樣20微克電泳，之后轉(zhuǎn)到Hybond雜交膜上，用紫外光交聯(lián)，方法同上。在基因的中止密碼下游設(shè)計(jì)引物B1(B1為5’-AGCAAGCACGCGTTCCATTC-3’，用引物A和B1擴(kuò)增出該基因上相對(duì)保守的序列Fab1，以它為模板，用隨機(jī)引物法合成同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，結(jié)果如圖7所示，圖中，泳道1用BamH I消化基因組DNA；泳道2用EcoR V消化基因組DNA；泳道3用Hind III消化基因組DNA；泳道4用Xba I消化基因組DNA；MLambda DNAEcoRI/HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn)。雜交時(shí)利用32P標(biāo)記的片段做探針，該片段是利用引物A和引物B1擴(kuò)增出來的。結(jié)果顯示，對(duì)于BamHI和XbaI，只有一個(gè)條帶，而對(duì)于HindIII則有兩個(gè)條帶，EcoRV無條帶，說明，在單倍體基因組中，ZMglp1基因及其啟動(dòng)子ZMp1至少有兩個(gè)拷貝。
序列表<160>1<210>1<211>1400<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>1tctagattga taaacctcac atgtcacgca tgtaataagt tccgaccaaa ccagatgatg60catatgtttc attacagtac tagtttaata tcaaaatagt ttaataatca tacacatttt120tttatacaga tggtgtgaca gtgatggcga gtatgcacag gcgcgcggcg tggctaaggg180gtgcgggcag atggttgcgt ggtggcgggc ggtcgcctgg cactgtgcgg tctaacgaga240tggggacggg cgcgacaaga cgatggtagg taggtgcaag agtaggagcg agcacgaggg300atgggcaaca agtggtcagg caggtgatga cgacgtgatg gggagggcat aagtgtagaa360gacgagcagc gaccacaaca ataaaaccct acatttccga cggccaaagt cgtcggacat420aagcactaag ccgtcggaaa tagcttattt ttatgactga aagcttattt ccaacggtac480ctgtctctcg gtcgtaacgg gtcagaaata aacttatttc cgacggcggt cgtcgaaaat540aagctatgtc tgatggccga aagagaccgt cagcatttaa cctcgataac ggtattaccg600gttgttaatg gggtcacttc tcttatgtcc gatggtttag tggagaccgt cggacataag660atgaggatag atacgagcac gatttataga ccattattat tttggatcga cggttaggat720ttaaccacta aatagcctct tattttttgg ttggccagcc tacaatccta aaaaaattag780actatatttt tgacgatgag cctcaagaca ccaaaataaa tctgttattt tcagcagact840ccaataactg ccaaaaaata ctttattttt tacaactaaa caataataga ccgtcgaaaa900taatagattt attttcgatg ggctttgtat tttggccatc caatactata ttaatcgcag960taaactgtcg tttttctgta gagtgctggt ctagtcggga gcatatcgct atcttcgtaa1020aaaaatgtat cgcgtgtcct atccatagcc cgtcccgatc aatgtaacaa tgcagagcaa1080gacgaggcct tttgctcatc aaagctctgg tcccatttct tccatcctgg aggacattgc1140atgcaccagc tggcaacgct tgtctattgc ctcctttcgt ccaaatatcc ctagcagcgc1200catgccgacg aacactagcc gcatgcctct catcctaacc aaatttcact cacgtacgtt1260aacagcagtt aacgtacgcg cgctgtcatt ttttcctctg cgtgcatata cacatacact1320gaatcactga tacactacgc ccttcttcct tcttcctata taaagaggcc ctagctccaa1380gtctacaatg caacagatac1400
權(quán)利要求
1.玉米萌發(fā)類似蛋白基因啟動(dòng)子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子是序列表中序列1的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子的保守啟動(dòng)子區(qū)為自5’端第1347到第1396位堿基。
4.含有權(quán)利要求1所述DNA序列的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求1所述DNA序列的細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子在作物育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了玉米萌發(fā)類似蛋白基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用，目的是提供來自玉米的萌發(fā)類似蛋白的啟動(dòng)子序列。玉米萌發(fā)類似蛋白基因啟動(dòng)子命名為ZMp1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和其功能的闡明，在植物特別是玉米育種中具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1510140SQ0215811
公開日2004年7月7日 申請(qǐng)日期2002年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月25日
發(fā)明者瞿禮嘉, 范戰(zhàn)民 申請(qǐng)人:北京大學(xué)