專利名稱：建立天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜的方法并應(yīng)用于藥物篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立基因表達(dá)差異譜的方法，特別是建立一種天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜的方法并應(yīng)用于藥物篩選。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)譜是指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫，大規(guī)律cDNA測序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體，描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息，這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達(dá)譜。近年來，人們相繼開展了一系列大規(guī)?；虮磉_(dá)檢測技術(shù)，人們已經(jīng)能定性、定量且大規(guī)模地檢測基因的表達(dá)產(chǎn)物mRNA，并繪制基因表達(dá)譜。
在現(xiàn)有技術(shù)中，基因表達(dá)譜與藥物治療機(jī)理無關(guān)?，F(xiàn)行中藥的作用機(jī)理研究中，所用的常規(guī)方法皆為西藥的藥理研究方法。其特點(diǎn)是單一分子針對某種單一病機(jī)，或稱單分子針對單靶點(diǎn)。而中藥大多是多成分組成的復(fù)方藥物，其藥理作用是多靶點(diǎn)。顯然用常規(guī)的藥理學(xué)方法來研究中藥是極不科學(xué)和合理，在《藥學(xué)學(xué)報(bào)》1998，33(11)876～879“藥物篩選的發(fā)展與現(xiàn)狀”中報(bào)道人類靠自身試驗(yàn)進(jìn)行藥物篩選，受到多種因素的限制，特別是毒性反應(yīng)是用人體篩選藥物過程中很難避免的巨大困難。因此，使用動(dòng)物進(jìn)行藥物篩選就被人們所采用，古代文獻(xiàn)中就有用動(dòng)物進(jìn)行藥物毒性觀察的大量記載。但人類有目的、有計(jì)劃地應(yīng)用動(dòng)物進(jìn)行藥物篩選，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)用，使藥物研究產(chǎn)生又一次飛躍，發(fā)現(xiàn)了大量新型藥物，如抗高血壓藥和其它心血管系統(tǒng)藥物的大量發(fā)現(xiàn)，就與應(yīng)用動(dòng)物進(jìn)行篩選分不開的。直到本世紀(jì)70年代中期，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一直是藥物篩選的基本方法。但由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要時(shí)間長、勞動(dòng)強(qiáng)度大、操作技術(shù)要求高、受試樣品需要量大(約5g)等因素的限制，因而發(fā)展緩慢，未能進(jìn)行大規(guī)模篩選。而天然藥物組成復(fù)雜，尤其是中藥無法在分子水平進(jìn)行藥理研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供將祖國將傳統(tǒng)中醫(yī)理論和現(xiàn)代生物分子知識(shí)緊密相結(jié)合，從而建立一種天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜的方法并應(yīng)用于藥物篩選。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了的方法包括如下步驟(1)建立兩組動(dòng)物模型一組為正常組，一組為疾病模型組；(2)尋找疾病相關(guān)靶組織分離兩組動(dòng)物模型的肝臟、腎臟、脾臟、心肌、肺葉、腦組織、動(dòng)靜脈大血管、橫紋肌、胰腺、腸組織和胃組織，提取兩組動(dòng)物組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，制備探針，雜交，芯片掃描，數(shù)據(jù)分析，凡疾病模型組與正常組相同組織的基因表達(dá)無差異的組織剔除，基因表達(dá)有差異的組織即為疾病相關(guān)靶組織；(3)建立天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜將待測天然藥物按方劑的高劑量，中劑量和低劑量，分三組給疾病動(dòng)物模型組，給藥形成三個(gè)劑量的“疾病給藥”組，將疾病動(dòng)物模型給等容量生理鹽水形成“疾病對照”組，將正常動(dòng)物模型給等容量生理鹽水形成“正常對照”組，常規(guī)療程后，分離上述五個(gè)組的疾病相關(guān)靶組織，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，制備探針，雜交，芯片掃描，數(shù)據(jù)分析；依據(jù)正常對照-疾病對照-疾病給藥三種情況下高劑量、中劑量或低劑量的，在疾病相關(guān)靶組織中，疾病相關(guān)基因的表達(dá)差異而形成的圖譜即為天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜。
本發(fā)明能將所建立的天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜應(yīng)用于天然藥物藥理的研究和天然藥物的篩選。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、可以對所用病癥從基因表達(dá)的分子學(xué)水平闡明各種疾病致病的機(jī)理。
2、可以進(jìn)行天然藥物藥理的研究?？朔爽F(xiàn)行中藥的作用機(jī)理研究中，只能用西藥的藥理研究方法。而又無法將西藥的單一分子針對某種單一病機(jī)，或稱單分子針對單靶點(diǎn)應(yīng)用于解決中藥大多是多成分組成的復(fù)方藥物，其藥理作用是多靶點(diǎn)的問題。
3、可以通過本發(fā)明進(jìn)行天然藥物藥理的研究，當(dāng)眾多異常基因表達(dá)在天然藥物的作用下趨于正常表達(dá)時(shí)，該天然藥物就顯然是有療效的。從而進(jìn)行天然藥物新藥的篩選。藥理學(xué)研究不但是藥物作用機(jī)理的研究，同時(shí)也是藥物篩選的依據(jù)及方法。
4、利用已知藥物(療效確切的藥物)建立的藥理基因表達(dá)差異譜，可知道療效與靶組織中相關(guān)基因表達(dá)的定性、定量關(guān)系，利用此關(guān)系就可以對待篩藥物有無療效及療效強(qiáng)弱做判斷，而篩選新藥。


圖1是利用本發(fā)明建立的高血壓天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜。
圖2是利用本發(fā)明建立的II型糖尿病天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜。
(1)建立高血壓的動(dòng)物模型。將試驗(yàn)小鼠分為兩組，即正常組和模型組，正常組12只，模型組30只，模型小鼠喂養(yǎng)高糖、高蛋白飼料，使之形成原發(fā)性高血壓模型，正常組小鼠給予普通飼料，兩組動(dòng)物均自由飲水。
(2)尋找原發(fā)性高血壓的相關(guān)靶組織。造模成功后處死正常組中的6只小鼠和模型組中的6只小鼠，分離動(dòng)物的腎臟、肝臟、脾臟、心肌、肺(肺葉)、動(dòng)靜脈大血管、橫紋肌、腦組織、胰腺、腸組織和胃組織，將正常組和模型組中每6只動(dòng)物組各個(gè)組織合并，提取總RNA，將RNA制備成RNA探針，用每張芯片含8000個(gè)以上基因、數(shù)目為2×11張的Oligo芯片雜交，雜交芯片掃描，數(shù)據(jù)分析。比較模型組和正常組小鼠上述組織的基因表達(dá)差異，相同表達(dá)的組織剔除，表達(dá)有差異的組織為心肌、動(dòng)靜脈大血管，腎臟，即這些組織為原發(fā)性高血壓的相關(guān)靶組織。
(3)建立治療高血壓天然藥物的藥理基因表達(dá)差異譜取已造模成功的小鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為KH-012號(hào)天然藥物方劑的高劑量組(12g/kg)，中劑量組(6g/kg)和低劑量組(3g/kg)，另取6只給予等容量生理鹽水，為模型對照組，最后取6只正常小鼠，給予等容量生理鹽水，為正常對照組。給藥時(shí)間均為7天，處死全部動(dòng)物，取出高血壓相關(guān)靶組織，即心肌、動(dòng)靜脈大血管，腎臟，按前述方法進(jìn)行RNA提取，制備探針，雜交，掃描，數(shù)據(jù)分析。依據(jù)正常對照-疾病對照-疾病給藥三種情況下三個(gè)劑量的，在高血壓相關(guān)靶組織中，疾病相關(guān)基因的表達(dá)差異而形成的圖譜，如圖1所示的是KH-012號(hào)治療高血壓天然藥物高劑量組的藥理基因表達(dá)差異譜。
實(shí)施例2(1)建立針對II型糖尿病病因的小鼠動(dòng)物模型。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組，即正常組和模型組，正常組12只，模型組30只。模型組小鼠喂養(yǎng)高糖、高脂飼料，使之形成II型糖尿病模型，喂養(yǎng)時(shí)間100天，正常組小鼠給予普通飼料，兩組動(dòng)物均自由飲水。
(2)尋找II型糖尿病相關(guān)靶組織。100天后測定模型組小鼠和正常組小鼠的血糖值，胰島素含量，以確認(rèn)造模成功。處死正常組中6只小鼠和模型組中6只小鼠，分離動(dòng)物的腎臟、肝臟、脾臟、心肌、肺(肺葉)、動(dòng)靜脈大血管、橫紋肌、腦組織、胰腺、腸組織和胃組織，將正常組和模型組中每6只動(dòng)物組各個(gè)組織合并，提取總RNA，將RNA制備成RNA探針，用每張芯片含8000個(gè)以上基因、數(shù)目為2×11張的Oligo芯片雜交，雜交芯片掃描，數(shù)據(jù)分析。比較模型組和正常組小鼠上述組織的基因表達(dá)差異，相同表達(dá)的組織剔除，表達(dá)有差異的組織為橫紋肌、胰腺，即這些組織為II型糖尿病的相關(guān)靶組織。
(3)治建立治療II型糖尿病天然藥物的藥理基因表達(dá)差異譜取已造模成功的小鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為KH-054號(hào)天然藥物方劑的高劑量組(12g/kg)，中劑量組(6g/kg)和低劑量組(3g/kg)，另取6只給予等容量生理鹽水，為模型對照組，最后取6只正常小鼠，給予等容量生理鹽水，為正常對照組。給藥時(shí)間均為7天，處死全部動(dòng)物，取出II型糖尿病相關(guān)靶組織，即橫紋肌、胰腺，按前述方法進(jìn)行RNA提取，制備探針，雜交，掃描，數(shù)據(jù)分析。依據(jù)正常對照-疾病對照-疾病給藥三種情況下三個(gè)劑量的，在高血壓相關(guān)靶組織中，疾病相關(guān)基因的表達(dá)差異而形成的圖譜，如圖2所示的是KH-054號(hào)治療II型糖尿病天然藥物的中劑量組的藥理基因表達(dá)差異譜。
實(shí)施例3.如圖1所示的1-19均為基因編號(hào)，具體基因如下所示

其中編號(hào)1-6的基因是大血管靶組織的，編號(hào)7-11的基因是心肌靶組織的，編號(hào)12-19的基因是腎皮質(zhì)靶組織的。
下面結(jié)合附圖進(jìn)行說明6號(hào)基因Granzyme C在正常小鼠大血管靶組織中的基因表達(dá)豐度為5078，在疾病小鼠大血管靶組織中的基因表達(dá)豐度為935，即可以從6號(hào)基因表達(dá)水平的變化中發(fā)現(xiàn)，大血管靶組織中6號(hào)基因的低表達(dá)與高血壓相關(guān)。6號(hào)基因在給藥后基因表達(dá)豐度變?yōu)?523，即給藥后疾病動(dòng)物的該基因表達(dá)豐度有恢復(fù)正常的趨勢，為評價(jià)高劑量的KH-012號(hào)治療高血壓天然藥物是否對該種疾病有治療作用提供了依據(jù)和方法，也為天然藥物新藥的篩選提供了依據(jù)。
18號(hào)基因Interleukin 1 superfamily 1，epsilon在正常小鼠腎皮質(zhì)靶組織中的基因表達(dá)豐度為765，在疾病動(dòng)物腎皮質(zhì)靶組織中的基因表達(dá)豐度為4921，即可以從18號(hào)基因表達(dá)水平的變化中發(fā)現(xiàn)，腎皮質(zhì)靶組織中18號(hào)基因的高表達(dá)與高血壓相關(guān)。18號(hào)基因在給藥后基因表達(dá)豐度變?yōu)?518，即給藥后疾病動(dòng)物的該基因表達(dá)豐度有恢復(fù)正常的趨勢，為評價(jià)高劑量的KH-012號(hào)治療高血壓天然藥物是否對該種疾病有治療作用提供了依據(jù)和方法，也為天然藥物新藥的篩選提供了依據(jù)。
用本發(fā)明所建立的圖1可以從基因表達(dá)的分子學(xué)水平闡明高血壓致病的機(jī)理及治病機(jī)理，可以進(jìn)行天然藥物藥理的研究及新藥的篩選。
實(shí)施例4.如圖2所示的1-21均為基因標(biāo)號(hào)，具體基因如下所示

其中編號(hào)為1-14的基因是胰腺靶組織的，15-21的基因是橫紋肌靶組織的。
1號(hào)基因Transcription factor 12在正常小鼠中的基因表達(dá)豐度為3241，在疾病小鼠中的基因表達(dá)豐度為687，即可以從1號(hào)基因表達(dá)水平的變化中發(fā)現(xiàn)，胰腺靶組織中1號(hào)基因的低表達(dá)與II型糖尿病相關(guān)。1號(hào)基因在給藥后疾病小鼠的基因表達(dá)豐度變?yōu)?978，即給藥后疾病小鼠的基因表達(dá)豐度有恢復(fù)正常的趨勢，為評價(jià)中劑量的KH-054號(hào)治療II型糖尿病天然藥物是否對該疾病有治療作用提供了依據(jù)和方法，也為天然藥物新藥的篩選提供了依據(jù)。
21號(hào)基因c-sre tyrosine kinase在正常小鼠中的基因表達(dá)豐度為5782，在疾病小鼠中的基因表達(dá)豐度為1024，即可以從21號(hào)基因表達(dá)水平的變化中發(fā)現(xiàn)，橫紋肌靶組織21號(hào)基因的低表達(dá)與II型糖尿病相關(guān)。21號(hào)基因在給藥后疾病小鼠中的基因表達(dá)豐度變?yōu)?982，即給藥后疾病小鼠的基因表達(dá)豐度有恢復(fù)正常的趨勢，為評價(jià)中劑量的KH-054號(hào)治療II型糖尿病天然藥物是否對該疾病有治療作用提供了依據(jù)和方法，也為天然藥物新藥的篩選提供了依據(jù)。
用本發(fā)明所建立的圖2可以從基因表達(dá)的分子學(xué)水平闡明II型糖尿病致病的機(jī)理及治病機(jī)理，可以進(jìn)行天然藥物藥理的研究及天然藥物新藥的篩選。
權(quán)利要求
1.一種建立天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜的方法，其步驟的特征在于1.1建立兩組動(dòng)物模型一組為正常組，一組為疾病模型組；1.2尋找疾病相關(guān)靶組織分離兩組動(dòng)物模型的肝臟、腎臟、脾臟、心肌、肺葉、腦組織、動(dòng)靜脈大血管、橫紋肌、胰腺、腸組織和胃組織，提取兩組動(dòng)物組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，制備探針，雜交，芯片掃描，數(shù)據(jù)分析，凡疾病模型組與正常組相同組織的基因表達(dá)無差異的組織剔除，基因表達(dá)有差異的組織即為疾病相關(guān)靶組織；1.3建立天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜將待測天然藥物按方劑的高劑量，中劑量和低劑量，分三組給疾病動(dòng)物模型組，給藥形成三個(gè)劑量的“疾病給藥”組，將疾病動(dòng)物模型給等容量生理鹽水形成“疾病對照”組，將正常動(dòng)物模型給等容量生理鹽水形成“正常對照”組，常規(guī)療程后，分離上述五個(gè)組的疾病相關(guān)靶組織，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，制備探針，雜交，芯片掃描，數(shù)據(jù)分析；依據(jù)正常對照-疾病對照-疾病給藥三種情況下高劑量、中劑量或低劑量的，在疾病相關(guān)靶組織中，疾病相關(guān)基因的表達(dá)差異而形成的圖譜即為天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1一種建立天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜的方法的應(yīng)用，其特征在于是將所建立的天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜應(yīng)用于天然藥物藥理的研究和天然藥物的篩選。
全文摘要
一種建立天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜的方法，它克服了現(xiàn)有技術(shù)中從分子學(xué)水平只能對非系統(tǒng)類疾病進(jìn)行研究的缺陷。本發(fā)明是在建立動(dòng)物模型之后，分離兩組動(dòng)物模型的肝臟、腎臟、脾臟、心肌、肺葉、腦組織、動(dòng)靜脈大血管、橫紋肌、胰腺、腸組織和胃組織，通過基因芯片技術(shù)尋找相關(guān)疾病的靶組織，最后再通過基因芯片技術(shù)建立天然藥物藥理基因表達(dá)差異譜。用本發(fā)明可以從基因表達(dá)的分子學(xué)水平闡明各種疾病致病的機(jī)理?？梢酝ㄟ^本發(fā)明進(jìn)行天然藥物藥理的研究，從而進(jìn)行天然藥物新藥的篩選。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1414113SQ0213360
公開日2003年4月30日 申請日期2002年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月13日
發(fā)明者郝曉鋒 申請人:成都康弘科技實(shí)業(yè)(集團(tuán))有限公司