專利名稱：用趨磁細(xì)菌生產(chǎn)磁性顆粒的方法及其中使用的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用趨磁細(xì)菌生產(chǎn)磁性顆粒的方法。這種方法通過(guò)在控制的條件下使趨磁細(xì)菌快速生長(zhǎng)并在細(xì)胞內(nèi)合成磁性顆粒，從而獲得細(xì)菌磁性顆粒。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
細(xì)菌磁顆粒是由趨磁細(xì)菌合成的一種Fe3O4顆粒，在細(xì)胞內(nèi)逐步合成并沿磁力線排列成鏈狀。它們顆粒大小均勻、一般直徑為納米級(jí)(40～50nm)，并具有穩(wěn)定晶型。每個(gè)磁顆粒都有脂蛋白膜包被，因此被稱為磁小體(magnetosome)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌磁顆粒在醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)等領(lǐng)域具有十分廣泛的應(yīng)用前景，它的應(yīng)用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1)作為固定化酶載體和生物傳感器的組成部分Matsunaga等(1987)將葡萄糖氧化酶和脲酶分別固定在細(xì)菌磁顆粒、人造磁粒和Zn-Fe顆粒上制成磁化酶，發(fā)現(xiàn)，同樣的酶量在細(xì)菌磁顆粒上和人造磁粒的固定量分別是Zn-Fe顆粒固定量的100倍和40倍。連續(xù)使用5次后，細(xì)菌磁顆粒固定的酶活力變化不大，而人造磁粒和Zn-Fe顆粒固定的酶活則明顯降低。說(shuō)明被細(xì)菌磁顆粒所固定的酶具有穩(wěn)定、高效等特點(diǎn)。另外，有人試驗(yàn)將葡萄糖氧化酶和脲酶固定在這種磁性顆粒上，作為葡萄糖和尿酸生物傳感器的組成部分，也在醫(yī)學(xué)診斷上具有重要意義。
2)連接抗體用于快速、高靈敏度的免疫檢測(cè)利用戊二醛處理后的磁小體，每毫克可偶聯(lián)29微克的抗體。因此有人利用抗SCC(扁皮細(xì)胞癌)抗體連接視頻監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可檢測(cè)SCC抗原。當(dāng)有SCC抗原存在時(shí)，由于抗原抗體結(jié)合可使磁顆粒聚集在監(jiān)測(cè)系統(tǒng)而反映出來(lái)，這種方法的檢測(cè)限可達(dá)到1.5ng/ml的水平。
此技術(shù)還可以用于熒光免疫測(cè)定。如圖1所示，用FITC-抗老鼠抗原抗體-磁小體復(fù)合物測(cè)定老鼠的IgG。Matsunaga T等(1999)利用基因工程技術(shù)在Magnetospirllum sp.AMB-1中合成磁小體的關(guān)鍵基因magA和它的啟動(dòng)子之間插入ProteinA基因，得到了在磁小體表面表達(dá)有ProteinA蛋白的磁小體，建立了用磁小體-ProteinA復(fù)合物快速高靈敏度地測(cè)定人IgG的化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定方法，用這種方法檢測(cè)IgG的最低濃度為1ng/ml。
3)制備磁性細(xì)胞和純化某些難以純化的細(xì)胞產(chǎn)物利用趨磁細(xì)菌和某些有特殊功能的細(xì)胞融合，從而使這種具有特殊功能的細(xì)胞帶有磁性，利用外加磁場(chǎng)的磁導(dǎo)向作用使之定向地行使其功能。例如，當(dāng)有免疫活性的細(xì)胞與磁細(xì)菌融合后，具有趨磁性，它可能在外加磁場(chǎng)的作用下定向地攻擊腫瘤細(xì)胞。Matsunaga T等1987年成功的用聚乙二醇作融合劑，使趨磁細(xì)菌與綿羊的紅細(xì)胞融合，因而使綿羊的紅細(xì)胞具有趨磁性。Matsunaga T等又于1989年利用人體白細(xì)胞的吞噬作用將趨磁細(xì)菌導(dǎo)入了粒細(xì)胞和單核白細(xì)胞，每個(gè)粒細(xì)胞和單核白細(xì)胞可以吞噬20-40個(gè)趨磁細(xì)菌，利用Sm-Co磁鐵收集除去這些具有趨磁性的細(xì)胞，就可得到污染率極低的淋巴細(xì)胞。依據(jù)這種原理，Matsunaga T(1991)利用磁場(chǎng)控制來(lái)回收和純化產(chǎn)生干擾素的細(xì)胞也獲得成功。
4)用于基因轉(zhuǎn)移利用載有DNA和RNA的微發(fā)射物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)近年發(fā)展較快。人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌磁小體比鎢、金或人造磁?？筛嗟匚紻NA或RNA，同時(shí)用粒子槍轉(zhuǎn)移而獲得某一基因的細(xì)胞可以方便地利用Sm-Co磁鐵選擇性的分離，從而使細(xì)菌磁小體作為一名自然的侯選者應(yīng)用于這一生物技術(shù)領(lǐng)域。Matsunaga T等(1995)用細(xì)菌磁性顆粒作為DNA的載體進(jìn)行了海洋藍(lán)細(xì)菌的彈道轉(zhuǎn)化，經(jīng)Southern雜交和CAT測(cè)定表明，外源基因已被成功導(dǎo)入受體細(xì)胞，并得以表達(dá)。此外，細(xì)菌磁性顆粒還可用于mRNA的分離。
5)作為藥物的載體用于腫瘤的靶向定位治療利用人造磁性顆粒Fe3O4作為載體與藥物混合制備的磁性藥物制劑，在足夠強(qiáng)的體外磁場(chǎng)作用下注入血管，定位于腫瘤靶區(qū)，藥物以受控的方式從載體中逐步釋放，攻擊腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常組織影響較小，此技術(shù)為腫瘤的靶向定位治療開(kāi)辟了一條新的途徑。目前國(guó)內(nèi)外分別開(kāi)展了一些研究。Lubbe(1996)實(shí)施了人造磁粒對(duì)大鼠的急性毒性試驗(yàn)，認(rèn)為人造磁性顆粒的加入不會(huì)影響磁性藥物制劑的急性毒性，器官毒性在臨床治療中也沒(méi)有增加。德國(guó)、英國(guó)也開(kāi)始對(duì)磁性微球免疫毫微粒進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，得到肯定結(jié)果。我國(guó)以張陽(yáng)德教授為首的課題組，利用血清白蛋白和抗腫瘤藥物阿霉素與人造磁粉混合后制備成微小顆粒，在小鼠肝癌細(xì)胞的靶向定位治療中取得令人滿意的效果。
基于以上研究，我們認(rèn)為，細(xì)菌磁小體顆粒均勻，利用其表面的游離基團(tuán)，更容易連接藥物而用于腫瘤的靶向定位治療。
由于趨磁細(xì)菌的生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求比較苛刻，人工培養(yǎng)困難。通常采用液體靜置的培養(yǎng)方法，5～7天后，細(xì)胞光密度只能達(dá)到OD6000.2，無(wú)法獲得大量細(xì)胞和磁性顆粒，限制了應(yīng)用。為了解決這一問(wèn)題，德國(guó)、日本、美國(guó)和我國(guó)學(xué)者對(duì)趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)和細(xì)菌磁性顆粒的生產(chǎn)進(jìn)行了一些研究，但目前還沒(méi)有突破性的進(jìn)展。德國(guó)學(xué)者D.Schuler(1997)等采用乙酸鈉為碳源的培養(yǎng)基，控制空氣供給‘進(jìn)行格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)的液體培養(yǎng)，70小時(shí)后細(xì)胞密度為OD4001.4(相當(dāng)于OD600的0.7)，磁顆粒產(chǎn)量為2.6mg/L培養(yǎng)液。日本學(xué)者M(jìn)atsunaga(2001)在以琥珀酸鈉為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)磁螺菌(Magnetospirillum sp.AMB-1)，144小時(shí)后磁顆粒的產(chǎn)量?jī)H為7.4mg/L培養(yǎng)液。因此，本領(lǐng)域希望有一種快速培養(yǎng)趨磁細(xì)菌并使其高產(chǎn)率地產(chǎn)生磁顆粒的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了實(shí)現(xiàn)利用趨磁細(xì)菌有效生產(chǎn)磁性顆粒的目的，發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，明確了碳源、氮源的種類及濃度與磁螺菌生長(zhǎng)和磁性顆粒合成的關(guān)系，氧分壓和pH值對(duì)磁螺菌生長(zhǎng)和磁性顆粒合成的影響，最終獲得了以下新發(fā)現(xiàn)1)磁螺菌的生長(zhǎng)速度和磁性顆粒的合成與碳源的種類和濃度密切相關(guān)。該菌僅能利用少數(shù)幾種有機(jī)酸或有機(jī)酸鹽為碳源，如蘋(píng)果酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉等，且濃度不宜過(guò)高(0.05％-2.0％)，否則抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和磁顆粒的合成。
2)碳氮比與磁顆粒的合成密切相關(guān)。過(guò)高或過(guò)低的碳氮比均會(huì)影響磁顆粒的產(chǎn)率。
3)在無(wú)銨固氮生長(zhǎng)的條件下，細(xì)胞不合成磁顆粒。
4)環(huán)境中氧分壓是影響磁顆粒合成的關(guān)鍵因素之一。
5)pH值小于6.8或高于8.5不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和磁顆粒的合成。
發(fā)明人基于這些新發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。本發(fā)明利用趨磁細(xì)菌生產(chǎn)磁顆粒的方法包括以下步驟在含有碳源、氮源和鐵源的培養(yǎng)基中通過(guò)深層培養(yǎng)法在25℃～35℃下培養(yǎng)趨磁細(xì)菌，其中培養(yǎng)基中碳氮比為4∶1～15∶1，pH值控制在7.0～7.8之間，氧分壓控制在0.5％～21％之間，菌體生長(zhǎng)完成后通過(guò)降低氧分壓使細(xì)菌產(chǎn)生磁顆粒；然后收集菌體并提取磁顆粒。
本發(fā)明還提供了一種新的培養(yǎng)趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)基。


圖1是用磁小體-Protein A復(fù)合物測(cè)定人IgG的化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定方法的原理。
圖2顯示不同種類碳源對(duì)磁細(xì)菌(格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌)生長(zhǎng)的影響。其中單一碳源培養(yǎng)基中的碳源濃度均為15mM的碳原子數(shù)；混合碳源培養(yǎng)基中的各碳源濃度分別為7.5mM碳原子數(shù)。a，乙酸鈉；b，酒石酸鉀鈉；c，檸檬酸鈉鈉；d，D，L-蘋(píng)果酸；e，琥珀酸鈉；f，乳酸鈉；g，乙酸鈉+酒石酸鉀鈉；h，乙酸鈉+檸檬酸鈉；I，乙酸鈉+D，L-蘋(píng)果酸；j，乙酸鈉+琥珀酸鈉；k，酒石酸鉀鈉+檸檬酸鈉；l，酒石酸鉀鈉+D，L-蘋(píng)果酸；m，酒石酸鉀鈉+琥珀酸鈉；n，檸檬酸鈉+D，L-蘋(píng)果酸；o，檸檬酸鈉+琥珀酸鈉；p，D，L-蘋(píng)果酸+琥珀酸鈉；q，Blakemore培養(yǎng)基。
圖3顯示不同濃度的D，L-蘋(píng)果酸對(duì)磁細(xì)菌(格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌)生長(zhǎng)的影響。
圖4顯示不同濃度的乳酸鈉對(duì)磁細(xì)菌(格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌)生長(zhǎng)的影響。
圖5顯示不同氧濃度對(duì)磁細(xì)菌(格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌)生長(zhǎng)的影響。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和鐵源，并且，碳源和氮源的比例應(yīng)控制在一定范圍。
本發(fā)明的培養(yǎng)基中所使用的碳源為一些有機(jī)酸或有機(jī)酸鹽，如乙酸鈉、蘋(píng)果酸、琥珀酸鈉、乳酸鈉及它們的組合，優(yōu)選有機(jī)酸鹽。如果選擇有機(jī)酸，需用NaOH調(diào)至中性以后使用。單一的碳源優(yōu)選乙酸鈉、蘋(píng)果酸，更優(yōu)選乳酸鈉，其濃度應(yīng)控制在1g/L～13g/L。也可使用混合碳源。
氮源可以選自硝酸鹽或銨鹽，優(yōu)選銨鹽，其中更優(yōu)選氯化銨，其濃度控制在0.1g/L～1g/L。
鐵源可以選自喹啉酸鐵或硫酸亞鐵，優(yōu)選喹啉酸鐵，濃度控制在20μM～150μM，優(yōu)選20μM～50μM。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所使用的培養(yǎng)基是Schuler培養(yǎng)基，其中含有如下成分乙酸鈉1.0g，NH4Cl 0.1g，喹啉酸鐵20μmol/L，酵母粉0.1g，K2HPO40.5g，硫代乙醇酸鈉0.05g，MgSO4·7H2O 0.1g，加蒸餾水至1000ml。
培養(yǎng)基的pH值控制在6.8～8.3之間，種子培養(yǎng)的起始pH優(yōu)選7.0；深層培養(yǎng)前期(細(xì)胞生長(zhǎng)期)的pH優(yōu)選7.8，后期(磁顆粒合成期)的pH優(yōu)選7.0。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，在含有碳源、氮源和鐵源的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)趨磁細(xì)菌，獲得種子培養(yǎng)液，其中所述培養(yǎng)基中碳氮比為4∶1～15∶1，pH值為6.8～8.3，初始氧分壓控制在5％～21％。
種子培養(yǎng)過(guò)程中，氧分壓的控制可以采用排水法進(jìn)行。具體方法為在60～500ml的血清瓶中裝入蒸餾水50ml～450ml，塞上棉塞，滅菌后補(bǔ)無(wú)菌水至滿，換無(wú)菌橡皮塞，利用針頭通入無(wú)菌高純氮?dú)?，同時(shí)插入無(wú)菌排水針頭，直至無(wú)菌水全部被無(wú)菌氮?dú)庵脫Q。然后用無(wú)菌注射器將瓶中一定量的無(wú)菌氮?dú)庵脫Q為無(wú)菌空氣，制備出一定初始氧分壓的培養(yǎng)瓶。一般將初始氧分壓控制在5％～21％之間，優(yōu)選10％～21％，更優(yōu)選10％～15％。
種子培養(yǎng)時(shí)，首先將菌種在半固體培養(yǎng)基上活化2～3次，每次3～5天。半固體培養(yǎng)基的瓊脂濃度控制在0.1％～0.3％之間，優(yōu)選0.1％～0.2％。然后將活化好的菌種轉(zhuǎn)接至一定初始氧分壓的培養(yǎng)瓶(瓶中用注射器注入1/2～1/3瓶體積的無(wú)菌培養(yǎng)基)，在30℃、60～150轉(zhuǎn)/分的振蕩培養(yǎng)條件下活化2～3次，每次接種量為10％。最后一次轉(zhuǎn)接也可在塞上棉塞的三角瓶中振蕩培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)這樣培養(yǎng)的種子液的OD600為0.4～1.8(種子液細(xì)胞密度OD600的高低與培養(yǎng)基的種類密切相關(guān))。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在含有碳源、氮源和鐵源的培養(yǎng)基中通過(guò)深層培養(yǎng)法培養(yǎng)趨磁細(xì)菌，其中培養(yǎng)基中碳氮比為4∶1～15∶1，培養(yǎng)溫度為25℃～35℃，pH值控制在7.0～7.8之間，氧分壓控制在0.5％～21％之間，菌體生長(zhǎng)完成后通過(guò)降低氧分壓使細(xì)菌產(chǎn)生磁顆粒，然后收集菌體并提取磁顆粒。
液體深層培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基的成分相同。pH值控制在7.0～7.8之間，氧分壓控制在0.5％～21％之間，前期優(yōu)選5～10％后期優(yōu)選1％～3％。通氣量控制在0.5L/min～2.0L/min之間，優(yōu)選0.5L/min～1.0L/min。攪拌轉(zhuǎn)速控制在200轉(zhuǎn)/分～800轉(zhuǎn)/分之間，優(yōu)選300轉(zhuǎn)/分～500轉(zhuǎn)/分。培養(yǎng)溫度為25℃～35℃，優(yōu)選28℃～32℃。在5升、20升、80升自動(dòng)發(fā)酵罐中裝入培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入10％的種子液，最終培養(yǎng)液的體積為罐體積的75％。培養(yǎng)周期為30～50小時(shí)，最終細(xì)胞密度OD600穩(wěn)定控制在1.8～2.2，磁顆粒產(chǎn)量在20mg/L～28mg/L(濕重)。
以下通過(guò)實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅為說(shuō)明目的，并非限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1碳源種類對(duì)趨磁細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。
將Schuler培養(yǎng)基(乙酸鈉1.0g，NH4Cl 0.1g，喹啉酸鐵20μmol/L，酵母粉0.1g，K2HPO40.5g，硫代乙醇酸鈉0.05g，MgSO4·7H2O 0.1g，加蒸餾水至1000ml，pH7.0)中的碳源分別用15mM(以碳原子摩爾數(shù)計(jì)，以下相同)的單一碳源乳酸鈉、D，L-蘋(píng)果酸、酒石酸鉀鈉、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉及它們的兩兩組合取代(各7.5mM)，制備含有不同碳源及其組合的培養(yǎng)基各20ml。注入已預(yù)先制備好的含有O2(5％)，N2(95％)的60ml血清瓶中，將活化好的格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌液體培養(yǎng)物2ml接種在Schuler培養(yǎng)基中，30℃，100r/min，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)OD600。
結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，磁細(xì)菌(格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌)能以乙酸鈉、蘋(píng)果酸、琥珀酸鈉和乳酸鈉作為單一碳源生長(zhǎng)，蘋(píng)果酸和乳酸鈉明顯優(yōu)于乙酸鈉和琥珀酸鈉。在混合碳源中，乙酸鈉+蘋(píng)果酸、乙酸鈉+酒石酸鉀鈉、乙酸鈉+琥珀酸鈉、酒石酸鉀鈉+蘋(píng)果酸、酒石酸鉀鈉+琥珀酸鈉均能生長(zhǎng)。在這些組合中，以乙酸鈉+蘋(píng)果酸的組合最好。不能生長(zhǎng)的組合碳源有乙酸鈉+檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉+檸檬酸鈉、檸檬酸鈉+蘋(píng)果酸鈉、檸檬酸鈉+琥珀酸鈉、蘋(píng)果酸+琥珀酸鈉。
實(shí)施例2碳源濃度對(duì)趨磁細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。
A)分別用7.5、15、22.5、30、37.5、45及52.5mM(以碳原子摩爾數(shù)計(jì)，以下相同)的D，L-蘋(píng)果酸代替Schuler培養(yǎng)基中的乙酸鈉，NH4Cl按比例增減，維持C∶N為10∶1。滅菌后各取20ml注入已預(yù)先制備好的含有O2(5％)、N2(95％)的60ml無(wú)菌血清瓶中，接種量10％，30℃，100r/min振蕩培養(yǎng)48小時(shí)后，測(cè)定OD600。
B)分別用1.3、2.6、6.5、13.0克的乳酸鈉代替Schuler培養(yǎng)基中的乙酸鈉，NH4Cl按比例增減，以維持C∶N為10∶1。各取20ml裝入60ml的血清瓶中，塞上棉塞，滅菌，接種量10％，30℃，100r/min振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)定OD600。
碳源濃度以蘋(píng)果酸和乳酸鈉濃度試驗(yàn)為例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖3和圖4。圖3表明，當(dāng)以蘋(píng)果酸作為單一碳源時(shí)，最適合的濃度為7.5～15mM(0.25～0.5克/升)，當(dāng)蘋(píng)果酸濃度達(dá)到22.5mM(0.75克/升)時(shí)，磁細(xì)菌(格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌)細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。
圖4表明，當(dāng)以乳酸鈉為單一碳源時(shí)，最適合的濃度為6.5g/L，但濃度增加至13g/L也不抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
實(shí)施例3氧分壓對(duì)生長(zhǎng)及磁顆粒合成的影響。
以Schuler培養(yǎng)基加維生素和礦質(zhì)元素混合液作為試驗(yàn)培養(yǎng)基，取20ml分別注入含有0、2.5％、5.0％、7.5％、10.0％、12.5％、15.0％、17.5％及21％O2濃度的60ml血清瓶中，接種量10％，30℃，100r/min振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)OD600。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，磁螺菌對(duì)氧的耐受力較強(qiáng)，在搖床上振蕩培養(yǎng)或在發(fā)酵罐中通空氣培養(yǎng)細(xì)胞都能生長(zhǎng)，但磁顆粒的合成必須限氧。
維生素混合液的組成如下
生物素(Biotin) 2mg葉酸(Folic acid) 2mg鹽酸吡哆辛(Pyridoxine-HCl) 10mg鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl·2H2O)5mg核黃素(Riboflavin) 5mg煙酸(Nicotinic acid) 5mg泛酸鈣(D-Ca-pantothenate) 5mg維生素B12(Vitamin B12) 0.1mg對(duì)-氨基苯甲酸(p-Aminobenzoic acid) 5mg硫辛酸(Lipoic acid)5mg蒸餾水 至1000ml礦質(zhì)元素混合液的組成如下氨三乙酸(Nitrilotriacetic acid)1.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 3.0g硫酸錳(MnSO4·2H2O) 0.5g氯化鈉(NaCl) 1.0g硫酸鐵(FeSO4·7H2O) 0.1g硫酸鈷(CoSO4·7H2O) 0.18g氯化鈣(CaCl2·2H2O) 0.1g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.18g硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.01g硫酸鋁鉀(KAl(SO4)2·12H2O) 0.02g硼酸(H3BO3) 0.01g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.01g氯化鎳(NiCl2·6H2O) 0.025g亞硒酸鈉(Na2SeO3·5H2O) 0.3mg蒸餾水 至1000ml實(shí)施例4液體深層培養(yǎng)液體深層培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基組分如下(以1000ml計(jì)算)
乳酸鈉(60％-70％) 6.5gNH4Cl 1.0gFe3+(喹啉酸鐵)80μM酵母粉 0.1gK2HPO40.5g硫代乙醇酸鈉 0.05gMgSO4.7H2O 0.1g維生素混合液 10ml礦質(zhì)元素混合液 5ml蒸餾水 至1000毫升在5L自控發(fā)酵罐中裝入3600ml培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，接入10％的種子液，控制溫度為30℃、攪拌速度為400r/min、通氣量為0.5L/min的情況下，通過(guò)改變氧濃度和pH值進(jìn)行6批次的實(shí)驗(yàn)。其中氧濃度的改變是通過(guò)調(diào)節(jié)空氣與氮?dú)獾谋壤齺?lái)進(jìn)行，氧濃度用氣相色譜儀監(jiān)測(cè)。培養(yǎng)完成后，按照以下方法提取磁顆粒。
磁顆粒提取與純化A)培養(yǎng)液于4℃，5000r/min離心30min，去掉上清，加入10～20ml10mM HEPES緩沖液(pH7.4)，振蕩懸浮。
B)合并懸浮液至100ml燒杯中進(jìn)行超聲波破碎。
C)燒杯底部加一塊磁鐵(約2000guass)，靜置20～30min。
D)傾去上清液，加入30～50ml的10mM HEPES緩沖液(pH7.4)，振蕩洗滌，磁鐵收集，重復(fù)洗滌3～4次。
E)傾去上清液，加入10ml 0.2M PBS緩沖液(pH7.4)，4℃保存。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)以下表1。
表1 5L發(fā)酵罐中6批次試驗(yàn)結(jié)果

由表1看出，磁螺菌在pH值7.0～7.8之間均可生長(zhǎng)，但最適生長(zhǎng)pH為7.8。當(dāng)控制pH7.8、氧含量在3.5％～21％之間，細(xì)胞密度可達(dá)1.8～2.1OD600，但沒(méi)有磁顆粒合成。在培養(yǎng)20小時(shí)后，調(diào)節(jié)氧含量為1％～2％、pH7.0，磁顆粒開(kāi)始積累，繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí)，磁顆粒產(chǎn)量可達(dá)20mg/L～28mg/L。
權(quán)利要求
1.使用趨磁細(xì)菌生產(chǎn)磁性顆粒的方法，包括以下步驟在含有碳源、氮源和鐵源的培養(yǎng)基中通過(guò)深層培養(yǎng)法在25℃～35℃下培養(yǎng)趨磁細(xì)菌，其中培養(yǎng)基中碳氮比為4∶1～15∶1，pH值控制在7.0～7.8之間，氧分壓控制在0.5％～21％之間，菌體生長(zhǎng)完成后通過(guò)降低氧分壓使細(xì)菌產(chǎn)生磁顆粒；然后收集菌體并提取磁顆粒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基中使用的碳源是有機(jī)酸或者有機(jī)酸鹽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中培養(yǎng)基中使用的碳源是乳酸鈉。
4.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基中使用的氮源是硝酸鹽或銨鹽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中培養(yǎng)基中使用的氮源是氯化銨。
6.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基中使用的鐵源是喹啉酸鐵。
7.權(quán)利要求1的方法，其中氧分壓在菌體生長(zhǎng)階段控制在5～10％，磁顆粒生產(chǎn)階段控制在1％～3％。
8.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基中碳氮比為10∶1。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在深層培養(yǎng)之前，先在振蕩條件下培養(yǎng)趨磁細(xì)菌，獲得種子培養(yǎng)液。
10.一種用于趨磁細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其組成如下乳酸鈉(60％-70％)6.5gNH4Cl 1.0gFe3+(喹啉酸鐵) 80μM酵母粉 0.1gK2HPO40.5g硫代乙醇酸鈉 0.05gMgSO4·7H2O 0.1g維生素混合液 10ml礦質(zhì)元素混合液 5ml蒸餾水 至1000毫升其中，維生素混合液的組成如下生物素(Biotin) 2mg葉酸(Folic acid) 2mg鹽酸吡哆辛(Pyridoxine-HCl) 10mg鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl·2H2O) 5mg核黃素(Riboflavin) 5mg煙酸(Nicotinic acid) 5mg泛酸鈣(D-Ca-pantothenate)5mg維生素B12(Vitamin B12) 0.1mg對(duì)-氨基苯甲酸(p-Aminobenzoic acid) 5mg硫辛酸(Lipoic acid) 5mg蒸餾水 至1000ml礦質(zhì)元素混合液的組成如下氨三乙酸(Nitrilotriacetic acid) 1.5g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)3.0g硫酸錳(MnSO4·2H2O)0.5g氯化鈉(NaCl) 1.0g硫酸鐵(FeSO4·7H2O)0.1g硫酸鈷(CoSO4·7H2O)0.18g氯化鈣(CaCl2·2H2O)0.1g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.18g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.01g硫酸鋁鉀(KAl(SO4)2·12H2O)0.02g硼酸(H3BO3)0.01g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.01g氯化鎳(NiCl2·6H2O)0.025g亞硒酸鈉(Na2SeO3·5H2O) 0.3mg蒸餾水 至1000ml
全文摘要
本發(fā)明提供一種使用趨磁細(xì)菌生產(chǎn)磁性顆粒的方法，包括以下步驟在含有碳源、氮源和鐵源的培養(yǎng)基中通過(guò)深層培養(yǎng)法在25℃～35℃下培養(yǎng)趨磁細(xì)菌，其中培養(yǎng)基中碳氮比為4∶1～15∶1，pH值控制在7.0～7.8之間，氧分壓控制在0.5％～21％之間，菌體生長(zhǎng)完成后通過(guò)降低氧分壓使細(xì)菌產(chǎn)生磁顆粒；然后收集菌體并提取磁顆粒。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1472308SQ02125920
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2002年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月2日
發(fā)明者偉 姜, 姜偉, 付剛, 李穎, 田杰生, 王珍芳, 李季倫 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)