專利名稱：H型非病毒載體以及包含其的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因治療領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及非病毒載體及編碼其的融合基因，所述非病毒載體將能夠在體內(nèi)表達(dá)對細(xì)胞具有殺傷作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)型重組體靶向性地導(dǎo)入被HIV/SIV感染的CD4+細(xì)胞，以使該表達(dá)型重組體在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白，從而殺傷清除所述被感染的細(xì)胞；該非病毒載體同時在細(xì)胞外中和游離的HIV/SIV；本發(fā)明還涉及包含所述非病毒載體和所述表達(dá)型重組體的藥物組合物，并涉及特定的表達(dá)型重組體及用于構(gòu)建所述表達(dá)型重組體的特定目的基因。
背景技術(shù)：
目前，艾滋病的最常用的治療方法為雞尾酒療法，該方法最大的缺陷是毒副作用大，雖然可以降低患者血中的病毒滴度，但不能根治艾滋病。
基因治療逐漸成為艾滋病治療方法中非常有前景的一種手段。基因治療通過將外源DNA導(dǎo)入人體的特定細(xì)胞以產(chǎn)生治療效果，達(dá)到治療疾病的目的。目前主要有兩大類方法可以有效地介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)入人體細(xì)胞，一類是病毒載體介導(dǎo)的方法；另一類是非病毒載體介導(dǎo)的方法。病毒載體存在一些目前的技術(shù)多無法克服的缺點，如滴度低、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在致瘤的可能性、病毒載體感染的靶細(xì)胞必須為可分裂細(xì)胞、病毒引起的免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致治療失效以及靶細(xì)胞的死亡等。而近年來發(fā)展起來的非病毒載體有以下優(yōu)點簡便、安全、無毒，可以將目的基因特異性地導(dǎo)入靶組織或細(xì)胞，達(dá)到治療目的。
對屬于非病毒載體的受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法，近年來有所報道。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移可以通過外源DNA與受體的相應(yīng)配體結(jié)合形成復(fù)合物來實現(xiàn)。該類復(fù)合物中的配體可與特定細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，將外源DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入特定細(xì)胞，提高基因轉(zhuǎn)移的靶向性和轉(zhuǎn)移效率。
靶向性治療技術(shù)又稱為“生物導(dǎo)彈”技術(shù)，正越來越引起人們的關(guān)注。第一代生物導(dǎo)彈的設(shè)計思路是將單克隆抗體與藥物、核素或毒素蛋白融合在一起用于臨床治療，其主要問題是靶向性差；第二代生物導(dǎo)彈的設(shè)計思路是將不同的功能區(qū)段拼接所構(gòu)建的融合蛋白作為“分子導(dǎo)向”型導(dǎo)彈，如人工構(gòu)建IL2-PE40融合蛋白用于治療某些自身免疫性疾病，其主要問題是人工構(gòu)件的融合蛋白由于其中的PE40對人體而言是異源蛋白，在人體應(yīng)用會有較強(qiáng)的免疫原性，無法真正在臨床上推廣；第三代生物導(dǎo)彈主要設(shè)計思路是利用治療基因(或基因片段)與多聚陽離子分子形成DNA-蛋白脂復(fù)合物，利用此復(fù)合物中蛋白質(zhì)上的特異性配體作為分子識別蛋白，將整個復(fù)合物特異性地導(dǎo)向到靶細(xì)胞實現(xiàn)其靶向性設(shè)計。經(jīng)常用于結(jié)合DNA的多聚陽離子分子為多聚賴氨酸(Polylysine)，但大部分的多聚賴氨酸都是人工合成的，在基因治療臨床應(yīng)用中成本極高(在美國，固相合成的28氨基酸，1克約為40-50萬美元，在中國約為150-160萬人民幣)，以至于即使臨床試驗成功也幾乎無法在臨床推廣應(yīng)用。為了降低成本，并盡可能減少外源物質(zhì)引起免疫原性的可能，需要有更廉價易得且無免疫原性的結(jié)合DNA的多聚陽離子物質(zhì)。
為了克服以上缺點，本發(fā)明的發(fā)明者應(yīng)用來自于人體基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)片段，復(fù)合與包裹帶有毒素基因的重組體DNA，以使毒素基因僅在擬將之殺滅的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從而殺滅該細(xì)胞。這樣，一方面通過用基因代替蛋白，避免了作為人體異源蛋白的毒素蛋白在人體內(nèi)運行過程中因免疫原性所導(dǎo)致的抗體產(chǎn)生及其繼后的中和失效的發(fā)生；另一方面也避免了毒素蛋白對正常細(xì)胞的殺傷作用，即毒副作用。同時由于用于復(fù)合與包裹重組體DNA的蛋白質(zhì)片段是來自于人體的基因的表達(dá)產(chǎn)物，從而避免了使用昂貴的多聚賴氨酸，使其實施成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在第一方面，本發(fā)明提供非病毒載體，所述非病毒載體是包含受體多肽與富含陽性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白。
在另一方面，本發(fā)明提供包含所述非病毒載體以及表達(dá)型重組體的藥物組合物，其用于靶向性艾滋病基因治療，所述表達(dá)型重組體包含表達(dá)對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)的基因。
優(yōu)選地，所述非病毒載體中的受體多肽是能夠與HIV/SIV表面分子gp120和/或gp41特異性結(jié)合的CD4分子、CD4V1V2或CD4V1，或它們的相關(guān)片段、類似物或突變體；或者是能夠與gp120和/或gp41特異性結(jié)合的CXCR4或其相關(guān)片段、類似物或突變體；或者是能夠與gp120和/或gp41特異性結(jié)合的CCR5或其相關(guān)片段、類似物或突變體。
優(yōu)選地，所述非病毒載體中的富含陽性氨基酸的多肽是人組蛋白H1或其片段或類似物，特別是組蛋白H1中的一段86個氨基酸的片段，其氨基酸序列如下AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKK或者是組蛋白H1中的一段24個氨基酸的片段，其氨基酸序列如下AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKV。
由于使用組蛋白H1或其片段，因此本發(fā)明人將本發(fā)明的非病毒載體稱為H型非病毒載體。
優(yōu)選地，通過基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核與真核細(xì)胞中表達(dá)該融合基因而獲得本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)。
最優(yōu)選地，所述非病毒載體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。
優(yōu)選地，所述對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他對細(xì)胞具有殺傷能力的來自人體、動植物或者微生物的蛋白，或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物；更優(yōu)選地，其中所述對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素，或者是其第二和第三結(jié)構(gòu)域；最優(yōu)選地，所述對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三結(jié)構(gòu)域或其突變體，其中所述突變體的氨基酸序列SEQ ID NO.8所示。
優(yōu)選地，所述表達(dá)型重組體為基于pcDNA3.1mychisA而構(gòu)建的表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut；或者是受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV啟動子雙重控制的真核重組表達(dá)型重組體pYL-PEIIImut。
在另一方面，本發(fā)明提供三種融合基因及其所編碼的特定的本發(fā)明的非病毒載體(融合蛋白)，所述融合基因的DNA序列分別如SEQID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。它們編碼的融合蛋白包括人CD4的V1V2結(jié)構(gòu)域的179個氨基酸和人組蛋白H1的86個氨基酸，或者包括人CXCR4的309個氨基酸和人組蛋白H1的86個氨基酸，或者包括人CCR5的300個氨基酸人組蛋白和H1的24個氨基酸，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6所示。這些融合蛋白是運用基因工程技術(shù)方法生產(chǎn)的，同固相合成相比較，其造價約降低2-3個數(shù)量級，以便于臨床實驗及可能的臨床應(yīng)用。
在另一方面，本發(fā)明涉及序列如SEQ ID NO.7所示的突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNA，PEIIImut；涉及其表達(dá)產(chǎn)物，所述表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；并涉及包含PEIIImut的表達(dá)型重組體，如基于pcDNA3.1mychisA而構(gòu)建的表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut，或者受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV啟動子雙重控制的真核重組表達(dá)型重組體pYL-PEIIImut。


圖1為本發(fā)明的藥物組合物的總體設(shè)計圖。
圖2為表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut的構(gòu)建圖譜。
圖3為重組質(zhì)粒pBS-PEIIImut的構(gòu)建圖譜。
圖4為表達(dá)型重組體pYL-PEIIImut的構(gòu)建圖譜。
圖5為重組體pPIC9K-H1的構(gòu)建圖譜。
圖6為含有融合基因CD4V1V2-H1的重組體pPIC9K-CD4-H1的構(gòu)建圖譜。
圖7為含有融合基因CXCR4-H1的重組體pPIC9K-X4-H1的構(gòu)建圖譜。
圖8為含有融合基因CCR5-H1-24的重組體pPIC9K-CCR5-H1-24的構(gòu)建圖譜。
圖9為表達(dá)型載體pYL-PEIIImut的酶切鑒定結(jié)果，其中序號1～7分別代表1.pBR322/BstNI(1875bp、1060bp、929bp、383bp、121bp)；2.pYL158/PstI&ClaI；3.pYL-PEIIImut/PstI&ClaI；4.pBS-PEIIImut/PstI&ClaI；5.pA-PEIIImut/HindIII&EcoRV(690bp，5452bp)；6.pBS-PEIIImut/EcoRI&HindIII；7.λDNA/HindIII(23130bp、9416bp、6557bp、4361bp、2322bp、；2027bp、564bp)。
圖10a是CXCR4H1的5′端測序圖；圖10b是CXCR4H1的3′端測序圖；圖10c是CD4H1的5′端測序圖；圖10d是CD4H1的3′端測序圖；圖10e是CCR5H1的5′端測序圖；圖10f是CCR5H1的3′端測序圖。
圖11-1～11-5是顯示殺傷試驗中各組細(xì)胞的形態(tài)的熒光照片，其中圖11-1為正常細(xì)胞；圖11-2為A組被SIV感染的CEMX-174細(xì)胞；圖11-3為D組細(xì)胞；圖11-4為E組細(xì)胞；圖11-5為F組細(xì)胞；放大倍數(shù)均為200X。
圖12-2～12-5是顯示中和試驗中各組細(xì)胞的形態(tài)的熒光照片，其中圖12-2為B組細(xì)胞；圖12-3為D組細(xì)胞；圖12-4為E組細(xì)胞；圖12-5為H組細(xì)胞；放大倍數(shù)均為200X，該中和試驗中的正常細(xì)胞形態(tài)與圖11-1所示相同。
具體實施例方式
綠膿桿菌毒素(PE)是由綠膿桿菌分泌的一種毒素，其是一種極毒的毒素，僅僅對小鼠一次靜脈注射0.3微克即可使之在24小時內(nèi)死亡。對一個細(xì)胞來說幾個分子的毒素的導(dǎo)入即可使這個細(xì)胞死亡。由于PE這種獨特的性能，使其作為一種很有前途的毒素被應(yīng)用到艾滋病的基因治療中去。PE具有三個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ia(AA1-252)為細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域III(AA405-613)為ADP糖基化區(qū)域，結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III又合稱為PE40，而結(jié)構(gòu)域Ib(AA365-404)無明顯的生物學(xué)功能。
為了增加毒素基因PEIIImut在人體內(nèi)表達(dá)的安全性，本發(fā)明人另將毒素基因連接在HIV-1或HIV-2的5′-LTR(-158～+80)下游，以期通過TAT/Tat的調(diào)控作用，將毒素基因的表達(dá)限制在被病毒感染的細(xì)胞內(nèi)。被HIV感染的細(xì)胞中有Tat的存在，能和LTR中的TAR序列結(jié)合，從而啟動毒素基因的表達(dá)。即使毒素基因被非特異性地導(dǎo)入正常細(xì)胞，因正常細(xì)胞內(nèi)無Tat的存在，TAR序列不能活化，毒素基因也不會表達(dá)。為了在體外檢測pYL-PEIIImut以及融合蛋白CXCR4-H186的作用，也可利用穩(wěn)定表達(dá)HIV-1 Tat蛋白的模型細(xì)胞。上述設(shè)計確保了毒素使用的靶向性和安全性。
因此，在本發(fā)明的第一個優(yōu)選的實施方案中，提供了包含突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNA，PEIIImut的表達(dá)型重組體，所述重組DNA PEIIImut的序列如SEQ ID NO.7所示，其編碼的突變綠膿桿菌毒素結(jié)構(gòu)域III的毒力，即殺傷力更強(qiáng)。
毒力的增強(qiáng)如下實現(xiàn)通過將綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域C端的5個氨基酸殘基RDELK的密碼子突變?yōu)镵DEL的密碼子，并引入終止密碼子TGATAA而得到重組DNA PEIIImut，其編碼的毒素蛋白的毒力比原來的PEIII強(qiáng)20倍左右。PEIIImut可根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)引入各種表達(dá)載體以用于構(gòu)建表達(dá)型重組體，從而表達(dá)毒素蛋白。這種表達(dá)型重組體的一個例子是pcDNA3.1-PEIIImut，本發(fā)明人得到了以pcDNA3.1-PEIIImut轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α/pcDNA3.1-PEIIImut。
在本發(fā)明的第二個優(yōu)選的實施方案中，提供了用于艾滋病靶向基因治療的藥物組合物，其包含上述表達(dá)型重組體與非病毒載體(融合蛋白)的復(fù)合物。所述融合蛋白包括人CD4V1V2的179個氨基酸和人組蛋白H1(第134位至219位)的86個氨基酸，或者所述融合蛋白包括人CXCR4的309個氨基酸組蛋白和人H1的86個氨基酸，或者包括人CCR5的氨基末端的300個氨基酸和人組蛋白H1(第134位至157位)的24個氨基酸。該融合蛋白對人體無免疫原性。在本發(fā)明的這種用于靶向性基因治療的藥物的應(yīng)用中，包含PEIIImut的表達(dá)型重組體與融合蛋白中可結(jié)合DNA的組分，人組蛋白H1緊密結(jié)合，融合蛋白中的定向組分CD4V1V2、CXCR4或CCR5通過與被HIV/SIV感染的CD4+細(xì)胞(包括Hut-78細(xì)胞、CEMX-174細(xì)胞等)的gp120結(jié)合而將復(fù)合物導(dǎo)入被HIV/SIV感染的CD4+細(xì)胞，在被感染的細(xì)胞中PEIIImut表達(dá)型重組體表達(dá)毒素蛋白，從而將被SIV/HIV的CD4+細(xì)胞殺死。
在本發(fā)明的第三個實施方案中，提供了融合基因，所述融合基因編碼本發(fā)明的藥物組合物中使用的融合蛋白，所述融合蛋白從5′到3′依次包括人CD4V1V2的179個氨基酸和人組蛋白H1的86個氨基酸(含53個賴氨酸和6個精氨酸，即59個帶正電氨基酸)，或者從5′到3′依次包括人CXCR4的309個氨基酸和人組蛋白H1的86個氨基酸(含52個賴氨酸和11個精氨酸，即63個帶正電氨基酸)，或者從5′到3′依次包括人CCR5的300個氨基酸和人組蛋白H1的24個氨基酸(含21個賴氨酸和12個精氨酸，即33個帶正電氨基酸)。分別將以上三種融合基因命名為CD4V1V2-H1、CXCR4-H1、CCR5-H1-24，它們的DNA序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示。用上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母KM71，獲得轉(zhuǎn)化子巴氏畢赤酵母/KM71。用含有CD4V1V2-H1編碼的質(zhì)粒pPIC9K-CD4V1V2、含有CXCR4-H1編碼的質(zhì)粒pPIC9K-CXCR4-H1以及含有CC54-H1-24編碼的質(zhì)粒pPIC9K-CCR5-H1-24分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得轉(zhuǎn)化子大腸桿菌DH5α/pPIC9K-CD4V1V2、DH5α/pPIC9K-CXCR4-H1及DH5α/pPIC9K-CCR5-H1-24。
具體地說，由于本發(fā)明的藥物組合物是將毒素基因?qū)氡籋IV/SIV感染的CD4+細(xì)胞中表達(dá)，因此，就不需要毒素的跨膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。正是由于這種原因，本發(fā)明的毒素基因PEIIImut中僅含有綠膿桿菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第III結(jié)構(gòu)域的編碼序列。該編碼序列在靶細(xì)胞中表達(dá)出的蛋白可作為殺死靶細(xì)胞的毒素。另外，本發(fā)明人用白喉毒素C端的4個氨基酸殘基KDEL替代了PE毒素C端的5個氨基酸殘基REDLK，由此大大增強(qiáng)了毒素的殺死細(xì)胞能力。另外，由于毒素蛋白是在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，這就徹底避免了毒素蛋白的免疫原性問題。即使在靶細(xì)胞崩解后，其中的毒素蛋白也許可能被機(jī)體免疫識別捕獲，從而產(chǎn)生抗體，但這些抗體既無法清除細(xì)胞內(nèi)的毒素蛋白，也不會和作為毒素蛋白表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA發(fā)生反應(yīng)。事實上，這類被殺滅的細(xì)胞將迅速被機(jī)體的免疫機(jī)制所清除。
關(guān)于本發(fā)明的非病毒載體中的特異性受體CD4V1V2，CXCR4和CCR5，已知單獨的CD4胞外可變區(qū)V1V2即可與gp120充分結(jié)合，故在此選取其V1V2部分。利用RT-PCR技術(shù)從正常中國人外周血中獲得的CD4V1V2、CXCR4和CCR5的編碼序列。CXCR4和CCR5為化學(xué)趨化因子受體，作為CD4的輔助受體可以配合CD4與HIV Env結(jié)合，也可直接與Env結(jié)合。其C端細(xì)胞內(nèi)部分的作用是將信號傳遞給GTP結(jié)合蛋白，它的缺失并不影響受體與gp120的結(jié)合，而受體分布于整個胞外區(qū)的部位對于HIV的結(jié)合及病毒進(jìn)入細(xì)胞均有作用。為了使靶向蛋白盡可能在維持功能的基礎(chǔ)上減小體積，進(jìn)一步利用PCR分別去掉CXCR4和CCR5羧基端的34和52個氨基酸，同時在C端引入一個AvrII酶切位點，便于組蛋白H1的加入。本發(fā)明的融合蛋白中利用人體內(nèi)正常存在的組蛋白H1作為DNA的結(jié)合分子。組蛋白H1含有足夠量的堿性氨基酸，特別是大量的賴氨酸，在一定pH條件下帶正電荷，能通過靜電作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合。其自然形態(tài)本身就在真核生物基因組DNA的折疊、濃聚方面有重要的作用。這樣設(shè)計可以保證DNA分子充分濃聚的基礎(chǔ)上保證了低免疫原性。
以下通過實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實施例1 PEIIImut的克隆及其表達(dá)型重組體的構(gòu)建1、PEIIImut的擴(kuò)增和克隆以含有綠膿桿菌毒素PE40的質(zhì)粒pZM3為模板，用序列如下的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出綠膿桿菌毒素的III結(jié)構(gòu)域的編碼序列。所用的引物序列中引入了EcoRV和EcoRI的識別序列，并且引入了以使PEIII編碼序列3′端如上所述的5個氨基酸的密碼子突變?yōu)?個氨基酸的密碼子的序列，引物序列為上游引物(33bp)5′-tcgatatcaccatgctcggcgacggcggcgacg-3′EcoRV Kozak下游引物(40bp)5′-ggaattcttacagttcgtccttcggcggtttgccgggctg-3′EcoRIPCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘后開始循環(huán)94℃變性40秒，56℃退火40秒，70℃延伸40秒。經(jīng)35個循環(huán)后，70℃延伸10分鐘。使用的擴(kuò)增酶為Promega公司(麥迪遜，威斯康星，美國)的高保真Pfu。以瓊脂糖凝膠電泳、玻璃奶法回收PCR產(chǎn)物中的660bp的目的DNA片段。所得擴(kuò)增片段經(jīng)EcoRV和EcoRI雙酶切，再以瓊脂糖凝膠電泳、玻璃奶法回收酶切產(chǎn)物的目的DNA片段。2、表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut的構(gòu)建將上述回收的目的DNA片段與同樣經(jīng)EcoRV和EcoRI處理的哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1(-)/Myc-HisA(Invitrogen公司，Carlsbad，加州，美國)的DNA片段相連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選出陽性克隆，從中制備質(zhì)粒，用EcoRV和EcoRI酶切鑒定所的質(zhì)粒。由此鑒定出約含有650bp插入片段的陽性重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-PEIIImut，其構(gòu)建過程如圖2所示。經(jīng)測序顯示所得PEIIImut片段的序列與所設(shè)計的序列吻合。PEIIImut的大小為642bp，其序列如SEQ ID NO.7所示。實施例2 重組質(zhì)粒pYL-PEIIImut的構(gòu)建1、pBS-PEIIImut的構(gòu)建用EcoRV和HindIII(六合通公司，大連，中國)對含有PEIIImut毒素基因的DNA片段的載體pcDNA3.1-PEIIImut(見實施例1)進(jìn)行雙酶切，純化、回收649bp大小的片段。同樣地，對質(zhì)粒pBSKS進(jìn)行雙酶切，純化、回收大片段。用連接酶連接上述所獲得的兩片段，取部分連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選出陽性克隆，從中制備質(zhì)粒，用EcoRV和HindIII酶切鑒定所得的質(zhì)粒。由此鑒定出約含有650bp插入片段的陽性重組質(zhì)粒，命名為pBS-PEIIImut，其構(gòu)建過程如圖3所示。2、重組質(zhì)粒pYL-PEIIImut的構(gòu)建pYL158是以HIV-1 5′-LTR-158到+80的片段為啟動子，含熒光酶報告基因的表達(dá)質(zhì)粒。用PstI和ClaI(六合通公司，大連，中國)將帶有PEIIImut的DNA片段從pBS-PEIIImut中酶切下，與經(jīng)同樣酶切處理的pYL158載體片段相連接。取部分連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性克隆，并對陽性克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒制備，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，確定有PEIIImut片段正確插入的陽性重組質(zhì)粒，命名為pYL-PEIIImut，其構(gòu)建過程如圖4所示。實施例3 含有H1基因的重組體的構(gòu)建1、組蛋白H1基因片段的擴(kuò)增用人類白細(xì)胞的基因組DNA為模板，以如下引物經(jīng)PCR擴(kuò)增人組蛋白H1基因，所用引物如下上游引物5′-TTTCCTAGGGCCAAGAAGCCCAAGAAGGT-3′AvrII下游引物5′-GCTGCGGCCGCTTATCACTTTTTCTTCGGAGCTG-3′NotIPCR反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘后開始循環(huán)94℃變性35秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒。經(jīng)35個循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。使用的擴(kuò)增酶為Promega公司(麥迪遜，威斯康星，美國)的高保真Pfu。以2.0％瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，得到283bp的DNA片段。2、重組體pPIC9KH1的構(gòu)建分別用AvrII和NotI酶切步驟1純化回收的酶切產(chǎn)物，同時用這兩種酶分別酶切酵母表達(dá)型載體pPIC9K，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用玻璃奶法分別純化、回收283bp和載體大片段，用T4 DNA連接酶連接這兩個片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，在含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平板上篩選抗性克隆，按照《分子克隆實驗指南》(第二版)(J.薩姆布魯克等主編，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1992)的堿裂解法小量制備抗性克隆的質(zhì)粒DNA，限制性分析證實質(zhì)粒插入片段大小與融合基因相符。將該重組體命名為pPIC9KH1，其構(gòu)建過程如圖5所示。實施例4 含有融合基因CD4V1V2-H1的重組體pPIC9K-CD4V1V2-H1的構(gòu)建1、CD4V1V2基因片段的獲得用含CD4V1V2基因的pPIC9-CD4V1V2重組體為模板，以如下引物經(jīng)PCR擴(kuò)增人CD4V1V2區(qū)段的編碼序列，所用引物如下上游引物序列5′-CAGGGAAAGAAAGTGGTGCTG-3′下游引物序列5′-CGCCCTAGGGAAAGCTAGCACCACGATG-3′AvrIIPCR反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘后開始循環(huán)94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸60秒。經(jīng)35個循環(huán)后，72℃延伸5分鐘，4℃5分鐘。使用的擴(kuò)增酶為Promega公司(麥迪遜，威斯康星，美國)的高保真Pfu。以1.5％瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，得到556bp的DNA片段。2、PIC9K-CD4V1V2-H1融合基因的構(gòu)建和測序用AvrII酶切步驟1中回收的基因片段CD4V1V2，同時用AvrII和SnaBI酶切pPIC9KH1，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用玻璃奶法分別純化、回收546bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克維爾，馬里蘭州，美國)的連接酶(5u/μl)連接上述獲得的兩種酶切產(chǎn)物。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，在含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平板上篩選抗性克隆。按照《分子克隆實驗指南》(第二版)(J.薩姆布魯克等主編，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1992)的堿裂解法小量制備抗性克隆的質(zhì)粒DNA，限制性分析證實質(zhì)粒插入片段大小與融合基因相符。其構(gòu)建過程如圖6所示。經(jīng)測序表明CD4V1V2-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.6所示。實施例5 含有融合基因CXCR4-H1的重組體pPIC9K-CXCR4-H1的構(gòu)建1、CXCR4基因片段的擴(kuò)增用含基因CXCR4的pPIC9-CXCR4重組質(zhì)粒為模板，以如下引物經(jīng)PCR擴(kuò)增人CXCR4的N端的編碼序列，所用引物如下上游引物序列5′-ACTTCAGATAACTACACCGAG-3′下游引物序列5′-AATCCTAGGACAGGTGAGTGCGTGCTG-3′AvrIIPCR反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘后開始循環(huán)94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分鐘。經(jīng)35個循環(huán)后，72℃延伸5分鐘，4℃、5分鐘。使用的擴(kuò)增酶為Promega公司(麥迪遜，威斯康星，美國)的高保真Pfu。以1％瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，得到936bp左右的DNA片段。2、pPIC9K-CXCR4-H1融合基因的構(gòu)建和測序用AvrII酶切步驟1中回收的基因片段CXCR4，同時用AvrII和SnaBI酶切pPIC9KH1，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用玻璃奶法分別純化、回收936bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克維爾，馬里蘭州，美國)的連接酶(5u/μl)連接上述獲得的兩種酶切產(chǎn)物。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，在含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平板上篩選抗性克隆。按照《分子克隆實驗指南》(第二版)(J.薩姆布魯克等主編，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1992)的堿裂解法小量制備抗性克隆的質(zhì)粒DNA，限制性分析證實質(zhì)粒插入片段大小與融合基因相符。其構(gòu)建過程如圖7所示。經(jīng)測序表明CXCR4-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.7所示。實施例6 含有融合基因CCR5-H1-24的重組體pPIC9K-CCR5-H1-24的構(gòu)建1、CCR5基因片段的擴(kuò)增含基因CCR5的pPIC9重組質(zhì)粒為模板，以如下引物經(jīng)PCR擴(kuò)增人CCR5的N端的編碼序列，所用引物如下上游引物序列5′-GTAGATTATCAAGTGTCAAGTCCAAT-3′下游引物序列5′-CTTCCTAGGCCCGACAAAGGCATAGATGATG-3′AvrIIPCR反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘后開始循環(huán)94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸2分鐘。經(jīng)35個循環(huán)后，72℃延伸5分鐘，4℃5分鐘。使用的擴(kuò)增酶為Promega公司(麥迪遜，威斯康星，美國)的高保真Pfu。以1％瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，得到912bp左右的DNA片段。2、pPIC9K-CCR5-H1融合基因的構(gòu)建和測序AvrII酶切步驟1中回收的基因片段CCR5，同時用AvrII和SnaBI酶切pPIC9KH1，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用玻璃奶法分別純化、回收912bp和9300bp左右的片段。用Gibco-BRL公司(洛克維爾，馬里蘭州，美國)的連接酶(5u/μl)連接上述獲得的兩種酶切產(chǎn)物。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)，在含氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平板上篩選抗性克隆。按照《分子克隆實驗指南》(第二版)(J.薩姆布魯克等主編，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1992)的堿裂解法小量制備抗性克隆的質(zhì)粒DNA，限制性分析證實質(zhì)粒插入片段大小與融合基因相符。其構(gòu)建過程如圖8所示。經(jīng)測序表明CCR5-H1融合基因的序列如SEQ ID NO.8所示。實施例7 融合基因CD4V1V2-H1、CXCR4-H1和CCR5-H1-24在甲醇營養(yǎng)型酵母中的表達(dá)1、表達(dá)載體的線性化及酵母的轉(zhuǎn)化所用表達(dá)載體為實施例4、5、6制備的pPIC9K-CD4V1V2-H1、pPIC9K-CXCR4-H1及pPIC9K-CCR5-H1-24，酵母為巴氏畢赤酵母KM71。KM71(黃秉人教授惠贈)是aox-1缺陷型巴氏酵母株，其AOX1基因被野生型ARG4基因插入破壞，基因型為ARG4HIS4(缺陷型)AOX1∷ARG，所有轉(zhuǎn)化子均為Muts。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞前需經(jīng)線性化處理。線性化表達(dá)載體進(jìn)入巴氏酵母后，外援基因表達(dá)單元可以分別在基因組的his4位點或5‘AOX1位點通過單交換插入酵母染色體產(chǎn)生Mut+(MethanolUtilization Plus)酵母株，也可在AOX1位點通過雙交換插入酵母染色體產(chǎn)生Muts酵母株。整合后，表達(dá)質(zhì)粒上的his4替換了酵母宿主細(xì)胞基因組上原有的缺陷型his4基因，使酵母株表型轉(zhuǎn)變?yōu)镠IS+，能在組氨酸(HIS)缺陷的MD培養(yǎng)基上生長。染色體中沒有外援基因整合的酵母細(xì)胞則不能在HIS缺陷的培養(yǎng)基中生長。因此，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物首先需涂布于MD培養(yǎng)基上，以篩選由外援基因整合的轉(zhuǎn)化子。
具體地，酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法如下(1)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的準(zhǔn)備取2-3μg大量制備并純化的質(zhì)粒DNA，用SalI或BglII進(jìn)行單酶切。去少量酶切反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確證酶切完全。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇脫鹽后于超凈臺無菌條件下晾干備用。
酵母表達(dá)載體線性化常用酶SalI于HIS4位點插入基因組。(SMD1168，Mut+或KM71，Muts)BglII于AOX1位點取代(SMD1168，Muts)本發(fā)明優(yōu)選使用SalI。(2)電轉(zhuǎn)a.取冷凍的畢赤酵母菌種劃線于YPD板，30℃培養(yǎng)2-3天。條取單個菌落接種，于5ml YPD，30℃劇烈振蕩(大于200rpm)培養(yǎng)過液。以1/1000-1/1500轉(zhuǎn)接量接種于50mlYPD，再一次培養(yǎng)過夜，至OD600＝1.3-1.5。b.4℃1500g離心5分鐘收集細(xì)胞。用40ml冰冷的無菌去離子水沉淀。同樣條件離心5分鐘收集細(xì)胞。c.20ml冰冷的無菌去離子重復(fù)上述操作一次。d.重懸細(xì)胞于20冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上備用。e.細(xì)胞沉淀重懸于400μl冰冷的1mol/L山梨醇溶液中，放置冰上備用。f.取1.5ml Eppendorf管，每管加入40μl制備好的細(xì)胞。分別加入3-5μg線性化的質(zhì)粒DNA?；靹蚝筠D(zhuǎn)入冰冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5分鐘以上。g.設(shè)置電穿孔儀以產(chǎn)生7500V/cm，4-5ms的電脈沖。使用Bio-Rad產(chǎn)品是的具體設(shè)置為電壓1500V，電容25uF，電阻200Ω。電擊后立即在電轉(zhuǎn)杯中加入0.8ml冰冷的1mol/L山梨醇，混勻。h.細(xì)胞混懸液涂布于MD培養(yǎng)基上，每個9cm直徑平板涂300μl，15cm平板涂600μl。30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。2、分泌表達(dá)目的蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子的篩選挑取在MD培養(yǎng)基上生長的His+轉(zhuǎn)化子于500ml離心管中進(jìn)行小量培養(yǎng)誘導(dǎo)，以篩選分泌表達(dá)目的蛋白的陽性酵母株。誘導(dǎo)3-4天后，離心收集培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白的表達(dá)情況。
各挑取20個KM71/CD4V1V2-H1、KM71/pPIC9K-CXCR4-H1及KM71/pPIC9K-CCR5-H1-24的His+轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選，分別得到2、2、4個有CD4V1V2-H1分泌表達(dá)的轉(zhuǎn)化株。其中，在表達(dá)株KM71/CD4V1V2-H1培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，在約30KD處有蛋白帶出現(xiàn)，比理論氨基酸序列推算分子量大，考慮由糖基化修飾所致。雜蛋白大多在43KD以上，目的蛋白附近并沒有明顯雜蛋白帶。經(jīng)SDS-PAGE凝膠激光掃描分析，目的蛋白占培養(yǎng)基總蛋白的11％，粗略計算表達(dá)量為13mg/L。用同樣的方法，對高表達(dá)株KM71/pPIC9K-CXCR4-H1和KM71/CCR5-H1-24的培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE分析顯示，分別在約47KD和40KD處有蛋白帶出現(xiàn)，比理論推算分子量大，可能由糖基化修飾所致。而pPIC9K空載體相應(yīng)的位置沒有相應(yīng)的目的條帶，經(jīng)SDS-PAGE凝膠激光掃描分析，目的蛋白占培養(yǎng)上清中總蛋白的6％和8％，粗略計算表達(dá)量為8mg/L和10mg/L。實施例8 融合蛋白的大量制備與純化1、大體積培養(yǎng)菌種接種于2ml BMGY培養(yǎng)基中，30℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜后接種于200～500ml BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600＝2-5(約需36小時)。室溫3000g離心10分鐘收集菌體，換入相應(yīng)于原體積1/4或1/5的BMMY培養(yǎng)基，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3～5天，每天補(bǔ)加甲醇至1％，同時加入適當(dāng)?shù)臏缇ルx子水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分。4℃6000g離心10分鐘收集上清，菌體可重懸于新鮮的BMMY進(jìn)行第二次甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。大體積培養(yǎng)時，特別是在甲醇誘導(dǎo)時，要注意通風(fēng)和溫度，所以培養(yǎng)體積不應(yīng)超過搖瓶體積的1/8，瓶口用兩層紗布罩住，控制搖床轉(zhuǎn)速在200-250rpm，溫度28-30℃，不得超過30℃。2、培養(yǎng)上清的處理收集搖瓶大規(guī)模培養(yǎng)誘導(dǎo)后的工程酵母菌培養(yǎng)液，6000g離心后收集培養(yǎng)上清液，于上清液中加入蛋白酶抑制劑PMSF以保護(hù)蛋白不被降解，每30ml培養(yǎng)上清液加入300μl PMSF。培養(yǎng)上清液經(jīng)0.4μm的濾膜過濾處理后，裝入透析袋中對水透析2天。注意透析袋留出一半空間，并盡可能排除其中的空氣。最初每1小時更換一次透析外液，4小時以后，2～4小時更換一次外液。透析結(jié)束后，將裝有培養(yǎng)上清液的透析袋置于20mm的培養(yǎng)皿中，在其外面撒適量的8000或10000PEG，于4℃冰箱中濃縮。濃縮液收集至50ml離心管中，加入5倍體積的冰凍丙酮，混勻后于-20℃沉淀蛋白12小時。10000r/min離心蛋白沉淀，蛋白用氮氣吹干后，用滅菌去離子溶解，加入2×樣品緩沖液，100℃加熱3～5分鐘，上樣12％～15％PAGE凝膠進(jìn)行電泳。一時不用的蛋白沉淀保存于-20℃冰箱中。3、從PAGE凝膠中回收目的蛋白a.凝膠切割SDS-PAGE電泳后，切下蛋白Marker泳道所在的膠條和少部分樣品膠條，將其放入快速染色液中速染15分鐘，剩余凝膠用保鮮膜包好置于4℃冰箱。速染的膠條脫色顯出條帶后，將膠條與剩余的凝膠對比，切下含目的帶部分的凝膠條。b.電洗脫將切下的凝膠條裝入透析袋中并置于水平電泳槽中，加入蛋白電泳緩沖液進(jìn)行電泳。電泳2～4h后反向電泳5分鐘。將透析袋中的緩沖液倒入50ml離心管中，并轉(zhuǎn)入另一透析袋對去離子水透析1天。透析后的溶液轉(zhuǎn)入另一滅菌的干凈50ml離心管中c.痕量SDS的去除在離心管中加入5倍體積以上的冰凍酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀過夜。10,000r/m離心10分鐘，去掉上清收集沉淀。將收集的沉淀用蛋白沉淀液洗滌1次。d.蛋白沉淀的保存用氮氣吹干蛋白沉淀。沉淀干粉置-20℃冰箱可保存1個月。實施例9 靶向基因藥物CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1+pcDNA3.1-PEIIImut的制備及其對SIV感染的CEMX-174的殺傷作用1、表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut分別與蛋白CDV1V2-H1、CXCR4-H1、CCR5-H1-24的電荷數(shù)及質(zhì)量比1.1表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut和蛋白CDV1V2-H1電荷數(shù)及質(zhì)量比表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut(見實施例1)共有6142bp，其中A+T＝2854，G+C＝3288。根據(jù)美國PE公司的DNA分子量計算公式MW＝A×312+C×288+G×328+T×303-61該質(zhì)粒的分子量為3780557。其所含負(fù)電荷數(shù)為2×6142＝12284。其質(zhì)量電荷比為307.76蛋白CD4V1V2-H1來自酵母系統(tǒng)，其分子量為28955Dalton，靜電荷數(shù)為40，其質(zhì)量電荷之比應(yīng)為723.88。
根據(jù)電荷相等結(jié)合的原則，蛋白質(zhì)CD4V1V2-H1和表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut的質(zhì)量之比應(yīng)為2.35∶1，但考慮到蛋白質(zhì)的純度，將此比例定為2.5∶l。1.2表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut和蛋白CXCR4-H1電荷數(shù)及質(zhì)量比同樣地，蛋白質(zhì)CXCR4-H1也來自酵母表達(dá)系統(tǒng)，其分子量為44409 Dalton，靜電荷為40，其質(zhì)量電荷之比應(yīng)為1110.23。根據(jù)電荷相等結(jié)合的原則，融合蛋白CXCR4-H1與表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut的質(zhì)量之比應(yīng)為3.61∶1，但考慮到蛋白質(zhì)的純度等因素，將此比例定為4∶1。1.3表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut和蛋白CCR5-H1-24電荷數(shù)及質(zhì)量比同樣地，蛋白質(zhì)CCR5-H1-24也來自較酵母表達(dá)系統(tǒng)，其分子量為37207.55 Dalton，靜電荷為21，其質(zhì)量電荷之比應(yīng)為1771.79。根據(jù)電荷相等結(jié)合的原則，融合蛋白CCR5-H1-24與表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut的質(zhì)量之比應(yīng)為5.76∶1，但考慮到蛋白質(zhì)的純度等因素，將此比例定為6∶1。2、靶向基因藥物(即轉(zhuǎn)染復(fù)合物)的制備本實施例所用融合蛋白CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1(見實施例4、5、6)既作為靶向蛋白，又作為DNA結(jié)合蛋白；所用質(zhì)粒DNA為實施例1的毒素基因表達(dá)載體pcDNA3.1-PEIIImut。由于H1富含帶正電的賴氨酸，將與帶負(fù)電性的DNA分子結(jié)合，從而使整個復(fù)合物分子整體電性趨近于中性，在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)出電泳遷移率滯后的現(xiàn)象。
具體地，用PIERCE公司(Rockford，伊利諾易州，美國)的蛋白質(zhì)定量試劑盒分別對上述三種融合蛋白CCR5-H1-24、CD4V1V2-H1和CXCR4-H1進(jìn)行定量測定。具體方法按照試劑盒提供的方法進(jìn)行。再以紫外吸收法測定所制備的pcDNA3.1-PEIIImut質(zhì)粒的濃度。分別將蛋白質(zhì)和DNA溶于適量無血清的1640培養(yǎng)基，制備蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。具體如下將10μg的表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut分別和60、25、40μg的CCR5-H1-24、CD4V1V2-H1和CXCR4-H1溶于2ml 1640培養(yǎng)基中，在室溫下放至4小時，讓它們結(jié)合。然后，放置4℃過夜。將此蛋白和DNA結(jié)合產(chǎn)物用0.8％的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(同時用牛血清白蛋白代替融合蛋白，作對照試驗)。紫外燈下觀察，可見上述三種蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)合明顯。
將制備的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物以0.22μm濾膜過濾除菌，進(jìn)行以下試驗。轉(zhuǎn)染前在混合物中加入1％的胎牛血清。3、培養(yǎng)基中的正常和被感染的CEMX-174細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)基中不含有融合蛋白CCR5-H1-24和/或CD4V1V2-H1和/或CXCR4-H1與表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut的結(jié)合物。細(xì)胞呈正常狀態(tài)生長，呈圓形或卵圓形，邊緣整齊，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)清晰，折光性好，如圖11a所示。
感染對照組為經(jīng)SIV感染后的CEMX-174細(xì)胞。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，被感染的細(xì)胞占75％左右，被感染的細(xì)胞呈不規(guī)則狀，如梭形，皺紙團(tuán)狀等，特征性改變?yōu)槎鄠€細(xì)胞發(fā)生融合，形成合胞體細(xì)胞；細(xì)胞膜發(fā)生破裂或皺縮，有時細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到空泡，嚴(yán)重時細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)破壞甚至消失，細(xì)胞的折光性差，如圖11b所示。4、毒素基因的轉(zhuǎn)染、表達(dá)以及對感染細(xì)胞的殺傷作用4.1模式細(xì)胞的制備本試驗所使用的模式細(xì)胞為CEMX-174細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物研究所病毒室)。具體地，將液氮保存的CEMX-174細(xì)胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)接于含10％胎牛血清(天津三利公司，天津)的1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司，洛克維爾，馬里蘭州，美國)的100ml的培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時后換液，隨后在培養(yǎng)液中加入病毒滴度大于5120的SIV，來感染CEMX-174細(xì)胞。由于該細(xì)胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小時在顯微鏡下觀察細(xì)胞被感染情況，包括被感染細(xì)胞的百分率以及細(xì)胞的形態(tài)改變等。通常在加入病毒3-5天后(視加入的病毒量而定)，即可達(dá)70％以上的感染率。本實驗所使用的模式細(xì)胞(CEMX-174細(xì)胞)的被感染率為75.8％。在病毒感染72小時后，輕輕棄去上層的培養(yǎng)液，再補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)液，充分混懸細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度在4×105cells/ml。4.2實驗分組與實施本實驗分7組，每組3個平行試驗，每種蛋白-DNA復(fù)合物由分三個劑量，即2、4、6微克。7組分別為A.感染對照組，為受SIV感染的CEMX-174細(xì)胞，用作觀察CEMX-174細(xì)胞在感染狀態(tài)下的生長情況；B.pcDNA3.1-PEIIImut組.C.CXCR4-H1-pcDNA3.1-PEIIImut組；D.CD4V1V2-H1-pcDNA3.1-PEIIImut組；E.CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut；F.(C+D)組合；G.(D+E)組合。本實驗所使用的培養(yǎng)板為滅菌的一次性24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司，哥本哈根，丹麥)，每孔加入的細(xì)胞數(shù)為2.0×105/ml，即0.5ml細(xì)胞懸液。
轉(zhuǎn)染24小時后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物處理組的細(xì)胞生長狀況明顯劣于其它各組細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)相對較少，出現(xiàn)許多死亡細(xì)胞。吸取少量上清進(jìn)行病毒滴度檢測(見實施例11)。48小時后計數(shù)存活細(xì)胞數(shù)。用血球計數(shù)器觀察計數(shù)各孔的存活細(xì)胞數(shù)。同時取少量細(xì)胞涂片作熒光染色，觀察被感染細(xì)胞的情況(見實施例12)。所得各孔存活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行方差分析和T檢驗(T-Test)分析，結(jié)果顯示，以感染對照組中存活細(xì)胞數(shù)作對照，計算出各轉(zhuǎn)染復(fù)合物對CEMX-174細(xì)胞的殺傷率。5、加入各處理因素后各組的細(xì)胞計數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果如圖11c、11d和11e所示，與感染對照組相比，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入融合蛋白-表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut結(jié)合產(chǎn)物的各組，細(xì)胞數(shù)顯著減少(p＜0.05)。細(xì)胞減少的數(shù)量隨復(fù)合物濃度的增加而加劇。此結(jié)果表明，這三種融合蛋白-質(zhì)粒復(fù)合物可以顯著殺傷被SIV感染的CEMX-174細(xì)胞，并具有劑量依賴性。詳細(xì)數(shù)據(jù)如表1所示。表1.CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut和CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物對SIV感染的CMEX-174細(xì)胞的殺傷與病毒滴度試驗結(jié)果(n＝12，x±SD)

說明1、每組有3個平行孔，每個孔計數(shù)4次細(xì)胞，共12次(n＝12)，以減少孔間誤差。2、劑量列中的數(shù)值2、4、6μg，以DNA計，同時還包括相應(yīng)的蛋白質(zhì)。3、顯著性水準(zhǔn)為*p＜0.05。分別與感染對照組比較。4、數(shù)值計算方法，見相應(yīng)的實施例。
CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物的2、4、6μg三個劑量組的細(xì)胞存活相對于空白對照均明顯的減少(p＜0.05)。CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut、CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、以及CD4V1V2-H1/CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut等的三個劑量組與空白對照組相比，存活細(xì)胞也顯著減少(p＜0.05)，其中CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物各劑量轉(zhuǎn)染組與CD4V1V2-Hl86/CCR5-H124/pcDNA3.1-PEIII復(fù)合物的2μg和4μg DNA劑量轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞存活數(shù)各自相近，后者略低于前者，而CD4V1V2-H186/CCR5-H124/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物的6μgDNA劑量轉(zhuǎn)染組的存活細(xì)胞數(shù)為1.072×105，明顯小于其它各組。
由于所用的CEMX-174細(xì)胞在感染組中有約75.8％的細(xì)胞感染了SIV，故實際上所用的細(xì)胞是正常細(xì)胞和SIV感染細(xì)胞的混合物，根據(jù)正常細(xì)胞組的轉(zhuǎn)染結(jié)果可知，正常細(xì)胞并不受轉(zhuǎn)染復(fù)合物的影響。為了更明確地了解所用毒素基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)在多大程度上影響了被SIV感染的細(xì)胞的生長，有必要排除正常細(xì)胞的遮蔽作用。在此以24.2％的百分含量計算出空白對照組中的正常細(xì)胞數(shù)，以之作為正常細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)含量，從各組存活細(xì)胞數(shù)中減去該標(biāo)準(zhǔn)數(shù)，得到實際上感染了SIV病毒的細(xì)胞(CEMX-174/SIV)的存活數(shù)。進(jìn)一步以空白對照的CEMX-174/SIV存活細(xì)胞數(shù)作對照，計算出各轉(zhuǎn)染復(fù)合物對CEMX-174/SIV細(xì)胞的殺傷率。該數(shù)據(jù)能更明顯地顯示出細(xì)胞生長所受到的影響。所得數(shù)據(jù)顯示，2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut對CEMX-174/SIV細(xì)胞的殺傷率約為46.2％、52.2％、62.2％；三種劑量的CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut對CEMX-174/SIV細(xì)胞的殺傷率約分別為33.1％、41.2％、48.3％；三種劑量的CXCR4-H1-86/pcDNA3.1-PEIIImut對感染細(xì)胞的殺傷率分別為42.8％、51.2％、63.5％；聯(lián)用組2μg、4μg、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物對CEMX-174/SIV的殺傷率分別為47.2％、50.7％和61.9％。聯(lián)用組2μg、4μg、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物對CEMX-174/SIV的殺傷率分別為52.2％、60.4％和71.9％。實施例10靶向基因藥物CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1+pcDNA3.1-PEIIImut的制備及其對SIV感染的CEMX-174細(xì)胞和游離SIV的中和作用1、靶向基因藥物(即轉(zhuǎn)染復(fù)合物)的制備制備方法同實施例9中的步驟1。2、靶向基因藥物(即轉(zhuǎn)染復(fù)合物)的制備制備方法同實施例9中的步驟2。3、培養(yǎng)基中的正常和被感染的CEMX-174細(xì)胞形態(tài)制備方法同實施例9中的步驟3。4、毒素基因的轉(zhuǎn)染、表達(dá)以及對被感染的CEMX-174細(xì)胞和SIV的中和作用4.1模式細(xì)胞的制備本試驗所使用的模式細(xì)胞為CEMX-174細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗動物研究所病毒室)。具體地，將液氮保存的CEMX-174細(xì)胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)接于含10％胎牛血清(天津)的1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司，洛克維爾，馬里蘭州，美國)的100ml的培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后觀察細(xì)胞的生長情況，并計數(shù)細(xì)胞，48小時后換液，繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞數(shù)為106cells/ml。棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105cells/ml。4.2試驗分組與實施本實驗分8組，每組3個平行試驗，每種蛋白-DNA復(fù)合物由分三個劑量，即2、4、6微克。8組分別為A.正常對照組，正常對照組為不加任何處理因素(如SIV和各種蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物)的CEMX-174細(xì)胞組，用作正常生長對照；B.感染對照組，SIV+CEMX-174細(xì)胞；C.SIV+CEMX-174細(xì)胞+pcDNA3.1-PEIIImut組；D.SIV+CEMX-174細(xì)胞+CXCR4-H1-pcDNA3.1-PEIIImut組；E.SIV+CEMX-174細(xì)胞+CD4V1V2-H1-pcDNA3.1-PEIIImut組；F.SIV+CEMX-174細(xì)胞+CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut；G.(D+E)組合；H.(E+F)。本實驗所使用的培養(yǎng)板為滅菌的一次性24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司，哥本哈根，丹麥)，每孔加入的細(xì)胞數(shù)為2.0×105/ml，即0.5ml細(xì)胞懸液。然后按照需要分別加入0.5ml分別含有2、4、6μg質(zhì)粒DNA與相應(yīng)融合蛋白所形成的復(fù)合物的溶液，充分混勻。然后，每孔分別加入0.5ml含有SIV的病毒液，置于二氧化碳孵箱中(95％空氣，5％CO2)于37℃孵育，48小時后，觀察細(xì)胞生長情況，并換液。
7天后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，CCR5-H1-24或CD4V1V2-H1或CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物處理組的細(xì)胞生長狀況明顯好于感染對照組細(xì)胞，正常細(xì)胞數(shù)相對較多，死亡細(xì)胞較感染對照組少，如圖12a、12b、12c和12d所示。同時用血球計數(shù)器觀察計數(shù)各孔的存活細(xì)胞數(shù)。所得各孔存活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行方差分析和T檢驗(T-Test)分析，結(jié)果顯示，以感染對照組中存活細(xì)胞數(shù)作對照，計算出各復(fù)合物對CEMX-174細(xì)胞的中和作用。所得數(shù)據(jù)顯示，2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H-PEIIImut對SIV的中和作用為52％、55.5％、62％；2、4、6μg DNA劑量的CXCR4-H1-PEIIImut對SIV的中和作用為48.3％、55.1％、59.2％；2、4、6μg DNA劑量的CCR5-H1-PEIIImut對SIV的中和作用為44.2％、51.1％、53.6％；2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut對SIV的中和作用為57.9％、62.6％、71.7％；2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut對SIV的中和作用為52.3％、57.0％、62.3％。細(xì)胞實驗結(jié)果見表1和表2。表2.CD4V1V2-H1/pcDNA3.1-PEIIImut、CXCR4-H1/pcDNA3.1-PEIIImut和CCR5-H1-24/pcDNA3.1-PEIIImut復(fù)合物對SIV感染的CMEX-174細(xì)胞的中和作用的病毒滴度結(jié)果(n＝12，x±SD)

說明1.每組有3個平行孔，每個孔計數(shù)4次細(xì)胞，共12次(n＝12)，以減少孔間誤差。2.劑量列中的數(shù)值2、4、6μg，以DNA計，同時還包括相應(yīng)的蛋白質(zhì)。3.顯著性水準(zhǔn)為*p＜0.05。分別與(正常細(xì)胞+SIV)組比較。4.數(shù)值計算方法，見相應(yīng)的實施例。實施例11 病毒的滴度試驗1、殺傷試驗后的病毒滴度試驗取上述實施例9中的各試驗組培養(yǎng)孔中的上清進(jìn)行倍比稀釋，按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560、1∶5120、1∶10240的比例用1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。每孔含有培養(yǎng)基量為100μl，再加入100μl正常的CEMX-174細(xì)胞，37℃、5％CO2下培養(yǎng)。7天后計數(shù)每個孔中被感染的細(xì)胞數(shù)，最后出現(xiàn)被感染細(xì)胞的孔所對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為病毒的滴度。結(jié)果顯示，CXCR4-H1-PEIIImut三個劑量(2、4、6ug)處理組的病毒滴度分別為640、320、320；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三個劑量組的病毒滴度分別為640、640、320；CCR5-H1-24-PEIIImut組分別為1280、640、640；2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut對SIV的中和作用為320、320、160；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut的三個劑量組(2、4、6μg)的滴度分別為640、320、320。而對照組的滴毒大于5120，顯著的大于上述各試驗組。細(xì)胞實驗結(jié)果見表1。2、中和試驗后的病毒滴度試驗取實施例10中的各培養(yǎng)孔中的上清進(jìn)行倍比稀釋，方法同實施例11中的步驟1。計算出病毒的滴度。結(jié)果顯示CXCR4-H1-PEIIImut三個劑量(2、4、6ug)處理組的病毒滴度分別為640、640、320；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三個劑量組的病毒滴度分別為640、640、320；CCR5-H1-24-PEIIImut組分別為1280、640、640；2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut對SIV的中和作用為640、320、160；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-PEIIImut的三個劑量組(2、4、6μg)的滴度分別為640、640、320。而對照組的滴毒大于5120，顯著的大于上述各試驗組。細(xì)胞實驗結(jié)果見表2。實施例14 感染細(xì)胞的熒光計數(shù)將殺傷試驗和中和試驗中各培養(yǎng)孔的細(xì)胞充分混懸，取1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，3000rpm離心3分鐘，棄上清。再用1ml的PBS洗一次，棄上清，在逐漸加入PBS，混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。取15μl混懸液滴加在載玻片上的環(huán)內(nèi)，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分鐘，取出晾干，加入gp120的抗體(猴抗SIV抗體，來自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分鐘。然后用pH7.2的PBS沖洗，并置于其中浸泡10分鐘，其間不斷振搖。取出片子后，再加入用萬分之二的Evens蘭配制的兔抗猴抗體(即二抗)，37℃水浴30分鐘，用PBS沖洗，晾干后在熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)并拍照。在熒光顯微鏡下觀察被SIV/HIV感染的細(xì)胞在藍(lán)色光的激發(fā)下發(fā)黃色熒光，可以看到細(xì)胞周邊呈黃色，而未被感染的細(xì)胞則不呈黃色，呈暗紅色。殺傷試驗組結(jié)果為(見表1)，CXCR4-H1-PEIIImut三個劑量(2、4、6ug)處理組的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為43.6％、37.2％、27.8％；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三個劑量組的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為41.0％、36.4％、28.8％；CCR5-H1-24-PEIIImut組熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為5 1.0％、44.8％、39.42％；2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為36.4％、30.2％、21.4％；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24-PEIIImut的三個劑量組(2、4、6μg)的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為40.2％、37.6％、29.0％。而感染對照組的熒光細(xì)胞的百分率為76.2％。試驗組與對照組相比均顯著減小(p＜0.05)。
如表2所示，中和試驗組的結(jié)果分別為CXCR4-H1-PEIIImut三個劑量(2、4、6μg)處理組的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為33.2％、28.8％，26.2％；CD4V1V2-H1-PEIIImut的三個劑量組的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為30.8％、28.6％、24.4％；CCR5-H1-24-PEIIImut組熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為35.8％、31.4％、29.8％；2、4、6μg DNA劑量的CD4V1V2-H1/CXCR4-H1-PEIIImut的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為27.0％、24.0％、18.2％；CD4V1V2-H1/CCR5-H1-24-PEIIImut的三個劑量組(2、4、6μg)的熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為30.6％、27.6％、24.2％。而感染對照組的熒光細(xì)胞的百分率為76.2％。試驗組與對照組相比均顯著減小(p＜0.05)。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>H型非病毒載體以及包含其的藥物組合物<130>I20021003CB<160>8<170>PatentIn version3.1<210>1<211>807<212>DNA<213>人<400>1cagggaaaga aagtggtgct gggcaaaaaa ggggatacag tggaactgac ctgtacagct 60tcccagaaga agagcataca attccactgg aaaaactcca accagataaa gattctggga120aatcagggct ccttcttaac taaaggtcca tccaagctga atgatcgcgc tgactcaaga180agaagccttt gggaccaagg aaacttcccc ctgatcatca agaatcttaa gatagaagac240tcagatactt acatctgtga agtggaggac cagaaggagg aggtgcaatt gctagtgttc300ggattgactg ccaactctga cacccacctg cttcaggggc agagcctgac cctgaccttg360gagagccccc ctggtagtag cccctcagtg caatgtagga gtccaagggg taaaaacata420caggggggga agaccctctc cgtgtctcag ctggagctcc aggatagtgg cacctggaca480tgcactgtct tgcagaacca gaagaaggtg gagttcaaaa tagacatcgt ggtgctagct540ttccctaggg ccaagaagcc caagaaggtg gctggcgccg ctaccccgaa gaaaagcatc600aaaaagactc ctaagaaggt aaagaagcca gcaaccgctg ctgggaccaa gaaagtggcc660aagagtgcga aaaaggtgaa aacacctcag ccaaaaaaag ctgccaagag tccagctaag720gccaaagccc ctaagcccaa ggcggccaag cctaagtcgg ggaagccgaa ggttacaaag780gcaaagaagg cagctccgaa gaaaaag 807<210>2<211>269<212>PRT<213>人<400>2Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu1 5 10 15Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn20 25 30Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys35 40 45Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp50 55 60Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp65 70 75 80Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln85 90 95Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln100 105 110Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro115 120 125Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys130 135 140Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr145 150 155 160Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile165 170 175Val Val Leu Ala Phe Gly Thr Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly180 185 190Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys195 200 205Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys210 215 220Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys225 230 235 240Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro245 250 255Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys260 265<210>3<211>1272<212>DNA<213>人<400>3aactacaccg aggaaatggg ctcaggggac tatgactcca tgaaggaacc ctgtttccgt 60gaagaaaatg ctaatttcaa taaaatcttc ctgcccacca tctactccat catcttctta120actggcattg tgggcaatgg attggtcatc ctggtcatgg gttaccagaa gaaactgaga180agcatgacgg acaagtacag gctgcacctg tcagtggccg acctcctctt tgtcatcacg240cttcccttct gggcagttga tgccgtggca aactggtact ttgggaactt cctatgcaag300gcagtccatg tcatctacac agtcaacctc tacagcagtg tcctcatcct ggccttcatc360agtctggacc gctacctggc catcgtccgc gccaccaaca gtcagaggcc aaggaagctg420ttggctgaaa aggtggtcta tgttggcgtc tggatccctg ccctcctgct gactattccc480gacttcatct ttgccaacgt cagtgaggca gatgacagat atatctgtga ccgcttctat540cccaatgact tgtgggtggt tgtgttccag tttcagcaca tcatggttgg ccttatcctg600cctggtattg tcatcctgtc ctgctattgc attatcatct ccaagctgtc acactccaag660ggccaccaga agcgcaaggc cctcaagacc acagtcatcc tcatcctggc tttcttcgcc720tgttggctgc cttactacat tgggatcagc atcgactcct tcatcctcct ggaaatcatc780aagcaagggt gtgagtttga gaacactgtg cacaagtgga tttccatcac cgaggcccta840gctttcttcc actgttgtct gaaccccatc ctctatgctt tccttggagc caaatttaaa900acctctgccc agcacgcact cacctctaac gtttccgaag ctgacgaccg ttacatctgc960gaccgtttct acccgaacga cctgtgggtt gtggttttcc agttccagcc tagggccaag 1020aagcccaaga aggtggctgg cgccgctacc ccgaagaaaa gcatcaaaaa gactcctaag 1080aaggtaaaga agccagcaac cgctgctggg accaagaaag tggccaagag tgcgaaaaag 1140gtgaaaacac ctcagccaaa aaaagctgcc aagagtccag ctaaggccaa agcccctaag 1200cccaaggcgg ccaagcctaa gtcggggaag ccgaaggtta caaaggcaaa gaaggcagct 1260ccgaagaaaa ag 1272<210>4<211>397<212>PRT<213>人<400>4Asn Tyr Thr Glu Glu Met Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu1 5 10 15Pro Cys Phe Arg Glu Glu Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro20 25 30Thr Ile Tyr Ser Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu35 40 45Val Ile Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp50 55 60Lys Tyr Arg Leu His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr65 70 75 80Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn85 90 95Phe Leu Cys Lys Ala Val His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser100 105 110Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile115 120 125Val Arg Ala Thr Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys130 135 140Val Val Tyr Val Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro145 150 155 160Asp Phe Ile Phe Ala Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys165 170 175Asp Arg Phe Tyr Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln180 185 190His Ile Met Val Gly Leu Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys195 200 205Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys210 215 220Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala225 230 235 240Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu245 250 255Leu Glu Ile Ile Lys Gln Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys260 265 270Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Ash275 280 285Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln290 295 300His Ala Leu Thr Ser Gly Thr Ala Lys Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly305 310 315 320Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys Lys Thr Pro Lys Lys Val Lys325 330335Lys Pro Ala Thr Ala Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala Lys Ser Ala Lys340 345 350Lys Val Lys Thr Pro Gln Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys355 360 365Ala Lys Ala Pro Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Ser Gly Lys Pro370 375 380Lys Val Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys385 390 395<210>5<211>978<212>DNA<213>人<400>5gattatcaag tgtcaagtcc aatctatgac atcaattatt atacatcgga gccctgccaa 60aaaatcaatg tgaagcaaat cgcagcccgc ctcctgcctc cgctctactc actggtgttc120atctttggtt ttgtgggcaa catgctggtc atcctcatcc tgataaactg caaaaggctg180aagagcatga ctgacatcta cctgctcaac ctggccatct ctgacctgtt tttccttctt240actgtcccct tctgggctca ctatgctgcc gcccagtggg actttggaaa tacaatgtgt300caactcttga cagggctcta ttttataggc ttcttctctg gaatcttctt catcatcctc360ctgacaatcg ataggtacct ggctgtcgtc catgctgtgt ttgctttaaa agccaggacg420gtcacctttg gggtggtgac aagtgtgatc acttgggtgg tggctgtgtt tgcgtctctc480ccaggaatca tctttaccag atctcaaaaa gaaggtcttc attacacctg cagctctcat540tttccataca gtcagtatca attctggaag aatttccaga cattaaagat agtcatcttg600gggctggtcc tgccgctgct tgtcatggtc atctgctact cgggaatcct aaaaactctg660cttcggtgtc gaaatgagaa gaagaggcac agggctgtga ggcttatctt caccatcatg720attgtttatt ttctcttctg ggctccctac aacattgtcc ttctcctgaa caccttccag780gaattctttg gcctgaataa ttgcagtagc tctaacaggt tggaccaagc tatgcaggtg840acagagactc ttgggatgac gcactgctgc atcaacccca tcatctatgc ctttgtcggg900cctagggcca agaagcccaa gaaggtggct ggcgccgcta ccccgaagaa aagcatcaaa960aagactccta agaaggta 978<210>6<211>326<212>PRT<213>人<400>6Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr Ser1 5 10 15Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu Leu20 25 30Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met35 40 45Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met Thr50 55 60Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu Leu65 70 75 80Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly85 90 95Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe Phe100 105 110Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala115 120 125Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly130 135 140Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu145 150 155 160Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr165 170 175Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe180 185 190Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Val195 200 205Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg210 215 220Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile Met225 230 235 240Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu Leu245 250 255Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn260 265 270Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His275 280 285Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Gly Thr Ala Lys290 295 300Lys Pro Lys Lys Val Ala Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ile Lys305 310 315 320Lys Thr Pro Lys Lys Val325<210>7<211>642<212>DNA<213>綠膿桿菌<400>7atgctcggcg acggcggcga cgtcagcttc agcacccgcg gcacgcagaa ctggacggtg 60gagcggctgc tccaggcgca ccgccaactg gaggagcgcg gctatgtgtt cgtcggctac120cacggcacct tcctcgaagc ggcgcaaagc atcgtcttcg gcggggtgcg cgcgcgcaac180caggacctcg acgcgatctg gcgcggtttc tatatcgccg gcgatccggc gctggcctac240ggctacgccc aggaccagga acccgacgca cgcggccgga tccgcaacgg tgccctgctg300cgggtctatg tgccgcgctc gagcctgccg ggcttctacc gcaccagcct gaccctggcc360gcgccggagg cggcgggcga ggtcgaacgg ctgatcggcc atccgctgcc gctgcgcctg420gacgccatca ccggccccga ggaggaaggc gggcgcctgg agaccattct cggctggccg480ctggccgagc gcaccgtggt gattccctcg gcgatcccca ccgacccgcg caacgtcggc540ggcgacctcg acccgtccag catccccgac aaggaacagg cgatcagcgc cctgccggac600tacgccagcc agcccggcaa accgccgaag gacgaactgt aa 642<210>8<211>213<212>PRT<213>綠膿桿菌<400>8Met Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln1 5 10 15Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu20 25 30Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala35 40 45Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp50 55 60Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr65 70 75 80Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn85 90 95Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe100 105 110Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val115 120 125Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr130 135 140Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro145 150 155 160Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro165 170 175Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu180 185 190Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Asp Pro195 200 205Pro Lys Asp Glu Leu210
權(quán)利要求
1.非病毒載體，其是包含受體多肽與富含陽性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的非病毒載體，其特征在于所述受體多肽是能夠與gp120和/或gp41特異性結(jié)合的CD4、CD4V1V2或CD4V1，或者是它們的相關(guān)片段、類似物或突變體，其中編碼CD4V1V2的基因序列為CAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTCCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTC；其編碼的CD4V1V2的氨基酸序列為QGKKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAF突變后的CD4V1的基因序列為AAAAAAGTAGTTCTGGGTAAAAAGGGTGACACCGTTGAACTGACTTGCACCGCTTCCCAGAAAAAGTCTATCCAGTTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATCAAAATCCTAGGTAACCAGGGTTCCTTCCTGACCAAAGGTCCGTCTAAACTGAACGATCGTGCTGACTCCCGCCGTTCTCTATGGGACCAGGGTAACTTCCCGCTGATTATCAAAAACCTGAAAATCGAAGATTCCGACACCTACATCTGTGAAGTTGAAGACCAGAAAGAAGAAGTTCAACTACTGGTTTTCGGTCTG；編碼的CD4V1的氨基酸序列為KKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGL。
3.如權(quán)利要求1所述的非病毒載體，其特征在于所述受體多肽是能夠與gp120和/或gp41特異性結(jié)合的CXCR4或其相關(guān)片段、類似物或突變體，其中編碼CXCR4氨基末端的氨基酸的DNA序列為AACTACACCGAGGAAATGGGCTCAGGGGACTATGACTCCATGAAGGAACCCTGTTTCCGTGAAGAAAATGCTAATTTCAATAAAATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATCTTCTTAACTGGCATTGTGGGCAATGGATTGGTCATCCTGGTCATGGGTTACCAGAAGAAACTGAGAAGCATGACGGACAAGTACAGGCTGCACCTGTCAGTGGCCGACCTCCTCTTTGTCATCACGCTTCCCTTCTGGGCAGTTGATGCCGTGGCAAACTGGTACTTTGGGAACTTCCTATGCAAGGCAGTCCATGTCATCTACACAGTCAACCTCTACAGCAGTGTCCTCATCCTGGCCTTCATCAGTCTGGACCGCTACCTGGCCATCGTCCGCGCCACCAACAGTCAGAGGCCAAGGAAGCTGTTGGCTGAAAAGGTGGTCTATGTTGGCGTCTGGATCCCTGCCCTCCTGCTGACTATTCCCGACTTCATCTTTGCCAACGTCAGTGAGGCAGATGACAGATATATCTGTGACCGCTTCTATCCCAATGACTTGTGGGTGGTTGTGTTCCAGTTTCAGCACATCATGGTTGGCCTTATCCTGCCTGGTATTGTCATCCTGTCCTGCTATTGCATTATCATCTCCAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAGAAGCGCAAGGCCCTCAAGACCACAGTCATCCTCATCCTGGCTTTCTTCGCCTGTTGGCTGCCTTACTACATTGGGATCAGCATCGACTCCTTCATCCTCCTGGAAATCATCAAGCAAGGGTGTGAGTTTGAGAACACTGTGCACAAGTGGATTTCCATCACCGAGGCCCTAGCTTTCTTCCACTGTTGTCTGAACCCCATCCTCTATGCTTTCCTTGGAGCCAAATTTAAAACCTCTGCCCAGCACGCACTCACCTCT；所編碼的氨基酸序列為NYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVRATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTS。
4.如權(quán)利要求1所述的非病毒載體，其特征在于所述受體多肽是能夠與gp120和/或gp41特異性結(jié)合的CCR5或其相關(guān)片段、類似物或突變體，其中編碼CCR5氨基末端的氨基酸的DNA序列為GATTATCAAGTGTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATTATACATCGGAGCCCTGCCAAAAAATCAATGTGAAGCAAATCGCAGCCCGCCTCCTGCCTCCGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGGCTGAAGAGCATGACTGACATCTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAATACAATGTGTCAACTCTTGACAGGGCTCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGGTACCTGGCTGTCGTCCATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGACAAGTGTGATCACTTGGGTGGTGGCTGTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCAAAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCATACAGTCAGTATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAAAAACTCTGCTTCGGTGTCGAAATGAGAAGAAGAGGCACAGGGCTGTGAGGCTTATCTTCACCATCATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGGCTCCCTACAACATTGTCCTTCTCCTGAACACCTTCCAGGAATTCTTTGGCCTGAATAATTGCAGTAGCTCTAACAGGTTGGACCAAGCTATGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATGACGCACTGCTGCATCAACCCCATCATCTATGCCTTTGTCGGG；所編碼的氨基酸序列為EYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLLPPLYSLVFIFGFVGNMLVILILINCKRLKSMTDIYLLNLAISDLFFLLTVPFWAHYAAAQWDFGNTMCQLLTGLYFIGFFSGIFFIILLTIDRYLAVVHAVFALKARTVTFGVVTSVITWVVAVFASLPGIIFTRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKIVILGLVLPLLVMVICYSGILKTLLRCRNEKKRHRAVRLIFTIMIVYFLFWAPYNIVLLLNTFQEFFGLNNCSSSNRLDQAMQVTETLGMTHCCINPIIYAFVG。
5.如權(quán)利要求1所述的非病毒載體，其特征在于所述富含陽性氨基酸的多肽是組蛋白H1或其片段或類似物。
6.如權(quán)利要求5所述的非病毒載體，其特征在于所述富含陽性氨基酸的多肽是組蛋白H1中的一段86個氨基酸的片段，其編碼DNA序列為GCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTAAAGAAGCCAGCAACCGCTGCTGGGACCAAGAAAGTGGCCAAGAGTGCGAAAAAGGTGAAAACACCTCAGCCAAAAAAAGCTGCCAAGAGTCCAGCTAAGGCCAAAGCCCCTAAGCCCAAGGCGGCCAAGCCTAAGTCGGGGAAGCCGAAGGTTACAAAGGCAAAGAAGGCAGCTCCGAAGAAAAAG；所編碼的氨基酸序列為AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKVKKPATAAGTKKVAKSAKKVKTPQPKKAAKSPAKAKAPKPKAAKPKSGKPKVTKAKKAAPKKK。
7.如權(quán)利要求5所述的非病毒載體，其特征在于所述富含陽性氨基酸的多肽是組蛋白H1中的一段24個氨基酸的片段，其編碼DNA序列為GCCAAGAAGCCCAAGAAGGTGGCTGGCGCCGCTACCCCGAAGAAAAGCATCAAAAAGACTCCTAAGAAGGTA；所編碼的序列為AKKPKKVAGAATPKKSIKKTPKKV。
8.如權(quán)利要求1至7之一所述的非病毒載體，其特征在于通過基因工程方法在體外重組獲得融合基因，并在原核與真核細(xì)胞中表達(dá)該融合基因而獲得該融合蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的非病毒載體，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
10.如權(quán)利要求8所述的非病毒載體，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
11.如權(quán)利要求8所述的非病毒載體，其氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
12.編碼權(quán)利要求9的非病毒載體的融合基因CD4V1V2-H1，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
13.編碼權(quán)利要求10的非病毒載體的融合基因CXCR4-H1，其DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
14.編碼權(quán)利要求11的非病毒載體的融合基因CCR5-H1-24，其DNA序列如SEQ ID NO.5所示。
15.用于靶向性艾滋病基因治療的藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1至11之一種或多種的非病毒載體，以及表達(dá)型重組體，所述表達(dá)型重組體包含表達(dá)對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)的基因。
16.如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其中所述對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素、白喉毒素、商陸、蓖麻毒素，或其他對細(xì)胞具有殺傷能力的來自人體、動植物或者微生物的蛋白，或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類似物。
17.如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中所述對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)為綠膿桿菌毒素，或者是其第二和第三功能結(jié)構(gòu)域。
18.如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其中所述對細(xì)胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)是綠膿桿菌毒素的第三功能結(jié)構(gòu)域或其突變體，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
19.如權(quán)利要求15-18之一所述的藥物組合物，其中所述表達(dá)型重組體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)對細(xì)胞具有殺傷作用的毒素蛋白。
20.如權(quán)利要求15-18之一所述的藥物組合物，其中所述表達(dá)型重組體為基于pcDNA3.1mychisA而構(gòu)建的表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut。
21.如權(quán)利要求15-18之一所述的藥物組合物，其中所述表達(dá)型重組體為受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV啟動子雙重控制的真核重組表達(dá)型重組體pYL-PEIIImut。
22.突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結(jié)構(gòu)域的重組DNA，PEIIImut，其DNA序列如SEQ ID NO.7所示。
23.由權(quán)利要求22的基因PEIIImut編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
24.以權(quán)利要求22的基因PEIIImut作為目的基因，基于pcDNA3.1mychisA而構(gòu)建的表達(dá)型重組體pcDNA3.1-PEIIImut。
25.以權(quán)利要求22的基因PEIIImut作為目的基因，受HIV-1或HIV-2的5′-LTR和CMV啟動子雙重控制的真核重組表達(dá)型重組體pYL-PEIIImut。
全文摘要
本發(fā)明涉及非病毒載體及編碼其的融合基因，所述非病毒載體是包含受體多肽與富含陽性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白，其將能夠在體內(nèi)表達(dá)對細(xì)胞具有殺傷作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)型重組體靶向性地導(dǎo)入被HIV/SIV感染的CD4+細(xì)胞，以使該表達(dá)型重組體在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白，從而殺傷清除所述被感染的細(xì)胞；該非病毒載體同時在細(xì)胞外中和游離的HIV/SIV；本發(fā)明還涉及包含所述非病毒載體和所述表達(dá)型重組體的藥物組合物，并涉及特定的表達(dá)型重組體及用于構(gòu)建所述表達(dá)型重組體的特定目的基因。
文檔編號C12N15/11GK1461753SQ02121670
公開日2003年12月17日 申請日期2002年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者盧圣棟, 申景平, 洪梅, 杜延平, 張樹民, 原菊, 蔣虹, 叢喆, 李兆忠, 李靜軒 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所