專利名稱：抗腫瘤抗生素力達霉素高產(chǎn)菌株c－1027－20的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤抗生素的產(chǎn)生菌，特別是涉及一種經(jīng)選育培養(yǎng)、發(fā)酵可得到高單位的菌株。
本發(fā)明的目的在于通過菌種選育、發(fā)酵條件的研究等手段，找到優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的高產(chǎn)菌株，以期產(chǎn)生高單位的目的產(chǎn)物力達霉素，為臨床前研究和臨床治療提供可靠的保證。發(fā)明要點1、 本發(fā)明涉及抗腫瘤抗生素力達霉素高產(chǎn)菌株一球孢鏈霉菌C-1027-20(Streptomyces globisporus C-1027-20)。所用的出發(fā)菌株球孢鏈霉菌C-1027能產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的新化合物力達霉素，發(fā)酵液對八疊球菌抑菌圈僅為19mm，提取得到精品極少。通過菌種選育包括自然選育，化學(xué)，物理誘變，原生質(zhì)體形成，原生質(zhì)體融合，菌落抗生素活性檢測等手段，可以提高菌種的單位.C-1027菌株經(jīng)原生質(zhì)體融合結(jié)合紫外光照射處理，獲得4株比原株效價高的變株No11，13，19，20。其中C-1027-20菌株對八疊球菌的抑菌圈為28mm。該菌株于2002年1月30日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號CGMCCNO.0704。2、 發(fā)酵研究將平皿上生長出單菌落挑在含有瓊脂的發(fā)酵培養(yǎng)基小鋼管表面.28℃培養(yǎng)7天，3℃過夜，次日將此對照效價高及無活性之菌株傳到Gauze斜面上，28℃培養(yǎng)10天后進行發(fā)酵，培養(yǎng)基經(jīng)多次試驗，確定以下配方為種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g％)玉米粉1.5，淀粉1.0，葡萄糖0.5，蛋胨0.5，玉米漿0.5，MgSO40.02，KI 0.06，CaCO30.4自來水配制，其中血胨，玉米漿及葡萄糖對維持高效價較重要。此配方不僅在搖瓶而且40L罐發(fā)酵也得到滿意結(jié)果.經(jīng)過搖瓶發(fā)酵、立瓶發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵的研究，對裝量、接種量、空氣流量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、罐壓、攪拌等等都進行了研究。從2000年1月3日至2000年3月27日，用經(jīng)過選育的菌株進行200立升發(fā)酵罐裝量100立升發(fā)酵液進行發(fā)酵，結(jié)果如下

以上結(jié)果表明，經(jīng)過選育后發(fā)酵獲得的力達霉素的精品接近20克。3、鏈霉菌菌學(xué)考察形態(tài)特征C-1027-20菌株的孢子絲直或波曲，孢子呈柱形，表面光滑(

圖1)。培養(yǎng)特征C-1027-20菌株在各種合成的或有機的培養(yǎng)基上形成淺灰白，奶油白色氣生菌絲?；鶅?nèi)菌絲一般為淺黃，淺黃褐，微黃。在所有的實驗培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可溶性色素。C-1027-20培養(yǎng)特性見表1；C-1027-20的生理生化反應(yīng)見表2；C-1027-20的碳源利用譜見表3。
培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)及碳源利用的實驗結(jié)果表明，經(jīng)過選育后的C-1027-20與原株C-1027比較有以下不同點如C-1027-20在含有蛋白等有機氮的培養(yǎng)基中，生長不好，而在含有淀粉的合成培養(yǎng)斜面上生長良好；又如黑色素，硫化氫，明膠等生化反應(yīng)也有差異；碳源利用如半乳糖，甘露醇也有不盡一致。C-1027-20產(chǎn)生菌所使用的培養(yǎng)基，以含有該菌可利用的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基為好。培養(yǎng)基組成的碳源有葡萄糖、果糖、甘油、糊精淀粉、玉米漿、玉米粉；氮源有蛋白胨、酵母膏、魚粉、豆粉、硫酸銨。它們可以單獨或組合使用，還可加適當(dāng)?shù)逆V鹽、鈉鹽、磷酸鹽(葡萄糖，玉米漿，血胨對產(chǎn)生力達霉素影響大)。培養(yǎng)過程中產(chǎn)生泡沫。只加泡敵不能止住泡沫，而只加豆油則能止住泡沫。但是不能同時加入泡敵和豆油，否則發(fā)酵液會出現(xiàn)混濁。
表1培養(yǎng)特征28℃二周

表2生理生化反應(yīng)


表3碳源利用含糖1g/100ml 28℃2周培養(yǎng)

發(fā)明的積極效果所說的高產(chǎn)菌C-1027-20經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵，制備了足夠量的力達霉素，完成了新藥臨床前研究，包括制備工藝，理化性質(zhì)，純度，檢驗方法，劑型，穩(wěn)定性等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，藥學(xué)，藥效，藥理，毒理，藥代及分子機制等研究，現(xiàn)正進入申報臨床階段。
(2)細菌檢測Sarcinalutea及Bacillus subtilis ATCC6633作為檢定菌，試驗了不同培養(yǎng)基，pH及水源對抑菌圈邊緣清晰度的影響。由于C-1027-20菌種發(fā)酵液對細菌的作用較弱，菌濃度也較低，故平皿僅用10ml培養(yǎng)基單層檢測。實驗結(jié)果，酵母膏，pH8.0是抑菌圈邊緣清晰的主導(dǎo)因素，確定八疊球菌檢定培養(yǎng)基為(％)蛋白胨0.5，酵母膏0.5，牛肉膏0.5，葡萄糖0.2，瓊脂1.6，pH8，蒸餾水配制。
(3)發(fā)酵條件觀察了一級二級發(fā)酵的不同時間，通氣量，pH值，培養(yǎng)基對效價的作用，并用40L罐發(fā)酵，27-28℃，氣流0-24hrs 1∶0.5，24-48hrs 1∶0.8，pH7.0.自來水250rpm轉(zhuǎn)速。
(4)菌種選育所用誘變劑NTG(亞硝基胍)，用0.05mol/l磷酸鉀緩沖溶液配成2.5mg/ml，5.0mg/ml，10.0mg/ml，處理孢子條件為水浴32-35℃，1h；EMS(甲基磺酸乙酯(乙基磺酸甲烷)用水配成6.0，10.0，20.0ul/ml，室溫下浸泡孢子1.5h；紫外光照射條件是用30w燈管，燈距23cm，將內(nèi)有10ml孢子懸液的平皿分別照射10，20，及30min。將上述三種處理過的孢子懸液稀釋成不同濃度后涂在Gauze平板上，28℃培養(yǎng)10天。將生長好的單菌落挑選轉(zhuǎn)種在內(nèi)有固體培養(yǎng)基的小鋼管上部，內(nèi)有小鋼管的平皿放入干燥器中，再放入一小瓶水以保濕，整個容器蓋嚴(yán)后置28℃培養(yǎng)一周，放鋼管至八疊球菌平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑出高活性及無活性變株。
(5)菌培養(yǎng)將上述平皿上生長出的單菌落挑在含有瓊脂的發(fā)酵培養(yǎng)基的鋼管表面，28℃培養(yǎng)7天，移鋼管至八疊球菌平板上，37℃過夜。次日將此對照效價高及無活性的菌株傳至Gauze斜面上，28℃培養(yǎng)10天后進行發(fā)酵。培養(yǎng)基經(jīng)多次試驗確定以下配方為種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g/％)玉米粉1.5，淀粉1.0，葡萄糖0.5，血胨0.5，玉米漿0.5，MgSO40.02，KI 0.06，CaCO30.4，PH7.0自來水配制，其中血胨、玉米漿及葡萄糖對維持高效價較重要。
(6)原生質(zhì)體形成將無活性變株斜面接種到種子瓶中，培養(yǎng)48h后取10％轉(zhuǎn)種于含0.5％甘氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h取出離心收集菌絲并用水洗，菌絲懸液含2mg/ml溶菌酶及0.05M EDTA的高滲緩沖液，35℃水浴保溫30-60min，用顯微鏡40倍物鏡進行原生質(zhì)體觀察，懸液通過脫脂棉層過濾，2500rpm離心10min收集原生質(zhì)體，經(jīng)高滲液洗一次，離心后再混懸于少量高滲液中。
(7)原生質(zhì)體融合將等體積107/ml兩種菌株的原生質(zhì)體混合，加入等體積PEG(1/21000+1/2 6000)，32℃水浴15min，用高滲液稀釋后離心并再洗一次，沉淀稀釋不同濃度，涂布于RMYE再生培養(yǎng)基平皿上，28℃培養(yǎng)5-7天。
(8)菌落抗生素活性檢測原生質(zhì)體再生后，挑選接種于有培養(yǎng)基的鋼管上，培養(yǎng)后移到八疊球菌平板上檢測。
(9)突變菌株的復(fù)試從有抑菌圈的菌株轉(zhuǎn)種在斜面培養(yǎng)基中，10天后二級發(fā)酵，測48，72及96h發(fā)酵液的抗八疊球菌活性及抗精原細胞活性。斜面再經(jīng)兩次傳化，每次均經(jīng)二級發(fā)酵和檢測。
CaCO30.2水50ml跡量鹽溶液 0.1ml合并I和II，調(diào)pH7.0-7.4 瓊脂2 15磅消毒ISP-5 L-天門冬素 0.1 K2HPO4(無水) 0.1 甘油 1 跡量鹽溶液 1ml pH7.2瓊脂2 15磅消毒ISP-7 甘油1.5 L-天門冬素0.1 MgSO4·7H2O 0.05 跡量鹽溶液1mlpH 7.2 瓊脂2 15磅消毒 (FeSO47H2O 0.001 L-酪氨酸 0.05K2HPO40.05 (無水)NaCl 0.05)培養(yǎng)特征在恒溫室28℃培養(yǎng)2周。2.生理生化反應(yīng)所用培養(yǎng)基(g％)(1)明膠蛋白胨0.1 明膠4 葡萄糖0.4(先將水煮沸慢慢投入明膠，不斷搖至全部溶化，然后調(diào)pH，分裝小管 15磅消毒)(2)牛奶脫脂牛奶 分裝小管 巴氏消毒(3)淀粉水解可溶性淀粉1 MgCO30.1 KNO30.1 K2HPO40.03 NaCl0.05 瓊脂2 pH7.2 15磅消毒(4)黑色素反應(yīng)胰酶解胨0.5 酵母膏0.3 瓊脂2 pH 7.2 15磅消毒(5)H2SL-酪氨酸 0.1 NaCl 0.85 酵母膏 0.5 瓊脂 2 pH 7.0 15磅消毒(6)硝酸鹽還原MgSO40.05 K2HPO40.05 蔗糖 2 KNO30.1 NaCl 0.0515磅消毒溶液I 氨基苯磺酸0.5(醋酸80％+2倍水)150ml溶液II 苯胺0.1ml(α-萘胺)水20ml(7)纖維素分解MgSO40.05 K2HPO40.05 NaCl 0.05 KNO30.1 pH7.0(紙條0.8×5cm) 15磅消毒28℃恒溫培養(yǎng)，不同時間觀察。3.碳源利用培養(yǎng)基(g％)1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NH4)2SO42.64，K2HPO45.65，CuSO4.5H2O 0.0064，MnSO4.7H2O0.0079，KH2PO42.38，MgSO4.7H2O 1，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.001％，1000ml蒸餾水，瓊脂2，pH7，15磅消毒以上基礎(chǔ)液分裝中管每管5ml，分別加入1的糖(阿拉伯糖，木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖，肌醇，鼠李糖，棉籽糖，甘露醇，半乳糖，水楊苷，可溶性淀粉，糊精，甘油，對照)，28℃恒溫培養(yǎng)1-2周觀察。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤抗生素力達霉素的高產(chǎn)菌株球孢鏈霉菌C-1027-20(streptomyces globisporus C-1027-20)CGMCC No.0704.
2.球孢鏈霉菌C-1027-20在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤抗生素力達霉素高產(chǎn)菌株球孢鏈霉菌C－1027－20(streptomyces globisporus C－1027－20),它是通過對出發(fā)菌株C－1027進行自然選育,化學(xué)物理誘變,原生質(zhì)體形成,原生質(zhì)體融合等手段,并從原生質(zhì)體融合結(jié)合紫外光照射處理后的菌株中篩選出一株高效價的菌株,經(jīng)長期培養(yǎng)觀察測試,其性能穩(wěn)定,且發(fā)酵,提取產(chǎn)物明顯高于出發(fā)菌株,為進一步臨床前研究和今后的臨床治療提供了可靠保證。
文檔編號C12P21/02GK1373209SQ0211620
公開日2002年10月9日 申請日期2002年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月19日
發(fā)明者李電東, 甄永蘇, 胡繼蘭, 姚恩泰 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所, 深圳市盛康達生物技術(shù)有限公司