專利名稱：病毒載體與人腫瘤抑制基因的重組體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，更具體地說(shuō)是涉及一種由人類腫瘤抑制基因p53與腺病毒載體重組序列構(gòu)建成的重組體。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，特別是基因工程技術(shù)的發(fā)展，惡性腫瘤的基因治療成為人們研究的熱點(diǎn)。目前，全球共有600多項(xiàng)基因治療方案獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，有些治療方案已獲得了一定的療效，初步顯示了基因治療的前景。
作為可用于基因治療的各種載體，本身不具有任何治療疾病的意義、無(wú)臨床應(yīng)用價(jià)值；而作為可用于各種治療目的基因，由于導(dǎo)入靶細(xì)胞及在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的難度，只具有潛在的治療作用，而不具備實(shí)用的臨床價(jià)值。只有將具有潛在治療作用的基因與可轉(zhuǎn)移基因的載體結(jié)合，通過(guò)后者介導(dǎo)，將目的基因?qū)氚屑?xì)胞并表達(dá)，才能達(dá)到真正的臨床治療效果。因此，構(gòu)建治療基因與基因載體的融合序列是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵。
將目的基因的表達(dá)盒與載體進(jìn)行融合常用的方法是在真核細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而使用在原核細(xì)胞(大腸桿菌)中實(shí)現(xiàn)同源重組、構(gòu)建融合表達(dá)載體的新技術(shù)則可有效解決上述問(wèn)題。
缺乏特異性、靶向性及高效性的基因轉(zhuǎn)移載體一直是腫瘤基因治療的一個(gè)難題。目前，用于基因治療研究的載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。腺病毒載體是常用的基因載體，它的優(yōu)點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染效率高、可操作性好、能攜帶較大的目的基因片斷、可制備高效價(jià)的病毒顆粒，易于工業(yè)化生產(chǎn)，既能感染分裂期細(xì)胞也可感染非分裂期細(xì)胞，具有安全、致病性低等優(yōu)點(diǎn)。但也存在不足之處，一是感染缺乏特異性，二是具有免疫原性。因此，對(duì)腺病毒載體進(jìn)行存利去弊的改進(jìn)是發(fā)展基因治療的必由之路。研究表明，腺病毒載體E1或E3缺失區(qū)攜帶外源性基因時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)目的基因的較長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)，且可降低其免疫原性；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能攜帶外源性基因整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組中實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定持久的表達(dá)，但逆轉(zhuǎn)錄病毒體外繁殖滴度低、轉(zhuǎn)染效率低，只感染分裂期細(xì)胞。對(duì)染色體的隨機(jī)整合，有致癌的危險(xiǎn)性；其他可用于基因轉(zhuǎn)移的病毒載體和非病毒載體均存在不同的利弊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在將具有潛在治療作用的基因與可轉(zhuǎn)移基因的載體進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，而提供一種病毒載體與人腫瘤抑制基因的重組體，使得人類腫瘤抑制基因與病毒載體構(gòu)成融合序列，使之在基因工程改造過(guò)的特定細(xì)胞中繁殖、生產(chǎn)，并可直接在真核細(xì)胞中表達(dá)，達(dá)到預(yù)防或/和治療腫瘤的目的。
本發(fā)明的目的還在于提供該重組體的制備方法及其用于制備預(yù)防或/和治療腫瘤藥物的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種病毒載體與人腫瘤抑制基因的重組體，該重組體是將由DNA克隆技術(shù)構(gòu)建的病毒載體與人腫瘤抑制基因表達(dá)盒相結(jié)合，構(gòu)建成一個(gè)能在基因工程改造過(guò)的特定細(xì)胞中擴(kuò)增、繁殖，也能在真核細(xì)胞中表達(dá)腫瘤抑制蛋白的融合序列。
該重組體的載體可以為DNA病毒或RNA病毒的任一種，其優(yōu)選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的復(fù)合載體，最優(yōu)選載體為腺病毒載體。
所述人腫瘤抑制基因可以是具有對(duì)腫瘤抑制作用的基因中的任一種，其最優(yōu)選基因?yàn)閜53基因。
該重組體由腺病毒載體與p53基因構(gòu)建而成，定義為重組p53腺病毒體，其融合序列為腺病毒5基因組序列右側(cè)-ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA2848-腺病毒5基因組序列左側(cè)其中1.腺病毒5基因組序列右側(cè)和腺病毒5基因組序列左側(cè)見腺病毒5基因組全序列(Genbank NoNC_001406)2.1-70腺病毒右側(cè)臂(70位堿基位于腺病毒5基因組序列正向3328位)3.71-523Rous肉瘤病毒的LTR(啟動(dòng)子)4.524-6555’端非翻譯區(qū)5.656-1837p53基因的編碼序列6.1838-27333’端非翻譯區(qū)(其中從2298開始為多聚腺苷酸尾poly A)7.2734-2848腺病毒左側(cè)臂(2734位堿基位于腺病毒5基因組序列正向452位堿基)該重組體的基因表達(dá)盒是由啟動(dòng)子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸構(gòu)成的特征序列，其上游為任一真核細(xì)胞啟動(dòng)子、原核細(xì)胞啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子，下游為任何真核基因的多聚腺嘌呤核苷酸。
本發(fā)明的重組體是通過(guò)如下方法獲得的，重組病毒載體是在原核細(xì)胞中同源重組獲得的，首先是腺病毒與質(zhì)粒pGT-1(含有腺病毒兩側(cè)反向重復(fù)序列)在大腸桿菌中同源重組獲得重組體pGT-2，再與人工構(gòu)建的“腺病毒右側(cè)臂/啟動(dòng)子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸/腺病毒左側(cè)臂”在大腸桿菌中同源重組獲得重組體pGT-3，隨后經(jīng)內(nèi)切酶PacI線性化去除原核質(zhì)粒序列，獲得重組p53腺病毒體。
實(shí)質(zhì)上，該重組體可在任何原核細(xì)胞中以同源重組的方式獲得。
根據(jù)上述方案，將PCR擴(kuò)增腺病毒5兩側(cè)的LTR序列，分別引入PacI酶切位點(diǎn)。將兩側(cè)的LTR序列均克隆到pUC18載體中，構(gòu)成重組載體pGT-1；將構(gòu)建的pGT-1載體與腺病毒5基因組共轉(zhuǎn)染大腸桿菌株BJ5183(賽百諾公司保存，保存號(hào)P-e012)，使腺病毒5基因組與pGT-1發(fā)生同源重組，陽(yáng)性病毒克隆經(jīng)擴(kuò)增、PCR篩選和酶切鑒定，獲得含有腺病毒5全基因組的重組載體pGT-2。
以5′ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATC和5′ATATCTGCAGAATTCCAGCAC作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增人類腫瘤抑制因子p53基因，將擴(kuò)增的全長(zhǎng)p53基因(含有5′和3′端非翻譯區(qū)序列)克隆到原核質(zhì)粒pUC19，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。隨后，PCR分別擴(kuò)增RSV(rous sarcoma virus)的LTR序列(含啟動(dòng)子)、BGH的PA序列和腺病毒E1區(qū)序列，并于一側(cè)分別引入linker序列，測(cè)序驗(yàn)證。再次進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，將LTR和PA序列分別拼接到緊靠p53基因的5′和3′端。將腺病毒E1區(qū)及其上游序列分別拼接到p53基因的最外側(cè)，構(gòu)成p53復(fù)合基因(見圖1)。
將構(gòu)建好的重組載體pGT-2和p53復(fù)合基因共轉(zhuǎn)染大腸桿菌株BJ5183，使二者發(fā)生同源重組。同上，陽(yáng)性克隆經(jīng)擴(kuò)增、PCR篩選和酶切鑒定。獲得重組載體pGT-3，該載體中含有腺病毒5大部分序列(其E1區(qū)及上游部分序列被p53基因表達(dá)盒置換)。重組載體pGT-3經(jīng)PacI酶切線性化，去除來(lái)源于pUC18的載體序列，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(賽百諾公司凍存，保存號(hào)E-393)培養(yǎng)。在細(xì)胞內(nèi)包裝成含有腺病毒順式活化序列(cis-acting sequence)與LTR的啟動(dòng)子操縱的人腫瘤抑制基因p53。組建成轉(zhuǎn)染效率高、可操作性強(qiáng)、由單啟動(dòng)子控制的重組p53腺病毒體。
該重組p53腺病毒體具有下列特點(diǎn)它是由腺病毒載體和p53基因人工表達(dá)盒兩部分構(gòu)成，1、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)其本質(zhì)是一個(gè)活的重組腺病毒體，不同于現(xiàn)有的化學(xué)合成藥物、中藥、基因工程藥物，是直接實(shí)現(xiàn)目的基因的體內(nèi)表達(dá)，生物學(xué)活性高，可有效達(dá)到治療作用；腺病毒載體能攜帶較大的基因、轉(zhuǎn)染率高、可制備高效價(jià)的病毒顆粒，宿主范圍廣，安全性好，致病性低，尤其是經(jīng)改建后的腺病毒載體免疫原性大大下降，使目的基因易于在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定、持久表達(dá)；p53基因人工表達(dá)盒是用腺病毒載體單啟動(dòng)子直接調(diào)控p53基因的表達(dá)，且有完整的多聚腺苷酸加尾信號(hào)，從而構(gòu)成一個(gè)完整的表達(dá)盒(expression cassette)，可調(diào)控p53基因在靶細(xì)胞中高效表達(dá)。
2、應(yīng)用特點(diǎn)該重組p53腺病毒體為廣譜抗瘤藥，具有對(duì)各種惡性腫瘤的治療作用。II期臨床實(shí)驗(yàn)顯示，該重組p53腺病毒體對(duì)頭頸部鱗癌、肺癌等十多種腫瘤具有明顯的治療作用；該重組p53腺病毒體具有預(yù)防腫瘤發(fā)生的獨(dú)特作用。I期臨床試驗(yàn)及術(shù)后3年隨訪表明，該重組p53腺病毒體可預(yù)防喉癌等腫瘤病人的術(shù)后復(fù)發(fā)，起到腫瘤疫苗的作用。
利用本發(fā)明的重組p53腺病毒體可制備治療各種惡性腫瘤的藥物，并可制備預(yù)防腫瘤的發(fā)生和手術(shù)切除后的腫瘤再生的藥物。
本發(fā)明的重組p53腺病毒體還可用于制備進(jìn)行靜脈注射、動(dòng)脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水內(nèi)注射的藥物。
本發(fā)明利用所制備的重組p53腺病毒體，先轉(zhuǎn)染到基因工程改造過(guò)的特定細(xì)胞中培養(yǎng)、繁殖，濃縮純化成可用于臨床的重組腺病毒p53抗癌注射液。
其中本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所用的293細(xì)胞系(ATCC CRL-1573，第32代次，1997年6月13日從ATCC訂購(gòu))來(lái)源于經(jīng)5型腺病毒(Ad5)DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎上皮細(xì)胞獲得，含有Ad5 5′端的11％的基因組(包括E1a)。該細(xì)胞對(duì)腺病毒的感染和生長(zhǎng)是高度許可的。
應(yīng)用該重組p53腺病毒體對(duì)12例中、晚期喉癌病人進(jìn)行里I期臨床實(shí)驗(yàn)，治療后并隨訪31-36個(gè)月。結(jié)果顯示，該重組p53腺病毒體使用安全，全部12例病人無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)。目前，臨床上中晚期喉癌病人3年生存期只有44％，手術(shù)后6-12個(gè)月的復(fù)發(fā)率約20％。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該重組p53腺病毒體具有治療和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的雙重作用。從2001年開始進(jìn)行II期臨床實(shí)驗(yàn)，已顯示良好的治療作用。實(shí)施例附圖9至13的結(jié)果顯示，一些對(duì)常規(guī)治療方法(化療和放療)無(wú)效的病人，使用本發(fā)明的重組p53腺病毒體仍具有良好的治療作用。
本發(fā)明的貢獻(xiàn)在于，它利用人類腫瘤抑制基因p53能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，將其克隆到腺病毒E1-株，通過(guò)瘤體注射，使腺病毒有效地將p53基因?qū)肽[瘤組織，表達(dá)出P53蛋白后，抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯或凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的。該發(fā)明同時(shí)也解決了由于P53蛋白半衰期短(約20分鐘)、不穩(wěn)定、無(wú)法體外制備成為重組基因工程產(chǎn)品的問(wèn)題，即實(shí)現(xiàn)了p53基因的腫瘤治療。
該重組p53腺病毒體利用腺病毒攜帶人類腫瘤抑制基因p53，直接在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，從而解決了由于P53蛋白不穩(wěn)定、無(wú)法用基因工程的方法體外制備成重組基因工程產(chǎn)品的問(wèn)題。用腺病毒以及腺相關(guān)病毒進(jìn)行癌癥治療，病人可在體內(nèi)持續(xù)、高效表達(dá)P53蛋白，并在蛋白質(zhì)分子修飾程序上，如蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)折疊以及多聚化等方面都具有與體內(nèi)真核生物相同的特性。本發(fā)明的重組p53腺病毒體可直接介導(dǎo)p53基因在真核細(xì)胞中表達(dá)，也就是說(shuō)可以直接導(dǎo)入實(shí)體瘤部位讓其表達(dá)，使受治療者自身變成一個(gè)可生產(chǎn)人類腫瘤抑制因子P53蛋白的“源泉”。這種方法實(shí)現(xiàn)將外源p53基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移并在病人瘤體內(nèi)高效表達(dá)而達(dá)到治療目的，使得腫瘤及其它疾病的基因治療成為現(xiàn)實(shí)。


圖1是本發(fā)明的重組p53腺病毒體的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
圖2是本發(fā)明的重組p53腺病毒體的技術(shù)路線框圖。
圖3是重組p53腺病毒體經(jīng)多次傳代后，以5′CCACGACGGTGACA CGCTTC和5′CAAGCAAGGGTTCAAAGAC為引物，以p53cDNA為模版，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的p53基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，以鑒定其穩(wěn)定性。
圖4是重組p53腺病毒體(賽百諾公司凍存，保存號(hào)No-1，下同)感染293細(xì)胞后36小時(shí)，經(jīng)細(xì)胞裂解、提取病毒DNA經(jīng)PCR鑒定的瓊脂糖凝膠分析結(jié)果。
圖5是重組p53腺病毒體感染293細(xì)胞后36小時(shí)，經(jīng)細(xì)胞裂解、提取后經(jīng)Western blot分析結(jié)果。
圖6是重組p53腺病毒體不同劑量對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷效應(yīng)的曲線示意圖。
圖7是重組p53腺病毒體對(duì)Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的曲線示意圖。
圖8是重組p53腺病毒體感染Hep-2細(xì)胞36小時(shí)后的光鏡照片。
圖9是重組p53腺病毒體對(duì)臨床鼻咽癌病人治療作用(II期臨床)的CT照片。
圖10是重組p53腺病毒體對(duì)臨床肺癌病人治療作用(II期臨床)的CT照片。
圖11是重組p53腺病毒體對(duì)臨床甲狀腺癌病人治療作用(II期臨床)的CT照片。
圖12是重組p53腺病毒體對(duì)臨床宮頸癌病人治療作用(II期臨床)的CT照片。
圖13是重組p53腺病毒體對(duì)臨床食道癌病人治療作用(II期臨床)的CT照片。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步解釋和說(shuō)明，對(duì)本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1如圖1和圖2所示，構(gòu)建重組p53腺病毒體及鑒定
1、已發(fā)表的p53基因cDNA全序列，設(shè)計(jì)合成兩段引物5′ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATC和5′ATATCTGCAGAATTCCAGCAC作為引物，兩端分別引入linker序列。以HeLa細(xì)胞cDNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增得到人p53基因，其中，反應(yīng)條件為第一循環(huán)94℃變性4分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘；以后各循環(huán)94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。由此得到大量的p53基因，用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收得到p53基因全長(zhǎng)，片段純化后再用此酶切割p53基因，插入到同樣酶切的pUC19載體中測(cè)序，測(cè)得編碼區(qū)的堿基序列和和推導(dǎo)的氨基酸序列(與GenBank Acc XM_058834一致)，隨后酶切回收。
2、PCR反應(yīng)擴(kuò)增LTR和PA序列，引物分別為5′TCTGACATGCGATGTCGACTCG，5′CGGCAGTGACCCGGAAAGCAG；5′TCACAGAGTGCATTGTGAGGG，5′GCTCTAGCGTGGGGATCCC。分別于5′引物和3′端引物引入linker序列。同上的退火條件下，PCR擴(kuò)增LTR和PA序列，純化后克隆測(cè)序驗(yàn)證。
3、PCR反應(yīng)分開擴(kuò)增腺病毒的E1序列，反應(yīng)條件同上，兩端引物分別引入Bam HI和Eco RI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證。
4、將1所得序列分別與2所得的兩條序列進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同前，得到PCR拼接產(chǎn)物L(fēng)TR-p53-PA，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。
5、將3所得序列與4所得序列LTR-p53-PA經(jīng)T4 DNA粘接酶粘接，獲得p53復(fù)合基因。
6、PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增腺病毒兩端IRT序列，反應(yīng)條件同上，測(cè)序驗(yàn)證后分別將兩段序列克隆到pUC18載體中構(gòu)成重組載體pGT-1。
7、提取野生型腺病毒5(ATCC-VR-5，腺病毒株75，滴度10(6.75)TCID(50)/ml)DNA，與重組載體pGT-1共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183，經(jīng)4℃孵育30分鐘，42℃熱休克50秒鐘，再在4℃孵育1分鐘，加1ml LB培養(yǎng)液1小時(shí)，將溫育的工程菌轉(zhuǎn)入含安卞青霉素的瓊脂培養(yǎng)板，24小時(shí)后，用滅菌牙簽挑取單個(gè)細(xì)菌克隆，然后放入干凈的含有LB的培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)后，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，用PacI切割篩選，獲得陽(yáng)性克隆為pGT-2(含有Ad5全序列)。
8、將p53復(fù)合基因與重組載體pGT-2共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183，同上方法培養(yǎng)，篩選和鑒定，獲得陽(yáng)性克隆pGT-3，含有腺病毒全基因組序列及插入的p53基因表達(dá)盒，再用PacI酶切，使之線性化，去除來(lái)源于pUC18的載體序列。
9、將分離的陽(yáng)性質(zhì)粒線性化后經(jīng)CsCl2純化，經(jīng)CaCl2方法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。7天后，收集細(xì)胞，1000rpm離心15分鐘，棄上清，細(xì)胞經(jīng)37℃-80℃凍融，裂解三次，4000rpm離心30分鐘，取上清，棄沉淀，上清經(jīng)二次感染，擴(kuò)增病毒，以同樣方法裂解病毒，上清經(jīng)CsCl2密度梯度離心，條件為4℃60000rpm，16小時(shí)。經(jīng)7號(hào)注射針頭取重組腺病毒體分離帶。用SpectraMW6000透析袋在N1H緩沖液中透析4小時(shí)，整個(gè)過(guò)程保持4℃。取出病毒液，用0.25μm的濾膜過(guò)濾除菌，分裝。于-80℃保存，一部分作空斑形成試驗(yàn)及病毒顆粒含量測(cè)定。
10、重組p53腺病毒體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性鑒定，經(jīng)多次傳代后，提取其基因組DNA，以p53基因兩端5′CCACGACGGTGACACGCTTC和5′CAAGCAAGGGTTCAAAGAC為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3；以重組p53腺病毒體表達(dá)裝置兩側(cè)的腺病毒臂5′TTT CTC AGG TGT TTT CCG C和5′CATCGT ACC TCA GCA CCT TC為引物，PCR鑒定結(jié)果見圖4。以上結(jié)果均表明重組p53腺病毒體經(jīng)多次傳代后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
12、重組p53腺病毒體介導(dǎo)的p53基因在Hep-2和H1299細(xì)胞的表達(dá)鑒定。用重組p53腺病毒體感染293細(xì)胞36小時(shí)后，常規(guī)方法裂解細(xì)胞，以P53蛋白特異性抗體進(jìn)行western blot分析，結(jié)果見圖5。
13、重組p53腺病毒體對(duì)Hep-2細(xì)胞作用的時(shí)間與劑量關(guān)系。重組p53腺病毒體感染Hep-2細(xì)胞36小時(shí)后，分別研究其不同劑量和不同作用時(shí)間對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷作用。以苔酚藍(lán)染色記數(shù)死亡細(xì)胞數(shù)，結(jié)果見圖6和圖7。
實(shí)施例2重組p53腺病毒體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用將重組p53基因腺病毒常規(guī)方法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞。各組細(xì)胞數(shù)相同，實(shí)驗(yàn)分以下各組1.空白對(duì)照；2.MOI 200；3.MOI 150；4.MOI 100；5.MOI 50；6.MOI 10。7.GFP virus MOI 200；8.GFP virus MOI 150。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)，光鏡觀察，可見在MOI＞50時(shí)，均可見到重組p53腺病毒體對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷作用，且隨著劑量的增加殺傷作用更加明顯。光鏡觀察細(xì)胞出現(xiàn)明顯的固縮變小等凋亡表現(xiàn)，如圖8所示。
實(shí)施例3重組p53腺病毒體的臨床治療作用(鼻咽癌)如圖9所示，重組p53腺病毒體在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局指定的醫(yī)院進(jìn)行II期臨床實(shí)驗(yàn)(下同)，圖9顯示為一位鼻咽癌患者在接受重組重組p53腺病毒體治療前后的CT照片，左圖為治療前的癌腫塊，右圖為接受治療后(腫塊縮小87％，伴瘤內(nèi)出現(xiàn)壞死)。目前已有超過(guò)60例患者接受了II期臨床實(shí)驗(yàn)，療效確鑿。
實(shí)施例4重組p53腺病毒體的臨床治療作用(肺癌)如圖10所示，II期臨床實(shí)驗(yàn)。重組p53腺病毒體在II期臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)肺癌的治療作用。女性左肺腺癌患者、左胸腔積液，伴肝轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移。經(jīng)多次抽液和化療后，胸腔中仍有大量積液出現(xiàn)。病人接受胸腔內(nèi)注射重組p53腺病毒體一個(gè)月后，胸腔內(nèi)積液完全消失。
實(shí)施例5重組p53腺病毒體的臨床治療作用(甲狀腺癌)如圖11所示，II期臨床實(shí)驗(yàn)。重組p53腺病毒體在II期臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)甲狀腺癌的治療作用。女性甲狀腺癌患者，術(shù)后1年局部復(fù)發(fā)，右上頸淋巴轉(zhuǎn)移，病理診斷為低分化鱗癌，經(jīng)放療-化療-熱療聯(lián)合治療1個(gè)年后無(wú)效，頸前腫瘤壓迫氣管，呼吸困難。隨后接受重組p53腺病毒體的治療，共注射8次，腫塊明顯縮小(縮小48％)。
實(shí)施例6重組p53腺病毒體的臨床治療作用(宮頸癌)如圖12所示，II期臨床實(shí)驗(yàn)。重組p53腺病毒體在II期臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)宮頸癌的治療作用。宮頸癌患者，病理診斷為鱗癌。接受重組p53腺病毒體的治療(共注射8次)后，腫塊明顯縮小(約91％，)，三個(gè)月后復(fù)查，腫塊完全消失。
實(shí)施例7重組p53腺病毒體的臨床治療作用(食道癌轉(zhuǎn)移)如圖13所示，II期臨床實(shí)驗(yàn)。重組p53腺病毒體在II期臨床實(shí)驗(yàn)中對(duì)食道癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療作用。食道癌左鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，病理診斷為鱗癌。經(jīng)放療后無(wú)效，接受重組p53腺病毒體的治療后，共注射8次，腫塊明顯縮小(縮小29％，)。
權(quán)利要求
1.一種病毒載體與人腫瘤抑制基因的重組體，其特征在于，該重組體是由DNA克隆技術(shù)構(gòu)建的病毒載體與人腫瘤抑制基因表達(dá)盒相結(jié)合，構(gòu)建成一個(gè)能在基因工程改造過(guò)的特定細(xì)胞中擴(kuò)增、繁殖，也能在真核細(xì)胞中表達(dá)腫瘤抑制蛋白的融合序列。
2.如權(quán)利要求1所述的重組體，其特征在于，該重組體的載體可以為DNA病毒或RNA病毒的任一種。
3.如權(quán)利要求2所述的重組體，其特征在于，該重組體的載體是腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的復(fù)合載體。
4.如權(quán)利要求1所述的重組體，其特征在于，所述人腫瘤抑制基因可以是具有對(duì)腫瘤抑制作用的基因中的任一種。
5.如權(quán)利要求4所述的重組體，其特征在于，所述人腫瘤抑制基因?yàn)閜53基因。
6.如權(quán)利要求1所述的重組體，其特征在于，它是由腺病毒載體與p53基因構(gòu)建而成，其融合序列為腺病毒5基因組序列右側(cè)-ATGTTTACCGCCACACTCGCAGGGTCTGCACCTGGTGCGGGTCTCATCGTACCTCAGCACCTTCCAGATC70TCTGACATGCGATGTCGACTCGACTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCG523CTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCTTTCCGGGTCACTGCC655ATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGA1837CATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGATTTGCCCTACCTCGGAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTT2297AATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGCGGGATCCACTAGTAACGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGATCCCCACGCTAGAGCT2733GACTATAATAATAAAACGCCAACTTTGACCCGGAACGCGGAAAACACCTGAGAAAAACACCTGGGCGAGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTCCCCGCGGCCCTAGACAAATATTA2848-腺病毒5基因組序列左側(cè)其中1)腺病毒5基因組序列右側(cè)和腺病毒5基因組序列左側(cè)見腺病毒5基因組全序列(Genbank NoNC_001406)2)1-70腺病毒右側(cè)臂(70位堿基位于腺病毒5基因組序列正向3328位)3)71-523Rous肉瘤病毒的LTR(啟動(dòng)子)4)524-6555’端非翻譯區(qū)5)656-1837p53基因的編碼序列6)1838-27333’端非翻譯區(qū)(其中從2298開始為多聚腺苷酸尾poly A)7)2734-2848腺病毒左側(cè)臂(2734位堿基位于腺病毒5基因組序列正向452位堿基)
7.如權(quán)利要求1所述的重組體，其特征在于，該重組體的基因表達(dá)盒是由啟動(dòng)子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸構(gòu)成的特征序列。
8.如權(quán)利要求7所述的重組體，其特征在于，所述基因表達(dá)盒的上游為任一真核細(xì)胞啟動(dòng)子、原核細(xì)胞啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子，下游為任何真核基因的多聚腺嘌呤核苷酸。
9.如權(quán)利要求1所述的重組體，其特征在于，該重組體是在原核細(xì)胞中同源重組獲得的，首先是腺病毒與質(zhì)粒pGT-1(含有腺病毒兩側(cè)反向重復(fù)序列)在大腸桿菌中同源重組獲得重組體pGT-2，再與人工構(gòu)建的“腺病毒右側(cè)臂/啟動(dòng)子-p53cDNA-多聚腺嘌呤核苷酸/腺病毒左側(cè)臂”在大腸桿菌中同源重組獲得重組體pGT-3，隨后經(jīng)內(nèi)切酶PacI線性化去除原核質(zhì)粒序列，獲得重組p53腺病毒體。
10.如權(quán)利要求9所述的重組體，其特征在于，該重組體在任何原核細(xì)胞中以同源重組的方式獲得。
11.如權(quán)利要求1所述的重組體用于制備治療各種惡性腫瘤的藥物。
12.如權(quán)利要求1所述的重組體用于制備預(yù)防腫瘤的發(fā)生和手術(shù)切除后的腫瘤再生的藥物。
13.如權(quán)利要求1所述的重組體用于制備進(jìn)行靜脈注射、動(dòng)脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、器官注射和胸、腹水內(nèi)注射的藥物。
全文摘要
一種病毒載體與人腫瘤抑制基因的重組體及其應(yīng)用，該重組體是將由DNA克隆技術(shù)構(gòu)建的病毒載體與人腫瘤抑制基因表達(dá)盒相結(jié)合，構(gòu)建成一個(gè)能在基因工程改造過(guò)的特定細(xì)胞中擴(kuò)增、繁殖，也能在真核細(xì)胞中表達(dá)腫瘤抑制蛋白的融合序列。本發(fā)明將腺病毒載體與人p53基因在原核細(xì)胞(E.coli)中同源重組，獲得腺病毒載體與人p53基因表達(dá)盒構(gòu)建的重組p53腺病毒體。其人p53基因表達(dá)盒是由啟動(dòng)子－p53cDNA－多聚腺嘌呤核苷酸構(gòu)成的特征序列。使用本發(fā)明的重組p53腺病毒體，可制備成臨床級(jí)基因治療制品，用于治療和預(yù)防人類各種惡性腫瘤。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1401778SQ02115228
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月8日
發(fā)明者彭朝暉, 張曉志 申請(qǐng)人:彭朝暉, 張曉志