專利名稱：只生育單一性別后代的哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明通常涉及生產(chǎn)單一性別后代的方法。同過去別人使用的乏味的分離精子的方法相比，本發(fā)明中的方法是通過對生殖系進(jìn)行遺傳修飾來實(shí)現(xiàn)的。因此，生育單一類型子代的特性就可以遺傳給后代。這項(xiàng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)，特別在牛肉和豬肉產(chǎn)業(yè)中有特殊的用途。
2.技術(shù)背景此處所有的出版物和專利申請都在同等程度上被引用，似乎每一篇出版物和專利申請都是具體并單獨(dú)地被引用的。
通過識別性染色體，雄性和雌性哺乳動(dòng)物在遺傳上是可區(qū)別的。正常雌性哺乳動(dòng)物含有兩條X染色體，而正常雄性則含有一條X和一條Y。由于在交配中，雌性哺乳動(dòng)物只貢獻(xiàn)X染色體，因此是雄性配子決定了后代的性別。在正常情況下，由于哺乳動(dòng)物的精液中含X染色體的精子和含Y染色體的精子的數(shù)目大致相等，因此用正常交配技術(shù)產(chǎn)生雄性或雌性子代的幾率十分接近于50％。
在過去的幾十年中，改變產(chǎn)生特定性別后代的概率的能力已經(jīng)成為眾多興趣關(guān)注的主題。在人類的生育中，減少性連鎖疾病發(fā)生的愿望在一定程度上加強(qiáng)了這種興趣。例如，由于雄性只接受一條X染色體，因此有幾百種X連鎖的疾病在雄性身上典型地顯現(xiàn)出來，如血友病和萊-尼綜合癥。通過增加產(chǎn)生雌性的概率，夫婦能夠避免生育顯示此類疾病的男孩。
在農(nóng)業(yè)中，預(yù)先決定牲畜性別的能力具有改進(jìn)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)和管理的潛力。根據(jù)產(chǎn)業(yè)特定部門的不同，大多數(shù)畜牧場主對不同性別的動(dòng)物有不同的喜好。例如，雄性小牛對牛奶場主來說，基本上沒有用處。另一方面，肉牛場主則偏愛雄性小牛，因?yàn)樾坌孕∨Ｍ鼈兊拇菩酝橄啾?，長得更快，而且能更有效的增加體重。養(yǎng)豬場主喜歡用母豬做的熏肉，而不喜歡用公豬做的。家禽場主喜歡選擇母雞而不是公雞。
用多種方式機(jī)械分選精子的方法已經(jīng)存在一段時(shí)間了，這導(dǎo)致了精液制劑的商業(yè)銷售，這種精液制劑可以用在人工授精中以影響子代的性別。美國專利號5,439,362和5,840,504提供了對多種機(jī)械方法的評論，并且在此以參考文獻(xiàn)形式引用。這些方法包括基于精子特性的技術(shù)，例如尺寸，頭部形狀，質(zhì)量，表面性質(zhì)，表面大分子，DNA含量，泳動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)性(見Windsor等人寫的評論，1993，Reprod.Fert.Dev.5155)。例如，有人試圖根據(jù)膜抗原外形潛在的差別，用免疫學(xué)方法來分離精子(如美國專利號5,439,362)。最近更多的方法集中在精子的分選技術(shù)上，借此精子細(xì)胞用一種熒光染料處理，接著根據(jù)攜帶X染色體的精子較高的DNA含量、因此具有較高的熒光而用流式細(xì)胞儀分選(Johnson，1996，Genderpreselectioninmammalsanoverview，DTW103(8-9)288-291)。
但是，機(jī)械分離的方法乏味而且并不完全準(zhǔn)確。尤其對于精子分選技術(shù)而言，不能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量精子將使這些精子在人工授精方法中的使用復(fù)雜化。而且，已經(jīng)有人爭辯說DNA的標(biāo)記會(huì)造成潛在的遺傳損傷。另外，機(jī)械化的精子分選技術(shù)不能通過單獨(dú)繁殖的單一性別動(dòng)物系中將特定性狀遺傳下去，那些希望操縱動(dòng)物后代性別的農(nóng)場主必需為每次授精購買精子。
胚胎分離技術(shù)是最成功的，借此將胚胎從母體中取出，對一些細(xì)胞進(jìn)行活組織檢查，接著用PCR擴(kuò)增去分析性染色體特異的DNA。然而，這種方法十分乏味，需要廣泛的訓(xùn)練，昂貴的設(shè)備以及需要移植胚胎的受體雌性動(dòng)物。因此，這項(xiàng)技術(shù)很少使用。
對生殖系進(jìn)行遺傳修飾以使其偏向于生育某一特定性別后代的報(bào)道很少。美國專利號5,596,089報(bào)道了一種操縱哺乳動(dòng)物性別表型的方法，該方法利用SRY啟動(dòng)子(從Y染色體編碼的睪丸決定因子而來)在胚胎發(fā)育中啟動(dòng)白喉毒素基因在雄性生殖組織中的轉(zhuǎn)錄。這個(gè)基因用Cre-Lox系統(tǒng)來控制和激活。但是，由于用這種處理產(chǎn)生的雌性后代在遺傳上仍是雄性的(XY)，因此這種方法只能操縱性別的表型。
Bruton等人在美國專利號5,223,610中建議，制作能在精子細(xì)胞中表達(dá)非致死的調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可能成為一種檢驗(yàn)治療法對精子受精力的影響的方法。盡管精子發(fā)生中的某些變化是意料中的結(jié)果，Bruton等人并沒有建議這種方法也可以用來操縱由此產(chǎn)生的后代的性別。
本發(fā)明提供了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。第一，在本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制造出來之后，不需要進(jìn)一步的技術(shù)即可生產(chǎn)特定性別的子代。能產(chǎn)生單一性別子代的雄性動(dòng)物可以應(yīng)用在正常的多方交配或人工授精方法中。而且，當(dāng)雄性轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物被用來產(chǎn)生單一性別的子代時(shí)，遺傳修飾不會(huì)傳遞給后代，發(fā)明的專利性質(zhì)就得到了保護(hù)。一旦發(fā)展了這種遺傳修飾，就可以通過克隆技術(shù)或者甚至是通過使用載體雌性動(dòng)物的自然育種技術(shù)以相對低的成本來繁殖。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)動(dòng)物的方法，這些動(dòng)物具有經(jīng)過改變的生育某一特定性別子代的傾向性，本發(fā)明涉及的特別是那些生產(chǎn)具有此類傾向性的哺乳動(dòng)物的方法。這些方法涉及對異配性別(帶有兩條不同的性染色體從而決定子代性別的性別)進(jìn)行遺傳修飾，以使經(jīng)遺傳修飾過的配子帶上標(biāo)記或者失活。這些哺乳動(dòng)物，同時(shí)也是本發(fā)明的對象，將會(huì)生育單一性別的子代。
同時(shí)也包含那些對同配性別動(dòng)物進(jìn)行遺傳修飾的方法，這些遺傳修飾使得這些動(dòng)物的異形配子的子代能生育單一性別的后代。這些經(jīng)過遺傳修飾的同配性別的動(dòng)物，同時(shí)也是本發(fā)明的對象，提供了一種通過育種技術(shù)來繁殖生育單一性別性狀的方法。這些育種技術(shù)也是本發(fā)明的對象。同時(shí)也包含用來完成此處所述方法的遺傳構(gòu)建體和工具。
5.發(fā)明詳述定義除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都和本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所共同理解的具有相同的含義。盡管任何同此處所述的那些相似或等同的方法和材料都可以用在本發(fā)明的實(shí)施或檢驗(yàn)中，此處還是描述了優(yōu)選的方法和材料。為本發(fā)明的用途，對下面的術(shù)語進(jìn)行了定義。
如此處所用的，異配性別的意思是含有兩條不同的性染色體，即一條X染色體和一條Y染色體，因此表明這樣的動(dòng)物將決定子代的性別。在哺乳動(dòng)物中，異配性別是雄性，而在鳥類中，則是雌性。同配性別意味著含有兩條相同的染色體，即含有兩條X染色體的遺傳上正常的雌性哺乳動(dòng)物。
發(fā)明描述本發(fā)明包含一種生產(chǎn)動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物的方法，其中這種動(dòng)物具有經(jīng)過改變的生育某一特定性別后代的傾向性。術(shù)語“后代”指直系子代或后代，即子代的子代，由所生產(chǎn)的動(dòng)物的性別決定。
這些方法通過將核酸構(gòu)建體引入所述動(dòng)物生殖系的至少一條性染色體上來實(shí)現(xiàn)，其中核酸構(gòu)建體編碼一種能在減數(shù)分裂后在發(fā)育著的精子細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)用來改變由所述正在發(fā)育的精子細(xì)胞產(chǎn)生的精子的受精力，以使所生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物具有經(jīng)過改變的生育某一特定性別后代的傾向性。
這些方法也可以用來生產(chǎn)異配性別和同配性別的動(dòng)物。例如，當(dāng)用這些方法生產(chǎn)在一條性染色體上帶有轉(zhuǎn)基因并且是異配性別的產(chǎn)精子動(dòng)物時(shí)，減數(shù)分裂后攜帶轉(zhuǎn)基因的配子就具有了經(jīng)過改變的受精力，即完成與卵細(xì)胞受精的能力發(fā)生了改變。因此這些動(dòng)物在第一代中就具有一種非自然的生育某一特定性別子代的概率，這種概率依賴于轉(zhuǎn)基因的性質(zhì)以及表達(dá)轉(zhuǎn)基因的精子失活的程度。
當(dāng)這些方法生產(chǎn)同配性別的產(chǎn)卵細(xì)胞動(dòng)物時(shí)，在第一代中生育某一特定性別子代的概率不會(huì)受到影響，因?yàn)檫@種動(dòng)物不產(chǎn)生精子。因此，如果轉(zhuǎn)基因位于兩條性染色體的其中一條上，依賴自然概率它就會(huì)傳遞給大約一半的子代，無論是雄性還是雌性。如果轉(zhuǎn)基因位于兩條性染色體上，所有的子代都會(huì)得到轉(zhuǎn)基因。但是，如果轉(zhuǎn)基因是用來影響精子受精力的，那么產(chǎn)卵細(xì)胞哺乳動(dòng)物的第一代子代生育某一特定性別后代的概率就不會(huì)改變。
從產(chǎn)卵細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因親本中得到轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)卵細(xì)胞者將攜帶這一轉(zhuǎn)基因，但是由于它們不產(chǎn)生精子，它們的直系子代不會(huì)受到影響。但是那些得到轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)精子的異配性別動(dòng)物將基本上生育單一性別的后代，這種程度由任何在減數(shù)分裂后得到含有轉(zhuǎn)基因的染色體的精子失活來決定。由于產(chǎn)卵細(xì)胞的同配性別的動(dòng)物具有無限制攜帶轉(zhuǎn)基因的能力，因此當(dāng)轉(zhuǎn)基因?qū)胪湫詣e動(dòng)物系中時(shí)，任何后續(xù)代中的產(chǎn)精子者都可能受到影響。
本發(fā)明中的方法基本上是通過在動(dòng)物的生殖系中引入轉(zhuǎn)基因來實(shí)現(xiàn)的，憑借此方法就可以產(chǎn)生生育某一特定性別后代的傾向性被改變的動(dòng)物。因此，任何適于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法都可能用到。特別優(yōu)選的方法包括核移植技術(shù)，在此處引用的美國專利號5,945,577以及共同未決的專利申請系列號.08/888,057和08/888,283中有詳細(xì)描述。當(dāng)然，一旦通過在動(dòng)物生殖系中引入轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生了合適的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，那么本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可以用自然育種技術(shù)來生產(chǎn)。
轉(zhuǎn)基因的表達(dá)最好只是令精子失活，如減少它的運(yùn)動(dòng)力或者受精力，而不是殺死精子。這就意味著本發(fā)明中的方法可以通過對雌性供體卵細(xì)胞進(jìn)行胞質(zhì)內(nèi)精子注射來實(shí)現(xiàn)。通過這種方法，同配性別的雌性載體系可以用體外技術(shù)再生，這種再生還需要來自攜帶轉(zhuǎn)基因X染色體的雄性動(dòng)物的精子。同樣的，只生育雌性后代的異配性別的雄性動(dòng)物可以從攜帶轉(zhuǎn)基因Y染色體的雄性精子中產(chǎn)生。但是，由于本發(fā)明中的動(dòng)物可以用核移植技術(shù)或其它遺傳技術(shù)很容易的產(chǎn)生，因此在表達(dá)時(shí)對精子有毒理作用的轉(zhuǎn)基因也可以使用。
為了達(dá)到轉(zhuǎn)基因在發(fā)育著的精子細(xì)胞中的特異表達(dá)，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以由精子特異性的序列來控制。這樣的控制序列可以通過轉(zhuǎn)錄或翻譯控制機(jī)制來影響其在精子中的特異表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，控制序列是一種精子細(xì)胞特異基因的啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子只在減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞中特異性的影響轉(zhuǎn)錄。許多這類啟動(dòng)子已經(jīng)確認(rèn)，任何一種都可以用來影響減數(shù)分裂后精子中轉(zhuǎn)基因的特異性表達(dá)。尤其是，精子特異性的控制序列包括魚精蛋白基因1或2的啟動(dòng)子。
術(shù)語“經(jīng)過改變的受精力”或者“經(jīng)過改變的生育某一特定性別后代的傾向性”基本上指的是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)以某種方式影響了正在發(fā)育的轉(zhuǎn)基因精子細(xì)胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因精子細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因的同類相比，具有不同的授精能力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使含有轉(zhuǎn)基因染色體的精子失活，從而使非轉(zhuǎn)基因的精子在受精過程中具有競爭優(yōu)勢來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。但是，轉(zhuǎn)基因本身提供競爭優(yōu)勢即改善精子運(yùn)動(dòng)力的實(shí)施方案也是可行的。
對于那些編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因來說，它們所編碼的蛋白質(zhì)應(yīng)該具有以下特征(1)不能通過精子細(xì)胞之間的胞質(zhì)連接，因此就定位在含有轉(zhuǎn)基因染色體的精子細(xì)胞中；(2)能使含有轉(zhuǎn)基因染色體的精子細(xì)胞失活，帶上標(biāo)記或者增加受精力。關(guān)于轉(zhuǎn)基因的單倍體表達(dá)，有人爭辯說在精子生成過程中精子細(xì)胞通過胞質(zhì)橋共享基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)錄物，從而使配子在發(fā)育的減數(shù)分裂后階段呈現(xiàn)出表型上的雙倍性。但是，一些研究表明并不總是這樣的(如Zhang和Martin-Deleon，1997，Mol.Repro.Dev.46252-257)。事實(shí)上，已經(jīng)有人提出，一些基因轉(zhuǎn)錄物從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運(yùn)出來之后，立刻就結(jié)合在細(xì)胞膜上或者穩(wěn)固地定位下來，如同那些編碼細(xì)胞骨架蛋白的轉(zhuǎn)錄物一樣，從而不會(huì)被互相聯(lián)結(jié)的精子細(xì)胞所共享(Caldwell和Handel，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA882407-2411)。也有許多報(bào)道指出，轉(zhuǎn)錄物儲(chǔ)存在非多核糖體的核糖核蛋白(RNP)顆粒中(Burmester和Hoyer-Fender，1996，Mol.Repro.Dev.4510-20；Sommerville和Ladomery，1996，Chromosoma104469-478)，或者諸如擬染色體(CB)之類的細(xì)胞器中(Biggiogera等人，1990，Mol.Repro.Dev.26150-158)，進(jìn)一步提示這些轉(zhuǎn)錄物并不能輕易的在精子細(xì)胞之間通行。
但是，即使轉(zhuǎn)錄物能在精子細(xì)胞之間共享，控制或使精子的受精力偏向于生成某一性別的選擇還是能夠通過遺傳機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。例如，某些自主的自在因子被認(rèn)為能夠通過轉(zhuǎn)錄物共享來影響精子的受精力和正在發(fā)育的精子細(xì)胞的不平衡狀態(tài)(如鼠的t等位基因，參見Miller的評論，1997，Mol.HumanRepro.3(8)669-676)。有人提出，這類自在因子編碼了能通過胞質(zhì)橋自由擴(kuò)散的轉(zhuǎn)錄物或基因產(chǎn)物，從而使攜帶野生型等位基因的精子細(xì)胞失活，但卻使得到這類因子的精子細(xì)胞產(chǎn)生對失活作用的免疫力。例如，將這樣的一個(gè)因子插入Y染色體，預(yù)計(jì)可以有多種交配情況。例如，在Y染色體上攜帶自在因子的雄性就可以和兩條X染色體上都攜帶有野生型等位基因的雌性交配了。這種交配對只能產(chǎn)生雄性后代。
如果確實(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物，還是有可能用調(diào)節(jié)序列將轉(zhuǎn)錄物錨定在含有X或Y染色體的精子細(xì)胞中的。例如，本發(fā)明中所用的啟動(dòng)子可以是雜合啟動(dòng)子，它們由來自不同的精子特異性控制序列的序列設(shè)計(jì)成。特別是，已經(jīng)表明在小鼠魚精蛋白2mRNA的3’非翻譯區(qū)連接上一種磷蛋白，就會(huì)抑制mRNA的翻譯直至精子生成過程的較遲階段，據(jù)推測可能在調(diào)節(jié)蛋白去磷酸化之后(Fajardo等人，1995，Dev.Biol.，1994，166643-653)。有人針對其它的精子特異性基因提出了一種相似的調(diào)節(jié)方式(Kwon和Hecht，1993，Mol.Cell.Biol.13(10)6547-6557)。因此，通過確保本發(fā)明的構(gòu)建體含有合適的3’端非翻譯區(qū)域，就有可能用蛋白質(zhì)相互作用將轉(zhuǎn)錄物錨定在單倍體精子細(xì)胞中。
對于那些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物影響它們所位于的精子細(xì)胞的受精力的實(shí)施方案而言，適合于本發(fā)明目的的蛋白質(zhì)實(shí)例是精子細(xì)胞中高度不溶性的細(xì)胞骨架組分，這些骨架組分構(gòu)成了外部的致密纖維或精子尾部的纖維鞘或精子頭部的核周鞘。這些蛋白質(zhì)在精子細(xì)胞中形成大的叢集，不太可能從一個(gè)精子細(xì)胞中通行到另一個(gè)中。另一個(gè)例子是含有很強(qiáng)的核定位序列的蛋白質(zhì)，這些序列將把蛋白質(zhì)引導(dǎo)至細(xì)胞核中，從而阻止蛋白質(zhì)從一個(gè)精子細(xì)胞通行到另一個(gè)。
為了使精子失活，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可以過量表達(dá)，或者修飾以使其不能正常地行使功能，即令其突變，或者轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物也可以來自于其它物種。細(xì)胞骨架或者核蛋白的改變會(huì)使精子的運(yùn)動(dòng)力降低，或者產(chǎn)生其它缺陷和較低的受精力。要增強(qiáng)精子的表現(xiàn)，可以改變這些蛋白質(zhì)，即有益突變，從而增強(qiáng)功能。在代謝中起作用的核調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)也可以被加工，以使其在精子中特異性表達(dá)時(shí)提供競爭性優(yōu)勢。
蛋白質(zhì)也可以經(jīng)過改變而含有一段如綠色熒光蛋白之類的標(biāo)記蛋白序列，即含有綠色熒光蛋白序列的融合蛋白，這類標(biāo)記蛋白序列可以用來標(biāo)記攜帶某條或者另一條性染色體的精子細(xì)胞。可將被標(biāo)記的精子分離，從而產(chǎn)生單一性別的后代。另外，與標(biāo)記物、例如綠色熒光蛋白形成的融合蛋白，能夠允許肉眼監(jiān)視和評估蛋白質(zhì)在精子細(xì)胞之間通過胞質(zhì)橋的轉(zhuǎn)運(yùn)，假使這種轉(zhuǎn)運(yùn)存在的話。這種融合蛋白質(zhì)也允許肉眼估測精子的運(yùn)動(dòng)力和受精力。
盡管優(yōu)選的實(shí)施方案利用結(jié)構(gòu)蛋白的變化來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，那些編碼具有調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄物即反義轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)基因，在與精子特異性控制元件偶聯(lián)之后，也可以用來改變精子的受精力。
轉(zhuǎn)基因通常應(yīng)該插入一條或者另一條性染色體。要產(chǎn)生雄性哺乳動(dòng)物，基因應(yīng)該插入X染色體以使含X染色體的精子失活；要產(chǎn)生雌性，基因應(yīng)該插入Y染色體以使含有Y染色體的精子失活?？蛇x擇的是，用來提供競爭性優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因應(yīng)該插入能夠決定所要特定后代性別的性染色體中。
為了確保轉(zhuǎn)基因的最佳表達(dá)，將基因插在內(nèi)源性表達(dá)的基因附近是很有用的。特異性定位于X和Y染色體上的基因已經(jīng)確定了，并且已經(jīng)為本領(lǐng)域所熟知(參見此處引用的美國專利號5,595,089和5,700,926,以及5,763,166)?？蛇x擇的是，待插入的新位點(diǎn)可以用下面所述的技術(shù)或者本領(lǐng)域中常用的其它技術(shù)來確定。
應(yīng)該指出的是，對于提供競爭性優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因，可以設(shè)想這樣的實(shí)施方案將轉(zhuǎn)基因插在編碼某種所要特性的基因旁邊，而這個(gè)基因位于非性染色體上(常染色體)。將轉(zhuǎn)基因以此種方式插入，使得轉(zhuǎn)基因和所要的特性能以連鎖的方式遺傳。因此，得到常染色體上提供優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因的精子細(xì)胞也連鎖地得到了所要的特性，而且通過連鎖的、精子特異性的競爭優(yōu)勢，這些精子細(xì)胞也為所要特性在后代動(dòng)物中的傳播提供了選擇優(yōu)勢。這類技術(shù)對育種者設(shè)計(jì)或繁殖具有多種所要特性的動(dòng)物系是有用的，減少了培育每種性狀至純合狀態(tài)所需的時(shí)間以及由此帶來的不便。
本發(fā)明也涵蓋了用上述方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。關(guān)于具有失活作用的轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物也可以組成一個(gè)載體雌性動(dòng)物系，這個(gè)動(dòng)物系可以由許可的育種者來繁殖。
此處也涵蓋了在某些方式中使用本發(fā)明中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，這些方式能基本上改變生育某一特定性別后代的自然概率。可以用自然育種技術(shù)培育本發(fā)明中所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而在任何后續(xù)代基本上改變生育某一特定性別后代的自然概率，由此實(shí)現(xiàn)上述的方法。
用來實(shí)現(xiàn)這些公開的方法的核酸構(gòu)建體也是本發(fā)明的一部分。如上所述，這樣的核酸構(gòu)建體包括精子特異性控制序列，它有效地與編碼某一蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因序列連接在一起，這一蛋白質(zhì)選自精子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，它們的突變體以及從它們設(shè)計(jì)的融合蛋白質(zhì)中。轉(zhuǎn)基因序列可以是cDNA序列，基因組序列或者人工序列。
含有這類核酸構(gòu)建體的載體也包括在本發(fā)明中，同時(shí)也包括原核和真核細(xì)胞系，這些細(xì)胞系含有插在染色體上的該核酸構(gòu)建體或者帶有核酸構(gòu)建體的載體。特別有用的細(xì)胞系包括含有整合在合適染色體上合適位置處的核酸構(gòu)建體的成纖維細(xì)胞系，用來進(jìn)行體細(xì)胞的細(xì)胞核移植(參見此處引用的美國專利號5,945,577)。含有核酸構(gòu)建體的胚胎干細(xì)胞系也是可取的。
如上面所討論的，在至少一條性染色體上帶有轉(zhuǎn)基因的同配性別產(chǎn)卵細(xì)胞的動(dòng)物，即雌性哺乳動(dòng)物，是轉(zhuǎn)基因的載體，并且可以培育來繁殖這種特性。因此，本發(fā)明也涵蓋了培育轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物系的方法，這種動(dòng)物系的至少一條性染色體上帶有轉(zhuǎn)基因。這種方法基本上包括在所述轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物系的雌性后代中檢測所述轉(zhuǎn)基因，以及用所述的轉(zhuǎn)基因陽性雌性后代來延續(xù)這一品系。
在這種育種方法中，后代可以用自然育種技術(shù)來產(chǎn)生，從而含有一個(gè)拷貝的所述轉(zhuǎn)基因。可選擇的是，后代也可以通過胞質(zhì)內(nèi)精子轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生，所述精子來源于基本上生育雄性后代的雄性動(dòng)物，從而含有兩個(gè)拷貝的所述轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明也涵蓋用這種育種方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物，以及用這種轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物來生育雄性哺乳動(dòng)物的方法，而這種雄性哺乳動(dòng)物基本上生育雄性后代。這種方法包含培育轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物從而來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雄性哺乳動(dòng)物。這樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因雄性哺乳動(dòng)物也是本發(fā)明的一部分。
如上所述，這種育種方法中繁殖的轉(zhuǎn)基因在減數(shù)分裂后在由所述轉(zhuǎn)基因雌性的轉(zhuǎn)基因雄性后代產(chǎn)生的精子細(xì)胞中表達(dá)。如果轉(zhuǎn)基因?qū)蛹?xì)胞有失活作用，用自然育種技術(shù)就能使這樣的轉(zhuǎn)基因雄性后代產(chǎn)生大量的雄性后代。可選擇的是，如果轉(zhuǎn)基因給精子提供競爭性優(yōu)勢，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因雄性后代就能通過自然育種技術(shù)生育大量雌性后代。生育單一性別后代的概率依賴于轉(zhuǎn)基因的性質(zhì)而改變。但是，基本上’是雄性或雌性的后代，是指幾乎總是允許劣勢轉(zhuǎn)基因精子早于非轉(zhuǎn)基因精子而使卵細(xì)胞受精的小概率事件，或者具有競爭性優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因精子未能敵過非轉(zhuǎn)基因精子而發(fā)生受精的小概率事件。
盡管，確信本發(fā)明能用任何一種動(dòng)物來輕易實(shí)現(xiàn)，但是優(yōu)選的動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，這中間最好的是小鼠，牛和豬。
通過參考下面的實(shí)驗(yàn)方法，本發(fā)明的全部范圍將變得更加明顯。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述用于評估魚精蛋白啟動(dòng)子特異性的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體設(shè)計(jì)了兩個(gè)構(gòu)建體。通過將啟動(dòng)子和EGFP基因構(gòu)建體配對，設(shè)計(jì)了第一個(gè)構(gòu)建體，用來檢驗(yàn)魚精蛋白啟動(dòng)子的功能。建成了六只轉(zhuǎn)基因小鼠(三只雄性和三只雌性)，其中一只表達(dá)定位于整個(gè)精子的EGFP(數(shù)據(jù)沒有列出)。第二個(gè)構(gòu)建體含有一段核定位序列，其它部分與第一個(gè)構(gòu)建體相同。目的是確定EGFP表達(dá)能否定位于精子的細(xì)胞核。建成了三只轉(zhuǎn)基因小鼠，將使其生育雄性后代來評估精子。
用來評估蛋白質(zhì)在精子細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，可以在發(fā)育的精子細(xì)胞中自轉(zhuǎn)基因表達(dá)分子量為85kDa和27kDa的精子外致密纖維(ODF)蛋白質(zhì)，或者是它們的衍生物。這兩種蛋白質(zhì)的序列信息都是已知的，因此可以很容易的做到以下幾點(diǎn)(i)分離小鼠精子細(xì)胞群，(ii)制備用來篩選的cDNA文庫，(iii)篩選這樣的文庫以獲得一個(gè)或幾個(gè)能用來制作轉(zhuǎn)基因的cDNA克隆，或者PCR擴(kuò)增合適的序列。用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)，能很容易的構(gòu)建含有融合基因的構(gòu)建體，這個(gè)融合基因是將綠色熒光蛋白(GFP)摻入ODF蛋白序列的融合體。下面給出了對這些構(gòu)建體的描述。
1.CMV/ODF-GFP+SV40或IRES/NEO這個(gè)構(gòu)建體允許在成纖維細(xì)胞中檢測ODF/GFP融合蛋白盒的功能。
2.CMV/NEO+PROT/ODF-GFP這個(gè)構(gòu)建體允許在ES或成纖維細(xì)胞中進(jìn)行選擇、在精子細(xì)胞中的較遲表達(dá)以及在精子細(xì)胞中追蹤GFP熒光。具有功能的PROT/ODF-GFP盒可以使得構(gòu)建體用于同源重組。
融合蛋白構(gòu)建體對確定那些攜帶轉(zhuǎn)基因的精子，以及調(diào)查蛋白質(zhì)在精子細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移是很有用的。在這個(gè)構(gòu)建體中所用的啟動(dòng)子是小鼠魚精蛋白啟動(dòng)子，但是任何能限制基因在減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子或者其它表達(dá)控制元件都可以使用。
能夠用這些構(gòu)建體來制備轉(zhuǎn)基因小鼠。在性成熟期，使雄性和雌性配對，并且監(jiān)視轉(zhuǎn)基因的傳遞。另外，讓轉(zhuǎn)基因雌性交配來生育轉(zhuǎn)基因雄性。這些GI和GO雄性將和雌性配對，并且監(jiān)視轉(zhuǎn)基因的傳遞。在與至少五只雌性交配之后，雄性將被施以無痛致死術(shù)，并且摘除睪丸和附睪。從附睪中取出一些精子樣品，并且在半數(shù)的精子中檢驗(yàn)GFP的存在。如果這些結(jié)果是模棱兩可的，對睪丸進(jìn)行冷凍切片來檢查生精小管和GFP的分布。
預(yù)期轉(zhuǎn)基因會(huì)從雌性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而不是雄性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物傳給后代。這將意味著轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)影響了精子的受精力。如果不是這樣，就有必要用修飾過的基因制備一個(gè)構(gòu)建體，重新檢驗(yàn)對受精力的作用。(注意預(yù)期子代性別比不會(huì)發(fā)生變化，因?yàn)樵谶@項(xiàng)研究中，轉(zhuǎn)基因的靶子并不是性染色體)。
由于綠色熒光融合蛋白的表達(dá)，來自轉(zhuǎn)基因雄性的半數(shù)轉(zhuǎn)基因精子預(yù)期會(huì)在尾部有綠色熒光。這將顯示轉(zhuǎn)基因在減數(shù)分裂后的成功表達(dá)。而且，它也顯示轉(zhuǎn)基因正確定位在半數(shù)的轉(zhuǎn)基因精子細(xì)胞中。
牛X染色體上能用于基因打靶的DNA序列的確定如前面所述，插在X染色體上從而在含X染色體的精子細(xì)胞中表達(dá)的有害基因會(huì)降低將產(chǎn)生雌性小牛的精子的受精力。這種基因應(yīng)該插在它可能表達(dá)的位點(diǎn)。要做到這一點(diǎn)，就需要確定臨近組成型表達(dá)的內(nèi)源基因的一段序列。為了避免破壞基因的功能，對這片DNA區(qū)域進(jìn)行鑒定是必要的。
這可以通過篩選牛YAC文庫以分離兩個(gè)帶有標(biāo)記位點(diǎn)的酵母人工染色體(YAC)克隆來實(shí)現(xiàn)，這些標(biāo)記位點(diǎn)已被鑒定位于X染色體的特定區(qū)域，在假常染色體邊界(PAB)區(qū)域附近。YAC克隆原位雜交(FISH)中的熒光能夠用于確認(rèn)X染色體上的合適位點(diǎn)。將這些克隆亞克隆入粘粒載體來獲得更小的DNA插入物。外顯子捕獲法將被用來確定編碼序列在這些粘粒克隆中的存在。
要進(jìn)行外顯子捕獲，就要將粘?？寺喛寺∪胭|(zhì)粒pSPL3中。在亞克隆之后，將亞克隆DNA轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞中。經(jīng)過瞬間表達(dá)后，收獲RNA，用載體特異的寡核苷酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄來生成第一鏈的cDNA。在將RNA模板消化之后，進(jìn)行起始輪PCR，接著用BstXI消化以除去那些不含外顯子的PCR產(chǎn)物。再進(jìn)行第二輪PCR，接著用尿嘧啶—DNA糖基化方法快速克隆進(jìn)噬菌粒載體中。
捕獲的外顯子就用來確定含有編碼序列的粘粒區(qū)域。其中一些序列將用來篩選牛cDNA文庫、確定全長基因，以確定粘粒區(qū)域，從而避免對這些區(qū)域進(jìn)行同源重組。缺少外顯子和重復(fù)序列的粘粒區(qū)域?qū)⑻貏e標(biāo)明，以用來作為同源重組的目標(biāo)位點(diǎn)。
預(yù)期上述技術(shù)將允許用同源重組的方法在X染色體的合適區(qū)域插入載體構(gòu)建體，從而使載體構(gòu)建體的插入不會(huì)對轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有害。相似的方法也可以用Y染色體或常染色體進(jìn)行。
將DNA構(gòu)建體插入預(yù)先確定的X染色體位點(diǎn)并且選擇能用作細(xì)胞核移植的正確打靶的成纖維細(xì)胞系。
要將序列正確導(dǎo)入有限壽命的原代培養(yǎng)細(xì)胞系，就必需作大規(guī)模的轉(zhuǎn)染，克隆和選擇。優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率，選擇以及使轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞系傳代的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并且也可以用來實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的。
基本上，DNA構(gòu)建體是通過這樣一種方式構(gòu)建的，即令X染色體同源序列位于陽性選擇標(biāo)記(CMV/neo)和常有魚精蛋白啟動(dòng)子盒的目的基因側(cè)翼。陰性選擇標(biāo)記位于X染色體同源序列3’端的下游，當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí)，它們將被刪除。構(gòu)建體如下1.BTX5’序列+CMV/NEO+PROT/ODF-GFP+BTX3’序列+SV40/HGR2.BTX5’序列+PROT/ODF-GFP+CMV/NEO+BTX3’序列+SV40/HGR3.BTX5’序列+CMV/NEO+PROT/ODF+BTX3’序列+SV40/HGR4.BTX5’序列+PROT/ODF+CMV/NEO+BTX3’序列+SV40/HGRCMV/neo盒允許在成纖維細(xì)胞中選擇DNA插入。PROT/ODF-GFP盒將在精子細(xì)胞中表達(dá)，GFP可使表達(dá)可視化。如果融合蛋白太大而不能到達(dá)它的目的位點(diǎn)從而無法組裝入ODF，就必需用到PROT/ODF了。如果確是這種情況，ODF蛋白還需要經(jīng)過誘變處理。由于雙順反子構(gòu)建體表達(dá)3’端順反子的效率降低了，因此具有CMV/neo+PROT/ODF順序或者相反順序的構(gòu)建體應(yīng)該先進(jìn)行測試。
用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)，電穿孔參數(shù)也可以得到優(yōu)化。將細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長，那些存活的克隆將得到繁殖。用PCR來評估總?cè)后w混合物，以確定同源重組體是否已經(jīng)產(chǎn)生。如果存在同源重組體，在500個(gè)每個(gè)含有約10個(gè)細(xì)胞的孔中進(jìn)行初始的連續(xù)稀釋培養(yǎng)，并用PCR評估。這樣就確保陰性選擇只在含有同源重組體的細(xì)胞群體中進(jìn)行。因此，就可以丟棄任何存活的陰性選擇克隆。任何在影印培養(yǎng)后死掉的克隆都可以認(rèn)為是真正的同源重組體，并且將用Southern分析法來篩選。待用細(xì)胞將是那些具有大約35次群體倍增壽命的胎兒成纖維細(xì)胞。在選擇過程中監(jiān)測群體倍增情況，以盡量減少衰老。將大約3到5個(gè)細(xì)胞系冷凍，并且運(yùn)往Ultimate Biosystem來生產(chǎn)后代。
預(yù)期第一輪選擇后在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中將運(yùn)作良好，并且該實(shí)驗(yàn)?zāi)芎茌p易地重復(fù)，從而使得能很容易地篩選成千上萬的克隆。將用PCR進(jìn)行初篩選以確定同源重組體。接著應(yīng)該對幾個(gè)重組體進(jìn)行測試以確定那些能在培養(yǎng)基中生長良好的重組體。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，這種哺乳動(dòng)物生育某一特定性別后代的傾向性被改變，該方法包括將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入所述哺乳動(dòng)物生殖系的至少一條性染色體中，其中該核酸構(gòu)建體編碼一種能在發(fā)育著的精子細(xì)胞中在減數(shù)分裂后表達(dá)的轉(zhuǎn)基因，這種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)改變了由上述發(fā)育著的精子細(xì)胞產(chǎn)生的精子的受精力，從而使上述哺乳動(dòng)物具有被改變的生育某一特定性別后代的傾向性。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是異配性別的。
3.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是同配性別的。
4.權(quán)利要求2中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物生育某一特定性別的第一代后代的傾向性被改變。
5.權(quán)利要求3中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物生育某一特定性別的第二代后代的傾向性被改變。
6.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是用細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)的。
7.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是用自然育種技術(shù)生產(chǎn)的。
8.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是用胞質(zhì)內(nèi)精子注射的方法生產(chǎn)的。
9.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物選自小鼠，牛和豬。
10.權(quán)利要求1中的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)由精子特異性的控制序列控制。
11.權(quán)利要求10中的方法，其中所述精子特異性控制序列是選自魚精蛋白1或2基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求1中的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因選自精子結(jié)構(gòu)蛋白，它們的突變體以及由它們設(shè)計(jì)的融合蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求12中的方法，其中所述精子結(jié)構(gòu)蛋白是一種外致密纖維(ODF)蛋白。
14.權(quán)利要求12中的方法，其中所述融合蛋白包含與綠色熒光蛋白(GFP)的融合體。
15.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有增強(qiáng)的生育雄性后代的傾向性。
16.權(quán)利要求1中的方法，其中所述哺乳具有增強(qiáng)的生育雌性后代的傾向性。
17.權(quán)利要求5中的方法，其中所述第二代后代基本上是雄性。
18.由權(quán)利要求1中的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
19.通過對權(quán)利要求3中的哺乳動(dòng)物進(jìn)行育種而生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物系。
20.一種基本上改變生育某一特定性別后代的自然概率的方法，該方法包括用自然育種技術(shù)繁殖權(quán)利要求1中的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，從而基本上改變?nèi)魏魏罄m(xù)代中生育某一特定性別后代的自然概率。
21.含有精子特異性控制序列以及與之可操作連接的cDNA序列的核酸構(gòu)建體，該cDNA序列編碼選自下組的蛋白質(zhì)；精子結(jié)構(gòu)蛋白，它們的突變體以及由它們設(shè)計(jì)的融合蛋白質(zhì)。
22.含有權(quán)利要求21中的核酸構(gòu)建體的載體。
23.含有權(quán)利要求21中的核酸構(gòu)建體的成纖維細(xì)胞系。
24.含有權(quán)利要求21中的核酸構(gòu)建體的胚胎干細(xì)胞系。
25.一種培育至少在一條性染色體上帶有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物系的方法，其中該轉(zhuǎn)基因在所述轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因雄性后代產(chǎn)生的精子細(xì)胞中在減數(shù)分裂后表達(dá)，從而用自然育種技術(shù)就可以使所述轉(zhuǎn)基因雄性后代基本上生育雄性后代，所述方法包括檢測所述轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物系的雌性后代中的所述轉(zhuǎn)基因，以及用所述雌性后代來攜帶這一轉(zhuǎn)基因。
26.權(quán)利要求25中的方法，其中所述雌性后代是用自然育種技術(shù)產(chǎn)生的，并且含有一個(gè)拷貝的所述轉(zhuǎn)基因。
27.權(quán)利要求25中的方法，其中所述雌性后代是用胞質(zhì)內(nèi)精子移植來產(chǎn)生的，并且含有兩個(gè)拷貝的所述轉(zhuǎn)基因，所述精子則來自基本上生育雄性后代的雄性攜帶者。
28.用權(quán)利要求25中的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物。
29.一種生產(chǎn)基本上生育雄性后代的雄性哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括培育權(quán)利要求28中的轉(zhuǎn)基因雌性哺乳動(dòng)物，從而來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雄性哺乳動(dòng)物。
30.用權(quán)利要求29中的方法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因雄性哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本文公開了對動(dòng)物進(jìn)行遺傳修飾從而使其生育單一性別的后代或者子代的方法。
文檔編號C12N15/09GK1443037SQ01807315
公開日2003年9月17日 申請日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月24日
發(fā)明者J·M·羅博, A·F·龐斯德里恩 申請人:馬薩諸塞大學(xué)