專利名稱：用固定化酯制備手性二氯菊酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二氯菊酸的制備方法，具體地說，涉及一種用固定化酯酶制造手性R(+)-trans-二氯菊酸的方法。
目前，雖然化學(xué)拆分法可以制造手性R(+)-trans-二氯菊酸，但是需要使用價格很高的光學(xué)活性試劑，而且工藝流程比較繁雜。由手性催化劑催化環(huán)丙烷化反應(yīng)雖然可以得到R(+)-trans-二氯菊酸，但尚難達到很高的光學(xué)純度。因此研究開發(fā)方便經(jīng)濟的生物催化劑拆分法制造R(+)-trans-二氯菊酸也成為一個重要途徑。
關(guān)于用生物催化劑動力學(xué)拆分方法制備手性R(+)-trans-二氯菊酸的報道有1、豬肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Eg.，2364(1984))。
2、球形節(jié)桿菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(光田賢等， (日)特開昭60-244296(1985)，63-251099(1988))。
3、中國發(fā)明專利(邵昌平等，001 10029.7，(2000))。
上述文獻中，豬肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-trans-二氯菊酸的光學(xué)純度達90％，但是，豬肝酯酶價格偏高，供生產(chǎn)使用有一定的限制，需通過酶固定化來解決。
球形節(jié)稈菌酯酶拆分法，水解率18.0％時，R(+)-trans-二氯菊酸的光學(xué)純度可達＝88.9％，但是，此菌種難以得到，而且未經(jīng)誘變或基因工程改造的菌株，活力比較低。
關(guān)于用固定化酯酶動力學(xué)拆分方法制備手性R(+)-trans-二氯菊酸未見有文獻報道。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的固定化酯酶制備手性二氯菊酸的方法，以消旋的二氯菊酸酯為原料，其結(jié)構(gòu)式如下
式中，R為C1-C4烷基或孟基，其順式與反式比例在10-90/90-10范圍內(nèi)；其制備步驟如下(除有特殊說明外，本發(fā)明提到的濃度均為重量百分濃度)1)制備固定化酯酶由酯酶共價結(jié)合到雙功能基活化的固體載體上；其中，酯酶(EC.3.1.1.1)由新鮮的哺乳動物的肝臟或細菌以及酵母中提取，活力不低于0.1U/mg，；雙功能基活化試劑包括雙醛、雙醚、雙酚、雙酸或雙環(huán)氧等；固體載體包括硅膠、氧化鋁、有機樹脂或天然多糖等；2)將消旋的二氯菊酸酯、非離子表面型表面活性劑和固定化酯酶加入到pH＝3-11的緩沖溶液中，攪拌或振蕩下進行催化水解反應(yīng)，并通過加堿保持其pH值，其pH值優(yōu)選6-8；其中，消旋的二氯菊酸酯在反應(yīng)溶液中濃度為0.1-40％，優(yōu)選1-10％；固定化酯酶用量在5-500U/g消旋的二氯菊酸酯，優(yōu)選30-200U/g；非離子型表面活性劑包括蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯，其濃度范圍為0.001-0.2％，優(yōu)選0.01-0.1％。；緩沖液為無機鹽緩沖溶液，如磷酸鹽、碳酸鹽或硼酸鹽等緩沖溶液。
緩沖液也可以用有機鹽緩沖溶液，如甘氨酸-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸或Tris-鹽酸等緩沖溶液；水解反應(yīng)溫度為20-70℃，優(yōu)選為30-60℃；水解反應(yīng)時間為6-96小時，優(yōu)選8-72小時。
3)將固定化酯酶與反應(yīng)液分離，固定化酯酶用緩沖液沖洗后保存?zhèn)溆?，反?yīng)液用濃鹽酸酸化后，用有機溶劑萃??；4)有機相用堿水皂化，使反應(yīng)生成的二氯菊酸進入水相，再用濃鹽酸酸化，析出結(jié)晶。
本發(fā)明制備的固定化酯酶，具有一定的柔韌性，基本上保持了游離的空間選擇性。它還具有很好的穩(wěn)定性，可以反復(fù)使用，解決了酯酶在生產(chǎn)成本中所占比例過高的問題，使之能在工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明用共價結(jié)合的固定化酯酶，水解消旋的二氯菊酸酯，通過動力學(xué)拆分，得到光學(xué)純度90％左右的R(+)-trans-二氯菊酸。此固定化酯酶與游離酯酶相比，其活性和對映體選擇性及非對映體選擇性皆相差不多。特別重要的是，此固定化酯酶穩(wěn)定性好，可以回收使用，至少循環(huán)使用10次以上，解決了游離酯酶只能使用1次的問題，使價格高的游離酯酶，通過共價結(jié)合固定化，可以實現(xiàn)在工業(yè)上反復(fù)使用，顯著地降低酯酶在手性二氯菊酸生產(chǎn)成本中所占的分額。
反應(yīng)液用濃鹽酸酸化后，用4-甲基-2-戊酮萃取(10ml，2次)，再向萃取液中加入等體積的1N NaOH水溶液，振蕩分相，使水解反應(yīng)生成的手性二氯菊酸形成鈉鹽進入水相。水相再用濃鹽酸酸化，靜置，使手性二氯菊酸逐漸結(jié)晶析出。結(jié)晶用蒸餾水淋洗，干燥，得手性二氯菊酸97mg，產(chǎn)率10.40％，為理論產(chǎn)率(23.90％)的43.52％。手性二氯菊酸的四個異構(gòu)體的組成比例用氣相色譜法測定(-環(huán)糊精手性毛細管柱(30m)分離，氫火焰鑒定器)。取手性二氯菊酸樣品50mg，加入等克分子的氯化亞砜，吡啶和(-)-孟醇的甲苯溶液，于110℃回流1小時，進行衍生化后，測定其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.07％，R(+)-cis＝0.07％，S(-)-trans＝11.04％，R(+)-trans＝88.82％。
離心分離回收的固定化酯酶用0.1MNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH＝8)洗3次，置于冰箱中保存，留待下一次循環(huán)使用。
實施例2取固定化豬肝酯酶(由自制的游離豬肝酯酶10000U/g，共價結(jié)合固定化于戊二醛活化的天然氨基多糖上得到，活力回收為40.0％，濕的固定化酶的單位活力為10.4U/g)，按實施例1同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定，得手性二氯菊酸93mg，產(chǎn)率為9.98％，為理論產(chǎn)率的41.74％。測定其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.02％，R(+)-cis＝0.02％，S(-)-trans＝9.77％，R(+)-trans＝90.19％。
實施例3將實施例1回收保存的固定化豬肝酯酶，按實施例1同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定，分離回收固定化酯酶，循環(huán)使用10次以上，第11次反應(yīng)，得手性二氯菊酸89mg，產(chǎn)率為9.55％，為理論產(chǎn)率的39.95％。其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.17％，R(+)-cis＝0.27，S(-)-trans＝13.47％，R(+)-trans＝86.11％。
實施例4取固定化豬肝酯酶(由自制的游離豬肝酯酶(10000U/g)，共價結(jié)合固定化于戊二醛活化的天然氨基多糖上得到，活力回收為87.0％，濕的固定化酶的單位活力為27.35U/g)，按實施例1和實施例3同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定。第1次反應(yīng)，得手性二氯菊酸104mg，產(chǎn)率為11.16％，為理論產(chǎn)率的46.69％。其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.14％，S(-)-trans＝12.06％，R(+)-trans＝87.64％。第10次反應(yīng)，得手性二氯菊酸64mg，產(chǎn)率為6.87％，為理論產(chǎn)率的28.73％。其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.09％，S(-)-trans＝16.63％，R(+)-trans＝83.12％。循環(huán)使用10次以后，固定化豬肝酯酶的活力降低約1/3，對映體選擇性降低約1/4。
實施例5取上述固定化豬肝酯酶50U，非離子表面活性劑用Span 80，取50mg，按實施例1同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定。得手性二氯菊酸77mg，產(chǎn)率為8.39％，為理論產(chǎn)率的35.06％。其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝2.19％，R(+)-cis＝2.53％，S(-)-trans＝12.20％，R(+)-trans＝83.07％。
實施例6取假絲酵母(Candida lipolytica)酯酶(Fluka Co.出品)100U，按實施例1同樣的方法和條件進行固定化，得固定化酯酶，其活力回收為98％，濕的固定化酶的單位活力為36.06U/g。取此固定化酯酶50U，按實施例1同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定。得手性二氯菊酸62mg，產(chǎn)率為6.74％，為理論產(chǎn)率的28.22％。其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.20％，R(+)-cis＝0.25％，S(-)-trans＝13.20％，R(+)-trans＝86.36％。
實施例7取雙環(huán)氧辛烷(1，2，5，6-Diepoxyoctane，97％，F(xiàn)isher Scientific出品)作為雙功能基話化劑，按實施例1同樣的方法和條件進行固定化，得固定化酯酶，其活力回收為69％，濕的固定化酶的單位活力為16.2U/g。取此固定化酯酶50U，按實施例1同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定。得手性二氯菊酸68mg，產(chǎn)率為7.40％，為理論產(chǎn)率的30.96％。其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.14％，S(-)-trans＝12.06％，R(+)-trans＝87.64％。
比較例1取自制的游離豬肝酯酶(10000U/g)50U，按實施例1同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定，得手性二二氯菊酸121mg，產(chǎn)率為12.98％，為理論產(chǎn)率的54.31％。測定其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.25％，R(+)-cis＝0.18％，S(-)-trans＝7.45％，R(+)-trans＝92.13％。
比較例2取固定化豬肝酯酶(由自制的游離豬肝酯酶(10000U/g)共價結(jié)合固定化于戊二醛活化的硅膠上得到，活力回收為36.9％，濕的固定化酶的單位活力為17.5U/g)60U，按實施例1和實施例3的同樣的方法和條件進行水解反應(yīng)和分析測定，得手性二氯菊酸59mg，產(chǎn)率為6.33％，為理論產(chǎn)率的26.48％。測定其四個異構(gòu)體的組成比例為S(-)-cis＝0.12％，R(+)-cis＝0％，S(-)-trans＝8.79％，R(+)-trans＝91.09％。此固定化豬肝酯酶第3次循環(huán)水解反應(yīng)，得手性二氯菊酸28mg，產(chǎn)率為3.04％，為理論產(chǎn)率的12.59％。測定其四個異構(gòu)體的組成比為S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.06％，S(-)-trans＝11.24％，R(+)-trans＝88.59％。第4次循環(huán)水解反應(yīng)，僅得手性二氯菊酸5mg，表明此固定化豬肝酯酶酶的流失很嚴(yán)重。
權(quán)利要求
1.一種固定化酯酶制備手性二氯菊酸的方法，以消旋的二氯菊酸酯為原料，其結(jié)構(gòu)式如下 式中，R為C1-C4烷基或孟基，其順式與反式比例在10-90/90-10范圍內(nèi)；其制備步驟如下1)制備固定化酯酶由酯酶共價結(jié)合到雙功能基活化的固體載體上其中，酯酶(EC.3.1.1.1)由新鮮的哺乳動物的肝臟或細菌以及酵母中提取，活力不低于0.1U/mg；雙功能基活化試劑為雙醛、雙醚、雙酚、雙酸或雙環(huán)氧；固體載體為硅膠、氧化鋁、有機樹脂或天然多糖；2)將消旋的二氯菊酸酯、非離子表面型表面活性劑和固定化酯酶加入到pH＝3-11的緩沖溶液中，攪拌或振蕩下進行催化水解反應(yīng)，并通過加堿保持其pH值；水解反應(yīng)溫度為20-70℃，反應(yīng)時間為6-96小時；其中，消旋的二氯菊酸酯在反應(yīng)溶液中濃度為0.1-40％；固定化酯酶用量在5-500U/g消旋的二氯菊酸酯；非離子型表面活性劑為蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯，其濃度范圍為0.001-0.2％；緩沖液為無機鹽或有機鹽緩沖溶液；3)將固定化酯酶與反應(yīng)液分離，固定化酯酶用緩沖液沖洗后保存?zhèn)溆?，反?yīng)液用濃鹽酸酸化后，用有機溶劑萃取；4)有機相用堿水皂化，使反應(yīng)生成的二氯菊酸進入水相，再用濃鹽酸酸化，析出結(jié)晶。
2.如權(quán)利要求1所述的固定化酶制備手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述消旋的二氯菊酸酯濃度為1-10％。
3.如權(quán)利要求1所述的固定化酶制備手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述固定化酯酶用量為30-200U/g底物。
4.如權(quán)利要求1所述的固定化酶制備手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述非離子型表面活性劑濃度為0.01-0.1％。
5.如權(quán)利要求1所述的固定化酶制備手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述反應(yīng)溶液pH＝6-8。
6.如權(quán)利要求1所述的固定化酶制備手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述水解反應(yīng)溫度為30-60℃，水解反應(yīng)時間為8-72小時。
7.如權(quán)利要求1所述的固定化酶制備手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述無機鹽緩沖溶液為磷酸鹽、碳酸鹽或硼酸鹽組沖溶液。
8.如權(quán)利要求1所述的固定化酶制備手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述有機鹽緩沖溶液為甘氨酸-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸或Tris-鹽酸緩沖溶液。
全文摘要
一種固定化酯酶制備手性二氯菊酸的方法，由酯酶共價結(jié)合到雙功能基活化的固體載體上，將消旋的二氯菊酸酯、非離子表面型表面活性劑和固定化酯酶加入到緩沖溶液中進行催化水解反應(yīng)，將固定化酯酶與反應(yīng)液分離，固定化酯酶用緩沖液沖洗后保存?zhèn)溆茫磻?yīng)液用濃鹽酸酸化后，用有機溶劑萃??；有機相用堿水皂化，使反應(yīng)生成的二氯菊酸進入水相，再用濃鹽酸酸化，析出結(jié)晶。該方法明顯地提高了酶反應(yīng)速度和對手性二氯菊酸的選擇。制備的固定化酯酶可以反復(fù)使用。
文檔編號C12P7/40GK1427080SQ01144909
公開日2003年7月2日 申請日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者邵昌平, 劉韌, 白長敏, 潘桂枝, 韓梅, 鄭卓 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所