專利名稱：提高3－0－乙?；?”－0－異戊?；肪禺a(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本的方法
在已公開的專利US4092473、US4522919中已對(duì)3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素的生產(chǎn)過程及抗菌活性等做了描述。
3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪厥嵌喾N泰樂菌素衍生物中的一種，該物質(zhì)比泰樂菌素具有更強(qiáng)的抗菌活性。目前已被商品化，并在世界范圍內(nèi)銷售。
3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐纳a(chǎn)過程是鏈霉菌Streptomyces.Thermotolerans發(fā)酵2-3天后產(chǎn)生乙酰化酶及異戊?；福诎l(fā)酵液中加入提供乙?；那绑w物葡萄糖和提供異戊?；腖-亮氨酸及泰樂菌素，經(jīng)過乙?；笇?duì)泰樂菌素3位上進(jìn)行乙?；愇祯；笇?duì)泰樂菌素4”位進(jìn)行異戊酰化，經(jīng)過約190小時(shí)的發(fā)酵過程，從而完成3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐纳锖铣蛇^程。
3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素的前體物泰樂菌素本身是一堿性物質(zhì)，加入酸后變?yōu)榕c加入酸對(duì)應(yīng)的泰樂菌素鹽，本說明如不特別指明則是指泰樂菌素堿或泰樂菌素鹽。
1、通過提高L-亮氨酸的濃度和泰樂菌素的濃度減少補(bǔ)入發(fā)酵內(nèi)的料液的體積，從而達(dá)到提高每批發(fā)酵液提種后體積的目的。
以目前生產(chǎn)使用120立方米的發(fā)酵罐為例，培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后接入Streptomyces.Thermotolerans菌種，接種后發(fā)酵液體積為約66立方米。3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐纳锖铣蛇^程分為明顯的微生物菌體繁殖階段及產(chǎn)物的生物合成階段。向發(fā)酵罐培養(yǎng)基接種接后，微生物生長(zhǎng)2-3天完成菌體繁殖階段。此時(shí)補(bǔ)入泰樂菌素與L-亮氨酸的混合液及葡萄糖溶液，開始3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐纳锖铣呻A段。由于泰樂菌素有強(qiáng)烈的抑制微生物生長(zhǎng)的作用，發(fā)酵液中補(bǔ)入泰樂菌素后，微生物菌體基本停止生長(zhǎng)。發(fā)酵液中補(bǔ)入無菌的1.8％(w/v)的L-亮氨酸溶液及約7.0％(w/v)泰樂菌素混合液約20立方米，同時(shí)補(bǔ)入約50％(w/v)的無菌葡萄糖溶液約10立方米。理論計(jì)算到發(fā)酵完畢后發(fā)酵液體積應(yīng)為96立方米，但由于菌種發(fā)酵過程中需通入并排出大量無菌空氣，排出的空氣帶走發(fā)酵罐中約14立方米水份，所以到發(fā)酵完成后實(shí)際得到的發(fā)酵液體積約82立方米。
在該生物轉(zhuǎn)化過程中，在發(fā)酵液中的每克微生物菌體酶活力一定的情況下，影響每批發(fā)酵液總產(chǎn)量的因素主要是每批發(fā)酵液的微生物菌體總量。所以提高每批發(fā)酵液的微生物菌體總量會(huì)等比例提高3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐漠a(chǎn)量。
由于L-亮氨酸在常溫下在水中的溶解度為2.0-2.5％，如溫度降至10℃時(shí)其溶解度約為1.8％。所以實(shí)際應(yīng)用中使用了1.4-1.8％濃度的L-亮氨酸。如L-亮氨酸濃度超過1.8％，則L-亮氨酸溶液在冬季氣溫低于10℃將會(huì)結(jié)晶析出，使補(bǔ)入發(fā)酵液中的L-亮氨酸計(jì)量不準(zhǔn)確及堵塞補(bǔ)料管道，造成3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐漠a(chǎn)量降低和發(fā)生生產(chǎn)事故等結(jié)果。本發(fā)明將L亮氨酸的濃度提高到了2.1-20％，在此濃度下如不加入本發(fā)明權(quán)利要求書1中所述的增溶劑和表面活性劑，不能溶解的L-亮氨酸固體懸浮于水面上，使補(bǔ)入發(fā)酵罐中的亮氨酸計(jì)量不準(zhǔn)確，甚至堵塞補(bǔ)料管道。加入增溶劑和表面活性劑后及懸浮劑后，不溶于水的L-亮氨酸固體細(xì)小顆粒均勻的懸浮于液體中成為流動(dòng)性很好的懸浮液。
泰樂菌素鹽水溶液在含量低于10％時(shí)，長(zhǎng)期放置也不會(huì)產(chǎn)生沉淀。如含量超過10％，底溫時(shí)長(zhǎng)期放置會(huì)有部分泰樂菌素結(jié)晶出現(xiàn)，同樣造成補(bǔ)入發(fā)酵罐內(nèi)的泰樂菌素鹽計(jì)量不準(zhǔn)和堵塞管道的問題。加入本發(fā)明權(quán)利要求書2中所述的表面活性劑后，則泰樂菌素鹽溶液不會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶。
泰樂菌素堿在水中難溶，本發(fā)明權(quán)利要求書中所述的助溶劑、表面活性劑及助懸劑后，便可使泰樂菌素堿均勻分布在水中，成為流動(dòng)性良好的懸浮液。同時(shí)，由于泰樂菌素堿在水溶液中易分解，但以固體顆粒的形式存在于液體中則減少了這種分解現(xiàn)象。
更由于在酶的作用下，泰樂菌素、L-亮氨酸是等摩爾反應(yīng)生成等摩爾的3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪?。所以L-亮氨酸的低濃度也必須要求與L-亮氨酸在同一種溶液中的被補(bǔ)入發(fā)酵液中的泰樂菌素鹽溶液的低濃度。雖然泰樂菌素鹽在水中的溶解度可達(dá)到40％以上。
本發(fā)明就是將補(bǔ)入的1.4-1.8％L-亮氨酸溶液濃度提高到2.1-20％，同時(shí)將補(bǔ)入的原9.0％以下的泰樂菌素鹽溶液濃度提高到10-50％。由于每批發(fā)酵所補(bǔ)入的泰樂菌素及L-亮氨酸的重量是一定的，相應(yīng)的補(bǔ)入的體積降低為原工藝過程的1/1.4到1/13。以總?cè)莘e為120立方米發(fā)酵罐為例，如補(bǔ)入發(fā)酵罐中的L-亮氨酸和泰樂菌素溶液體積降低為原工藝的1/5，則同樣達(dá)到發(fā)酵完成后每批發(fā)酵液體積82立方米，該批發(fā)酵液接種后的體積便可達(dá)到82立方米，而不是現(xiàn)在使用的66立方米。即接種后體積比原工藝提高了24％，發(fā)酵罐的利用率為68.3％，而原工藝接種后體積只有66立方米，發(fā)酵罐的利用率只有55％。相應(yīng)的在微生物菌體繁殖階段可以得到比原工藝多出24％的微生物菌體量，則每批發(fā)酵液3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐漠a(chǎn)量也可提高20％以上。
2、補(bǔ)液化淀粉說明原工藝中提供3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪厣锖铣删x所需碳源及3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素生物合成所需乙?；那绑w由發(fā)酵過程中補(bǔ)入的葡萄糖提供。本發(fā)明改由經(jīng)淀粉酶液化后的流動(dòng)性很好的液化淀粉提供。實(shí)驗(yàn)表明，在3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪厣a(chǎn)過程中，如發(fā)酵液中葡萄糖濃度過高，會(huì)降低3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐漠a(chǎn)率。由于液化淀粉是由短鏈的葡萄糖的聚合體，而3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐纳锖铣删煞置谔腔笇⒁夯矸劬徛獬善咸烟?。因而，液化淀粉相當(dāng)于葡萄糖的緩釋劑，既可起到葡萄糖應(yīng)起的作用，又使發(fā)酵液中的糖濃度控制在較低的水平，更有利于3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪氐暮铣?。
提供同樣數(shù)量的葡萄糖，液化淀粉的成本比葡萄糖的成本低約30％。使用液化淀粉代替葡萄糖，可降低3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪厣a(chǎn)成本約1.0％。
3、補(bǔ)泰樂菌素堿或泰樂菌素鹽半成品或中間體的說明目前應(yīng)用的3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐纳a(chǎn)過程是使用含量高達(dá)75％以上的成品泰樂菌素酒石酸鹽，配制成泰樂菌素酒石酸鹽溶液補(bǔ)入發(fā)酵液中。該方法成本較高，現(xiàn)廣泛使用的生產(chǎn)成品泰樂菌素酒石酸鹽生產(chǎn)工藝過程可簡(jiǎn)單描述為
泰樂菌素產(chǎn)生菌經(jīng)液體發(fā)酵140-200小時(shí)后用酸調(diào)整發(fā)酵液pH5.0以下后固液分離得到發(fā)酵液濾液，該步加酸及固液分離得到發(fā)酵液濾液的收率為約95％。發(fā)酵液濾液用堿調(diào)pH8.0以上使發(fā)酵液濾液中的泰樂菌素成為易溶解于有機(jī)溶媒的泰樂菌素堿。用有機(jī)溶媒萃取發(fā)酵液濾液中所含泰樂菌素堿。該步有機(jī)溶媒萃取收率為約95％。該含有泰樂菌素堿的萃取液與酒石酸的水溶液充分混合，使其中的泰樂菌素堿轉(zhuǎn)化成為易溶于水的泰樂菌素鹽而轉(zhuǎn)移到水溶液中。該步泰樂菌素堿從有機(jī)溶媒中被轉(zhuǎn)移到水中的收率為約95％。該水溶液經(jīng)用活性炭等脫去色素，并經(jīng)過超濾膜濃縮后成為含量為3-30％的泰樂菌素的酒石酸鹽溶液。該超濾過程泰樂菌素收得率約為90％。該超濾濃縮后的泰樂菌素酒石酸鹽溶液經(jīng)噴霧干燥得到成品泰樂菌素酒石酸鹽粉狀物。該噴霧干燥過程泰樂菌素酒石酸鹽的收得率約為90％。該經(jīng)噴霧干燥得到的泰樂菌素酒石酸鹽粉狀物用于制備成生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐奶肪鼐剖猁}補(bǔ)料液。經(jīng)過以上三個(gè)主要過程，從泰樂菌素發(fā)酵液到制得成品泰樂菌素酒石酸鹽的總收得率低于70％。該工藝的缺點(diǎn)還表現(xiàn)在使用大量的有機(jī)溶媒，增加了生產(chǎn)成本，污染環(huán)境。
本發(fā)明采用與現(xiàn)行生產(chǎn)工藝或曾被公開工藝完全不同的方法得到可用于制備成生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐奶肪鼐剖猁}補(bǔ)料液的泰樂菌素堿或泰樂菌素鹽的中間體。使用本發(fā)明的工藝過程，泰樂菌素酒石酸鹽的總收得率為85％以上。方法如下泰樂菌素產(chǎn)生菌經(jīng)液體發(fā)酵140-200小時(shí)后用酸調(diào)整發(fā)酵液pH5.0以下，經(jīng)固液分離得到發(fā)酵液濾液。該步加酸及固液分離得到發(fā)酵液濾液收率為約95％。該步驟與現(xiàn)在使用的工藝相同。但以下是本發(fā)明與現(xiàn)在使用工藝的不同點(diǎn)。得到的發(fā)酵液濾液用堿調(diào)pH7.5以上使發(fā)酵液濾液中的泰樂菌素成為易溶解于有機(jī)溶媒，但不易溶解于水的泰樂菌素堿，加熱到60-70℃，大量泰樂菌素堿沉淀產(chǎn)生，該步驟中加熱發(fā)酵液濾液是關(guān)鍵。如不將發(fā)酵液濾液加熱，則發(fā)酵液濾液中的泰樂菌素堿只有約40-70％的形成沉淀。將該沉淀物分離后用50-80℃熱水洗后得到水洗后的泰樂菌素堿一次沉淀物，該泰樂菌素堿一次沉淀物加入等當(dāng)量或超過泰樂菌素堿當(dāng)量的酒石酸溶液可得到含量為3-70％的泰樂菌素酒石酸鹽的溶液或半固體物。以上步驟從向泰樂菌素發(fā)酵液濾液中加入堿沉淀泰樂菌素堿一次沉淀物，后加酒石酸得到泰樂菌素酒石酸鹽的收率約為90％以上。以上從含泰樂菌素的發(fā)酵液始到得到泰樂菌素酒石酸鹽的收率可達(dá)到85％以上。即比目前使用的得到成品泰樂菌素酒石酸鹽的收得率提高15-20％，而且全部過程不使用有機(jī)溶媒，縮短了工藝過程，可使提取泰樂菌素的成本降低20％以上。該含量3-70％的泰樂菌素酒石酸鹽便可用于制備成生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素的泰樂菌素補(bǔ)料液。
本發(fā)明經(jīng)過以上三個(gè)主要過程的改進(jìn)，可使3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素每批發(fā)酵液3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐漠a(chǎn)量提高20％以上。降低3-O-乙?；?”-O-異戊酰基生產(chǎn)成本的15％以上。本發(fā)明還通過向L-亮氨酸溶液或懸浮液加助溶劑，表面活性劑及助懸劑的方法，解決了在生3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪剡^程中L-亮氨酸在加熱溶解再冷卻后會(huì)產(chǎn)生較大體積的結(jié)晶，易堵塞管道，從而在生產(chǎn)上無法應(yīng)用的問題。
下面實(shí)例予以說明本發(fā)明的方法，但實(shí)例不限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
實(shí)例一本實(shí)例是使用高濃度成品泰樂菌素鹽，高濃度L-亮氨酸，液化淀粉作為生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素的補(bǔ)料物的生產(chǎn)方法。
將2份重量的吐溫40，1-2份重量的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中常用的消泡劑與15份的L-亮氨酸與81份的水混合，加熱到60-65℃，加入8N的NaOH溶液調(diào)pH10以下使之完全溶解，劇烈攪拌下緩慢加入等當(dāng)量的鹽酸調(diào)pH6-8。此時(shí)有大量細(xì)小顆粒出現(xiàn)，并懸浮于液體中。120℃滅菌30分鐘，保持緩慢攪拌備用。
將5份重量的淀粉加5份水，加入淀粉重量0.2％的糖化酶，70-75℃攪拌20-30分鐘，此時(shí)淀粉液化成了流動(dòng)性很好的液化淀粉溶液。120℃保溫30分鐘滅菌備用。
取市售成品泰樂菌素酒石酸鹽粉配制成30-50％的泰樂菌素酒石酸鹽。此溶液與本實(shí)例前述的L-亮氨酸溶液混合，加熱到70-75℃保溫10-20分鐘冷卻后備用。
使用鏈霉菌Streptomyces.Thermotolerans的變異株，經(jīng)菌種培養(yǎng)后接種到容積120立方米并裝有82立方米發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)2-3天，完成微生物菌體的生產(chǎn)階段后開始按比例緩慢補(bǔ)加上述的L-亮氨酸與泰樂菌素的混合懸浮液、液化淀粉溶液。自補(bǔ)料開始計(jì)6-7天完成由泰樂菌素生物轉(zhuǎn)化為3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪氐陌l(fā)酵全過程。
應(yīng)用此工藝可得到約與原工藝相同的82立方米的發(fā)酵液。但單位體積的發(fā)酵液中所含3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪乇仍に囂岣吡?5-20％。同時(shí)，由于使用液化淀粉和高濃度的L-亮氨酸及高濃度的成品泰樂菌素鹽作為補(bǔ)料液，使每批生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素產(chǎn)量提高了10-15，成本降低了5％以上。
實(shí)例二本實(shí)例是優(yōu)化的使用普通濃度泰樂菌素中間體，普通濃度L-亮氨酸，液化淀粉與葡萄糖的混合液作為生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐难a(bǔ)料液的生產(chǎn)方法。
將1份重量的吐溫40，1份重量的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中常用的消泡劑與4份重量的L-亮氨酸與94份的水混合，加熱到70-80℃溶解備用。
將4份重量的淀粉加5份水，加入淀粉重量0.2％的淀粉酶，70-75℃攪拌20-30分鐘，此時(shí)淀粉液化成了流動(dòng)性很好的液化淀粉溶液。向該溶液中加入1份重量的葡萄糖配制成含10％(w/v)葡萄糖和40％(w/v)液化淀粉的混合液，120℃保溫30分鐘滅菌備用。
已發(fā)酵約8天的泰樂菌素發(fā)酵液加鹽酸調(diào)pH到3.3-3.9，固液分離。向得到的液體中加入9N的NaOH溶液調(diào)pH7.2-8.0，加熱到60-80℃出現(xiàn)沉淀。固液分離，如有必要將固體物水洗，再次固液分離，得到泰樂菌素堿一次沉淀物中間體。再加入含與泰樂菌素堿一次沉淀物中間體等當(dāng)量的酒石酸溶液溶解。加入9N氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.5-8.0，加熱70-75℃分離得到泰樂菌素堿二次沉淀物中間體，泰樂菌素二次沉淀物中間體加入等當(dāng)量的酒石酸溶液配制成25％的酒石酸泰樂菌素水溶液溶液，該溶液與上述的L-亮氨酸溶液混合后加熱至70-80℃保溫10鐘冷卻備用。
使用鏈霉菌Streptomyces.Thermotolerans的變異株經(jīng)菌種培養(yǎng)后接種到容積60立方米并裝有35立方米發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)2-3天，完成微生物菌體的生產(chǎn)階段后，按工藝要求開始按比例緩慢向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)加上述的L-亮氨酸懸浮液、泰樂菌素鹽溶液，液化淀粉溶液，直至發(fā)酵結(jié)束。自補(bǔ)料開始計(jì)6-7天完成由泰樂菌素生物轉(zhuǎn)化為3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐陌l(fā)酵全過程。
應(yīng)用此工藝發(fā)酵結(jié)束后可得到約與原工藝相同的42立方米的發(fā)酵液。由于使用液化淀粉與葡萄糖的混合液和泰樂菌素堿二次沉淀物中間體作為補(bǔ)料液，使生產(chǎn)3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪爻杀窘档土?％以上。
實(shí)例三本實(shí)例是使用高濃度泰樂菌素鹽一次液中間體，高濃度L-亮氨酸，液化淀粉作為生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐难a(bǔ)料物的生產(chǎn)方法。
將3份重量的吐溫20，0.5-1份重量的羧甲基纖維素鈉，1-2份重量的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中常用的消泡劑與15份的L-亮氨酸與79份的水混合，加熱到60-70℃溶解，加入8N的NaOH溶液調(diào)pH10以下使之完全溶解，劇烈攪拌下緩慢加入等當(dāng)量的鹽酸調(diào)pH6-8。此時(shí)有大量細(xì)小顆粒出現(xiàn)，并均勻懸浮于液體中。120℃滅菌30分鐘，保持緩慢攪拌備用。
將5份重量的淀粉加5份水，加入淀粉重量0.2％的糖化酶，70-75℃攪拌20-30分鐘，此時(shí)淀粉液化成了流動(dòng)性很好的液化淀粉溶液。120℃保溫30分鐘滅菌備用。
已發(fā)酵約8天的泰樂菌素發(fā)酵液加鹽酸調(diào)pH到3.3-3.9，固液分離。向得到的液體中加入9N的NaOH溶液調(diào)pH7.2-8.0，加熱到60-80℃出現(xiàn)沉淀。固液分離。如有必要將固體物用60-80℃水洗，再次固液分離，得到泰樂菌素堿一次沉淀物中間體。將該泰樂菌素堿一次沉淀物中間體加入等當(dāng)量的酒石酸溶液或其它的酸溶液將該中間體溶解，配制成30-50％的泰樂菌素酒石酸鹽一次液。該泰樂菌素酒石酸鹽一次液與本實(shí)例所述L-亮氨酸懸浮液混合，加熱到65-75℃維持10-20分鐘備用。
使用鏈霉菌Streptomyces.Thermotolerans的變異株，經(jīng)菌種培養(yǎng)后接種到容積120立方米并裝有42立方米發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)2-3天，完成微生物菌體的生產(chǎn)階段后開始按比例補(bǔ)加。上述的L-亮氨酸懸浮液、泰樂菌素溶液，葡萄糖液化淀粉溶液。自補(bǔ)料開始計(jì)6-7天完成由泰樂菌素生物轉(zhuǎn)化為3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪氐陌l(fā)酵全過程。
應(yīng)用此工藝可得到約與原工藝相同的82立方米的發(fā)酵液。但單位體積的發(fā)酵液中所含3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素比原工藝提高了15-20％。同時(shí)，由于使用液化淀粉與葡萄糖的混合液和泰樂菌素的中間體作為補(bǔ)料液，使生產(chǎn)3-O-乙酰基4”-O-異戊酰基泰樂菌素成本降低了15％以上實(shí)例四本實(shí)例是使用泰樂菌素半成品生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素生產(chǎn)方法。
將L-亮氨酸配制成2-3％的溶液，120℃保溫滅菌30分鐘后備用。
將5份重量的淀粉加5份水，加入淀粉重量0.2％的淀粉酶，70-75℃攪拌20-30分鐘，此時(shí)淀粉液化成了流動(dòng)性很好的液化淀粉溶液。含50％(w/v)液化淀粉的混合液，120℃保溫30分鐘滅菌備用。
泰樂菌素產(chǎn)生菌經(jīng)液體發(fā)酵140-200小時(shí)后用酸調(diào)整發(fā)酵液pH3.0-4.0后后固液分離，濾液用堿調(diào)pH8.0以上使濾液中的泰樂菌素成為易溶解于有機(jī)溶媒的泰樂菌素堿。用有機(jī)溶媒萃取濾液中所含泰樂菌素堿，該含有泰樂菌素堿的萃取液與稀酸的水溶液充分混合，使其中的泰樂菌素堿轉(zhuǎn)化成為易溶于水的泰樂菌素鹽而轉(zhuǎn)移到水溶液中。該水溶液經(jīng)超濾膜濃縮后成為含量為3-30％的泰樂菌素鹽即泰樂菌素半成品，該半成品與上述2-3％的滅菌后的L-亮氨酸溶液混合備用。
使用鏈霉菌Streptomyces.Thermotolerans的變異株經(jīng)菌種培養(yǎng)后接種到容積120立方米并裝有70立方米發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)2-3天，完成微生物菌體的生產(chǎn)階段后開始按比例補(bǔ)加。上述的L-亮氨酸懸浮液、泰樂菌素鹽的溶液，液化淀粉溶液。自補(bǔ)料開始計(jì)6-7天完成由泰樂菌素生物轉(zhuǎn)化為3-O-乙酰基4”-O-異戊?；肪氐陌l(fā)酵全過程。
本實(shí)例中由于使用了制備精制泰樂菌素酒石酸鹽所需噴霧干燥步驟之前的泰樂菌素半成品替代精制泰樂菌素做為生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素的補(bǔ)料原料，比使用精制泰樂菌素作為補(bǔ)料原料的成本降低了約5％以上。
參考資料Sebek et al.，Genetics of Industrial Microorganisms，Pub.by American Societyfor Microbiology，pp.117-122(1979).M.Tsuchiya et al.，″Studies on the Effects of 3-Acetyl-4″-Isovaleryltylosin AgainstMultiple-Drug Resistant Strains of Staphylococcus Aureus″，J.Antibiotics 34(3)，305-306(1981).M.Tsuchiya et al.，″Studies of Tylosin Derivatives Effective Against Macrolide-ResistantStrainsSynthesis and Structure-Activity Relationships″，J.Antibiotics 35(6)，661-671(1982).Derwent Abstract Nos.66634C/38，27592A/15 of Japanese Unexamined Patent Nos.J5 5043-013，J53021-182，3-26-80，2-27-78(Sanraku Ocean).Okamoto et al.，″The Activity of 4″-Acylated Tylosin Derivatives Against Macrolide-ResistantGram-Positive BacteriaJ.Antibiotics 32，542-544(1979).Okamoto et al.，″Biological Properties of New Acyl Derivatives of Tylosin″，J.Antibiotics 33，1309-1315(1980).
權(quán)利要求
1.一種提高3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本的方法，其特征在于，發(fā)酵生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪剡^程中，使用高濃度的，加入助溶劑或表面活性劑的L-亮氨酸溶液或高濃度的，加入助溶劑、表面活性劑及助懸劑的L-亮氨酸固體懸浮液，作為補(bǔ)料物補(bǔ)入發(fā)酵液中。
2.一種提高3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪禺a(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本的方法，其特征在于，加入表面活性劑的含泰樂菌素鹽成品9-70％的溶液或加入表面活性劑及助懸劑的含泰樂菌素堿成品9-70％固體懸浮液作為補(bǔ)料物補(bǔ)入發(fā)酵液；
3.一種提高3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪禺a(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本的方法，其特征在于，發(fā)酵生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊?；肪氐倪^程中，使用液化淀粉溶液或液化淀粉的固體懸浮液補(bǔ)料物補(bǔ)入發(fā)酵液中。
4.一種提高3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本的方法，其特征在于，發(fā)酵生產(chǎn)3-O-乙?；?”-O-異戊酰基泰樂菌素過程中，使用在發(fā)酵法生產(chǎn)泰樂菌素的鹽或泰樂菌素堿的提純生產(chǎn)過程中，得到的由泰樂菌素鹽半成品或泰樂菌素堿的中間體制備成含泰樂菌素鹽4-70％的溶液或含泰樂菌素堿4-70％的固體懸浮液作為補(bǔ)料物補(bǔ)入發(fā)酵液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求書1和2所述的方法，其特征在于加入助溶劑的L-亮氨酸的濃度為2.0-20％(w/v)。L-亮氨酸的助溶劑濃度為0.1-30％，種類包括無機(jī)酸、有機(jī)酸、無機(jī)堿、有機(jī)堿、吡咯烷酮類化合物、酰胺類化合物、氮酮。優(yōu)選的L-亮氨酸的助溶劑為無機(jī)酸、無機(jī)堿。特別優(yōu)選的L-亮氨酸的助溶劑為硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀。加入的表面活性劑濃度為0.1-40％，種類包括離子型和非離子型的表面活性劑，優(yōu)選的表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、失水山醇脂肪酸酯、烷基酚聚氧乙烯醚、蓖麻油聚乙烯醚類和由油合成的酯類化合物，表面活性劑可以使用一種，也可兩種或兩種以上混合使用。加入的助懸劑濃度為0.1-20％，種類包括作為食品添加劑使用的及化工行業(yè)使用的親水性助懸劑。優(yōu)選的助懸劑為瓊脂，羧甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，淀粉，明膠，海藻酸鈉，果膠，藻朊酸丙二脂，阿拉伯膠，酪朊酸鈉。
6.據(jù)權(quán)利要求書3所述的方法，其特征在于液化淀粉是淀粉加入糖化酶經(jīng)酶解液化后的產(chǎn)物，濃度為20-80％(w/v)。
7.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的方法，其特征在于泰樂菌素鹽的半成品為發(fā)酵法生產(chǎn)泰樂菌素堿或泰樂菌素鹽過程中，泰樂菌素經(jīng)過提純得到的含泰樂菌素鹽或泰樂菌素堿3-70％的液體或固體物。
8.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的方法，其特征還在于泰樂菌素堿中間體為泰樂菌素堿的一次沉淀物、泰樂菌素鹽一次溶液、泰樂菌素堿二次沉淀物、泰樂菌素鹽二次溶液和萃取后的泰樂菌素鹽溶液。泰樂菌素堿或泰樂菌素鹽中間體的制備方法為泰樂菌素產(chǎn)生菌經(jīng)液體發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，將得到的液體調(diào)pH＝7.0-14，加熱至50-100℃后產(chǎn)生泰樂菌素堿沉淀，經(jīng)固液分離而得到的泰樂菌素堿的一次沉淀物；該泰樂菌素堿的一次沉淀物加入有機(jī)酸或無機(jī)酸溶解該沉淀得到的泰樂菌素一次鹽溶液。泰樂菌素一次鹽溶液再用堿調(diào)pH7.0-14，加熱到50-100℃經(jīng)固液分離而得到的更純的泰樂菌素堿二次沉淀物，泰樂菌素二次該沉淀物加入有機(jī)酸或無機(jī)酸溶解得到泰樂菌素二次鹽溶液；泰樂菌素堿一次沉淀物加入疏水性有機(jī)溶媒萃取得到泰樂菌素堿萃取液，向泰樂菌素堿萃取液中加入無機(jī)酸，得到萃取后的泰樂菌素鹽溶液。優(yōu)選的泰樂菌素中間體為泰樂菌素堿一次沉淀物、泰樂菌素鹽一次溶液和萃取后的泰樂菌素鹽溶液。優(yōu)選的制備方法為泰樂菌素產(chǎn)生菌經(jīng)液體發(fā)酵后的發(fā)酵液經(jīng)固液分離后，將得到的濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH7.5-9.0，加熱至60-75℃后經(jīng)固液分離而得到的泰樂菌素堿一次沉淀物。向泰樂菌素堿一次沉淀物中加入酒石酸溶液得到的泰樂菌素一次鹽溶液。按泰樂菌素堿一次沉淀物∶乙酸丁脂＝1∶2的體積比將兩種物質(zhì)混均萃取，分離得到乙酸丁酯萃取液，向乙酸丁酯萃取液中加入酒石酸溶液，攪拌分離得到萃取后的泰樂菌素鹽溶液。
全文摘要
本發(fā)明是在發(fā)酵法合成泰樂菌素衍生物3－O－乙酰基4”－O－異戊?；肪貢r(shí)，向發(fā)酵液中補(bǔ)入高濃度的L－亮氨酸溶液或固體懸浮液和高濃度的泰樂菌素溶液，及使用成本較低的液化淀粉液及成本較低的泰樂菌素半成品或中間體作為發(fā)酵過程中的補(bǔ)料物，比現(xiàn)有工藝過程顯著提高產(chǎn)量及降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明通過向L－亮氨酸溶液或懸浮液加助溶劑，表面活性劑及助懸劑解決了高濃度L－亮氨酸溶液易結(jié)晶沉淀造成的計(jì)量不準(zhǔn)的問題。本發(fā)明還提供了一種低成本的制備泰樂菌素中間體的方法。
文檔編號(hào)C12P17/18GK1427081SQ01144540
公開日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月19日
發(fā)明者徐兵 申請(qǐng)人:徐兵