專利名稱：堿性氨基酸的制備方法
背景技術(shù)：
在通過(guò)發(fā)酵作用制備堿性氨基酸的方法中，具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物在培養(yǎng)液中培養(yǎng)以產(chǎn)生和積聚堿性氨基酸，并將堿性氨基酸從培養(yǎng)液中收集起來(lái)。在該方法中，以分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)。
在這樣的通過(guò)發(fā)酵作用的堿性氨基酸制備方法中，將硫酸根離子或氯離子添加進(jìn)培養(yǎng)基中作為平衡陰離子，以便于保持電中性。對(duì)于硫酸根離子源，主要以硫酸銨的形式提供(JP未審公開(kāi)5-30985和JP未審公開(kāi)5-244969)。
在大多數(shù)情況下，當(dāng)需要提純時(shí)，從培養(yǎng)液中收集堿性氨基酸是通過(guò)離子交換法進(jìn)行的。例如在L-賴氨酸的情況下，在發(fā)酵培養(yǎng)液每周一次的酸化之后，L-賴氨酸被吸附到離子交換樹(shù)脂上，且接著從具有銨離子的樹(shù)脂上脫附。該脫附的L-賴氨酸以賴氨酸堿的形式使用或以具有鹽酸的L-賴氨酸鹽酸鹽的形式結(jié)晶。
另一方面，當(dāng)其沒(méi)有提純時(shí)，該發(fā)酵培養(yǎng)液被濃縮成其本身，或在其用鹽酸或硫酸進(jìn)行每周的酸化之后，進(jìn)行噴霧制粒。在該情況下，因?yàn)樵讷@得的發(fā)酵產(chǎn)品中的堿性氨基酸的含量被培養(yǎng)基中所含的殘余成分所限制，所以添加到培養(yǎng)基中的平衡陰離子不能被忽略。因此，考慮到制造成本和產(chǎn)品質(zhì)量，將要被使用的平衡陰離子的數(shù)量的減少是有重要意義的。
順便說(shuō)一下，在發(fā)酵期間通過(guò)生理代謝例如呼吸作用，微生物排出許多二氧化碳?xì)狻P未審公開(kāi)11-243985公開(kāi)了一種對(duì)在L-谷氨酸發(fā)酵中產(chǎn)生的二氧化碳?xì)膺M(jìn)行收集的方法，其特征在于讓碳酸氫鈉和/或碳酸鈉作用于從水性培養(yǎng)基中的L-谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液中分離并獲得的L-谷氨酸，以產(chǎn)生谷氨酸-鈉，并且在同時(shí)，收集產(chǎn)生的二氧化碳?xì)庾鳛楦碑a(chǎn)品。然而，在發(fā)酵期間沒(méi)有有效地利用二氧化碳?xì)狻?br> 發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于在通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)堿性氨基酸期間減少添加到培養(yǎng)基中的平衡陰離子源數(shù)量的技術(shù)。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用二氧化碳?xì)獯嫫胶怅庪x子，例如硫酸根離子，則可以降低平衡陰離子源數(shù)量，并可以有效地利用發(fā)酵期間產(chǎn)生的二氧化碳?xì)?，從而完成了本發(fā)明。
即本發(fā)明提供以下內(nèi)容(1)一種制備堿性氨基酸、或含通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括以下步驟將具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物在液體培養(yǎng)基中，在需氧的條件下培養(yǎng)，用以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積聚堿性氨基酸，其中在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的pH值被控制在6.5至9.0，而培養(yǎng)結(jié)束時(shí)則為7.2-9.0，和一個(gè)培養(yǎng)期，其中在培養(yǎng)期間，通過(guò)控制發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)，使其在發(fā)酵期間為正壓力，或向培養(yǎng)基中提供二氧化碳?xì)饣蚝趸細(xì)獾幕旌蠚怏w，保證在培養(yǎng)基中有2g/L或更多的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的存在，使得碳酸氫根離子和/或碳酸根離子起陽(yáng)離子的平衡離子作用，而陽(yáng)離子主要由堿性氨基酸組成。
(2)根據(jù)(1)的制備堿性氨基酸、或含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)是0.03-0.2Mpa。
(3)根據(jù)(1)或(2)的制備堿性氨基酸、或含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中堿性氨基酸由選自L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸的一種或多種氨基酸組成。
(4)一種通過(guò)將具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物在需氧條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)而獲得的含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液，或由該培養(yǎng)液產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)品，其中含有碳酸氫根離子和/或碳酸根離子作為主要由堿性氨基酸組成的陽(yáng)離子的平衡離子，當(dāng)量濃度比是5-80％，該比值根據(jù)以下等式計(jì)算當(dāng)量濃度比＝[碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的當(dāng)量濃度]/[主要由堿性氨基酸組成的陽(yáng)離子的當(dāng)量濃度]×100(5)根據(jù)(4)的含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品，其中堿性氨基酸由選自L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸的一種或多種氨基酸組成。
(6)一種含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品，它是通過(guò)將根據(jù)(4)的含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品排出二氧化碳?xì)舛@得的。
根據(jù)本發(fā)明，可以降低工業(yè)原料，例如硫酸銨的量，且因此可以低成本制備堿性氨基酸。而且，雖然獲得的發(fā)酵培養(yǎng)液含碳酸根離子和/或碳酸氫根離子，但它們通過(guò)加熱可以輕易地被排放進(jìn)大氣中。因此，可以獲得具有高氨基酸濃度固體含量的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品。
附圖簡(jiǎn)述附

圖1顯示的是實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1中硫酸根離子以及碳酸根離子和碳酸氫根離子相對(duì)于主要由培養(yǎng)培養(yǎng)液中賴氨酸構(gòu)成的陽(yáng)離子的當(dāng)量濃度比的時(shí)程和所得到的發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)。
附圖2顯示的是實(shí)施例2和對(duì)比實(shí)施例2中硫酸根離子以及碳酸根離子和碳酸氫根離子相對(duì)于主要由培養(yǎng)培養(yǎng)液中賴氨酸構(gòu)成的陽(yáng)離子的當(dāng)量濃度比的時(shí)程和所得到的發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)。
發(fā)明詳述在下文將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解釋。
本發(fā)明的方法其特征在于，在通過(guò)發(fā)酵制備堿性氨基酸的方法中，使用碳酸根離子和/或碳酸氫根離子作為堿性氨基酸的主要平衡離子，該方法包括將具有在液體培養(yǎng)基中、在需氧條件下產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，用以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累堿性氨基酸。
通過(guò)本發(fā)明方法制備的堿性氨基酸可以由例如選自L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸的一種或多種氨基酸組成。
對(duì)用于本發(fā)明方法具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物沒(méi)有特別的限制，且可以使用任何微生物只要它們通過(guò)發(fā)酵可以產(chǎn)生堿性氨基酸。這樣的微生物的例子包括，例如，棒狀桿菌，屬于埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽胞桿菌屬等的細(xì)菌。棒狀桿菌和埃希氏桿菌將會(huì)在下面解釋，但用于本發(fā)明方法的微生物并不限于這些微生物。
棒狀桿菌包括迄今為止被歸類為短桿菌屬的那些細(xì)菌，但目前合并成棒狀桿菌屬(Int.J.Syst.Bacteriol.，41255(1981))，并包括相當(dāng)接近棒狀桿菌屬的屬于短桿菌屬的細(xì)菌。這樣的棒狀桿菌的實(shí)例將在下文提及。
嗜乙酰乙酸棒狀桿菌醋谷棒狀桿菌Corynebacterium alkanolyticum美棒狀桿菌谷氨酸棒狀桿菌百合棒狀桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)Corynebacterium melassecolaCorynebacterium thermoaminogenes力士棒狀桿菌擴(kuò)展短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)Brevibacterium immariophilum乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒狀桿菌)玫瑰色短桿菌解糖短桿菌生硫短桿菌白色短桿菌蠟狀短桿菌嗜氨短桿菌作為屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌的一個(gè)實(shí)例，可提及大腸埃希氏桿菌。
具有產(chǎn)生L-賴氨酸能力的棒狀桿菌的實(shí)例包括耐S-(2-氨基乙基)一半胱氨酸(下文簡(jiǎn)寫(xiě)為“AEC”)的突變體菌株，需要氨基酸例如L-高絲氨酸用于其生長(zhǎng)的突變體菌株(日本專利公開(kāi)48-28078和56-6499)，耐AEC并且還需要氨基酸例如，L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸的突變體菌株(US3,708,395和US3,825,472)，耐DL-á-氨基--己內(nèi)酰胺、DL-α-氨基-月桂基內(nèi)酰胺、天門(mén)冬氨酸類似物、磺胺藥物、醌型化合物和N-月桂酰亮氨酸的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體菌株，耐草酰乙酸酯脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶抑制劑的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體菌株(JP未審公開(kāi)50-53588、50-31093、52-102498、53-9394、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995、56-39778，日本專利公開(kāi)53-43591和53-1833)，需要肌醇或醋酸酯的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體菌株(JP未審公開(kāi)55-9784和56-8692)，對(duì)氟乙酰甲酸或34℃或更高溫度敏感的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體菌株(JP未審公開(kāi)55-9783和53-86090)，耐乙二醇的短桿菌屬或棒狀桿菌屬的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體菌株(US專利申請(qǐng)333455)等。
具體的實(shí)例是乳發(fā)酵短桿菌ATCC31269、黃色短桿菌ATCC21475和醋谷棒狀桿菌ATCC21491。
作為屬于埃希氏桿菌屬的產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌，耐L-賴氨酸類似物的突變體菌株可以作為例證。該L-賴氨酸類似物是一種抑制埃希氏桿菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，但如果培養(yǎng)基中存在有L-賴氨酸，則這種抑制被全部或部分鈍化。例如，可以是噁溶菌素、賴氨酸異羥肟酸鹽、(S)-2-氨基乙基一半胱氨酸(AEC)、γ-甲基賴氨酸、α-氯己內(nèi)酰胺等。通過(guò)常規(guī)的人工突變體技術(shù)可以從埃希氏桿菌屬細(xì)菌獲得耐這些賴氨酸類似物的突變體菌株。用于產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌菌株的具體實(shí)例包括大腸埃希氏桿菌AJ11442(FERMBP-1543、NRRLB-12185；參見(jiàn)JP未審公開(kāi)56-18596和US4346170)和大腸埃希氏桿菌VL611。AJ11442菌株保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(目前為獨(dú)立的管理公司，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，International Patent Organism Depositary)(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，郵編305-5466)，1981年5月1日，登記號(hào)為FERMP-5084。接著在1987年10月29日它從上述原始保藏處轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯條約所規(guī)定的國(guó)際保藏，登記號(hào)為FERMBP-1543。在前述微生物中，通過(guò)L-賴氨酸天冬氨酸激酶的反饋抑制被鈍化。
具有產(chǎn)生L-賴氨酸能力的大腸埃希氏桿菌菌株的具體實(shí)例包括大腸埃希氏桿菌W3110(tyrA)/pCABD2(國(guó)際專利公開(kāi)WO95/16042)等。該大腸埃希氏桿菌W3110(tyrA)/pCABD2是通過(guò)將含L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶基因的質(zhì)粒pCABD2引入W3110(tyrA)而獲得的菌株，是大腸埃希氏桿菌的tyrA缺陷菌株。該菌株W3110(tyrA)指定為AJ12604，保藏在National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofInternational Trade and Industry(目前為獨(dú)立的管理公司，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International Patent OrganismDepositary)(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-sbi，Ibaraki-ken，Japan，郵編305-5466)，1991年1月28日，登記號(hào)為FERM P-11975，接著在1987年10月29日轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯條約所規(guī)定的國(guó)際保藏，登記號(hào)為FERMBP-3579。
該質(zhì)粒pCABD2含用于編碼突變型二氫吡啶二羧酸鹽合酶的基因，所述的合酶的第118組氨酸殘基被酪氨酸殘基所替代，且通過(guò)L-賴氨酸的反饋抑制被鈍化，還包含用于編碼突變型天冬氨酸激酶III的基因，其第352蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基所取代，且通過(guò)L-賴氨酸的反饋抑制被鈍化，以及用于編碼二氫吡啶二羧酸鹽還原酶和二氨基庚二酸脫氫酶的基因。
而且，該大腸埃希氏桿菌W3110(tyrA)菌株可以如下述獲得。即，許多菌株通過(guò)將質(zhì)粒引入W3110(tyrA)菌株而獲得，其公開(kāi)于歐洲專利未審公開(kāi)488424/1992中。例如，將引入質(zhì)粒pHATerm而獲得的菌株指定為大腸埃希氏桿菌W3110(tyrA)/pHATerm菌株，且保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology(目前為獨(dú)立的管理公司，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depositary)登記號(hào)為FERM BP-3653。通過(guò)例如從大腸埃希氏桿菌W3110(tyrA)/pHATerm菌株除去質(zhì)粒pHATerm可獲得W3110(tyrA)菌株。質(zhì)粒的去除可以常規(guī)方式進(jìn)行。
屬于沙雷氏菌屬的產(chǎn)生L-賴氨酸細(xì)菌的實(shí)例包括通過(guò)將用于編碼突變的二氫吡啶二羧酸鹽合酶的DNA引入其細(xì)胞而轉(zhuǎn)化的沙雷氏菌，所述的突變使通過(guò)L-賴氨酸反饋的抑制鈍化，和含天冬氨酸激酶的沙雷氏菌，所述的天冬氨酸激酶通過(guò)L-賴氨酸反饋的抑制被鈍化(WO96/41871)。
具有產(chǎn)生L-精氨酸能力的棒狀桿菌的實(shí)例包括棒狀桿菌的野生型菌株；耐某些試劑的棒狀桿菌，這些試劑包括磺胺藥物、2-噻唑丙氨酸、α-氨基-β-羥基戊酸等；除了耐2-噻唑丙氨酸以外，顯示出對(duì)于L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的棒狀桿菌(JP未審公開(kāi)54-44096)；耐酮丙二酸、氟丙二酸或一氟乙酸的棒狀桿菌(JP未審公開(kāi)57-18989)；耐精氨醇的棒狀桿菌(JP未審公開(kāi)62-24075)；耐X-胍的棒狀桿菌(X表示脂肪酸或脂肪族鏈的衍生物，JP未審公開(kāi)2-186995)等。
具體地說(shuō)，可以是黃色短桿菌AJ11169(FERM BP-6892)，谷氨酸棒狀桿菌AJ12092(FERMBP-6906)，黃色短桿菌AJ11336(FERMBP-6893)、黃色短桿菌AJ11345(FERMBP-6894)和乳發(fā)酵短桿菌AJ12430(FERMBP-2228)。AJ11169菌株和AJ12092菌株是耐2-噻唑丙氨酸菌株，公開(kāi)于JP未審公開(kāi)54-44096中，AJ11336菌株是耐受精氨醇和磺胺嘧啶的菌株，公開(kāi)于日本專利公開(kāi)62-24075中，AJ11345菌株是耐精氨醇、2-噻唑丙氨酸、磺胺胍的菌株，并顯示出組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷，公開(kāi)于日本專利公開(kāi)62-24075中，而AJ12430菌株是耐辛基胍和2-噻唑丙氨酸的菌株，公開(kāi)于JP未審公開(kāi)2-186995中。
具有產(chǎn)生L-精氨酸能力的埃希氏桿菌的實(shí)例包括引入argA基因的大腸埃希氏桿菌(見(jiàn)JP未審公開(kāi)57-5693)，且具有產(chǎn)生L-精氨酸能力的沙雷氏菌屬的細(xì)菌實(shí)例包括粘質(zhì)沙雷氏菌，該細(xì)菌代謝精氨酸能力缺陷，且顯示出耐精氨酸拮抗物和刀豆氨酸，并對(duì)賴氨酸有營(yíng)養(yǎng)缺陷(參見(jiàn)JP未審公開(kāi)52-8729)。
具有產(chǎn)生L-組氨酸能力的棒狀桿菌的實(shí)例包括屬于短桿菌屬，且耐維生素B1拮抗物的微生物。具體地說(shuō)，乳發(fā)酵短桿菌FERM P-2170、FERM P-2316、FERM P-6478、FERM P-6479、FERM P-6480和FERM P-6481(JP未審公開(kāi)59-63194)。而且也可以是屬于短桿菌屬或棒狀桿菌屬，且耐多聚乙酰和具有產(chǎn)生L-組氨酸能力的突變體菌株，具體說(shuō)是FERMP-4161、FERMP-7273、FERMP-8371、FERMP-8372和ATCC1467。
具有產(chǎn)生L-組氨酸能力的屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌實(shí)例包括屬于埃希氏桿菌屬，且耐組氨酸類似物的突變體菌株，例如，大腸埃希氏桿菌R-344菌株，和屬于埃希氏桿菌屬并引入了L-組氨酸合成系統(tǒng)酶基因的細(xì)菌，所述的基因從前述菌株提取的。具體地說(shuō)，可以是大腸埃希氏桿菌NRRL-12116、NRRL-12118、NRRL-12119、NRRL-12120和NRRL-12121(JP未審公開(kāi)56-5099)。
具有產(chǎn)生L-組氨酸能力的屬于芽胞桿菌屬的細(xì)菌實(shí)例包括屬于芽胞桿菌屬，且耐組氨酸類似物的突變體菌株，和屬于芽胞桿菌屬并引入了從前述突變體菌株獲得的與耐組氨酸拮抗物有關(guān)的基因。具體地說(shuō)，可以是FERMBP-218、FERM BP-224和FERM BP-219(JP未審公開(kāi)58-107192)。
在本發(fā)明中，具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物可以在需氧條件下，在液體培養(yǎng)基中被培養(yǎng)，例如，以下述方式，優(yōu)選采用碳酸根離子和/或碳酸氫根離子作為堿性氨基酸的主要平衡離子。
在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的pH值被控制在6.5至9.0，優(yōu)選6.5至8.0，而培養(yǎng)結(jié)束時(shí)則為7.2-9.0。而且，一個(gè)培養(yǎng)期，其中在培養(yǎng)期間，通過(guò)控制發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)，使其在發(fā)酵期間為正壓力，或向培養(yǎng)基中提供二氧化碳?xì)饣蚝趸細(xì)獾幕旌蠚怏w，保證在培養(yǎng)基中有2g/L或更多的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的存在。本文所用的“一個(gè)培養(yǎng)期，其中在培養(yǎng)期間，保證在培養(yǎng)基中有2g/L或更多的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的存在”的描述，并不意味著在整個(gè)培養(yǎng)期必須有2g/L或更多的離子存在，而是意味著培養(yǎng)期的任何一段時(shí)期里，有2g/L或更多的離子存在即已足夠。優(yōu)選地，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期至靜止期有2g/L或更多的離子存在。
在本發(fā)明中，提高控制的pH使平衡由一價(jià)陰離子HCO3-占支配地位轉(zhuǎn)變成作為平衡離子更有效的二價(jià)陰離子CO32-占支配地位。而且，當(dāng)用氨控制pH時(shí)，提高pH提供氨，且其可以成為堿性氨基酸的氮源。除了堿性氨基酸，作為陽(yáng)離子的可以是來(lái)源于培養(yǎng)基成分的K、Na、Mg、Ca等。這些陽(yáng)離子占陽(yáng)離子總量的50％或更少。
為了在發(fā)酵罐中獲得正壓，例如，可以采用進(jìn)氣壓高于排氣壓。通過(guò)在發(fā)酵罐中使用正壓，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的二氧化碳?xì)獗蝗芙庥谂囵B(yǎng)液中以形成碳酸氫根離子或碳酸根離子，且它們作為堿性氨基酸的平衡離子。具體地說(shuō)，發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)可以是0.03-0.2Mpa，優(yōu)選0.05-0.15Mpa。而且，二氧化碳?xì)饪梢酝ㄟ^(guò)向培養(yǎng)液中通入二氧化碳?xì)饣蚝卸趸細(xì)獾幕旌蠚怏w而溶于培養(yǎng)液中。而且，可以控制發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)成為正壓，同時(shí)向培養(yǎng)液中提供二氧化碳?xì)饣蚝卸趸細(xì)獾幕旌蠚怏w。
為了在發(fā)酵罐中獲得正壓，例如，可以采用進(jìn)氣壓高于排氣壓。當(dāng)將二氧化碳?xì)馓峁┙o培養(yǎng)液時(shí)，可以向培養(yǎng)液中通以純二氧化碳?xì)饣蚝?體積％或更多二氧化碳?xì)獾幕旌蠚怏w。
對(duì)用于培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基沒(méi)有特別的限制，依據(jù)所采用的微生物，含有機(jī)或無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)源例如碳源和氮源以及其它痕量營(yíng)養(yǎng)素的任何常規(guī)的公知培養(yǎng)基可以被使用?？梢允褂萌魏翁荚粗灰⑸锟梢詫⑵涫褂眉纯梢?。例如，可以是糖，例如，蔗糖、葡萄糖、果糖、糖蜜和淀粉水解產(chǎn)物，有機(jī)酸例如，乙酸，醇例如，乙醇等。作為氮源，可以是無(wú)機(jī)物質(zhì)，例如銨離子，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、酵母抽提物等。作為痕量營(yíng)養(yǎng)素，可以是氨基酸、維生素、痕量金屬元素等。
對(duì)于發(fā)酵方案也沒(méi)有特別的限制，可以以任何的分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)的形式進(jìn)行，所述的分批培養(yǎng)其中的培養(yǎng)基不需要重新進(jìn)料，所述的流加培養(yǎng)其中當(dāng)初始添加的糖被消耗時(shí)，培養(yǎng)基需加料，而所述的連續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基的體積超過(guò)發(fā)酵罐可接受的體積時(shí)，取出其中的培養(yǎng)基。
而依據(jù)所采用的微生物選擇合適的培養(yǎng)溫度，通常是25-45℃，優(yōu)選30-40℃。而且，在發(fā)酵期間，要進(jìn)行充分的攪拌和提供充足的氧氣。
在常規(guī)方法中，將用硫酸或鹽酸獲得的足夠量的硫酸銨、氯化銨或蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物添加到培養(yǎng)基中，以便于將其用作產(chǎn)生的堿性氨基酸的平衡陰離子源，由此，該培養(yǎng)基含來(lái)源于這些原料的硫酸根離子和氯離子。因此，顯示弱酸性的碳酸根離子的濃度在培養(yǎng)期間非常低，它們以ppm級(jí)存在。本發(fā)明其特征在于，降低這些硫酸根離子和氯離子，并在發(fā)酵環(huán)境中，將發(fā)酵期間由微生物排放出的二氧化碳?xì)馊芙庠谂囵B(yǎng)基中，利用這些二氧化碳作為平衡離子源。因此，根據(jù)本發(fā)明不需要添加超過(guò)其微生物生長(zhǎng)所必須量的硫酸根離子或氯離子。優(yōu)選地，在培養(yǎng)的早期階段，向培基中添加合適量的硫酸銨等，且在培養(yǎng)期間停止進(jìn)料?；蛘?，可以將硫酸銨等添加進(jìn)培養(yǎng)基，并保持培養(yǎng)基中其與碳酸根離子或碳酸氫根離子的良好平衡。進(jìn)一步地，可以將氨水添加進(jìn)培養(yǎng)基作為L(zhǎng)-賴氨酸的氮源。
通常，如果將硫酸銨添加進(jìn)培養(yǎng)基作為堿性氨基酸的平衡離子源，則在培養(yǎng)液中二氧化碳通過(guò)硫酸根離子排放。而根據(jù)本發(fā)明，由于不需要向培養(yǎng)基中添加過(guò)量的硫酸銨，二氧化碳可以輕易地溶于發(fā)酵培養(yǎng)液中。
通過(guò)本發(fā)明獲得的含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液，相對(duì)于通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的堿性氨基酸的當(dāng)量濃度含5至80％濃度的碳酸根離子或碳酸氫根離子。這些碳酸根離子或碳酸氫根離子通過(guò)加熱釋放出二氧化碳?xì)狻Ｒ虼?，可以提高在發(fā)酵培養(yǎng)液中的固體成分中的堿性氨基酸含量。進(jìn)一步地，如果向發(fā)酵培養(yǎng)液添加比碳酸更強(qiáng)的酸，它可以輕易地代替碳酸，且因此可以選擇多種類型的鹽。在本發(fā)明中，該“發(fā)酵產(chǎn)品”包括濃縮的和干燥的由前述發(fā)酵培養(yǎng)液獲得的產(chǎn)品，該發(fā)酵培養(yǎng)液本身和其干燥的產(chǎn)品。
通過(guò)將諸如離子交換樹(shù)脂技術(shù)、沉淀技術(shù)和其它技術(shù)這樣的公知技術(shù)組合使用可以從發(fā)酵培養(yǎng)液收集堿性氨基酸。
實(shí)施例下面，本發(fā)明將參照下述實(shí)施例進(jìn)行更具體的說(shuō)明。
當(dāng)培養(yǎng)液中的糖濃度變?yōu)?g/L或更少時(shí)，含下列成分的培養(yǎng)基通過(guò)JP未審公開(kāi)5-30985中所述的方法進(jìn)行添加。具體地說(shuō)，測(cè)定pH和溶解的氧的濃度，基于測(cè)定值的改變來(lái)探測(cè)碳源的消耗狀態(tài)，并添加培養(yǎng)基以保持培養(yǎng)液中碳源的濃度是5g/L或更少。[進(jìn)料培養(yǎng)基]含530g/L的葡萄糖、1.4g/L(作為氮源)的大豆蛋白水解產(chǎn)物、1.0g/L的KOH、44g/L的氯化銨、0.3g/L的MnSO4·7H2O、0.35 mg/L的鹽酸硫胺素和0.35mg/L的生物素(pH5.5)的培養(yǎng)基。
在預(yù)定量的進(jìn)料培養(yǎng)基添加之后，當(dāng)培養(yǎng)液中的糖被完全消耗之后，結(jié)束培養(yǎng)。該培養(yǎng)在pH7.0時(shí)開(kāi)始培養(yǎng)，且pH逐漸改變至8.0。同時(shí)，罐中的壓強(qiáng)從0改變至0.12Mpa。
作為對(duì)比實(shí)施例1，添加硫酸銨以代替pH和罐中壓強(qiáng)的增加。
在培養(yǎng)期間主要陰離子濃度的改變?nèi)鐖D1中所示。在對(duì)比實(shí)施例1中的培養(yǎng)期間硫酸根離子得到提高，但在實(shí)施例1中該濃度低而碳酸氫根離子濃度提高。
在完成培養(yǎng)之后，相對(duì)于主要由賴氨酸構(gòu)成的陽(yáng)離子，碳酸根離子和碳酸氫根離子的當(dāng)量濃度比是33％，所述的L-賴氨酸是一種發(fā)酵培養(yǎng)液中的堿性氨基酸。進(jìn)一步地，在發(fā)酵培養(yǎng)液的總干產(chǎn)品中L-賴氨酸的含量是46％。在另一方面，在對(duì)比實(shí)施例1中，相對(duì)于主要由賴氨酸構(gòu)成的陽(yáng)離子，碳酸根離子和碳酸氫根離子的當(dāng)量濃度比是0％，因此硫酸根離子和氯離子過(guò)量。進(jìn)一步地，在發(fā)酵培養(yǎng)液的總干產(chǎn)品中L-賴氨酸含量是43％。
當(dāng)培養(yǎng)液中的糖濃度變?yōu)?g/L或更少時(shí)，含760g/L葡萄糖的溶液通過(guò)JP未審公開(kāi)5-30985中所述的方法，以實(shí)施例1中同樣的方式進(jìn)行添加。
在預(yù)定量的進(jìn)料培養(yǎng)基添加之后，當(dāng)培養(yǎng)液中的糖被完全消耗時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)。該培養(yǎng)在pH6.7時(shí)開(kāi)始培養(yǎng)，且pH逐漸改變至8.0。同時(shí)，罐中的壓強(qiáng)從0改變至0.1Mpa。
作為對(duì)比實(shí)施例2，添加硫酸銨以代替pH和罐中壓強(qiáng)的增加。
在培養(yǎng)期間主要陰離子濃度的改變?nèi)鐖D2中所示。在對(duì)比實(shí)施例2中的培養(yǎng)期間硫酸根離子濃度得到提高，但在實(shí)施例2中該濃度低而碳酸氫根離子濃度提高。
在完成培養(yǎng)之后，相對(duì)于主要由賴氨酸構(gòu)成的陽(yáng)離子，碳酸根離子和碳酸氫根離子的當(dāng)量濃度比是25％，所述的L-賴氨酸是一種發(fā)酵培養(yǎng)液中的堿性氨基酸。而且，在發(fā)酵培養(yǎng)液的總干產(chǎn)品中L-賴氨酸的含量是64％。
在另一方面，在對(duì)比實(shí)施例2中，相對(duì)于主要由賴氨酸構(gòu)成的陽(yáng)離子，碳酸根離子和碳酸氫根離子的當(dāng)量濃度比是0％，因此硫酸根離子和氯離子過(guò)量。而且，在發(fā)酵培養(yǎng)液的總干產(chǎn)品中L-賴氨酸含量是61％。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)發(fā)酵制備堿性氨基酸、或含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括以下步驟將具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物在液體培養(yǎng)基中，在需氧的條件下培養(yǎng)，用以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積聚堿性氨基酸，其中在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的pH值被控制在6.5至9.0，而培養(yǎng)結(jié)束時(shí)則為7.2-9.0，和一個(gè)培養(yǎng)期，其中在培養(yǎng)期間，通過(guò)控制發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)，使其在發(fā)酵期間為正壓力，或向培養(yǎng)基中提供二氧化碳?xì)饣蚝趸細(xì)獾幕旌蠚怏w，保證在培養(yǎng)基中有2g/L或更多的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的存在，使得碳酸氫根基離子和/或碳酸根離子起主要由堿性氨基酸組成的陽(yáng)離子的平衡離子作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備堿性氨基酸、或含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中發(fā)酵罐中的壓強(qiáng)是0.03-0.2Mpa。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備堿性氨基酸、或含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品的方法，其中堿性氨基酸由選自L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸的一種或多種氨基酸組成。
4.一種通過(guò)將具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物在需氧條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)而獲得的含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液，或由該培養(yǎng)液產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)品，其中含有碳酸氫根離子和/或碳酸根離子作為主要由堿性氨基酸構(gòu)成的陽(yáng)離子的平衡離子，當(dāng)量濃度比是5-80％，該比值根據(jù)以下等式計(jì)算當(dāng)量濃度比＝[碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的當(dāng)量濃度]/[主要由堿性氨基酸構(gòu)成的陽(yáng)離子的當(dāng)量濃度]×100
5.根據(jù)權(quán)利要求4的含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品，其中堿性氨基酸由選自L-賴氨酸、L-精氨酸和L-組氨酸的一種或多種氨基酸組成。
6.一種含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品，它是通過(guò)將根據(jù)權(quán)利要求4的含堿性氨基酸的發(fā)酵培養(yǎng)液或發(fā)酵產(chǎn)品排出二氧化碳?xì)舛@得的。
全文摘要
當(dāng)將具有產(chǎn)生堿性氨基酸能力的微生物在液體培養(yǎng)基中,在需氧的條件下培養(yǎng),用以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積聚堿性氨基酸而制備堿性氨基酸時(shí),在培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的pH值被控制在6.5至9.0,而培養(yǎng)結(jié)束時(shí)則為7.2－9.0,且一個(gè)培養(yǎng)期,其中在培養(yǎng)期間,通過(guò)控制發(fā)酵罐中的壓強(qiáng),使其在發(fā)酵期間為正壓力,或向培養(yǎng)基中提供二氧化碳?xì)饣蚝趸細(xì)獾幕旌蠚怏w,保證在培養(yǎng)基中有2g/L或更多的羰酸氫根離子和/或碳酸根離子的存在,使得碳酸氫根離子和/或碳酸根離子起主要由堿性氨基酸組成的陽(yáng)離子的平衡離子作用。
文檔編號(hào)C12P13/24GK1348009SQ01140778
公開(kāi)日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2001年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月24日
發(fā)明者小林正樹(shù), 糸山剛, 三谷幸生, 臼井直規(guī) 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社