專利名稱：生長變更劑對微生物菌落影響的確定方法
一般地，本發(fā)明涉及生長變更劑對生物樣品中的一種或多種微生物影響的確定方法，具體地說，涉及生長變更劑對生物樣品中的獨立的微生物菌落影響的確定方法。
對病人有效的治療經(jīng)常需要對生物樣品中的微生物進(jìn)行鑒別，和確定這些微生物對生長變更劑的敏感度。歷來，人們制備生物樣品并將其應(yīng)用于或添加到微生物生長培養(yǎng)基(稱為“培養(yǎng)物”)中，接著主要進(jìn)行基于肉眼的檢查和測試。在大多數(shù)常規(guī)測試中，用病人的樣品接種合適的生長培養(yǎng)基，且接著培養(yǎng)，直至出現(xiàn)可見的微生物生長跡象。大多數(shù)生物需要至少18至24小時的培養(yǎng)期，用以形成可見的菌落。獨立的菌落開始為單個或一小簇用顯微鏡可見的細(xì)胞或活的單位(總稱為菌落形成單位或CFU)，它們被包含于接種物中。在最初的遲滯期之后，有活力的微生物以指數(shù)增長在一代中一個細(xì)胞增長成兩個細(xì)胞，在三代中增長到八個細(xì)胞，在六代中增長到64個細(xì)胞，直至產(chǎn)生肉眼可見的菌落，所述的遲滯期是指生物體由于其自身適應(yīng)新環(huán)境和新的歷程幾乎不生長或沒有生長的時期。
如果接種物包含許多不同的微生物，每種微生物將形成其特有的菌落，能夠或不能夠從彼此之間被辨別出來。然而對于大多數(shù)目的，在生物體生長中只有單獨一種微生物存在是理想的。例如，某人想要測試一種生物樣品對具體的抗生素的敏感度，若該樣品和隨后的培養(yǎng)物含多種生物種類，他就不能確定在培養(yǎng)物中單個的生物體種類對抗生素的敏感度。為了確定單個生物體種類的敏感度，需要制備“純”培養(yǎng)物(即含一種單獨種類微生物的培養(yǎng)物)，它是通過在第一固體生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)初始的樣品接種物，并從第一生長培養(yǎng)基取單個菌落、或一組同樣的菌落，并將其接種于第二固體生長培養(yǎng)基或在使用液體培養(yǎng)基的情況下形成懸浮液而制備的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公認(rèn)該方法花費時間，且一般需要熟練技術(shù)人員。
在需要知道生長變更劑(例如抗生素、生長促進(jìn)劑、營養(yǎng)素、防腐劑等)對生物體的效力的情況下，現(xiàn)有技術(shù)一般的慣例是使用一種下述之一的評估方法。在一種方法中，生長變劑在培養(yǎng)之前，被施用于固體接種生長培養(yǎng)基區(qū)，且在施用區(qū)生物體的生長被評估，或與沒有施用生長變更劑的區(qū)域生物體的生長比較。Kirby-Bauer平板測試是這種目測方法的一個實例。Kirby-Bauer方法包括培養(yǎng)生長培養(yǎng)基直至在整個生長培養(yǎng)基上形成連片生長。含有從一圓盤擴散出來的有效的生長變更劑(抗菌劑)的生長培養(yǎng)基區(qū)域，如果抗菌劑在清除生物方面是有效的話，不會含有生物體的生長。圍繞該圓盤的無生長區(qū)域的大小接著與參照進(jìn)行比較，以確定生物體對臨床中有效濃度的生長變更劑是否敏感。第二種評估方法包括向接種了待測生物的液體培養(yǎng)基中添加已知量的生長變更劑。渾濁度測試是這種類型目測方法的一個實例。渾濁度測試測量液體樣品的濁度，以確定樣品的生物體含量。樣品濁度的增長表明樣品中生物體含量的增長。第三種評估方法包括觀察生物體生長對染色試劑的效果，其中染色試劑對一種或多種生長生物體的成分或代謝產(chǎn)物產(chǎn)生反應(yīng)。這些目測評估方法任意得到的信息一般說，性質(zhì)上也是宏觀的；例如，以具體濃度施用的生長變更劑或者影響生物體的生長，或者不影響生物體的生長。關(guān)于例如死亡機理、生物是否有橫隔形成、或培養(yǎng)物中生物群體的任何統(tǒng)計信息，卻只能提供很少或不能提供更多信息。
上述目測方法的一個問題是由于等待直至生物體的可見層或可接受的生物體濃度的出現(xiàn)而產(chǎn)生的測試錯誤。生物體菌落在生長培養(yǎng)基上或其內(nèi)部生長要競爭食物，結(jié)果由于競爭而不是由于生長變更劑導(dǎo)致生長被抑制。那些同樣的生物體也會由于其排泄物和代謝副產(chǎn)物而彼此影響。如果沒有這樣的干擾發(fā)生，則可能更準(zhǔn)確地分析生長變更劑對特定微生物的影響。
用生物體目測評估的另一個問題是要產(chǎn)生有意義的結(jié)果需要時間。如上所述，一般需要將生物體培養(yǎng)物培養(yǎng)大致18至24小時，用以產(chǎn)生出生長充分的生物體以便目測評估(例如，如果生物體每20至60分鐘復(fù)制一次，就需要至少產(chǎn)生20代生物體)。然而實際地說，產(chǎn)生培養(yǎng)物并用常規(guī)方法分析它，由于操作、評估等至少需要花費48小時。因為，微生物生長的速率是如此之快，且測試時間是如此之長，所以被懷疑有微生物感染的病人，在確切微生物和其敏感度被鑒別之前，最初經(jīng)常用廣譜抗生素治療。在接受測試數(shù)據(jù)之后，才進(jìn)行更有針對性的治療。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)識到，提供更迅速治療的廣譜抗生素相對于掌握具體信息的更有針對性的治療不是優(yōu)選的。實際上，相對于更有針對性的藥物，廣譜抗生素可能昂貴得多并更具有負(fù)作用。如今也是相當(dāng)令人擔(dān)憂的就是廣譜抗生素的過度使用，可能促進(jìn)了生物體抗生素抗性的發(fā)展，因此限制了其藥效。
為解決與進(jìn)行上述宏觀測試需要花費時間有關(guān)的問題，已經(jīng)提出許多用于快速測定抗生素敏感性的方法，包括測試單個生物體的方法。這些方法利用了敏感細(xì)菌當(dāng)暴露于抗生素時，可以改變其形狀、大小或內(nèi)部的化學(xué)過程(或其中的一些組合)這樣的一個事實。然而，一些種類的細(xì)菌不與抗生素發(fā)生可檢測的反應(yīng)，直至最初幾代繁殖之后。因此，只考慮最初不多的幾代的生物體的測試，在各種情況下均不能提供有用的信息，且被認(rèn)為是無效的，除非預(yù)先知道生物體的行為。由Ledley提出了用于結(jié)核分支桿菌(MTB)抗生素敏感性測定的具體微生物分析的實例(美國專利US5922282)。在Ledley的方法中，通過添加會導(dǎo)致活的生物體發(fā)熒光的質(zhì)粒改變單獨的生物體的DNA。比較添加抗菌劑之前和之后生物體發(fā)出的熒光，以確定抗菌劑是否消除了熒光，因此殺死了MTB微生物。除了產(chǎn)生熒光的手段以外，這個單一生物體技術(shù)類似于那些早先公開的技術(shù)，且只適用于窄范圍的生物體。用于測定液體肉湯培養(yǎng)基中生長變更劑的效果的另一種方法，如歐洲專利說明書EP0635126B1中所述。在該歐洲專利說明書中，圖象處理被用于確定單一生物體大小、數(shù)量或形狀的變化，以確定是否有源于抗生素的效果。這種方法的問題之一是由于是在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的，我們相信它不能分析針對具體的CFU或CFU的特性，例如CFU的復(fù)制速率的效果。
還提出了檢驗微生物生長和新陳代謝的其它方法，就是添加當(dāng)暴露于微生物生長時將改變顏色的試劑。還有其它方法(如美國專利US4724215、US4720463和US4856073所公開的)，就是用電視攝像檢驗微生物的變化。據(jù)我們所知，所有的這些方法實際上也是宏觀的，因此不提供有關(guān)單一微生物菌落在其早期的信息，且因此不能在非常短的時間內(nèi)提供可靠的抗生素抗藥性信息。它們只提供宏觀信息，即生長變更劑對微生物生長有還是沒有可檢測的影響。
同樣眾所周知的是，給定群體中的所有細(xì)菌不會對任何具體的生長變更劑以同樣的方式響應(yīng)。在任何微生物群體中均有用任何目前技術(shù)不易定量的對生長變更劑抗性的變異。如果這個群體數(shù)據(jù)是常規(guī)可得的，可以預(yù)知正被討論的微生物產(chǎn)生抗生素抗藥性的可能性，因此有助于確定最佳的治療時間。
生長變更劑對微生物影響的所有前述檢驗方法，我們覺得可以被分成兩個基本類型。第一組著眼于對裸眼來說是可見的對生物體生長的效果，例如，可見菌落或渾濁度的形成，或與這種生長相關(guān)的顏色改變。第二組依靠的是在對數(shù)生長期之前，液體生長培養(yǎng)基內(nèi)的單一生物體的變化。
需要一種用于確定微生物對生長變更劑反應(yīng)的方法，使微生物得到識別的方法，可以以一般商業(yè)用途方法所花費時間的一小部分來提供前述信息的方法，以及不需要肉眼可見的生長且不限制于著眼于單一生物體的方法。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于在培養(yǎng)的最初的幾個小時內(nèi)，研究生長變更劑對微生物菌落影響的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒別微生物的方法，它是通過確定何種營養(yǎng)素或抑制劑影響其生長而實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供一種生長變更劑對微生物菌落影響的確定方法。本文所用的術(shù)語“微生物菌落”或“小菌落”指的是在易于被裸眼識別之前的最早期增長階段的微生物菌落。如本文所使用的，術(shù)語“生長變更劑”包括會變更、抑制或增強微生物生長的試劑。生長變更劑的例子包括但不限于抗生素、防腐劑、營養(yǎng)素或生長促進(jìn)劑。生長變更劑也可以是環(huán)境類型的條件例如溫度、濕度、光、氣態(tài)環(huán)境。
在本方法下分析的各微生物菌落是單獨的微觀菌落，由接種物內(nèi)存在的菌落形成單位(CFU)形成。在本發(fā)明方法下，可以產(chǎn)生有意義的信息，其使用的菌落所處的生長范圍，包括由其CFU翻倍1次至翻倍20次左右[更少]。在本方面方法下，能夠提供有意義的信息的該生長范圍的菌落也可以按照生長時間、菌落大小或后代來描述。在大多數(shù)情況下，本發(fā)明方法采用的微生物菌落一般不能被人的裸眼看見。因此，本發(fā)明方法可以描述為微觀方法，與現(xiàn)有技術(shù)方法形成對照，現(xiàn)有技術(shù)方法是用肉眼評估多個彼此鄰近的微生物菌落，它們集合在一起足夠大而肉眼看到。另外，本發(fā)明方法可靠地用數(shù)量表示生長特性。
本發(fā)明方法采用了固體或半固體生長培養(yǎng)基，且生長變更劑被混合進(jìn)至少一部分的生長培養(yǎng)基，包括下述步驟(a)用具有一種或多種活的菌落形成單位的接種物接種生長培養(yǎng)基；
(b)以可能導(dǎo)致菌落形成單位復(fù)制成微生物菌落的方式培養(yǎng)菌落形成單位；(c)對暴露于生長變更劑的一種或多種單個的微生物菌落的一種或多種特性進(jìn)行定量；和(d)評估該定量的特性，以確定生長變更劑對單一微生物菌落的影響。
在量化步驟中，暴露于生長變更劑的微生物菌落的特性和在一些情況下作為對照的微生物菌落的特性被量化。菌落特性可以是任何可以被量化以提供有意義的有關(guān)生長變更劑對菌落影響的數(shù)據(jù)的性質(zhì)。一般用于確定影響的菌落特性，包括但不限于，菌落面積、周長、周長-面積比、邊緣粗糙度、邊緣輪廓和菌落密度的均勻性?？筛淖冇糜诹炕匦缘姆椒ㄒ赃m合已有判定、被量化的特性和提供有用數(shù)據(jù)必須的特異性水平。量化方法包括，但不限于測量、比較和檢驗類型的方法。量化以時間為函數(shù)進(jìn)行。在所有的情況下，量化特性以確定變化。在大多數(shù)情況下，通過在時間軸上的兩個或更多個點(例如，在T1、T2、T3、…、TN)的特性比較來確定變化。然而在一些情況下，通過在時間軸上的一個單獨的點量化特性就可能獲得有意義的信息。一種或多種微生物菌落必須被量化的次數(shù)取決于收集數(shù)據(jù)的充分性；即關(guān)于生長變更劑的影響做出臨床上充分的判斷所必需的任何次數(shù)。在量化步驟中采用的設(shè)備一般是成像裝置(例如，數(shù)字照相機等)，產(chǎn)生出清晰的圖象，足以被測量、比較、檢驗或別的方式量化圖象中截獲的特性?；蛘呖梢允褂闷渌鼒D象裝置例如條形碼掃描儀或飛點掃描儀。小菌落圖象可以實時利用和/或儲存。
生長變更劑對微生物菌落影響的判定是通過評估被量化的特性而作出的。象量化步驟一樣，量化的特性被評估的方式將依賴于現(xiàn)有的判定、被量化的特性和提供有用的數(shù)據(jù)必需的特異性水平。在一些情況下，評估只是看一下是否有量化的特性存在(例如，是否有菌落生長存在，或菌落的邊緣是否粗糙等)，且評估的作出可采用時間軸時上一個單獨的點或多個點收集的特性數(shù)據(jù)作出。在這樣情況下生長變更劑對微生物菌落的影響的判定可以只基于量化的特性作出。在其它情況下，可以通過考慮對照參照物評估量化特性作出。
對照參照物可以是在評估被考慮的微生物菌落的特性方面提供有用數(shù)據(jù)的任何信息源。例如，如果接種物含已知的生物體，使用提供如下數(shù)據(jù)的對照參照物可以進(jìn)行評估，這些數(shù)據(jù)有關(guān)生物體在類似的環(huán)境條件下，正常生長的特性；例如，臨床上獲得的數(shù)據(jù)等?；蛘?，可使用無生長變更劑或處于不同濃度生長變更劑之下、接種了相同接種物并在類似條件下培養(yǎng)的部份生長培養(yǎng)基形式的對照參照物進(jìn)行評估。生長培養(yǎng)基的對照參照物部分的菌落特性和生長培養(yǎng)基中施用生長變更劑區(qū)域的菌落特性被量化，并彼此參照進(jìn)行評估。在許多情況下，比較評估得到的數(shù)據(jù)足以作出判定?；蛘咭部梢圆捎闷渌愋偷脑u估。
本發(fā)明方法相對于目前使用的生物體對具體的生長變更劑敏感性的確定方法有幾個明顯的優(yōu)點。一個顯著的優(yōu)點是有關(guān)生長變更劑對生物體影響的判定作出的速度。當(dāng)本發(fā)明方法用于確定抗生素對一種或多種生物體的影響時，這點是特別確實的。如上所述，由于最初缺乏來自病人樣品的特有信息，會經(jīng)常使用廣譜抗生素。廣譜抗生素不如針對性強的抗生素，這是因為它們給病人服用可能會帶來很大的副作用的風(fēng)險，它們的過量使用可能會促進(jìn)生物體的抗生素抗藥性的產(chǎn)生，而且它們也可能非常昂貴。使用本發(fā)明方法，可以經(jīng)常在2小時或更短的時間內(nèi)提供抗生素敏感性的信息，明顯小于使用目前采用方法的一般性周轉(zhuǎn)時間。結(jié)果，現(xiàn)在經(jīng)?？梢砸婚_始就有效地使用針對性強的抗生素，而不是最初用廣譜抗生素處理病人。
這幾個優(yōu)點基于這樣的事實，就是本發(fā)明方法使用由單一的菌落收集的特性數(shù)據(jù)確定生長變更劑對生物體的影響。如上所述，本發(fā)明方法在培養(yǎng)物內(nèi)可以不是同樣起源或同樣種類的任何肉眼可見的聚集的菌落出現(xiàn)之前，在培養(yǎng)過程非常早的階段就利用了菌落(菌落一般有2至20次翻倍)?；趩我痪涞臄?shù)據(jù)的一個優(yōu)點是，有可能在一些情況下使用“不純的”培養(yǎng)物。因為是從單一的微觀的菌落收集數(shù)據(jù)，故分離不同種類菌落的需要降低，這一點與在固體培養(yǎng)基上或液體懸浮液中進(jìn)行的宏觀方法不同，其中，若宏觀方法在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，很可能會有許多生物體聚集成肉眼可見的不純的塊，若在液體懸浮液中進(jìn)行，則難以區(qū)別生物體彼此之間的生長。對肉眼可見的不純的塊施用生長變更劑可能會產(chǎn)生有限的信息，因為生長變更劑對多種不同的生物體的影響是不可分開的。由尿或腦脊髓的樣品制備的培養(yǎng)物是可能不純的培養(yǎng)物的實例，在其中本發(fā)明可以用于評估不同組成的生物體，而不用首先將其分離。
基于單一菌落數(shù)據(jù)的另一個優(yōu)點是可以統(tǒng)計分析有關(guān)生長變更劑影響的數(shù)據(jù)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以是有用的，例如，在確定生物體對抗生素的抗藥性方面。有關(guān)生物體抗生素的抗藥性的信息反過來可以提供有關(guān)最佳處理時間的有價值的信息。如果，例如生物體被發(fā)現(xiàn)對高濃度之外的所有的抗生素均具有抗藥性，并且敏感性機理需要幾代才能變得有效，則此時抗生素處理比馬上就受抗生素影響的更敏感的生物體的情況需要更長的時間。
單一菌落數(shù)據(jù)也有利地允許鑒定生長變更物質(zhì)非特征性影響的生物體突變。例如，單一菌落的生長速率可以進(jìn)行統(tǒng)計比較。如果生長速率的范圍超過預(yù)期的對照標(biāo)準(zhǔn)偏差，說明生物體比通常更具有抗藥性，且抗藥性可能正在發(fā)展。強調(diào)任何微生物治療必須直接針對組內(nèi)最具有抗藥性的生物體是重要的，因為這些生物體即使在更敏感的生物體已經(jīng)被消滅之后，仍然會繁殖。
本發(fā)明方法的另一個優(yōu)點是迅速地提供準(zhǔn)確的生長變更劑的敏感性信息。Kirby-Bauer測試的缺點是在生長培養(yǎng)基中任何給定的點有許多變量影響抗生素濃度。基于清晰區(qū)域大小計算抗生素濃度的公式已經(jīng)公開，但這些公式很少使用，且被認(rèn)為最多是近似值。Kirby-Bauer中，影響抗生素濃度的確定的一個變量是相鄰的生物體之間的競爭。在標(biāo)準(zhǔn)的平板測試中生物體為了食物競爭，且因此可能由于競爭而不是生長變更劑造成生長受到抑制。通過它們的排泄和代謝副產(chǎn)物，生物體之間也互相影響。本發(fā)明方法通過在接種之后很快檢驗該菌落而避免了這些類型的干擾，而不是一直等到生物體增殖到一定程度可以被裸眼看見為止。
本發(fā)明方法的另一個優(yōu)點是其多用途。例如，本發(fā)明方法能夠從生物體被施用于生長培養(yǎng)基的時候起收集有關(guān)生長變更劑對生物體影響的數(shù)據(jù)。本發(fā)明方法因此并不局限于觀察最初幾代微生物，也不局限于后期可以通過肉眼看見的各代，而是可以在生物體的整個成長過程使用。本發(fā)明方法另一個多用途的例子是可以用于在一個單個的測試中檢驗具體濃度的生長變更劑或檢驗濃度梯度的生長變更劑。該梯度方法避免了必須創(chuàng)建多稀釋度抗生素，以例如確定抗生素用于具體生物體的最小抑制濃度。本發(fā)明方法的另一個多用途的例子是其可以用于獸醫(yī)學(xué)。
本發(fā)明方法也可以被用來便于具體生物體的鑒別。例如，如果在一個具體的測試中，對照參照物是不含糖的生長培養(yǎng)基，而生長培養(yǎng)基的測試區(qū)域含糖，那些可以代謝糖的生物體在測試區(qū)域中會比在對照區(qū)域生長得更快。因此，可以使用許多不同的生長增強和生長抑制物質(zhì)以識別被懷疑的生物體。
本發(fā)明方法的另一個優(yōu)點是能夠提供在統(tǒng)計上小數(shù)量發(fā)生卻具有關(guān)于生長變更劑對微生物影響的重要意義的效果、反應(yīng)或沒有發(fā)生反應(yīng)的信息。該優(yōu)點基于的事實是本發(fā)明方法評估小菌落而不是肉眼可見的菌落。在生長培養(yǎng)基上給定區(qū)域中小菌落的數(shù)量會遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在同樣區(qū)域中肉眼可見菌落的數(shù)量，從而提供對于評估該區(qū)域的統(tǒng)計上更有效的群體。例如，眾所周知一些細(xì)菌具有低的突變率，其中在某一特定環(huán)境下對具體的抗生素大約在104中有1個至106中有1個可以有抵抗力。如果這種有抵抗力的菌株的生長沒有被發(fā)現(xiàn)，該菌株很可能被錯誤地報導(dǎo)為是對抗生素敏感的，而事實上該菌株是有抗藥性的。本發(fā)明提供的該優(yōu)點也許最好通過實例說明。如果某人用攝影機來記錄常規(guī)瓊脂平板上肉眼可見的菌落(正如目前用一些對菌落計數(shù)的儀器)，則在瓊脂平板上沒有足夠的空間包含出現(xiàn)上述抗性細(xì)菌在統(tǒng)計上必需數(shù)目的非匯合的肉眼可見的菌落。例如，10cm直徑的平板，每間隔2mm培養(yǎng)出具有肉眼可見的菌落，只可能擁有約2000個這樣的菌落，該群體明顯對于發(fā)現(xiàn)這種突變在統(tǒng)計上是不充分的。這種統(tǒng)計上不充分的群體是為什么用于抗生素敏感性的常規(guī)瓊脂平板菌落太擁擠而產(chǎn)生匯合生長的另一個原因。相反地，在本發(fā)明方法中，培養(yǎng)成小菌落的CFU可以以10μm的間距被接種，從而可以對統(tǒng)計上數(shù)量充足的每平方厘米104個小菌落進(jìn)行評估，而且允許在小菌落彼此匯合之前進(jìn)行評估。
本發(fā)明方法的另一個優(yōu)點是也可以用于檢測生長變更劑的存在。例如，用于在牛奶樣品中確定抗生素或其它生長變更劑存在。目前牛奶測試工藝需要預(yù)先已知測試抗生素的種類；即對具體的抗生素測試是特定的。在本發(fā)明方法中，牛奶被混合進(jìn)生長介質(zhì)中，且接種物被接種進(jìn)生長培養(yǎng)基。接種物選擇為有可能受牛奶中生長變更劑(例如，抗生素殘余物)存在的影響的類型。如果發(fā)源于接種物的小菌落的生長不同于現(xiàn)有條件下的常規(guī)生長，則已知或未知的抗生素很可能存在牛奶樣品中。
本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點，根據(jù)對其最佳模式的實施方案的詳細(xì)說明，并結(jié)合


會變得顯而易見。
圖1A-1D包括鋪有產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)的固體培養(yǎng)基的影像圖1A和1C包括未處理的影像，圖1B和1D是圖1A和1C同樣的影像，但在量化其特性之前，影像經(jīng)過了數(shù)字處理來定位菌落。
圖2A-2D包括了大腸桿菌(E.coli)菌落的影像，其中一些菌落暴露于抗生素。圖2A和2B是在鋪板之后馬上拍攝得到的，而圖2C和2D是在培養(yǎng)約2小時之后拍攝得到的。
圖3A-3D包括E.faecalis(E.faecalis)的影像，其中一些暴露于抗生素。圖3A和3B是在鋪板之后馬上拍攝得到的，而圖3C和3D是在培養(yǎng)約2小時之后拍攝得到的。
圖4A-4D包括E.faecium的影像，其中一些暴露于抗生素。圖4A和4B是在鋪板之后馬上拍攝得到的，而圖4C和4D是在培養(yǎng)約2小時之后拍攝得到的。
用于生長變更劑對小菌落影響的確定的本發(fā)明方法，采用了能夠支持微生物菌落生長的一種或多種生長培養(yǎng)基，優(yōu)選凝膠、半固體或可滲透的固體形式。在使用期間可以被再水合的脫水生長培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的，因為它們可以在延長的時間內(nèi)易于貯存。接種之后是透明或半透明的生長培養(yǎng)基也是優(yōu)選的，因為它便于下述的量化和評估步驟。然而如果采用了將在下面討論的合適的照明小菌落可以用任何生長培養(yǎng)基量化和評估?？梢允褂靡环N或多種培養(yǎng)基質(zhì)以適合現(xiàn)有的應(yīng)用。
術(shù)語“生長變更劑”可以是任何化學(xué)或環(huán)境試劑，它們將會改變、抑制或增強微生物生長?；瘜W(xué)生長變更劑包括，但不限于抗生素、防腐劑、營養(yǎng)素和生長促進(jìn)劑。環(huán)境類型生長變更劑包括但不限于參數(shù)例如，溫度、濕度、光和氣態(tài)環(huán)境?；瘜W(xué)類型生長變更劑可以以多種途徑被混合進(jìn)生長培養(yǎng)基。在那些期望僅將生長變更劑摻入部份生長培養(yǎng)基的情況中，可使用置于生長培養(yǎng)基所選部份之上的膠體或其它固體或半固體載體來摻入生長變更劑。在其它情況下，生長變更劑可以使用滲入整個生長培養(yǎng)基的液體載體來摻入。環(huán)境類型生長變更劑可以通過將生長培養(yǎng)基暴露于具體的因子而被引入；例如，將一對生長培養(yǎng)基置于不同的溫度、不同水平的濕度或光等條件下。
含生物體的接種物來源于尿、腦脊液、體腔液或其它樣品來源，例如，來源于早先分離的菌落的生物體懸浮液，該接種物被用于接種生長培養(yǎng)基。用于接種生長培養(yǎng)基的的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，且不用在以后進(jìn)一步討論。已接種的生長培養(yǎng)基以可能導(dǎo)致接種物成分復(fù)制成微生物菌落的方式被培養(yǎng)。
復(fù)制成小菌落的接種物中的成分本文指的是菌落形成單位(CFU)。CFU可以是接種物中活的單個生物體細(xì)胞或一叢生物體細(xì)胞。在生長培養(yǎng)基被接種，且已經(jīng)開始培養(yǎng)之后，各CFU至少會有一次翻倍(沒有抑制因素)，且變成小菌落。在本發(fā)明方法下在CFU被翻倍4至8次之前，且?guī)缀蹩偸窃谄湟呀?jīng)翻倍約20次之前，一般可以產(chǎn)生有意義的信息。應(yīng)該注意到本文所用的術(shù)語“翻倍”指的是小菌落面積或體積的翻倍，與單一的生物體不同，因此不能被用于確定單個生物體的大小。小菌落的“翻倍”可以是由于生物體數(shù)量的翻倍或其平均大小的翻倍或其一些組合。然而，由于單個的生物體的生長受限制，特別是經(jīng)過了幾代的時間之后，本文指的“翻倍”更經(jīng)常反映的是真實的復(fù)制生長，而不是生物體大小的改變。
可以產(chǎn)生有意義的信息的時期，也可以菌落生長時間或大小而不僅是培養(yǎng)期間CFU翻倍的次數(shù)來定義。例如，如果要被評估的生物體是已知的，很可能有在類似環(huán)境條件下有關(guān)該生物體翻倍次數(shù)的信息。如果那樣，時間可以被用作判定中的對照參數(shù)，而不是必需直接確立生物體有多少次翻倍。在一些情況下，生物體的大小和小菌落面積或體積的增長速率可以提供有關(guān)生物體的種類和生長變更劑對該生物體生長速率的影響的信息?？梢援a(chǎn)生有意義的信息的時期，也可以后代來定義。具體地說，在單一小菌落(各菌落代表源于一個具體的祖先的生長)與其它源于不同祖先生長的小菌落連接或接近之前，可以進(jìn)行判定?？梢援a(chǎn)生有意義的信息的時期，也可以小菌落的生長導(dǎo)致大量的小菌落彼此匯合之前的時間來定義。
不管評估期被如何定義，在本發(fā)明方法下采用的微生物菌落一般不能被人的肉眼看見。因此，本發(fā)明方法可被描述成微觀的，與現(xiàn)有方法形成對比，現(xiàn)有方法宏觀地評估彼此接觸的許多微生物菌落，這些菌落集合在一起足夠大，使得肉眼可見。
在開始培養(yǎng)且一些菌落形成單位成為適于評估的小菌落之后，在一或多個時間點上檢驗暴露于生長變更劑的一種或多種小菌落，量化這些菌落相關(guān)的特性。要被量化的菌落特性基于可能顯露出菌落暴露于生長變更劑的結(jié)果的那些特性，而被選擇。用于量化特性的優(yōu)選方法包括對含小菌落的一部分生長培養(yǎng)基進(jìn)行電子成像，所述的小菌落暴露于生長變更劑。如果即將進(jìn)行的測試使用生長培養(yǎng)基上的小菌落作為對照參照物(該小菌落要么沒有暴露于生長變更劑，要么暴露于不同的濃度的生長變更劑)，則也對一部分對比參照生長培養(yǎng)基進(jìn)行電子成像。
可以使用許多設(shè)備對生長培養(yǎng)基和其上含有的一或多種小菌落進(jìn)行電子成像能創(chuàng)建電子圖形文件的數(shù)字照相機是特別方便的，所述的電子圖形文件可以被個人計算機顯示。數(shù)字照相機可以設(shè)置于普通顯微鏡上，或優(yōu)選，設(shè)置在例如待審定的美國專利申請09/255673中所述的自動顯微鏡上。在相對于生長培養(yǎng)基小菌落不易被識別的一些情況下，可以采用有助于使微生物菌落相對于生長培養(yǎng)基形成反差的技術(shù)。透射法是一個可接受的照明技術(shù)，該技術(shù)利用了小菌落相對于大多數(shù)生長培養(yǎng)基具有相當(dāng)不同折光率的事實。具體地說，照射小菌落的光的散射與照射生長培養(yǎng)基的光的散射不同，因此使小菌落比生長培養(yǎng)基顯得更暗。利用了光散射性不同的其它技術(shù)包括窄角照明或暗視野檢驗。區(qū)分生長培養(yǎng)基和小菌落的另一種方法包括對小菌落和承載小菌落的生長培養(yǎng)基染色的方法。例如，色素/染料(例如，吖啶橙)被混合進(jìn)生長培養(yǎng)基，然后被小菌落吸收使兩者形成反差?；蛘撸ㄟ^“負(fù)”染料在兩者之間造成反差，其中染料給生長培養(yǎng)基提供顏色或熒光，而生長的小菌落則將顏色和熒光遮擋在外。小菌落的位置和范圍也可以通過數(shù)字處理軟件來提供，該軟件探查小菌落的邊緣，且數(shù)字化“填充”小菌落的內(nèi)部區(qū)域，以將其與小菌落的外部區(qū)域分別出來，反之亦然?；蛘吒鶕?jù)即將進(jìn)行的測試的性質(zhì)，也可以使用電子成像系統(tǒng)(例如，實時連續(xù)成像)。
如上所述，本發(fā)明方法包括量化作為時間函數(shù)的一或多種小菌落的特性。如果不止一次量化小菌落特性是必需的，則成像裝置必須能夠不止一次在生長培養(yǎng)基上進(jìn)行具體位置的定位。具體位置的定位可以通過多種不同的方式完成。例如，成像裝置和生長培養(yǎng)基其中之一或這兩者的移動和定位，可以通過機械控制或機電一體化控制。也可以通過定位在生長培養(yǎng)基上或與生長培養(yǎng)基靠得很近的可識別特性的利用，從而使生長培養(yǎng)基上的位置也是可定位的。例如，許多以靜止圖案分散在生長培養(yǎng)基上的非反應(yīng)性珠子，可以用作生長培養(yǎng)基上的導(dǎo)航浮標(biāo)。美國專利申請09/366881描述了這樣的方法?；蛘咭部梢允褂闷渌ㄎ环椒ɑ驒C理。
可以通過檢驗、測量或比較特性來量化特性。例如在一些情況下，可以通過檢驗一或多種小菌落的邊緣粗糙度，來收集有用的數(shù)據(jù)。在其它情況下，通過測量一或多種小菌落的面積，來收集有用的數(shù)據(jù)。在另外的一些情況中，通過比較暴露于生長變更劑的一或多種小菌落的面積與沒有暴露于生長變更劑的其它小菌落的面積，或暴露于不同濃度的同樣的生長變更劑的小菌落的面積，來收集有用的數(shù)據(jù)。也可以通過比較被暴露的菌落與另一暴露于影響是已知的，但品種不同的生長變更劑的菌落來收集有用的數(shù)據(jù)。如何使菌落特性被量化的更詳細(xì)的實例將在下文提供。
量化特性足夠多次，以確?？梢宰鞒鲇嘘P(guān)生長變更劑對生物體影響的臨床充分的判定。在一些狀況下，量化菌落的特性一次，就可以是足夠的。例如，在一些情況下，具體特性(例如，生長、奇異的菌落形態(tài)等)的存在可以足以作出臨床判定。在其它狀況下，臨床充分的判定可以需要量化特性許多次。例如，需要在一段時間內(nèi)存在具體的影響的臨床判定需要周期性量化特性。
經(jīng)常檢驗小菌落的一個優(yōu)點是，它是采用這種動力學(xué)技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)在最早期的時間里的相關(guān)信息，從而提供快速的臨床結(jié)果。多次量化特性也可以產(chǎn)生額外的令人滿意的信息。例如，一些生物體，當(dāng)存在一些抗生素時，顯示了早期生長的形態(tài)，隨著抗菌劑控制的影響，接著生長緩慢和停止或退化。在其它情況下，生物體生長非常緩慢，隨著最終突破了抗菌劑，接著就加速生長。在兩種情況下，通過對幾代的生長進(jìn)行檢驗，可說明有抗藥性模式或缺乏抗藥性模式。抗生素敏感性的機理也可以通過檢驗小菌落形狀和密度的變化而得到說明。例如，具有靜止的而不是殺滅影響的那些抗生素可以通過CFU的持久性被看見，然而具有殺滅影響的抗生素將顯示出CFU的消失，或在一些生長之后，小菌落大小突然降低。由于殺滅影響是更強大的，且經(jīng)常需要較短過程的處理，這種區(qū)別是重要的。
一旦特性被量化，就會被評估以確定是否生長變更劑對小菌落有影響。用于評估量化特性的標(biāo)準(zhǔn)依賴于已有的測試，特性和提供有用數(shù)據(jù)所必需的特異性水平。在一些情況下，評估標(biāo)準(zhǔn)可以是簡單的，不管是否有量化特性。特性被量化以確立其存在，是否生長變更劑具有影響的判定以特性的存在為前提；例如，是否已經(jīng)有菌落生長；小菌落的邊緣是否粗糙等。在這樣的情況下，量化的特性獨自能夠作出判定。在其它情況下，優(yōu)選鑒于對照參照物評估量化的特性。
在評估被考慮的小菌落的特性中，對照參照物可以是提供有用數(shù)據(jù)的任何信息源。例如，如果接種物含已知的生物體，使用對照參照物可以進(jìn)行評估，該對照參照物提供有關(guān)在類似環(huán)境條件下生物體正常生長特性的數(shù)據(jù)，例如臨床上獲得的數(shù)據(jù)等。作為一個例子，如果給定的生物體已知在現(xiàn)有的環(huán)境下，以每30分鐘翻倍一次的速率生長，而實際翻倍速率(例如，菌落體積或面積的改變)小于已知速率，則推測生長變更劑延遲了生物體的倍增和生長?；蛘撸墒褂脽o生長變更劑或處于不同濃度生長變更劑之下、接種了相同接種物并在類似條件下培養(yǎng)的部份生長培養(yǎng)基形式的對照參照物進(jìn)行評估。在生長培養(yǎng)基的對照參照物部分的一或多種菌落的特性和生長培養(yǎng)基的施用生長變更劑的區(qū)域中的一或多種菌落的特性被量化，并通常通過比較彼此參照進(jìn)行評估。
如上所述，用于確定生長變更劑對小菌落影響的本發(fā)明方法相對于目前使用的方法具有明顯的優(yōu)勢。下文提供本發(fā)明方法在使用中的實施例，以便于獲得對本發(fā)明方法的全面了解。但是，本發(fā)明并不限于這些實施例。
在有關(guān)的小菌落的面積被量化之后，即對各小菌落的面積值比較性地進(jìn)行評估(T1對T2)，以確定生長變更劑的影響。在一些測試中，可以采用多次評估(即，在T1、T2、T3、T4等)?？梢曰谄骄【涿娣e進(jìn)行評估，或通過在有或沒有生長變更劑的區(qū)域中小菌落面積的分布進(jìn)行評估。在第一種情況下，如果生長變更劑導(dǎo)致生長速率的增加(或降低)，則具有生長變更劑的區(qū)域中小菌落的面積會大于(或小于)對照參照物中小菌落的面積。在第二種情況下，可能有一些小菌落比平均值生長得更快(或更慢)，且雖然平均面積可以是相同的，但在具有生長變更劑的區(qū)域和對照參照物的區(qū)域之間，菌落面積的分布是不同的。如果進(jìn)行兩次以上的評估，通過評估順序的時間之間的特性可以確定生長速率的變化。
為了說明量化和評估小菌落的特性，特別是小菌落的生長的步驟，圖1A-1D中所示的生長培養(yǎng)基沒有暴露于生長變更劑。圖1C和1D中所包括的圖像清楚地顯示了小菌落的生長。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會從該實施例中了解到，可以在2個小時內(nèi)獲得有用的信息，在該時間里小菌落的直徑只有約3-5μm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于它們可以被肉眼看見。可以輕易地了解，在這兩個小時的培養(yǎng)期里，可以確定生長從而確定生長變更劑的影響。
雖然本發(fā)明已經(jīng)顯示和描述了有關(guān)詳細(xì)的實施方案，應(yīng)該理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以作出形式和細(xì)節(jié)上的許多改變。例如，上述詳細(xì)描述說明測試區(qū)域可以位于生長培養(yǎng)基的第一部分，而對照參照物可以位于同樣的生長培養(yǎng)基的第二部分。或者，測試區(qū)域可以位于第一生長培養(yǎng)基，而對照參照物位于第二生長培養(yǎng)基。另一個可以在不背離本發(fā)明精神和范圍前提下所做的改變的例子是步驟的順序。例如，優(yōu)選在用接種物接種生長培養(yǎng)基，并培養(yǎng)該接種物之前將生長變更劑混合進(jìn)生長培養(yǎng)基的一部分或全部。然而可以改變步驟順序而仍保持在本發(fā)明方法范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種生長變更劑對一種或多種微生物菌落影響的確定方法，包括以下步驟提供一種固體或半固體生長培養(yǎng)基；將所述的生長變更劑混合進(jìn)所述的生長培養(yǎng)基的至少一部分；用接種物對所述的生長培養(yǎng)基接種，所述的接種物具有一種或多種有活力的菌落形成單位；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；量化暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述微生物菌落的一個或多個特性；和評估所述的特性以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍一次之后，和所述的菌落形成單位翻倍超過20次之前，對暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍8次之前，對暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始面積，且在至少一些所述的微生物菌落其面積增長到其所述的初始面積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其面積增長到其所述初始面積的20倍之前，對所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始體積，且在至少一些所述的微生物菌落其體積增長到其所述的初始體積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其體積增長到其所述初始體積的20倍之前，對所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的特性被量化，而各微生物菌落是具體始祖菌落形成單位的產(chǎn)物。
7．一種生長變更劑對生長培養(yǎng)基支持的一種或多種微生物菌落影響的確定方法，其中生長培養(yǎng)基中至少一部分摻入了所述的生長變更劑，所述的方法包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；量化暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述微生物菌落的一個或多個特性；和將所述的一個或多個特性與對照參照物進(jìn)行比較，以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的生長變更劑被混合進(jìn)所述生長培養(yǎng)基的第一部分，而所述對照參照物包括沒有所述生長變更劑的所述生長培養(yǎng)基的第二部分。
9．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的生長變更劑以第一濃度被混合進(jìn)所述生長培養(yǎng)基的第一部分，而所述的對照參照物包括所述生長培養(yǎng)基的第二部分并且所述的生長變更劑以不同于所述第一濃度的第二濃度被混合進(jìn)所述的第二部分。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的第二濃度小于所述的第一濃度。
11．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的生長變更劑以濃度梯度的方式被使用，所述的濃度梯度具有較大的濃度端和較小的濃度端，而其中所述的對照參照物緊臨所述的較低濃度端。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中在所述較低端的所述生長變更劑的所述濃度對所述的微生物菌落沒有影響。
13．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的對照參照物包括臨床獲得的數(shù)據(jù)。
14．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的對照參照物包括一種或多種具有公知生長特性的比較微生物菌落。
15．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的對照參照物定位于獨立的第二生長培養(yǎng)基中。
16．一種生長變更劑對生長培養(yǎng)基支持的一種或多種微生物菌落影響的確定方法，所述生長培養(yǎng)基中至少一部分摻入了所述的生長變更劑，所述的方法包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；定期量化暴露于所述的生長變更劑的所述的一種或多種微生物菌落的一個或多個特性；和對所述特性的所述定期量化進(jìn)行評估，以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述的定期量化一種或多種微生物菌落的步驟包括定期使所述微生物菌落成像。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的評估步驟包括比較所述的定期圖像，以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述的評估步驟包括將所述的定期圖像與對照參照物進(jìn)行比較，以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中在所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍一次之后，和所述的菌落形成單位翻倍超過20次之前，對暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述微生物菌落所述特性進(jìn)行定期成像。
21．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始面積，且在至少一些所述的微生物菌落其面積增長到其所述的初始面積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其面積增長到其所述初始面積的20倍之前，對所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行定期成像。
22．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始體積，且在至少一些所述的微生物菌落其體積增長到其所述的初始體積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其體積增長到其所述初始體積的20倍之前，對所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行定期成像。
23．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的特性被定期成像，而各微生物菌落是具體始祖菌落形成單位的產(chǎn)物。
24．一種生長變更劑對生長培養(yǎng)基上支持的一種或多種微生物菌落影響的確定方法，所述生長培養(yǎng)基中至少一部分摻入了所述的生長變更劑，所述的方法包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；定期使暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述的微生物菌落成像，以顯示所述的微生物菌落的特性；和對所述特性進(jìn)行評估，以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的特性選自由微生物菌落面積、周長、周長與面積比、邊緣粗糙度、邊緣輪廓和菌落密度均勻性組成的組。
26．一種生長變更劑對生物樣品影響的確定方法，該樣品被接種進(jìn)固體或半固體生長培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)以產(chǎn)生由所述樣品中存在的菌落形成單位復(fù)制的微生物菌落，所述的方法包括下述步驟將所述生長變更劑混合進(jìn)所述生長培養(yǎng)基的至少一部分；在一段時間內(nèi)，當(dāng)幾乎所有的所述微生物菌落彼此分離時，對暴露于所述生長變更劑的所述微生物菌落成像；和評估所述的微生物菌落特性，以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
27．一種生長變更劑對生長培養(yǎng)基上支持的一種或多種微生物菌落作用機理的確定方法，包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長培養(yǎng)基；將所述生長變更劑混合進(jìn)所述生長培養(yǎng)基的至少一部分；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；定期對暴露于所述的生長變更劑的所述的一種或多種所述的微生物菌落成像；和對所述的定期成像進(jìn)行評估，以確定所述的生長變更劑的作用機理。
28．一種生長變更劑對生物體影響的確定方法，包括以下步驟將所述生長變更劑混合進(jìn)固體或半固體生長培養(yǎng)基的至少一部分；用含源于所述微生物的一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的生物體小菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；對暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述的小菌落成像許多次，從而創(chuàng)建按時間順序編排的所述的一種或多種小菌落的圖像；和評估所述的按時間順序編排的圖像，以確定所述的生長變更劑對所述的生物體的影響。
29．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述的按時間順序編排的圖像，創(chuàng)建于所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍一次之后，和所述的菌落形成單位翻倍超過20次之前。
30．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中按時間順序編排的圖像，創(chuàng)建于至少一些所述的小菌落其面積增長到兩倍之后和大多數(shù)所述的小菌落其面積增長到20倍之前。
31．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中按時間順序編排的圖像，創(chuàng)建于至少一些所述的小菌落其體積增長到兩倍之后和大多數(shù)所述的小菌落其體積增長到20倍之前。
32．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中創(chuàng)建所述的按時間順序編排的圖像，而各微生物菌落是具體始祖菌落形成單位的產(chǎn)物。
33．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中單個所述小菌落的特性作為測試組被評估，并與對照組相比較，以確定是否所述測試組的所述特性與所述對照組的特性在統(tǒng)計學(xué)上不同。
34．根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述的統(tǒng)計比較用于對所述的生長變更劑敏感性的變異進(jìn)行預(yù)報。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的變異是對抗微生物劑的抵抗力增加。
36．一種生長變更劑對一種或多種微生物菌落影響的確定方法，包括以下步驟提供一種固體或半固體生長培養(yǎng)基；將所述的生長變更劑混合進(jìn)所述的生長培養(yǎng)基的至少一部分；用接種物對所述的生長培養(yǎng)基接種，所述的接種物具有許多菌落形成單位，其中所述的菌落形成單位分散于所述的生長培養(yǎng)基上，彼此分開的距離一般不小于5μm，并不大于100μm；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；在大多數(shù)所述的小菌落彼此匯合之前，量化暴露于所述的生長變更劑的一種或多種所述微生物菌落的一個或多個特性；和評估所述的特性以確定所述的生長變更劑對所述的微生物菌落的影響。
37．一種探查樣品中生長變更劑存在的方法，包括以下步驟提供一種固體或半固體生長培養(yǎng)基；將所述的樣品混合進(jìn)所述的生長培養(yǎng)基的至少一部分；用接種物對所述的生長培養(yǎng)基接種，所述的接種物具有一種或多種有活力的菌落形成單位；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成一種或多種微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；量化暴露于所述的樣品的一種或多種所述微生物菌落的一個或多個特性；和評估所述的特性以探查所述的生長變更劑的存在。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生長變更劑對一種或多種微生物菌落影響的確定方法。該方法采用將生長變更劑混合進(jìn)生長培養(yǎng)基的至少一部分,并包括以下步驟:(a)以可能使菌落形成單位復(fù)制成微生物菌落的方式培養(yǎng)菌落形成單位;(b)用接種物對生長培養(yǎng)基接種,所述的接種物具有一種或多種有活力的菌落形成單位;(c)量化暴露于生長變更劑的一種或多種單個微生物菌落的一個或多個特性;和(d)評估量化的特性以確定生長變更劑對單個微生物菌落的影響。
文檔編號C12M1/34GK1321773SQ01117809
公開日2001年11月14日 申請日期2001年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月17日
發(fā)明者斯蒂芬·C·沃德羅, 羅伯特·A·利費恩 申請人:沃德羅合伙公司