專利名稱：在轉(zhuǎn)基因植物中激活和除去轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)型位點(diǎn)特異性重組的制作方法
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)變成在多細(xì)胞生物體中解決重要生物問題的有力工具，尤其是在植物領(lǐng)域。許多傳統(tǒng)遺傳學(xué)不可能完成的方法現(xiàn)在通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，包括在植物中導(dǎo)入同源或異源基因，所述基因功能得以修飾并且表達(dá)方式得以改變。這樣的技術(shù)的成功經(jīng)常是依賴于利用鑒定轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)記和控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
在植物轉(zhuǎn)化中廣泛利用了可選擇標(biāo)記。在歷史上，這樣的標(biāo)記經(jīng)常是編碼抗生素或除草劑抗性的顯性基因(Yoder和Goldsbrough，1994)。雖然這樣的標(biāo)記用途很廣，它們確實(shí)有一些缺點(diǎn)。用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗生素和除草劑通常對增殖和分化具有負(fù)作用，并且可能在轉(zhuǎn)化過程中延遲不定枝的分化(Ebinuma等人，1997)。同時(shí)，一些植物種類對這些選擇試劑是不敏感的或有耐受性的，因此分離轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織是困難的(Ebinuma等人，1997)。另外，這些基因是組成性地表達(dá)的，在生長于實(shí)驗(yàn)室外的植物中插入這樣的組成性表達(dá)的基因時(shí)，有環(huán)境和健康方面的問題(Bryant andLeather，1992；Gressel，1992；Flavell et al.，1992)。
只在期望的時(shí)間內(nèi)沉默或除去這樣的標(biāo)記基因或其它基因或表達(dá)它們的系統(tǒng)是非常有用的。將這樣的基因放置于可誘導(dǎo)的或特異于組織的啟動(dòng)子的控制下已經(jīng)完成。例如，已經(jīng)將在熱休克(Medford etal.，1989)，光(Redig et al.，1996)，銅(McKenzie et al.，1998)，四環(huán)素(Redig et al.，1996；Faiss et al.，1997；Gatz et al.，1992)或地塞米松(Kunkel等人1999)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下的ipt基因的轉(zhuǎn)基因植物用于研究細(xì)胞分裂素的生物效應(yīng)。其它可誘導(dǎo)系統(tǒng)包括熱誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Lyznik等人，1995)，乙醇可誘導(dǎo)系統(tǒng)(Caddick等人，1998)，蛻皮激素系統(tǒng)(Martinez等人，1999)，和TGV地塞米松/四環(huán)素系統(tǒng)(Bohner等人，1999)。
雖然發(fā)生的頻率非常低，并且出現(xiàn)在長期的培養(yǎng)后，但是利用可轉(zhuǎn)座元件Ac切除標(biāo)記基因已經(jīng)進(jìn)行(Ebinuma等人，1997)。切除基因的另一個(gè)方法將利用Cre/lox系統(tǒng)。噬菌體P1 Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)(Dale和Ow，1990；Odell等人，1994)包括兩個(gè)成分(I)重組酶(CRE)和(ii)重組酶作用的重組位點(diǎn)(lox)。CRE基因編碼能夠在沒有任何其它因子的情況下催化兩個(gè)lox位點(diǎn)之間的重組的38Kda的重組酶。Lox位點(diǎn)包括對稱的8bp的間隔子分開的兩個(gè)倒置的13bp重復(fù)，其中每個(gè)倒置的重復(fù)是CRE的結(jié)合位點(diǎn)。8bp的間隔子的對稱特性給出了lox位點(diǎn)的方向性，確定了重組事件的類型。兩個(gè)倒置的lox位點(diǎn)的存在導(dǎo)致了干擾DNA序列的倒置，而兩個(gè)直接重復(fù)的lox位點(diǎn)的存在導(dǎo)致能夠切除干擾DNA序列。
除了敘述的噬菌體P1 Cre/lox系統(tǒng)，有幾個(gè)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)已經(jīng)顯示能在植物中工作，這些包括(i)來自啤酒酵母的FLP-FRT系統(tǒng)(O’Gorman等人，1991)，(ii)來自噬菌體Mu的GIN/gix系統(tǒng)(Maeser and Kahmann，1991)和(iii)來自Zygosaccharomyces rouxii的R/RS系統(tǒng)(Onouchi等人，1991)。
來自啤酒酵母的FLP-FRT重組系統(tǒng)是基于FLP重組酶在FLP重組靶位點(diǎn)(FRT)上的位點(diǎn)特異性重組。FRT包括兩個(gè)倒置的13堿基對重復(fù)和FLP重組酶作用的8堿基對間隔子。通過插入兩個(gè)側(cè)接靶基因的方向性重復(fù)FRT位點(diǎn)，在FLP重組酶的作用下，通過位點(diǎn)特異回收切除干擾DNA片段是可能的。FLP重組酶介導(dǎo)的切除也已經(jīng)顯示是可逆的，提供了在哺乳動(dòng)物染色體的特異位點(diǎn)中導(dǎo)入DNA的方法(O’Gorman等人，1991)。
噬菌體Mu編碼的Gin倒置酶催化了噬菌體中的G區(qū)段的位點(diǎn)特異倒置。重組位點(diǎn)(gix)在長度上是34個(gè)堿基對，兩個(gè)位點(diǎn)包括兩個(gè)交叉區(qū)隔開的兩個(gè)逆向的半位點(diǎn)。GIN通過與兩個(gè)半位點(diǎn)結(jié)合作用于gix位點(diǎn)，介導(dǎo)了DNA交換，和由此的DNA倒置。
來自Zygosaccharomyces rouxii的pSR1的R基因編碼介導(dǎo)兩個(gè)重組位點(diǎn)(RS)之間的位點(diǎn)特異性重組的重組酶。在pSR1上的RS位點(diǎn)含有一對959個(gè)堿基對的倒置重復(fù)序列，它們含有重組位點(diǎn)(58個(gè)堿基對)。根據(jù)RS位點(diǎn)的方向性，沒有任何其它因子，RS重組酶仍然可以催化大DNA片段(約200,000個(gè)堿基對)的切除(方向重復(fù))或倒置(相反方向)。
本文利用的公開物和其它材料說明了本發(fā)明的背景或提供關(guān)于本方法的其它細(xì)節(jié)，都引入作為參考，為了方便，歸結(jié)在附加的參考文獻(xiàn)列表中。
該系統(tǒng)基于在時(shí)間和空間上誘導(dǎo)CRE重組酶的表達(dá)的能力，然后重組酶與正討論的轉(zhuǎn)基因側(cè)接的直接重復(fù)lox位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致準(zhǔn)確地切除基因表達(dá)盒。為了測試這一系統(tǒng)，利用螢火蟲螢光素酶(LUC)報(bào)道基因作為重組標(biāo)記設(shè)計(jì)允許在植物中檢測準(zhǔn)確切除事件的構(gòu)建體。
圖2A-B表示了來自兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系的DEX處理的和非DEX處理的葉子，表示了可誘導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組和“填充片段”的收回。用螢光素酶活性表示了陽性重組部分。
圖3是表示干擾轉(zhuǎn)基因的可誘導(dǎo)的位點(diǎn)特異倒置的原理。G1090驅(qū)動(dòng)三雜合體轉(zhuǎn)錄因子GVG的啟動(dòng)子；3A-terrbcs 3A polyA附加序列；6xUASGVG的6X結(jié)合位點(diǎn)；CaMV-terCaMV polyA附加序列；NOS-ter胭脂堿合酶poly附加序列；E9-terrbcs E9 polyA附加序列。
圖4是能夠組成性地表達(dá)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因，接著可誘導(dǎo)地切除DNA盒的二元載體的圖解說明。X表達(dá)盒編碼需要的遺傳特性的轉(zhuǎn)基因；G1090驅(qū)動(dòng)三雜合體轉(zhuǎn)錄因子GVG的啟動(dòng)子；3ATrbcs 3A polyA附加序列；6xUASGVG的6X結(jié)合位點(diǎn)；NOST胭脂堿合酶polyA附加序列；E9Trbcs E9 polyA附加序列；NOS胭脂堿合酶啟動(dòng)子。
圖5是能夠可誘導(dǎo)地表達(dá)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因，接著可誘導(dǎo)地切除DNA表達(dá)盒的二元載體的圖解說明。X表達(dá)盒編碼需要的遺傳特性的轉(zhuǎn)基因；G1090驅(qū)動(dòng)三雜合體轉(zhuǎn)錄因子GVG的啟動(dòng)子；3ATrbcs3A polyA附加序列；6xUASGVG的6X結(jié)合位點(diǎn)(高親和力)；1XUASGVG的1X結(jié)合位點(diǎn)(低親和力)；NOST胭脂堿合酶polyA附加序列；E9Trbcs E9 polyA附加序列；NOS胭脂堿合酶啟動(dòng)子。
發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明證明了將GVG可誘導(dǎo)系統(tǒng)與噬菌體P1 Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)結(jié)合使用可以從轉(zhuǎn)基因擬南芥植物位點(diǎn)特異性地切除DNA片段(美國專利申請系列編號09/014,592，引入本文作為參考，Aoyama和Chua，1997)。產(chǎn)生的構(gòu)建體pGVG-Cre/lox-luc包括驅(qū)動(dòng)CRE的表達(dá)的GVG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)(Aoyama和Chua，1997)和驅(qū)動(dòng)LUC表達(dá)的CaMV 35S啟動(dòng)子，它受到干擾DNA表達(dá)盒，一個(gè)含有側(cè)接NOS polyA附加序列的兩個(gè)直接重復(fù)lox位點(diǎn)的“填充片段”的轉(zhuǎn)錄封閉(


圖1)。
該系統(tǒng)的工作如下(I)給轉(zhuǎn)基因植物添加化學(xué)誘導(dǎo)物，本發(fā)明的實(shí)施例中的類固醇激素地塞米松(DEX)導(dǎo)致三雜合體轉(zhuǎn)錄因子GVG的構(gòu)象的變化和“激活”，這一轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合6XUAS啟動(dòng)子序列和啟動(dòng)CRE的轉(zhuǎn)錄。(ii)產(chǎn)生的CRE重組酶與直接重復(fù)lox位點(diǎn)結(jié)合，產(chǎn)生位點(diǎn)特異性重組和導(dǎo)致NOS終止子的切除。(iii)在NOS終止子的重組和除去后，CaMV 35S啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)標(biāo)記的重組部分的LUC表達(dá)。
我們已經(jīng)在Arabidopsis thaliana中轉(zhuǎn)化了pGVG-Cre/lox-luc，并且分析了DEX處理之前和之后發(fā)生的位點(diǎn)特異性重組事件。在溫室條件下生長含有GVG-Cre/lox-luc轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株2個(gè)星期，接著應(yīng)用DEX。在來自各種轉(zhuǎn)基因幼苗的一個(gè)標(biāo)記葉子上應(yīng)用(涂)20微摩爾/升的DEX溶液。然后將幼苗移回溫室6-12小時(shí)。然后，從幼苗上與鄰近的非DEX處理葉子一起切下標(biāo)記的DEX處理葉子，放置于培養(yǎng)皿上，接著用螢火蟲螢光素酶底物熒光素。然后，利用冷卻的CCD相機(jī)檢測所有葉子的LUC活性。
雖然利用GVG可誘導(dǎo)系統(tǒng)成功地證明了我們的系統(tǒng)，如所述的實(shí)施例，任何可誘導(dǎo)的或去阻遏的表達(dá)系統(tǒng)將能有效地工作。其他可誘導(dǎo)的系統(tǒng)包括，但不限于熱可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)(Lyznik等人，1995)，乙醇可誘導(dǎo)系統(tǒng)(Caddick等人，1998)，蛻皮激素系統(tǒng)(Martinez等人，1999)，和TGV地塞米松/四環(huán)素系統(tǒng)(Bohner等人，1999)。
除了所述的噬菌體P1 Cre/lox系統(tǒng)，存在幾個(gè)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，已經(jīng)顯示能在植物中工作，他們包括(I)來自啤酒酵母的FLP-FRT系統(tǒng)(O‘Gorman et al.，1991)，(ii)來自噬菌體Mu的GIN/gix系統(tǒng)(Maeser and Kahmann，1991)和(iii)來自Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系統(tǒng)(Onouchi et al.，1991)。雖然我們已經(jīng)證明了利用Cre/lox系統(tǒng)的回收，所有上面的重組系統(tǒng)也可以用于可誘導(dǎo)或去阻遏轉(zhuǎn)基因收回，或利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述重組酶的表達(dá)的激活。
所述的位點(diǎn)特異性重組的例子包括允許沉默轉(zhuǎn)基因的激活的填充片段的收回。當(dāng)將lox位點(diǎn)相反方向放置時(shí)，通過干擾DNA片段的位點(diǎn)特異的逆轉(zhuǎn)，激活基因也是可能的。
可誘導(dǎo)或去阻遏系統(tǒng)與重組系統(tǒng)結(jié)合使用允許特定地收回任何放置于選定的重組位點(diǎn)之間的單個(gè)轉(zhuǎn)基因。利用‘兩個(gè)成分’系統(tǒng)也是可能的，其中利用了兩個(gè)可誘導(dǎo)系統(tǒng)。這允許利用一個(gè)誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)地激活討論中的轉(zhuǎn)基因(例如，抗生素抗性標(biāo)記)，接著一旦轉(zhuǎn)基因(例如，抗生素抗性標(biāo)記)完成它的功能，利用第二個(gè)誘導(dǎo)物收回完整的轉(zhuǎn)基因，包括重組系統(tǒng)?；蛘撸哂胁煌T導(dǎo)物親和力的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以用于選擇性地激活一個(gè)轉(zhuǎn)基因，而不是其它依賴于討論中的誘導(dǎo)物的濃度的轉(zhuǎn)基因。利用Cre-催化切除生物學(xué)從植物基因組收回轉(zhuǎn)基因(例如，抗生素抗性標(biāo)記)已經(jīng)有報(bào)道(Daleand Ow，1991；Odell et al.，1994)。但是，這些事件依賴于基因轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)基因隨后的切除，讓重組轉(zhuǎn)基因與第二個(gè)標(biāo)記基因連接，仍然存在于植物基因組中。
雖然所述的系統(tǒng)是在Arabidopsis thaliana中測試的，在這一目的中可以利用任何可轉(zhuǎn)化的植物種類。
特定地從轉(zhuǎn)基因植物除去轉(zhuǎn)基因的能力提供了在沒有潛在地對環(huán)境不安全的轉(zhuǎn)基因如抗生素抗性標(biāo)記的情況下在作物種類中工程化需要的遺傳特性的方法。通過除去“填充”片段或?qū)⒊聊霓D(zhuǎn)基因倒置成用于功能表達(dá)正確的方向也可以利用該系統(tǒng)激活沉默轉(zhuǎn)基因。所述的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)具有實(shí)現(xiàn)這些目的的能力，并且這些可以分成兩大類A)通過切除或倒置時(shí)間性地激活沉默基因和B)在利用后收回組成性表達(dá)的基因。
參考下面的實(shí)施例描述本發(fā)明，它們是以舉例的方式提供的，不以任何方式限制本發(fā)明。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，或下面具體描述的各種技術(shù)。
實(shí)施例1通過切除或倒置時(shí)間性地激活沉默轉(zhuǎn)基因A)除去“填充”片段這一實(shí)施例明確地證明了可以暫時(shí)激活沉默轉(zhuǎn)基因。該原理的基礎(chǔ)是當(dāng)放置于啟動(dòng)子和討論中的轉(zhuǎn)基因之間時(shí)，終止子序列具有從組成性啟動(dòng)子廢除轉(zhuǎn)基因的功能表達(dá)的能力(
圖1)。通過將兩個(gè)方向lox位點(diǎn)放置于終止子序列(這里是NOS-ter)的側(cè)翼，由可誘導(dǎo)的重組酶表達(dá)切除終止子序列導(dǎo)致功能性轉(zhuǎn)基因表達(dá)是可能的。將螢火蟲螢光素酶(LUC)報(bào)道基因用作用于功能重組和隨后的轉(zhuǎn)基因激活的標(biāo)記。地塞米松的加入誘導(dǎo)了CRE的表達(dá)，這將切除兩個(gè)lox位點(diǎn)之間的終止子區(qū)。在沒有地塞米松時(shí)，在35S啟動(dòng)子和螢光素酶基因之間NOS-ter的存在阻止了螢光素酶的表達(dá)。在加入地塞米松后，誘導(dǎo)切除NOS-ter的CRE，LUC基因是CaMV 35S啟動(dòng)子控制的，并且得以表達(dá)。這一基因甚至在沒有地塞米松時(shí)也表達(dá)。本文利用的LUC基因只是一個(gè)例子，因?yàn)樗谋磉_(dá)容易觀察到。它可以用任何其它需要的基因替代，在加入地塞米松之前同樣是沉默的，但在加入地塞米松后啟動(dòng)了，并且在地塞米松撤除后仍然是啟動(dòng)狀態(tài)。
正如從圖2A-B可以看到，利用DEX在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的葉子中誘導(dǎo)了位點(diǎn)特異性重組。同樣明確的是該系統(tǒng)沒有顯示非特異誘導(dǎo)，正如在非處理葉子中缺乏螢光素酶活性所證實(shí)的。在實(shí)際應(yīng)用中，LUC基因可以簡單地利用任何轉(zhuǎn)基因替代。下面給出了敘述的實(shí)施例。
在擬南芥中花的同源異型基因的表達(dá)依賴于分生組織特性基因如LEAFY的作用，該基因編碼確定分生組織產(chǎn)生花而不是葉子和莖的轉(zhuǎn)錄因子。LEAFY參與了同源異型基因的作用，這些基因在花的特定區(qū)表達(dá)(Busch等人.，1999)，并且已經(jīng)顯示，LEAFY的異位表達(dá)導(dǎo)致在轉(zhuǎn)基因白楊中誘導(dǎo)了花(Weigel和Nilsson，1995)。
利用已開發(fā)的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)基因的樹中產(chǎn)生時(shí)間性的激活LIAFY是可能的，這些樹顯示了需要的特性，如在幾年后在田間快速地生長。處理的樹將開花并且長種子，可以立即用于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的繁殖。
B)轉(zhuǎn)基因倒置將兩個(gè)lox位點(diǎn)相反方向放置導(dǎo)致了干擾DNA片段的倒置。利用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，通過時(shí)間性地倒置所述的轉(zhuǎn)基因激活沉默的轉(zhuǎn)基因是可能的(圖3)。在組成性啟動(dòng)子后面以反義方向放置轉(zhuǎn)基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因的非功能性表達(dá)。時(shí)間性地表達(dá)重組酶導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異地倒置成有意義方向?qū)е罗D(zhuǎn)基因的激活。雖然可行，但這一途徑的缺點(diǎn)是由于在重組后連續(xù)地存在兩個(gè)重組位點(diǎn)，重組事件是可逆的。在效果上，這意味著干擾DNA片段在存在重組酶時(shí)，可以前后翻轉(zhuǎn)。
實(shí)施例2在使用后收回組成性表達(dá)基因A)組成性表達(dá)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因之后可誘導(dǎo)地切除為了鑒定已經(jīng)利用轉(zhuǎn)基因成功地轉(zhuǎn)化的個(gè)體，任何植物種類的轉(zhuǎn)化需要選擇標(biāo)記。這通常是利用抗生素抗性標(biāo)記基因如nptII和hptII或作為轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的一部分與需要的遺傳特性一起整合進(jìn)植物基因組的編碼莖再生特性如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的基因(Kunkel等人，1999)。一旦轉(zhuǎn)化植物已經(jīng)再生，所述的可誘導(dǎo)的重組系統(tǒng)可以除去“標(biāo)記”基因，并選擇用于成功的轉(zhuǎn)基因整合只留在需要的轉(zhuǎn)基因之后(遺傳特性)。原理如下構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化二元載體在整合序列的左和右邊界之間含有如下成分(圖4)(i)需要的基因(X表達(dá)盒)，(ii)組成性表達(dá)標(biāo)記基因，例如在圖4中表示的NOS啟動(dòng)子控制下的卡那霉素或CKIl，和(iii)可誘導(dǎo)地表達(dá)重組酶，例如利用在6XUAS啟動(dòng)子控制下的CRE結(jié)合的GVG系統(tǒng)，如圖4中所示。內(nèi)部的序列順序并不必需如圖4所示。含有標(biāo)記基因和重組酶的表達(dá)盒與兩個(gè)直接重復(fù)的重組位點(diǎn)側(cè)接。
在用載體轉(zhuǎn)染時(shí)，通過組成性表達(dá)的標(biāo)記可以鑒定轉(zhuǎn)染的植物或細(xì)胞。在選擇轉(zhuǎn)染植物或細(xì)胞后，用結(jié)合GVG的DEX處理選擇的植物或細(xì)胞，這一復(fù)合物依次結(jié)合誘導(dǎo)CRE的6XUAS，CRE然后切除兩個(gè)lox位點(diǎn)之間的完整載體區(qū)，從而留下RB，X表達(dá)盒，一個(gè)拷貝的lox和LB。這個(gè)系統(tǒng)允許通過標(biāo)記基因選擇，接著通過位點(diǎn)特異性重組應(yīng)答誘導(dǎo)物收回標(biāo)記基因再生含有需要的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
B)可誘導(dǎo)地表達(dá)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因，接著可誘導(dǎo)地切除可以操作誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)使其對誘導(dǎo)物的親和力改變。在這一方面，構(gòu)建位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)是可能的，其中標(biāo)記基因和重組酶都在同一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，但對討論中的誘導(dǎo)物具有不同的親和力。原理如下構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化二元載體在整合序列的右邊界和左邊界含下面成分(圖5)(i)需要的基因(X表達(dá)盒)，(ii)利用高親和力啟動(dòng)子(本文，6xUAS)誘導(dǎo)性地表達(dá)的標(biāo)記基因(例如，卡那霉素或CK11)，和(iii)利用低親和力啟動(dòng)子(本文，1xUAS)誘導(dǎo)性表達(dá)重組酶(例如，CRE)。內(nèi)部序列的順序并不必需如圖5所示。含有標(biāo)記基因和重組酶的表達(dá)盒與兩個(gè)直接重復(fù)的重組位點(diǎn)(在本實(shí)施例中是lox)側(cè)接。
為了利用這一系統(tǒng)，用該載體轉(zhuǎn)染植物或細(xì)胞。附加低水平的誘導(dǎo)物(在本實(shí)施例中是DEX)誘導(dǎo)了在高親和力(6xUAS)啟動(dòng)子而不是低親和力(1XUAS)啟動(dòng)子的控制下的基因。在本實(shí)施例中，低水平的DEX誘導(dǎo)了可以用于選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞或植物的卡那霉素或CKI1。在選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞或植物后，用高水平的誘導(dǎo)物處理，然后結(jié)合足夠的GVG以便在足夠高的濃度時(shí)結(jié)合1XUAS誘導(dǎo)CRE的合成。然后在兩個(gè)lox位點(diǎn)，CRE切除載體區(qū)，只留下作為整合的核酸的RB，X表達(dá)盒，一個(gè)拷貝的lox和LB。
這一系統(tǒng)允許利用低濃度的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)標(biāo)記基因再生轉(zhuǎn)基因植物，接著用高濃度的誘導(dǎo)物收回標(biāo)記基因。利用只區(qū)別在于誘導(dǎo)物親和力的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子激活標(biāo)記基因和重組酶具有可控制的標(biāo)記基因激活的附加的優(yōu)點(diǎn)，這在利用編碼參與莖再生或發(fā)育方式的蛋白質(zhì)的標(biāo)記基因時(shí)可能是重要的。
這一系統(tǒng)的其他方面的改進(jìn)是利用了對重組酶的親和力較低的突變重組位點(diǎn)。顯示對CRE具有較低的親和力的突變lox位點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)(Albert等人，1995)并且保證在提高誘導(dǎo)物的濃度之前，即由于遺漏了CRE的表達(dá)而沒有發(fā)生轉(zhuǎn)基因的收回。
實(shí)施例3葉綠體編碼的轉(zhuǎn)基因的可誘導(dǎo)收回或激活來自轉(zhuǎn)基因植物的通過花粉的外源核編碼的基因，特別是可選擇標(biāo)記基因如抗生素抗性基因的水平基因轉(zhuǎn)移是與環(huán)境有關(guān)系的?？朔@一潛在的問題的方法是在質(zhì)體中包含外源基因，因?yàn)榛ǚ鄄晦D(zhuǎn)移質(zhì)體編碼的基因。在煙草中已經(jīng)顯示了有高頻質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Svab和Maliga，1993)，并且對大量的植物種類中可以進(jìn)行?？朔ㄟ^花粉轉(zhuǎn)移水平基因的潛在危險(xiǎn)的一個(gè)方法是在成功選擇后將質(zhì)體轉(zhuǎn)化與葉綠體定位的可選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒的可誘導(dǎo)收回偶聯(lián)。該系統(tǒng)的原理是與所述的實(shí)施例2基本相同，只有下面的修改。含有組成性選擇標(biāo)記基因如抗生素抗性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒與直接重復(fù)的lox位點(diǎn)側(cè)接，并存在于質(zhì)體的基因組中。在正選擇轉(zhuǎn)基因植物后，如前面所述誘導(dǎo)了CRE，但是，在這時(shí)，CRE的重組酶基因已經(jīng)工程化，含有特別的編碼用于靶擊葉綠體的N末端轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA序列(Schnell，1995)。在加入誘導(dǎo)物后，產(chǎn)生了CRE重組酶，并轉(zhuǎn)位到質(zhì)體，在那里它作用于lox位點(diǎn)，并除去了可選擇標(biāo)記基因。也可以應(yīng)用實(shí)施例1的原理，可以將這一系統(tǒng)用于通過適當(dāng)放置lox位點(diǎn)可誘導(dǎo)地收回或激活任何葉綠體編碼轉(zhuǎn)基因。
實(shí)施例4定位激活或收回上面公開的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)和利用所述重組的任何變化和可誘導(dǎo)的或去阻遏的啟動(dòng)子系統(tǒng)可以用于在植物中的組織特異位置永久性地激活轉(zhuǎn)基因。
擬南芥ttg突變?nèi)狈γ珷铙w和花色素苷色素(Lloyd等人，1994)。這一突變表現(xiàn)型可以用玉米調(diào)節(jié)R的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)(這需要第二個(gè)調(diào)節(jié)子C1)，這在玉米的花色素苷的表達(dá)中是需要的。R蛋白質(zhì)含有酸性的和堿性的HLH區(qū)，與哺乳動(dòng)物MYC轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的HLH區(qū)域具有強(qiáng)同源性。利用所述的可誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)基因激活系統(tǒng)產(chǎn)生可以激活R基因表達(dá)和由此的在將在植物的生命循環(huán)中組成性地表達(dá)的特異區(qū)域的花色素苷生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因ttg植物。
在野生型擬南芥和其他植物如煙草或番茄中R基因的過度表達(dá)可以引起花色素苷的生產(chǎn)。所以，我們可以利用Cre/lox系統(tǒng)和選擇性地利用誘導(dǎo)物，利用模板如葉產(chǎn)生表達(dá)花色素苷的特異模式。
盡管在本申請中已經(jīng)參考本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案公開了本發(fā)明，可以理解本公開物是用于解釋而不是限制，因?yàn)椴幻撾x本發(fā)明的精神和附加的權(quán)利要求的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以進(jìn)行修改。
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美國專利申請系列編號09/014,592。
權(quán)利要求
1.一種載體，其含有編碼轉(zhuǎn)錄因子的第一個(gè)基因，可誘導(dǎo)的第二個(gè)基因，組成性啟動(dòng)子，第三個(gè)基因和位于終止子側(cè)翼的兩個(gè)重組位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1所述的載體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子與誘導(dǎo)物一起誘導(dǎo)所述的第二個(gè)基因的表達(dá)。
3.權(quán)利要求1所述的載體，其中第二個(gè)基因編碼在所述的兩個(gè)重組位點(diǎn)裂解的重組酶。
4.權(quán)利要求1所述的載體，其中當(dāng)所述的第二個(gè)基因受到誘導(dǎo)時(shí)，它的基因產(chǎn)物切除所述的終止子。
5.權(quán)利要求1所述的載體，其中在切除所述的終止子時(shí)，所述第三個(gè)基因在所述的組成性啟動(dòng)子的控制下。
6.權(quán)利要求1所述的載體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子是糖皮質(zhì)激素受體。
7.權(quán)利要求1所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼CRE，F(xiàn)LP，GIN或R。
8.權(quán)利要求1所述的載體，其中所述的重組位點(diǎn)是lox，F(xiàn)RT，gix或RS。
9.權(quán)利要求1所述的載體，其中所述的第三個(gè)基因編碼LEAFY。
10.權(quán)利要求1所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼包含用于定向于葉綠體的N末端轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)。
11.一種載體，其含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的第一個(gè)基因，組成性啟動(dòng)子，位于終止子側(cè)翼的兩個(gè)重組位點(diǎn)，和第二個(gè)基因。
12.權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自包括熱休克啟動(dòng)子，光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，銅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組。
13.權(quán)利要求11的載體，其中所述的第一個(gè)基因編碼在所述的兩個(gè)重組位點(diǎn)裂解的重組酶。
14.權(quán)利要求11所述的載體，其中當(dāng)所述的第一個(gè)基因受到誘導(dǎo)時(shí)，它的基因產(chǎn)物切除所述的終止子。
15.權(quán)利要求11所述的載體，其中在所述的終止子被切除時(shí)，所述的第二個(gè)基因在所述的組成性啟動(dòng)子的控制下。
16.權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的第一個(gè)基因編碼CRE，F(xiàn)LP，GIN或R。
17.權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的重組位點(diǎn)是lox，F(xiàn)RT，gix或RS。
18.權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼LEAFY。
19.權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的第一個(gè)基因編碼含有用于定向于葉綠體的N末端轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)。
20.一種載體，其含有編碼轉(zhuǎn)錄因子的第一個(gè)基因，可誘導(dǎo)的第二個(gè)基因，組成性啟動(dòng)子，第三個(gè)基因，和側(cè)接所述的第三個(gè)基因的兩個(gè)重組位點(diǎn)。
21.權(quán)利要求20所述的載體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子和誘導(dǎo)物一起誘導(dǎo)所述的第二個(gè)基因的表達(dá)。
22.利要求20所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼在所述的兩個(gè)重組位點(diǎn)裂解的重組酶。
23.權(quán)利要求20所述的載體，其中當(dāng)所述的第二個(gè)基因得到誘導(dǎo)時(shí)，它的基因產(chǎn)物引起所述的第三個(gè)基因的倒置。
24.權(quán)利要求20所述的載體，其中在所述的第三個(gè)基因倒置時(shí)，所述的第三個(gè)基因是在所述的組成性啟動(dòng)子的控制下。
25.權(quán)利要求20所述的載體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子是糖皮質(zhì)激素受體。
26.權(quán)利要求20所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼CRE，F(xiàn)LP，GIN或R。
27.權(quán)利要求20所述的載體，其中所述的重組位點(diǎn)是lox，F(xiàn)RT，gix或RS。
28.權(quán)利要求20所述的載體，其中所述的第三個(gè)基因編碼LEAFY。
29.權(quán)利要求20所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼含有用于定向于葉綠體的N末端轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)。
30.一種載體，其含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的第一個(gè)基因，一個(gè)組成性啟動(dòng)子，側(cè)接第二個(gè)基因的兩個(gè)重組位點(diǎn)。
31.權(quán)利要求30所述的載體，其中所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自包括熱休克啟動(dòng)子，光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，銅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，和蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組。
32.權(quán)利要求30所述的載體，其中所述的第一個(gè)基因編碼在所述的兩個(gè)重組位點(diǎn)裂解的重組酶。
33.權(quán)利要求30所述的載體，其中當(dāng)所述的第一個(gè)基因得到誘導(dǎo)時(shí)，它的基因產(chǎn)物引起所述的第二個(gè)基因的倒置。
34.權(quán)利要求30所述的載體，其中在所述的第二個(gè)基因倒置時(shí)，所述的第二個(gè)基因在所述的組成性啟動(dòng)子的控制下。
35.權(quán)利要求30所述的載體，其中所述的第一個(gè)基因編碼CRE，F(xiàn)LP，GIN或R。
36.權(quán)利要求30所述的載體，其中所述的重組位點(diǎn)是lox，F(xiàn)RT，gix或RS。
37.權(quán)利要求30所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼LEAFY。
38.權(quán)利要求30所述的載體，其中所述的第一個(gè)基因編碼含有用于定向于葉綠體的N末端轉(zhuǎn)移肽的蛋白質(zhì)。
39.一種載體，其含有感興趣的基因，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，標(biāo)記基因，編碼重組酶的可誘導(dǎo)基因和兩個(gè)重組位點(diǎn)，其中所述的重組位點(diǎn)位于所述的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，所述的標(biāo)記基因和所述的可誘導(dǎo)基因的側(cè)翼。
40.權(quán)利要求39所述的載體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子和誘導(dǎo)物一起誘導(dǎo)所述的可誘導(dǎo)基因的表達(dá)。
41.權(quán)利要求39所述的載體，其中所述的重組酶引起所述的編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因、所述的標(biāo)記基因和所述的可誘導(dǎo)基因的刪除。
42.權(quán)利要求39所述的載體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子是糖皮質(zhì)激素受體。
43.權(quán)利要求39所述的載體，其中所述的可誘導(dǎo)基因編碼CRE，F(xiàn)LP，GIN或R。
44.權(quán)利要求39所述的載體，其中所述的重組位點(diǎn)是lox，F(xiàn)RT，gix或RS。
45.權(quán)利要求44所述的載體，其中所述的lox位點(diǎn)是突變的，并且對CRE的親和力比野生型lox低。
46.利要求39所述的載體，其中所述的標(biāo)記基因是在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下的，所述的可誘導(dǎo)基因是在弱啟動(dòng)子的控制下的，其中所述的強(qiáng)啟動(dòng)子被低濃度的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)，所述的弱啟動(dòng)子被高濃度的所述誘導(dǎo)物誘導(dǎo)。
47.權(quán)利要求39所述的載體，其中所述的重組酶含有用于定向于葉綠體的N末端轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
48.一種載體，含有感興趣的基因，標(biāo)記基因，編碼重組酶的可誘導(dǎo)基因，兩個(gè)重組位點(diǎn)，其中所述的重組位點(diǎn)位于標(biāo)記基因和所述的可誘導(dǎo)基因的側(cè)翼。
49.權(quán)利要求48所述的載體，其中所述的重組酶導(dǎo)致所述的標(biāo)記基因和所述的可誘導(dǎo)基因的刪除。
50.權(quán)利要求48所述的載體，其中所述的可誘導(dǎo)基因編碼CRE，F(xiàn)LP，GIN或R。
51.權(quán)利要求48所述的載體，其中所述的重組位點(diǎn)是lox，F(xiàn)RT，gix或RS。
52.權(quán)利要求51所述的載體，其中所述的lox位點(diǎn)是突變的并且其對于CRE的親和力比野生型lox低。
53.權(quán)利要求48所述的載體，其中所述的標(biāo)記基因是在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下的，所述的可誘導(dǎo)基因是在弱啟動(dòng)子的控制下的，其中所述的強(qiáng)啟動(dòng)子被低濃度的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)，所述的弱啟動(dòng)子被高濃度的所述誘導(dǎo)物誘導(dǎo)。
54.權(quán)利要求48所述的載體，其中所述的重組酶含有用于定向于葉綠體的N末端轉(zhuǎn)移肽。
55.在特定時(shí)間，在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中表達(dá)基因的方法，包括如下步驟a)用權(quán)利要求1所述的載體轉(zhuǎn)染所述的植物或植物細(xì)胞；和b)加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述的載體的所述的第二個(gè)基因，其中所述載體的所述的第二個(gè)基因表達(dá)能從所述的載體切除所述的終止子的產(chǎn)物，從而使所述載體的所述第三個(gè)基因置于所述載體的所述組成性啟動(dòng)子的控制下，導(dǎo)致在加入所述的誘導(dǎo)物后表達(dá)所述的第三個(gè)基因。
56.在特定的時(shí)間，在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中表達(dá)基因的方法，包括如下步驟a)用權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)染所述的植物或植物細(xì)胞；和b)加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述載體的所述第一個(gè)基因，其中所述載體的所述第一個(gè)基因表達(dá)能從所述的載體切除所述的終止子的產(chǎn)物，從而使所述載體的所述第二個(gè)基因置于所述載體的所述組成性啟動(dòng)子的控制下，導(dǎo)致在加入所述的誘導(dǎo)物后表達(dá)所述的第二個(gè)基因。
57.在特定的時(shí)間，在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中表達(dá)基因的方法，包括如下步驟a)用權(quán)利要求20的載體轉(zhuǎn)染所述的植物或植物細(xì)胞；和b)加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述的載體的所述的第二個(gè)基因，其中所述載體的所述第二個(gè)基因表達(dá)導(dǎo)致所述載體的所述第三個(gè)基因倒置的產(chǎn)物，從而使所述的第三個(gè)基因置于所述載體的所述組成性啟動(dòng)子的控制下，導(dǎo)致在加入所述的誘導(dǎo)物后表達(dá)所述的第三個(gè)基因。
58.在特定時(shí)間在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中表達(dá)基因的方法，包括如下步驟a)用權(quán)利要求30所述的載體轉(zhuǎn)染所述的植物或植物細(xì)胞；和b)加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述載體的所述的第一個(gè)基因，其中所述的第一個(gè)基因表達(dá)導(dǎo)致所述載體的所述第二個(gè)基因倒置的產(chǎn)物，從而將所述的第二個(gè)基因置于所述載體的所述組成性啟動(dòng)子的控制下，導(dǎo)致在加入所述的誘導(dǎo)物后表達(dá)所述的第二個(gè)基因。
59.從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的基因組中切除標(biāo)記基因的方法，包括如下步驟a)用權(quán)利要求39所述的載體轉(zhuǎn)染植物或植物細(xì)胞，形成所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和b)加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述的可誘導(dǎo)基因，其中所述的可誘導(dǎo)基因產(chǎn)生從所述的基因組除去所述的標(biāo)記基因的重組酶。
60.權(quán)利要求59所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是在加入誘導(dǎo)物之前選擇的。
61.從轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞切除標(biāo)記的方法，包括步驟a)用權(quán)利要求48所述的載體轉(zhuǎn)染植物或植物細(xì)胞，形成所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和b)加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)所述的可誘導(dǎo)基因，其中所述的可誘導(dǎo)基因產(chǎn)生從所述的基因組除去所述的標(biāo)記基因的重組酶。
62.權(quán)利要求61所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞是在加入誘導(dǎo)物之前選擇的。
63.制備具有一設(shè)計(jì)，一個(gè)字(word)或多個(gè)字的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述的方法包括如下步驟a)制備含有載體的轉(zhuǎn)基因植物，載體含有在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的編碼重組酶以及在所述重組酶在所述的載體內(nèi)裂解之前是沉默的調(diào)節(jié)因子R的核酸，和b)將誘導(dǎo)所述的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的化學(xué)物以所希望的設(shè)計(jì)，一個(gè)字或多個(gè)字的模式放置在轉(zhuǎn)基因植物上；從而所述的植物將以化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子放置于所述的轉(zhuǎn)基因植物上的模式產(chǎn)生花色素苷。
64.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物含有權(quán)利要求1所述的載體，其中所述的第三個(gè)基因編碼調(diào)節(jié)因子R。
65.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物含有權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的第二個(gè)基因編碼調(diào)節(jié)因子R。
66.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物含有權(quán)利要求39所述的載體，其中所述的感興趣的基因編碼調(diào)節(jié)因子R。
67.權(quán)利要求63所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因植物含有權(quán)利要求48所述的載體，其中所述的感興趣的基因編碼調(diào)節(jié)因子R。
68.含有權(quán)利要求1所述的載體的植物或植物細(xì)胞。
69.含有權(quán)利要求11所述的載體的植物或植物細(xì)胞。
70.含有權(quán)利要求20所述的載體的植物或植物細(xì)胞。
71.含有權(quán)利要求30所述的載體的植物或植物細(xì)胞。
72.含有權(quán)利要求39所述的載體的植物或植物細(xì)胞。
73.含有權(quán)利要求48所述的載體的植物或植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了與位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)結(jié)合的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng),其允許(i)在特定的時(shí)間特異地激活轉(zhuǎn)基因或(ii)從轉(zhuǎn)基因植物中切除和除去轉(zhuǎn)基因(例如,抗生素抗性標(biāo)記)。這些“自殺”基因表達(dá)盒,包括重組系統(tǒng)本身,一旦它們的功能已經(jīng)發(fā)揮,可以從植物基因組中收回。該系統(tǒng)基于時(shí)空誘導(dǎo)CRE重組酶的表達(dá),該重組酶隨后結(jié)合位于所述的轉(zhuǎn)基因側(cè)翼的直接重復(fù)的lox位點(diǎn),導(dǎo)致精確切除基因表達(dá)盒。本發(fā)明還公開了激活倒置的所以是沉默的轉(zhuǎn)基因的方法,其是將兩個(gè)lox位點(diǎn)以相反方向放置于轉(zhuǎn)基因的側(cè)翼。這導(dǎo)致了在存在CRE重組酶時(shí)間插DNA片段倒置。這樣的激活可以通過將CRE重組酶置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下來按預(yù)定時(shí)間進(jìn)行。
文檔編號C12N15/82GK1423701SQ00818358
公開日2003年6月11日 申請日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月12日
發(fā)明者西蒙·蓋爾·莫勒, 左建儒, 蔡南海 申請人:洛克菲勒大學(xué)