專利名稱：L－泛內酯水解酶和一種d－泛內酯的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有水解L-泛內酯(L-pantolactone)酶活性的蛋白。本發(fā)明也涉及編碼這些蛋白的核酸、核酸構建體、載體、遺傳改造的微生物及一種D-泛內酯的制備方法。
D-泛內酯是化學合成和生物合成泛酸、泛醇和泛酰硫氫乙胺及其衍生物的前體。這些物質被用來作為人類飲食、動物飼料、醫(yī)藥(如傷口愈合)及化妝品(如護發(fā)產品)中的維生素補充劑。因此，經濟合理的合成對映體純的D-泛內酯是十分重要的。在制備D-泛內酯方面，除了長期采用的化學方法以外，最近越來越多的生物技術方法也已被設計出來。一篇關于D-泛內酯及其化學合成的綜述可以在Ullmann工業(yè)化學百科全書中找到(VCHVerlagsgesellschaft mbH，69451 Weinheim，1996年，A27卷，559-566頁)。
泛內酯的生物技術遵循著各種合成策略。
Galanzert等人描述了一種使用脂肪酶或酯酶選擇性地水解o-乙酰泛內酯，拆分外消旋物的方法(微生物酶學技術1988，10，689-690)。一個這種類型的外消旋物拆分方法已申請專利DE 40 05 150和EP-A-0 507278。而這種方法所達到的對映體的純度不能達到工業(yè)使用的要求。
Degussa描述了使用醇氰醛化酶，以羥基新戊醛和氫氰酸起始，經由光學純的羥基新戊醛氰醇制備泛內酯的方法(DE 41 26 580，EP-A-0 528 256，DE 41 39 987)。這個反應在理論上可以達到100％的收率。該反應的缺點是需要大量的酶(等摩爾的酶與底物)和產物的對映體純度相對較低(最高82％)。
JP 47019745描述了使用節(jié)桿菌(Arthrobacter)、短桿菌(Brevibacterium)、芽孢菌(Bacillus)或棒桿菌(Corynebacterium)合成D-泛內酯的方法。在該反應中，所述的生物體通過L-泛內酯的代謝將外消旋的泛內酯轉化成D-泛內酯。該方法的缺點是一半的前體被代謝并因此損失掉了。
三菱(Mitsubishi)化學公司和宇部(Ube)公司已要求了由D，L-泛內酯制備D-泛內酯的方法(JP 6067320，JP 62294092，JP 62294096，JP57152895)。這些方法描述了紅酵母(Rhodotorula)、鎖擲酵母(Sporidiobolus)和梗孢酵母(Sterigmatomyces)中的L-泛內酯水解酶。然而，當前的觀點(參考Yamada & Shimizu，Ann.N.Y.Acad.Sci.672in Enzyme Eng.XI，Clark et al.，372-386；Chimia，47，19935-10，JP 62187426；JP 61293384；JP 61293386；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27，1988622-642，Chemical Aspects of Enzyme Biotechnology，eds.T.O.Baldwin et al.，Plenum Press，New York，1990151-163)認為，在這些酵母里是否存在L-泛內酯的直接水解仍值得懷疑。這一觀點也為我們自己的研究所證實。該反應通過酮基泛解酸氧化還原酶將酮基泛內酯轉化成L-泛內酯之說更合適一些。在我們自己進行的研究中可以檢測到酮基泛內酯作為中間體存在，就是說并沒有直接水解成L-泛內酯的。該反應的缺點是可被轉化的泛內酯的濃度很低。
通過酮基泛內酯和酮基泛解酸氧化還原酶介導的這個反應在細菌中也有描述(例如Yamada & Shimizu，參上；Shimizu等.，生物化學雜志.1988，263，12077-12084，Kataoka等。歐洲生物化學雜志。1992，204，799-806)。雖然，由D，L-泛內酯通過酮基泛內酯和酮基泛解酸對映選擇合成D-泛內酯的相關方法具有高產率的優(yōu)點(理論上100％，紅球菌為90.5％，見下)，但由于其需要輔助因子(NADH，NADPH)、補加能量底物(葡萄糖)、低時空產率和低終濃度(18.2-72g/l D-泛內酯)，其生產是很不經濟的。這個反應更不利的一點是，參加反應的兩個酶對于轉化反應通常具有不同的最適點。這樣的問題在使用單(水解)酶時是不會出現的。
富士(Fuji)與京都大學(Kyoto University)的Yamada研究組合作，已經開發(fā)了一種利用真菌D-泛內酯水解酶，拆分外消旋體的酶學方法(JP09308-497，JP 11056356，EP-B-0 436 730，EP-B-0 504 421，EP-A-0794 251，Wo 92/06182，WO 97/10341，US 5,275,949，US 5,372,940)。該酶可以從真菌(Cylindrocarpon tonkinense)，藤倉赤霉(Gibberellafujikuroi)和尖鐮孢(Fusarium oxysporum)中分離得到。該D-泛內酯水解酶是一種Ca2+依賴型糖基化酶，由125kDa的同型二聚體構成(Ann.N.Y.Acad.Sci.1996，799650-658，酶工程)。該酶被Cd2+，Hg2+，Cu2+和EDTA(US 5,372,940)所抑制。Shimizu等人已對D-泛內酯水解酶的純化進行過描述。該純酶對許多內脂，尤其是糖內脂表現出水解活性(歐洲生物化學雜志，209，1992383-390)。其序列與運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的葡萄糖酸內脂酶(28.9％)，人和鼠的對氧磷酶(25.3％)，Catharanthus roseus的strictosidin合成酶(15.9％)具有低度的同源性(EP-A-0 794 251，Kobayashi等。美國國家科學院進展1998，95，12787-12792)。Kataoko等人描述了在不同pH值下轉化獲得的對映體純度依賴性很高(微生物酶學技術1996，19307-310和應用微生物生物技術1995，44333-338)。在接近或超過pH 7時獲得的對映體濃度較低，因為在較高pH條件下，L-泛內酯的自發(fā)化學水解增加，從而使產物的對映體純度降低。pH 5被認為是制備最高對映體純度D-泛內酯的最適pH。然而，在此pH，酶反應速度被大大降低。為獲得光學純的產物，有必要用結晶的方法進行抽提(Yamada，H.Chimia 47，19935-10)。
上述方法的缺點是，其產物的光學純度經常很低和/或時空產率不高，導致經濟前景并不看好。因此，仍然非常需要一種沒有上述缺點的，簡單、經濟的生物技術方法來制備D-泛內酯。可以說，這個方法使得以已經存在的化學合成為起始，簡便地獲得高收率的、不必進一步進行產物純化的對映體純度的D-泛內酯成為可能。
本發(fā)明的一個目標就是提供一種簡單、經濟地制備D-泛內酯的方法。我們已經發(fā)現，一段分離的、編碼一段具有L-泛內酯水解酶活力多肽的核酸序列，可以達到此目標，該序列選自a)SEQ ID NO1所述的核酸序列，b)由于遺傳密碼的簡并，導致從序列SEQ ID NO1中衍生的核酸序列，c)其編碼的多肽具有SEQ ID NO2所述氨基酸序列的SEQ ID NO1所述核酸序列的衍生物，并且該衍生物在不明顯損失該多肽酶活性的前提下，在氨基酸水平上至少應有50％的同源性，
d)(a)到(c)中所提序列的功能等同物。
這些L-泛內酯水解酶可在生物體，尤其是微生物(如細菌)中找到。此酶對于將L-泛內酯轉換成L-泛解酸的水解反應具有很高的酶活力。
這些L-泛內酯水解酶不能轉化D-泛內酯，因此這些生物體、抽提物或純酶及相關的重組菌株或蛋白能被用于制備對映體純的D-泛內酯。
本發(fā)明所述的、具有SEQ ID NO1序列的核酸序列的衍生物是指，例如，等位基因突變體，它們在衍生的氨基酸水平上至少具有50％的同源性，優(yōu)選60％以上，特別優(yōu)選70％，更特別優(yōu)選80％以上。同源性由Needleman & Wunsch法(分子生物學雜志1970，48443-453)或Smith& Waterman法進行測定(應用數學進展1981，2，482-489)。此種同源性在某些區(qū)域更高則優(yōu)。由SEQ ID NO1衍生的氨基酸序列可在SEQ ID NO2中找到。等位基因突變體尤其含有由SEQ ID NO1描述的序列通過核酸缺失、插入或替換所獲得的功能突變體，雖然其衍生蛋白的酶活力應該有些可忽略不計的損失?；盍p失可忽略不計的酶是指，酶活力至少要有20％，優(yōu)選50％，特別優(yōu)選75％，更特別優(yōu)選90％。因此，本發(fā)明也涉及上述核酸序列組編碼的氨基酸序列。本發(fā)明優(yōu)選涉及到由序列SEQ ID NO1編碼的氨基酸序列。
(a)到(c)中所提序列的功能等同物是指，編碼將L-泛內酯水解成相應酸的酶的核酸序列，該酶至少具有SEQ ID NO2所示序列活力的20％，優(yōu)選50％，特別優(yōu)選75％，更特別優(yōu)選90％，不被EDTA(1mM溶液)抑制，在pH 4和10之間穩(wěn)定。除此之外，這些功能等同物的最適pH在7和8之間，優(yōu)選最適溫度在70℃和80℃之間。
衍生物也指SEQ ID NO1的同系物，例如真菌或細菌的同系物，截短的序列，編碼和非編碼DNA序列的單鏈DNA或RNA。SEQ ID NO1的同系物與SEQ ID NO1總DNA序列相比，在DNA水平，具有至少50％的同源性，優(yōu)選60％以上，特別優(yōu)選70％，更特別優(yōu)選80％以上。
除此之外，SEQ ID NO1的同系物是指一些衍生物，如啟動子突變體。這些在所聲明核酸序列上游的啟動子，可由一個或多個核苷酸的替換、插入、和/或缺失進行修飾，而不損害該啟動子的功能或活力。而且，這些啟動子可以通過其序列修飾提高活力，或者可以被更有效的，甚至是來自異源生物體的啟動子完全取代。
衍生物也指變異體，其核苷酸序列在起始密碼子前-1到-200區(qū)域或終止密碼子后0到1000個堿基對處被修飾，因此基因表達和/或蛋白表達被改變，提高則更佳。
發(fā)明所述的核酸序列，原則上，可以從所有的生物體中鑒別和分離到。SEQ ID NO1或其同系物可輕易地從真菌、酵母或細菌中分離得到?？赡苌婕暗募毦鸀楦锾m氏陰性和陽性菌。用本領域熟練技術人員所知的方法，從革蘭氏陰性細菌分離發(fā)明所述核酸，優(yōu)選從α-蛋白細菌(α-proteobacteria)、β-蛋白細菌(β-proteobacteria)或γ-蛋白細菌(γ-proteobacteria)中，特別優(yōu)選腸桿菌(Enterobacteriaceae)、假單胞菌(Pseudomonadaceae)或根瘤菌(Rhizobiaceae)科，更特別優(yōu)選土壤桿菌(Agrobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)或伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)屬?？赡苌婕暗倪m合的真菌優(yōu)選白僵菌屬(Beauveria)或裸蓋菇屬(Psilocybe)。優(yōu)選的酵母菌可在Apiotrichum屬中找到。
SEQ ID No1或其衍生物、同系物或這些序列的一部分可以通過例如雜交或PCR技術從其它真菌或細菌中分離得到。這些DNA序列在標準條件下與本發(fā)明所述序列進行雜交。使用保守區(qū)內較短的寡核苷酸(如活性位點區(qū))對雜交有利。這些保守區(qū)可由本領域熟練技術人員所知方法通過與D-泛內酯水解酶相比較來測定(如所謂的HTGT基元)。然而，使用更長的本發(fā)明所述的核酸序列片段，或全序列進行雜交也是可能的。這些標準條件隨所使用的核酸(寡核苷酸、較長片段或全長序列)或隨用來雜交的核酸類型(DNA或RNA)而改變。因此，例如，在DNADNA雜交混合物中所用的熔化溫度就比相同長度的DNARNA中的要低10℃左右。
標準條件是指例如，在0.1到5×SSC(1×SSC＝0.15M氯化鈉，15mM檸檬酸鈉，pH 7.2)之間的水性緩沖液中，或再加50％甲酰胺，溫度在20到70℃之間。這一溫度依所用核酸而定。DNADNA雜交混合物的雜交條件在2.0×SSC及溫度為20℃到70℃之間為佳，優(yōu)選50℃到70℃之間。DNARNA雜交混合物的雜交條件在2.0×SSC及溫度為20℃到60℃之間為佳，優(yōu)選35℃到60℃之間。這些所述雜交溫度是通過例如，以長度約1000核苷酸、G+C含量在50％之間(無甲酰胺)的核酸計算出的熔化溫度。DNA雜交的實驗條件在相關的遺傳學書籍中有述，如Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港實驗室，1989，而且可由本領域熟練技術人員通過公式計算出來，如根據核酸長度、雜交混合液性質或G+C含量。雜交的更多信息可由本領域熟練技術人員在以下書籍中找到Ausubel等(eds)，1985，現代分子生物學方法，(John Wiley & Sons，New York)；Hames和Higgins(eds)，1985，核酸雜交實用方法，(IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford)；Brown(ed)，1991，基礎分子生物學實用方法，(IRL Press at Oxford University Press，Oxford)。
本發(fā)明所述核酸構建體是指具有序列SEQ ID No1的L-泛內酯水解酶基因，及其在功能上與一個或多個有利于增加基因表達的調節(jié)信號相連接的衍生物和同系物。這些調節(jié)序列是指，例如，一些序列，誘導子或抑制子與之結合并因此調節(jié)此核酸表達。除了這些新的調節(jié)序列以外，仍然有可能在實際的結構基因之前存在這些序列的自然調節(jié)，并且經由恰當地遺傳修飾關閉自然調節(jié)，提高基因表達。然而，核酸構建體也可以有著更簡單的結構，即是說，在序列SEQ ID No1或其序列同系物前，沒有插入其它的調節(jié)信號，也沒有刪除其用于調節(jié)的天然啟動子。相反，此天然調節(jié)序列產生突變，調節(jié)作用不再發(fā)生，基因表達得到提高。對于核酸構建體來說，額外的包含一個或多個，在功能上與可提高核酸序列表達的啟動子相連的所謂的增強子，也是有好處的。其它有利的序列也可以被插入到DNA的3’末端，例如其它的調節(jié)元件或終止子。本發(fā)明所述核酸可以以一個或多個拷貝的形式存在于該構建體中。此構建體也可以適當地包含其它的標記(如抗生素抗性或營養(yǎng)缺陷型互補基因)，以供篩選之用。
對本發(fā)明所述方法有利的調節(jié)序列存在于，諸如aphII(Tn5)，trc，cos，tac，trp，lacPAI，rha，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL啟動子中，這些啟動子優(yōu)選在革蘭氏陰性菌中使用。更優(yōu)選的調節(jié)序列存在于，如革蘭氏陽性菌中的啟動子，如組成型或誘導型鏈霉菌的aphI，ermE，melC，tipA，mcrAB，gylCAB，veg，SPO1，amy和SPO2啟動子中；或酵母或真菌中的AOX1，GAL1，ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH啟動子中。與此相關，來自例如漢遜酵母屬(Hansenula)的丙酮酸脫羧酶啟動子和甲醇氧化酶啟動子也非常好。也可以使用人造的啟動子進行調控。
為了進行表達，核酸構建體被插入到宿主中，優(yōu)選插入到可使基因在宿主中最適表達的載體中，如質粒、噬菌體或其它DNA。這些載體是本發(fā)明進一步的實施方案。適合質粒的例子有，例如大腸桿菌中的pBluescript，pBAD，pQE(His tag System)，pICIC223-3，pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pGEM7Z，pKK223-3，pUC19，pKC30，pRep4，pHS1，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11或pBdCI，或廣泛宿主范圍質粒pBBR1MCS或pRK293；鏈霉菌或其它放線菌中的pIJ101，pIJ364，pMVS301，pIJ702或pIJ361；芽孢桿菌中的pUB110，pC194或pBD214；棒桿菌中的pSA77或pAJ667；真菌中的pALS1，pIL2或pBB116；酵母中的2∝，pAG-1，YEp6，YEp13或pEMBLYe23；或植物中的pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004或pDH51。所述質粒僅為可用質粒中的一小部分。更多質粒被專業(yè)人員所知，而且可以在諸如克隆載體(Eds.Pouwels P.H.et al.Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)這樣的書中找到。
為表達存在的其它基因，核酸構建體含有其它的、根據所選宿主和基因選來進行最佳表達的、并用以提高表達的，3’和/或5’終止調節(jié)序列將更加有利。
這些調節(jié)序列使特定的基因表達及蛋白表達成為可能。這可以指，例如根據宿主的不同，基因只在誘導后被表達或過表達，或是基因被立即表達或過表達。
為此目的，優(yōu)選可以在被誘導基因的表達方面具有有利影響并因此增強其表達的調節(jié)序列或因子。因此，通過使用強轉錄信號，如啟動子和/或增強子，調節(jié)元件的增強可能優(yōu)選在轉錄水平上發(fā)生。當然，通過諸如提高mRNA穩(wěn)定性的方法，也能使翻譯水平得到增強。
在另一個載體的實施方案中，對于含有本發(fā)明所述核酸構建體或核酸的載體而言，優(yōu)選以線形DNA的形式轉入微生物，并通過異源或同源重組整合于宿主基因組。此線形DNA可以由一個線性化的載體(如質粒)或僅由本發(fā)明的核酸構建體或核酸組成。
此外，本發(fā)明涉及具有下列特征的L-泛內酯水解酶a)將L-泛內酯轉化成相應的酸，b)pH穩(wěn)定性L-泛內酯水解酶在pH 4-10范圍內穩(wěn)定c)最適pH7.2到7.6d)最適溫度大約70℃到75℃e)EDTA不抑制其活性此L-泛內酯水解酶可以作為游離酶或固定酶在發(fā)明所述的方法中使用。
為了在生物體中最適表達異源基因，按照該生物體特定的密碼子用法來修飾核酸序列將更為有利。根據相應生物體其它已知基因的計算機分析，該密碼子用法可被輕松建立起來。
本發(fā)明所述基因及其編碼蛋白在宿主中的表達，通常都會給宿主產生一種應激。在有至少一種編碼叫做應激蛋白的基因存在的情況下，或這些基因結合在一起的情況下，這些基因的同時表達使得本發(fā)明所述的核酸優(yōu)選在發(fā)明所述的宿主中得到表達。應激蛋白，也叫熱休克蛋白(＝HSP)或分子伴侶，是一些在進化中最保守的蛋白，無論是在原核生物中還是在真核生物中。而且，這種蛋白在所有生物體中普遍存在。它們以千道爾頓的分子量來劃分，如HSP60，70，90等。這些應激蛋白具有在應激條件下，如葡萄糖水平過低、熱激、乙醇、紫外線、氧化劑等，誘導產生的特性，因此得名。
許多應激蛋白及相關組成型蛋白，對于蛋白的正確折疊、裝配、穩(wěn)定和轉運都是非常重要的。本發(fā)明所述蛋白與至少一種應激蛋白的共表達，使優(yōu)選表達本發(fā)明所述的核酸成為可能。這種方法也有利于防止水解酶蛋白聚合的發(fā)生。這使應激蛋白結合到蛋白的疏水端，并因此防止蛋白的錯誤折疊并促進其正確折疊。已經聚集或已變性的蛋白被再次解離，并被正確折疊。當這些應激蛋白執(zhí)行其功能時，它們頻繁地與其它稱為輔助蛋白(＝股蛋白)并因此有陪伴機之說的蛋白協作。這些輔助蛋白對發(fā)明所述基因的表達具有有利的影響(Frydaman等，自然1994，370111-117)。這些陪伴機的作用可以在有ATP消耗(主陪伴機)或無ATP消耗(次分子伴侶)時發(fā)生。有利的分子伴侶或熱激蛋白有，如真核基因HSP17.5，HSP22，HSP 25，HSP27，HSP60，HSP70，HSP90，TRiC，UBI1，2，3，4；或它們的原核同系物，如HtpG，DnaK，DnaJ，GroES，GroEL，HtrC，ClpB，GrpE等。優(yōu)選的分子伴侶為GroES，GroEL，HtpG，DnaK，DnaJ，HSP70或HSP27。
本發(fā)明所述核酸優(yōu)選在有至少一種應激蛋白存在的條件表達。在這種情況下，基因可以在一個啟動子的接合控制之下，或從幾個單獨的啟動子讀出。相應地，通過在同一時間或在不同時間添加一種或多種誘導物的方法，可以誘導這些基因的表達。這些核酸可在一個載體上或在不同的載體上。也可能通過遺傳操作對宿主的應激蛋白進行修飾，從而使其過表達。
為增加天然酶含量而采用的其它替代方法也可以是優(yōu)選的，如在低溫下培養(yǎng)合成本發(fā)明所述蛋白的微生物，或在本發(fā)明所述蛋白的懸浮液(添加或不加變性劑，如鹽酸胍)上使用高壓(優(yōu)選1-2千巴)，以使之復性。
適合本發(fā)明所述核酸或核酸構建體的重組宿主，原則上為所有的原核或真核生物。宿主優(yōu)選使用微生物，如細菌、真菌或酵母。優(yōu)選革蘭氏陽性或陰性菌；更優(yōu)選腸桿菌(Enterobacteriaceae)、假單胞菌(Pseudomonadaceae)、根瘤菌(Rhizobiaceae)、鏈霉菌(Streptomycetaceae)或諾卡氏菌(Nocardiaceae)科的細菌，酵母(如畢赤(Pichia)，酵母屬(Saccharomyces)或漢遜酵母屬(Hansenula))或真菌(如白僵菌屬(Beauveria)或裸蓋菇屬(Psilocybe))；特別優(yōu)選埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)或紅球菌屬(Rhodococcus)的細菌；更特別優(yōu)選大腸桿菌屬和種。此外，可以在α-蛋白細菌(α-proteobacteria)、β-蛋白細菌(β-proteobacteria)或γ-蛋白細菌(γ-proteobacteria)族中找到進一步優(yōu)選的細菌。
本發(fā)明所述宿主，優(yōu)選含有至少一種本發(fā)明所描繪的，編碼L-泛內酯水解酶的核酸序列、核酸構建體或載體。
本發(fā)明所述方法中使用的生物體，根據宿主的不同，以本領域熟練技術人員所共知的方法進行生長或培養(yǎng)。微生物通常在含有碳源(一般以糖的形式)，氮源(一般以有機氮源如酵母抽提物，或鹽如硫酸銨的形式)，微量元素(如鐵、錳、鎂鹽)及適當維生素的液體培養(yǎng)基中，通氧生長；培養(yǎng)溫度為0℃到100℃之間，優(yōu)選10℃到60℃之間。此外，也有可能保持培養(yǎng)液的pH在一固定值，就是說在培養(yǎng)過程中調節(jié)或不調節(jié)pH?？梢赃M行分批的、半分批的或連續(xù)的培養(yǎng)。營養(yǎng)物可以在發(fā)酵開始時加入，也可以半連續(xù)或連續(xù)地進行補加。同樣，根據所使用的啟動子，可以使用不同的誘導物，如異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖和抗生素，和/或變換溫度以使發(fā)明所述基因進行表達。外消旋的泛內酯可以在培養(yǎng)中直接加入，或優(yōu)選在培養(yǎng)后加入。酶可以從生物體中通過實施例中描述的方法分離得到，或以粗提物的形式用于反應。
優(yōu)選含有0.5U/g DBM(＝干生物量)L-泛內酯水解酶活力的宿主生物體，更優(yōu)選4U/g DBM，特別優(yōu)選20到150U/g DBM，更特別優(yōu)選40到60U/gDBM。
本發(fā)明所述方法優(yōu)選在0℃到95℃之間進行，更優(yōu)選在10℃到85℃之間，特別優(yōu)選在15℃到75℃之間。
本發(fā)明所述方法中的pH優(yōu)選保持在4到12之間，更優(yōu)選在6到9之間，特別優(yōu)選在6到8之間，更特別優(yōu)選在6.5到7.5之間。
本發(fā)明所述方法中的外消旋泛內酯是指由兩種對映體以50∶50的比例組成，或者由任何其它的富含兩種對映體之一的混合物組成。
對映體純或手性泛內酯(D或L對映體)在本發(fā)明所述的方法中是指，表現出富含一種對映體的對映體混合物。此方法優(yōu)選達到至少70％ee對映體純度，更優(yōu)選80％ee，特別優(yōu)選90％ee，更特別優(yōu)選98％ee。
對于本發(fā)明所述方法，可以使用含有發(fā)明所述核酸、核酸構建體或載體的生長細胞。也可以使用休眠的或破裂的細胞。破裂的細胞是指，例如，已經通過諸如溶劑處理成為可滲透的細胞，或者通過酶處理、機械處理(如弗氏壓碎器或超聲波)或其它方法破損的細胞。此法獲得的粗抽提物適合本發(fā)明所述的方法。純的或部分純化的酶也可為本法所用。同樣，可在反應中優(yōu)選使用的固定化微生物或酶也是適合的。
如果在本發(fā)明所述的方法中使用游離的生物體或酶，它們可以在萃取之前被方便地除去，如通過過濾或離心的方法。不必使用固定化的生物體或酶，但仍然可以使用。
本發(fā)明所述方法制備的D-泛內酯，優(yōu)選從水性反應液中通過萃取或結晶(或優(yōu)選萃取并結晶)的方法進行分離。這一步通過使用有機溶劑萃取水性反應液來進行。萃取可重復進行幾次，以提高產率。溶液在萃取前冷凍到0℃到10℃為優(yōu)選。為了使游離的酸轉變成鹽以使前者在反應條件下不被萃取出來，優(yōu)選將水性溶液在冷凍前或冷凍后中和至大約pH6.0到7.0。被用來中和的堿是，例如，碳酸氫鹽或另外一個，如NaOH或KOH?？杀皇褂玫挠袡C溶劑原則上為所有的加入鹽后可與水分層，并且可使內脂從水相中出來并進入到該相中的溶劑。優(yōu)選的溶劑為僅吸收少量的水，所以僅有少量的酸進入到該溶劑的溶劑，如甲苯、二氯甲烷、乙酸丁酯、二異丙醚、苯、甲基叔丁醚、甲基異丁基酮、二乙基甲酮或乙酸乙酯。
在濃縮有機相之后，通常可以獲得化學純很高的產品，即化學純在90％以上。萃取之后，含有產品的有機相可被部分濃縮，產品可結晶析出。優(yōu)選將溶液冷凍到0℃到10℃進行操作。直接從有機相或從水溶液中進行結晶也是可能的。結晶化的產品可再次溶于相同或不同的溶劑并再次結晶。如果需要的話，可以再進行至少一次有利的結晶化操作，以進一步提高產品的對映體純度。無論如何，對于作為目的產品的D-泛內酯來說，直接使用未進行結晶處理的有機溶液也是可以及優(yōu)選的。
留在水溶液中的L對映體可以通過酸化(如硫酸)使其內脂化，然后被萃取出來，方法同上。優(yōu)選將溶液加熱進行內脂化。去除溶劑之后，所得的L-內脂可與堿(如NaOH，泛解酸鈉或甲醇鈉)的催化量(大約1到5mol％)，在熔化狀態(tài)下被外消旋化并被回收。優(yōu)選的外消旋化處理和對多余的對映體進行回收，可使本發(fā)明所述的方法有可能達到98％的理論收率。
經過上述各類后處理之后，本發(fā)明所述方法的產品，基于用于該反應的外消旋泛內酯，可以以60％到100％的收率分離得到，優(yōu)選80％到100％，特別優(yōu)選90％到100％。分離到的產品具有化學純＞90％的高品質，優(yōu)選＞95％，特別優(yōu)選＞98％。除此之外，產品還有很高的對映體純度。而且，通過必要的結晶化處理，對映體純度還可進一步提高。
本發(fā)明所述方法可以分批、半分批或連續(xù)地進行。
此法獲得的產品可作為合成泛酰醇、泛酰巰基乙胺及其衍生物的起始物。這些物質及獲得的對映體純的泛內酯可單獨或彼此組合使用，用于藥物、食品、動物飼料或化妝品的生產。
以下例子舉例說明了本發(fā)明。
2.水解活力的確認竹伯克霍爾德氏菌Lu681(或表1中其它菌株)在25毫升的復合培養(yǎng)基(例如HFP＝1％蛋白胨，1％胰化蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.3％NaCl)中培養(yǎng)1到3天，收獲，在Tris-HCl(50mM，pH 7.0)緩沖液中洗滌并重懸于5毫升Tris/HCl(50mM，pH 7.0)中，與50mM酮基泛內酯在30℃溫浴3小時。去除細胞后，以HPLC測定酮基泛內酯，酮基泛解酸，D，L-泛內酯，D，L-，D-和L-泛解酸的濃度(表1a)。由于酮基泛內酯的自發(fā)水解，列出的除Beauveria amorpha Lu7953以外的所有菌株都能夠將酮基泛解酸還原成泛解酸。既然，所有的菌株都可以形成D-泛解酸而不是L-泛解酸(如例1所述)，泛內酯到L-泛解酸的轉化就無法通過氧化-還原過方法(經由酮基泛內酯和酮基泛解酸)進行。在透析過的Lu681或Lu5351的粗抽提物中，及在使用來自Lu681或Lu5351的純酶時發(fā)現，L-泛內酯的水解并不依賴于其它輔助因子。因此，該酶活性可以歸于水解酶。
3.通過各種野生型菌株水解生產D-泛內酯a.石竹伯克霍爾德氏菌Lu681石竹伯克霍爾德氏菌Lu681在200毫升復合培養(yǎng)基(如GYP＝1％ D-葡萄糖，0.5％多聚蛋白胨，0.5％酵母抽提物)(OD600＝6.7，DBM＝2.97g/l)中生長，然后收獲并洗滌。10毫升10倍濃縮的懸浮液與50mM D，L-泛內酯(于50mM Tris/HCl pH 7.0；分批體積20毫升)在30℃溫浴，以4M NaOH滴定至pH 7.0。3小時和19.5小時后，以HPLC測定轉化c和ee(3hc＝45％，ee＝95％；19.5 hc＝59％，ee＝89％對L-泛解酸)。后者分別與ee值為73％和100％的D-泛內酯相當。b.放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)Lu5351放射形土壤桿菌Lu5351在200毫升復合培養(yǎng)基(如HFP＝1％蛋白胨，1％胰化蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.3％NaCl)(OD600＝11.5，DBM＝2.90g/l)中生長，然后收獲并洗滌。10毫升10倍濃縮的懸浮液與50mM D，L-泛內酯(于50mM Tris/HCl pH 7.0；分批體積20毫升)在30℃溫浴，以4M NaOH滴定至pH 7.0。3小時和19.4小時后，以HPLC測定轉化c和ee(3hc＝20％，ee＝93％；19.4hc＝53％，ee＝94％對L-泛解酸)。后者分別與ee值為21％和100％的D-泛內酯相當。
c.缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta)Lu683
缺陷假單胞菌Lu683在200毫升復合培養(yǎng)基(如GYP＝1％ D-葡萄糖，0.5％多聚蛋白胨，0.5％酵母抽提物)(OD600＝7.3，DBM＝3.78g/l)中生長，然后收獲并洗滌。10毫升10倍濃縮的懸浮液與50mM D，L-泛內酯(于50mM Tris/HCl pH 7.0；分批體積20毫升)在30℃溫浴，以4M NaOH滴定至pH 7.0。3小時和19.3小時后，以HPLC測定轉化c和ee(3hc＝48％，ee＝97％；19.4hc＝69％，ee＝79％對L-泛解酸)。后者分別與ee值為82％和100％的D-泛內酯相當。
d.Apiotrichum humicola Lu3215Apiotrichum humicola Lu3215在200毫升復合培養(yǎng)基(如HFP＝1％蛋白胨，1％胰化蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.3％NaCl)(OD600＝18.5，DBM＝7.34g/l)中生長，然后收獲并洗滌。10毫升10倍濃縮的懸浮液與50mM D，L-泛內酯(于50mM Tris/HCl pH 7.0；分批體積20毫升)在30℃溫浴，以4M NaOH滴定至pH 7.0。3小時和19.4小時后，以HPLC測定轉化c和ee(3hc＝55％，ee＝79％對L-泛解酸)。后者與ee值為84％的D-泛內酯相當。4.從石竹伯克霍爾德氏菌Lu681中分離L-泛內酯水解酶石竹伯克霍爾德氏菌Lu681，于14升復合培養(yǎng)基(HFP＝1％蛋白胨，1％胰化蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.3％NaCl)中，生長至OD600＝10(3g/l DBM)，收獲并打碎。然后從粗提物中純化出L-泛內酯水解酶(約200單位)。首先，用Ultra-Turrax shaft將細胞(1128克濕重)重懸于1.8升20mM Tris/HCl(pH 7.4)緩沖液中。終體積3升。然后，將溶液在玻璃漏斗中通過一層玻璃珠(0.1到0.2毫米，200毫升)除去粗顆粒物。此細胞懸液在z04微流化床裝置上，以1500巴壓力勻漿兩次。再以500毫升緩沖液沖洗一次。合并后(4升)，用200毫升1M MgCl2進行沉淀(終濃度為50mM)。加NaOH溶液，使其pH保持在7.0。6000rpm離心30分鐘。上清(3.1升)與200毫升0.2M EDTA(pH 7.5)溶液混合?；旌虾螅芤簆H降至5.0。所形成的沉淀再次以6000rpm(Sorvall)離心20分鐘。上清(3.4升)被重新滴定至pH 7.0。
隨后，加入989克硫酸氨(相當于50％飽和度)，攪拌10分鐘?；鞚嵛镆?000rpm，離心20分鐘。所得上清(3.7升)被分開1.2升進行苯基瓊脂糖(phenyl-Sepharose)層析。
苯基瓊脂糖柱(Pharmacia，直徑5厘米，高25厘米，體積490毫升)以1升緩沖液A(20mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.4，40％硫酸氨)洗滌，以緩沖液B(20mM磷酸鈉，pH 7.4)進行梯度洗脫。流速為10毫升/分鐘，120分鐘后達到100％緩沖液B；保持40分鐘。收集并合并活性峰(250毫升)。
稀釋到小于7mS/cm后，這3升溶液通過Q-Sepharose層析(直徑5厘米，高25厘米，體積430毫升，Fast Flow，Pharmacia)進行純化。柱子以1升緩沖液A(20mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.4，)洗滌(10毫升/分鐘)。以緩沖液B(緩沖液A加1M NaCl)進行的梯度洗脫在120分鐘內達到100％緩沖液B，并在100％保持40分鐘。收集并合并活性峰(118毫升)。溶液被濃縮(10kD Omega膜)，并對5升10mM Tris/HCl(pH 7.0)透析；終體積為21毫升。其中6毫升上Waters Q HR8柱。此柱以緩沖液A(20mMMes，pH 6.0)預平衡，然后以1％/分鐘梯度從緩沖液A展開至緩沖液B(緩沖液A加0.5M NaCl)。收集活性峰(3.7毫升)，并對2升10mM Tris/HCl(pH 7.0)透析兩次。透析液變混，離心之(4毫升)。
然后，該原料以Mono P層析(Pharmacia，直徑0.5厘米，體積5毫升)分開。所得Mono-P峰，在-20攝氏度通過丙酮沉淀濃縮至0.2毫升。
將沉淀物中加入0.005毫升無二硫蘇糖醇(DTT)的十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液，然后上樣至SDS凝膠(12％Tris/甘氨酸凝膠，from Novex，約2.5小時，125V，50mA，Laemmli，U.K.，1970，自然，227680-685)。分開后，以活性染色鑒定L-泛內酯水解酶，并將其切下。此項操作先將膠于TBS緩沖液(＝50mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4)中輕輕搖動，然后和50毫升TBS+50毫升α-乙酸萘酯(Sigma N-8505，0.4g/lin 10％丙酮)溶液溫浴10分鐘。再加入50毫升Fast Red TR溶液(SigmaF-8764，1g/l)，于室溫(＝大約23℃)攪動。L-泛內酯水解酶條帶呈微紅棕色，表觀分子量約為36kDa。這塊切下來的膠中的蛋白質以胰島素進行消化，所得肽段進行測序。得到兩段肽序列(SEQ ID NO3和4)。留下的膠進行考馬斯亮蘭染色。5.從放射形土壤桿菌Lu5351中分離L-泛內酯水解酶放射形土壤桿菌Lu5351，于14升復合培養(yǎng)基(如HFP＝1％蛋白胨，1％胰化蛋白胨，0.5％酵母抽提物，0.3％NaCl)中，生長至OD600＝10(3g/lDBM)，收獲并打碎。然后從粗提物中純化出L-泛內酯水解酶(約60單位)(表2)。首先，用Ultra-Turrax shaft將放射形土壤桿菌(Lu 5351)細胞(400克濕重)重懸于1.8升20mM Tris/HCl(pH 7.4)緩沖液中(終體積2.2升)。然后，將溶液在玻璃漏斗中通過一層玻璃珠(0.1到0.2毫米，200毫升)除去粗顆粒物。此細胞懸液在z04微流化床裝置上，以1500巴壓力勻漿兩次。微流化床再以500毫升緩沖液沖洗一次。合并后(2.7升)，用135毫升1M MgCl2進行沉淀(終濃度為50mM)。加NaOH溶液，使其pH保持在7.0。6000rpm離心30分鐘。上清(2.6升)與575ml 0.2MEDTA(pH 7.5)溶液混合并再次核查其pH。加入711克硫酸氨(相當于40％飽和度)，攪拌10分鐘?；鞚嵛镆?000rpm，離心30分鐘。所得上清(3.3升)進行苯基瓊脂糖(phenyl-Sepharose)層析。
苯基瓊脂糖柱(Pharmacia，直徑5厘米，高25厘米，體積490毫升)以1升緩沖液A(20mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.4，40％硫酸氨)洗滌，以緩沖液B(20mM磷酸鈉，pH 7.4)進行梯度洗脫。流速為10毫升/分鐘，120分鐘后達到100％緩沖液B，保持40分鐘。收集并合并活性峰(350毫升，20.9毫秒)。
稀釋到7mS/cm后(終體積3.1升)，進行Q-Sepharose層析(直徑5厘米，高25厘米，體積430毫升，Fast Flow，Pharmacia)。柱子以1升緩沖液A(20mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.4，)洗滌(10毫升/分鐘)。以緩沖液B(緩沖液A加1M NaCl)進行的梯度洗脫在120分鐘內達到100％緩沖液B，并在100％保持40分鐘。收集并合并活性峰(134毫升)。溶液被濃縮(10kD Omega膜)，并對3升10mM Tris/HCl(pH 7.0)透析；(終體積為19毫升)。其中6毫升上Waters Q HR8柱。此柱以緩沖液A(20mM Mes，pH 6.0)預平衡，然后以1％/分鐘梯度，從緩沖液A展開至緩沖液B(緩沖液A加0.5M NaCl)。收集活性峰(12.5毫升)，并對5升10mM醋酸鈉(pH 5.0)透析兩次。透析液變混，離心之(4毫升)。
然后，上清以Mono P層析(Pharmacia，直徑0.5厘米，體積5毫升)分開。
所得Mono-P峰在-20攝氏度通過丙酮沉淀濃縮至0.2毫升。沉淀物中加入0.005毫升無二硫蘇糖醇(DTT)的十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液，然后上樣至SDS凝膠。分開后，以活性染色鑒定L-泛內酯水解酶(參見例4)，并將其切下。L-泛內酯水解酶帶呈微紅棕色，表觀分子量為36kDa。切下這塊切下來的膠中的蛋白質以胰島素進行消化，所得肽段進行測序。得到兩段肽序列(SEQ ID NO5和6)。留下的膠進行考馬斯亮蘭染色。SEQ IDNO5的序列表明，其第一個氨基酸不能肯定。因為此處序列不甚明確，第一位的酪氨酸也可能是一個亮氨酸。6.Lu681和Lu5351來源的，純L-泛內酯水解酶的底物特異性來源于Lu681或Lu5351的苯基瓊脂糖層析峰段的純酶(0.1U/ml)，在150mM Pipes(pH 6.8)中與各種酯及內脂溫浴。保溫0、1及20小時后取樣，離心(通過一個10kDa的慮膜)以終止反應。上清中的濃度及相關的酸以HPLC分析進行測定。表3a和3b所示的活力，為與以L-泛內酯為底物的酶活力相比較的結果。
Lu681的酶，在微量滴定板上進行了對脂肪酶底物1，2-O-二月桂基-rac-甘油基-3-戊二酸試鹵靈酯的光學分析(Boehringer Mannheim，改進)。在45mM KH2PO4(pH 6.8)溶液中，60到482單位/升的酶，與0.18克/升試鹵靈酯(resorufin ester)(2克/升，在二烷+2％ SDS+10％H2O中)，在室溫下溫浴。2分鐘及82分鐘后，測量572nm處E的消光。表3c顯示了消光差異及由此計算出來的脂肪酶活力，其相當于大約0.05％的L-泛內酯水解酶活力。7.Lu681和Lu5351來源的，純L-泛內酯水解酶的抑制作用與活化作用來源于Lu681或Lu5351的苯基瓊脂糖層析峰段的純酶(0.1U/ml)，與各種效應物在150mM Pipes(pH 7.0)中預溫5分鐘。測定以加入150mM L-泛內酯起始(30℃ 1小時)，以離心(通過一個10kDa的慮膜)終止。然后，通過HPLC分析測定D，L-，D-和L-泛解酸的濃度。表4a和4b是與未加效應物樣品的活力比較。總的來說，Lu681和Lu5351來源的純酶對螯合劑、表面硬化劑(SH reagents)、蛋白酶抑制劑、去污劑及各種陽離子不敏感(殘余活力＞85％)(例外Lu5351在1％SDS中殘余活力為74％)。
大部分情況下，HgCl2對該酶有明顯的活化作用(133/170％)。另外，檢測到D-泛內酯對重組681內脂酶的競爭抑制(大腸桿菌細胞，見下面實施例8)。8.Genbank+篩選石竹伯克霍爾德氏菌Lu681中L-泛內酯水解酶的克隆分離到石竹伯克霍爾德氏菌Lu681的基因組DNA(Qiagen，Hilden)，以EcoRI酶切，連入經EcoRI酶切并脫磷酸化的pBluescriptKS+載體中(Maniatis，T.，分子克隆實驗手冊1989)。連接產物按Stratagene公司(La Jolla，Calif.)的操作說明轉入大腸桿菌(E.coli)XL1Blue菌株。轉化株鋪于含有氨芐青霉素(100μg/ml)，IPTG(＝異丙基β-硫代半乳糖苷，0.2mM)和X-Gal(80mg/l)的LB平板上，于30或37℃培養(yǎng)過夜。在含有氨芐青霉素(100μg/ml)，IPTG(＝異丙基β-硫代半乳糖苷，0.2mM)和X-Gal(80mg/l)的LB平板上挑取白色菌落，并再次培養(yǎng)過夜。在LB-氨芐青霉素(100mg/ml)-IPTG平板上，使用滅菌的硝酸纖維素膜，以濾膜復制的方法復制樣板。在此板上過夜培養(yǎng)后(參上)，濾膜與150mML-泛內酯、0.1％硝嗪黃及10mM Tris/HCl(pH 7.0)進行活性分析(3小時-過夜，30℃)。分離得到一個黃色克隆(XL1Blue pKS+681)。9.大腸桿菌(E.coli)XL1Blue pKS+681中EcoRI插入片斷的酶切圖譜建立及測序按Qiagen(Hilden)操作，從E.coli XL1Blue pKS+681中分離得到質粒DNA，并以限制酶EcoRI、BamHI、PstI和HindIII進行單或雙酶切。片斷化DNA以0.8％瓊脂糖進行瓊脂糖凝膠電泳。由得到的片斷大小繪出7.5kB插入片斷的限制酶切圖譜，如圖3。此插入片斷被完全測序(Sanger等.1977)，其包含核苷酸序列ID NO1。反過來，來源于石竹伯克霍爾德氏菌Lu681和放射形土壤桿菌Lu5351的，純的或不純的L-泛內酯水解酶(參見例4和例5)經胰酶消化后發(fā)現，該核酸序列衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO2)含有肽YGIEGLNNLEAL和AKEDANSTIEAED(SEQ ID NO3和4)。
數據庫比較(Genbank，EMBL，SwissProt，1999年5月7日數據，[Sptrembel]和1999年1月5日[PIR])顯示，該核酸序列及其衍生的氨基酸序列與一組假定蛋白及鏈霉菌中的某些四環(huán)素環(huán)化酶僅有很小的同源性(表5)。確切的說，具有共有序列HTGTHVDAP的基元在所有的蛋白中都是高度保守的。另外，與來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)WW2(WO 94/09175)的靛紅水解酶有48％的同源性(在氨基酸水平有38％的同源性)，其同樣含有所說的序列基元。既然未發(fā)現與其它內脂酶、酯酶或脂肪酶有同源性，所發(fā)現的L-泛內酯水解含有一個酶的新類別。序列比較表明，所說的假定蛋白、四環(huán)素環(huán)化酶、靛紅水解酶及所發(fā)現的L-泛內酯水解酶屬于同一個較遠的系統分類相關家族。10.E.coli XL1Blue pKS+681對L-泛內酯的水解接一環(huán)E.coli XL1Blue pKS+681菌株至含有氨芐青霉素(100μg/ml)，IPTG(0.2mM)和X-Gal(80mg/l)的LB平板，于37℃培養(yǎng)過夜。然后重懸(OD600＝2.5)于0.5毫升Tris-HCl(pH 7.0)和50mM D，L-泛內酯的溶液中。使用相應的E.coli XL1Blue pBluescriptKS+-樣品(OD600＝2.5)進行比較。1小時后，離下細胞。D，L-泛內酯，D，L-，D-和L-泛解酸以HPLC分析進行測定。表6a為各種樣品的活力和ee值。懸液的活力≥90U/L。然而在液體培養(yǎng)批次中，未發(fā)現明顯的活力(參考例12)。11.L-泛內酯水解酶在E.coli XL1Blue pKK223-3中的克隆表達基于核酸序列SEQ ID NO1，設計出寡核苷酸引物5‘-CCGGAATTCATGTGCAACAACTGC(P1)和5‘-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA(P2)，以對L-泛內酯水解酶基因進行PCR擴增。反應條件如下20mMTris/HCl pH 8.8，2mM MgSO4，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％ TritonX-100，0.1mg/ml BSA，25mM/dNTP，0.96μg/ml pKS+681，P1和P2各2.2μg/ml，25U/ml Pfu聚合酶(Stratagene，LaJolla，Calif.)；PCR參數如下95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2.5min，30個循環(huán)。PCR產物(0.8kb)用EcoRI和HindIII酶切，并連入經EcoRI和HindIII酶切并脫磷酸化的pKK223-3(Pharmacia，Freiburg)載體中。連接混合物轉化E.coliXL1 Blue或TG1(Stratagene，LaJolla，Calif.；DSMZ，Braunschweig，DSMZ-No.6056，Inoue et al，1990，基因9623-28)。轉化體鋪于LB-氨芐平板，培養(yǎng)過夜。在此轉化平板上進行如例8的濾膜復制及接下來的活力分析，找到了約100個黃色克隆。其中十個，以質粒DNA小量制備及限制酶消化(EcoRI-HindIII，EcoRI-HindIII-BamHI)的方法進行分析(Maniatis，T.，分子克隆實驗手冊，1989)。它們含有如圖4所示的質粒pKK681。12.E.coli XL1Blue pKK681對L-泛內酯的水解E.coli XL1Blue pKK681在30毫升含有氨芐青霉素(100μg/ml)和IPTG(0.5mM)的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。然后收獲，以Tris-HCl(50mM，pH 7.0)洗滌并懸浮(3毫升50mM Tris/HCl pH 7.0)。0.25毫升懸液與150mM L-泛內酯、150mM Pipes pH 7.0加0.5毫升蒸餾水混合，30℃溫浴3小時。與此平行，0.25毫升懸液與50mM D，L-泛內酯、50mM TrispH 7.0加0.5毫升蒸餾水混合，溫浴3小時。另外，2毫升懸液與300mM D，L-泛內酯、50mM Tris pH 6.8加2 0毫升蒸餾水混合，以4M NaOH滴定至pH 6.8，溫浴3小時。1小時和3小時后取樣，去除細胞，上清進行D，L-泛內酯、D，L-、D-和L-泛解酸的分析。表6b為各個樣品的活力及ee值。由此可知，此過夜培養(yǎng)物(1倍濃度)具有90-150U/l的活力。
在對數生長前期對E.coli XL1Blue pKK681進行誘導(OD600＝0.6，+0.5mM IPTG)，37℃溫浴5小時后，相應對數生長后期細胞(OD600＝4.1)具有大約480U/l的活力。13.L-泛內酯水解酶在E.coli TG1 pDHE19中的克隆表達基于核酸序列SEQ ID NO1，設計出寡核苷酸引物5‘-CAGGATGCCATATGTGCAACAACTGC(P1)和5‘-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA(P2)，以對L-泛內酯水解酶基因進行PCR擴增。反應條件如下20mMTris/HCl pH 8.8，2mM MgSO4，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％ TritonX-100，0.1mg/ml BSA，25mM/dNTP，0.96μg/ml pKS+681，P1和P2各2.2μg/ml，25U/ml Pfu聚合酶(Stratagene，LaJolla，Calif.)；PCR參數如下95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2.5min，30個循環(huán)。PCR產物(0.8kb)用NdeI和HindIII酶切，并連入經NdeI和HindIII酶切并脫磷酸化的pDHE19(Prof.Mattes，Stuttgart)載體中。連接混合物轉化E.coli XL1Blue或TG1(Stratagene，LaJolla，Calif.；DSMZ，Braunschweig，DSMZ-No.6056，Inoue et al，1990，Gene 9623-28)。轉化株鋪于LB-氨芐平板，培養(yǎng)過夜。在LB-氨芐(100μg/ml)/鼠李糖(2g/l)平板上(LB＝Luria Broth)進行如例8的濾膜復制及接下來的活力分析，找到了約100個黃色克隆。其中十個，以質粒DNA小量制備、限制酶消化(NdeI-HindIII，NdeI-HindIII-BamHI)及序列分析的方法進行分析(Maniatis，T.，分子克隆實驗手冊，1989)。它們含有如圖5所示的質粒pDHE681。14.E.coli TG1 pDHE681對L-泛內酯的水解E.coli TG1 pDHE681在14升含有40g/l甘油和2.5g/l鼠李糖的基本培養(yǎng)基(minimal medium)中，37℃培養(yǎng)6到7個小時。然后收獲，以Tris-HCl(50mM，pH 7.0)洗滌并懸浮(加1.4升緩沖液)。以標準方法進行測定(150mM Pipes pH 7.0，150mM L-泛內酯，30℃，1小時)，此一倍濃縮的細胞懸液具有680-2700U/l的活力或是60-160g/DBM。
10毫升10倍濃縮的懸液與50mM D，L-泛內酯，在50mM Tris/HCl pH7.0(批體積20毫升)的緩沖液中，以4M NaOH滴定至pH 7.0，30℃溫浴。0.4小時和3小時后，以HPLC分析測定轉化及ee值(0.4hc＝48％，ee＝92％；3hc＝58％，ee＝72％對L-泛解酸)。這分別與ee值為84％和100％的D-泛內酯相當。
15.通過E.coli TG1 pDHE681水解，制備D-泛內酯3克D，L-泛內酯溶于10毫升水，并以4M NaOH滴定至pH 6.5。加5-10毫升E.coli TG1 pDHE681細胞懸液(例14)，并以水補至20毫升。反應在30℃，溫浴15到22小時，滴定至pH 6.8。另外，還可以再加0到2毫升的細胞懸液并繼續(xù)溫浴3小時，或者是加3次5毫升的細胞懸液并繼續(xù)溫浴90小時。圖6顯示了基于NaOH消耗的滴定過程。根據轉化和溫浴時間的不同，D-泛內酯的ee值為71％到97％。然后，22毫升批次的細胞被離下，并以5毫升50mM Tris-HCl(pH 7.0)洗滌。合并上清(20到25毫升)，以1體積的乙酸乙酯抽提3次。在有機相中加入10克無水Na2SO4，室溫晾干1小時。濾出沉淀并以乙酸乙酯洗滌1次，濾出液在40℃蒸發(fā)3小時。粘性殘留物被稱重，并以HPLC、GC、GC-MS和H-NMR進行分析(表7)。其含有純的D-泛內酯(50％-52％的轉化率，71％-87的ee)。
水相(21毫升；L-泛解酸鈉)以約5毫升3M H2SO4調至pH 1，80℃加熱15分鐘，與8克無水Na2SO4混合。進行類似的操作以1體積的乙酸乙酯抽提3次，以Na2SO4干燥并蒸發(fā)，得到L-泛內酯。加入NaOH及少量L-泛解酸鈉后，熔化的L-泛內酯可被外消旋化(180℃，3小時)，以供循環(huán)使用。16.通過E.coli菌株產生的L-泛內酯水解酶，水解制備D-泛內酯大腸桿菌(E.coli TG1 pDHE681或共表達分子伴侶如GroEL的優(yōu)選菌株)發(fā)酵液，通過破碎細胞(2×1000巴，微流化床裝置)、去除細胞碎片(9000克，10℃ 20分鐘)、交叉流動過濾十倍濃縮(Hmoflow F60，Fresenius，排阻限度約為10kDa的膜)及熱沉淀(60℃ 20分鐘，室溫-10℃20分鐘，離心)，得到被濃縮至約3000U/g比活力的L-泛內酯水解酶。此10x勻漿的活力為63-100000U/l，蛋白濃度為20-30g/l。
D，L-泛內酯的外消旋拆分如下2.3M D，L-泛內酯(30％ w/v)與熱沉淀勻漿(16000U/l，6g/l蛋白)混合，30℃，以4到10M NaOH(pH 7.5)在弱緩沖液(6-20mM NaHCO3)中進行滴定，每批0.75到1.0升。溫浴過夜后，通過交叉流動過濾(Hmoflow F60，Fresenius，排阻限度約為10kDa的膜)，從含產物的溶液中分離出酶。以去離子水洗滌1到2次并濃縮。然后，酶在上述條件下被重新使用。有效期限的檢測表明，6天后，對于ee＞90％(D-PL)，需要雙倍的殘留時間，從12小時到24小時(圖7)。使用更大的體積(例如用F40柱，10升每批)有可能減少活力損失。
通過以1倍體積的MTBE抽提5次，逐步獲得外消旋拆分的勻漿混合物(50.8％轉化率，92.5％ee)。得到43％的D-泛內酯，ee為91.4％，純度為98.2％(GCint.st.；基于100％外消旋物)。與濃硫酸(25毫升)一起加熱(65℃/15分鐘)，并再次以MTBE抽提(5×1體積)后，得到53％的L-泛內酯，ee為62.3％，純度為98.2％(GCint.st.)。標準方法未檢測到蛋白質或DNA雜質。
*沒有6天的NaOH數據。1390分鐘(23.17小時)，轉化率50.4％，ee 89.8％。
沒有7天的樣品，故而沒有分析數據。17.通過固定化L-泛內酯水解酶，水解制備D-泛內酯將例16所獲得的L-泛內酯水解酶結合到各種載體介質上，如商業(yè)用途的EupergitC(Rhm GmbH，Darmstadt)或Deloxan DAPIII(Degussa，Frankfurt)。
EupergitCEupergitC是一種由環(huán)氧基活化的載體介質。因此，蛋白主要被共價結合在氨基上。
勻漿先以熱處理進行沉淀。550毫升勻漿(總計1.1升)在60℃溫浴30分鐘，然后在冰上冷卻20分鐘。離心(8000rpm，GS3轉頭，1小時)除去變性蛋白。然后，上清以Hmoflow F40柱進行濃縮，緩沖液改為20mMHEPES，pH 7.5。每克Eupergit對結合蛋白的數量無限制。下例中，7.2克蛋白被稀釋在270毫升含30毫升1M磷酸鉀pH7.0的緩沖液中，然后加入17.5克固體NaCl使之鹽析析出。大量的鹽可促進蛋白與載體的結合。精確調節(jié)pH至6.8，然后加入15克干Eupergit，室溫攪拌17小時。然后，反應混合物用玻璃漏斗抽氣過濾，并用水洗滌載體。該濕介質重約60克。保存使用10mM磷酸緩沖液(pH 7.5)。
Deloxan DAPIII，還原型和非還原型Deloxan是一種氨村修飾的硅酸鹽。這些氨基可被戊二醛激活，形成席夫堿(Schiff’s base)。洗出剩余的醛后，將蛋白加到活化的載體上。蛋白質的游離氨基與戊二醛上仍游離的醛反應，形成第二個席夫堿。以這種方法固定的蛋白就可以使用了。然而，由于席夫堿易于水解，蛋白會在水溶液中從載體上慢慢地瀝出來。因此，可以用硼氫化鈉還原，使席夫堿轉變?yōu)榇渭壈穪砑右员苊狻＿M行此項處理的前提是，酶對硼氫化鈉的還原作用是穩(wěn)定的。
進行勻漿的熱沉淀，以固定在EupergitC上。
活化140克Deloxan DAPIII分別用水、1.5升0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 6)和1.5升0.1M磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)洗滌，然后重懸。加入560毫升2.5％的戊二醛溶液(在同一緩沖液中修正至pH 7.5)，反應3到4小時。載體變?yōu)槌燃t色。然后，活化的載體用6升水洗滌并重懸于1升磷酸鈉緩沖液(pH 7.5)。
例如，10000個單位(約2.7克蛋白)的L-泛內酯水解酶加到40克活化的Deloxan上。蛋白與活化的載體在室溫下溫浴18小時。用玻璃漏斗將載體和溶液分開。載體分別用水、1升0.1M的磷酸鈉緩沖液(pH 7.2)和1M NaCl洗滌幾次。移出一半的載體(未還原)。另一半再次用水洗滌，然后加入0.1M硼酸鈉緩沖液(pH 7.2)。
用硼氫化鈉還原在重懸于80毫升硼酸緩沖液的載體中加入0.4克硼氫化鈉(0.5％)，于室溫攪拌3小時。期間，載體再次變?yōu)樯n黃色。用抽氣玻璃漏斗濾出載體，并用400毫升硼酸緩沖液洗滌。載體再次以1升水洗滌，然后加到20mM磷酸緩沖液中。
外消旋物拆分用固定化酶拆分2.3M D，L-泛內酯(30％w/v)，固定化酶以40毫升批次在30℃攪拌，以10M NaOH(pH 7.5，在10mM NaHCO3中)滴定至D-泛內酯的ee為90％時止(25到60小時)。該生物催化劑經過每批次的過濾后(反應混合物以HPLC洗滌液濾器通過抽氣過濾)，從產物中分離出來并進行回收，其間適當地洗滌3次(去離子水)。下面的圖表顯示了為在一個攪拌混合物中檢測有效期限的NaOH分布圖。
表1a
PA，泛解酸ee值指(L)-泛解酸的形成ee，對映體過量(enantiomeric excess)，corr.，ee通過減去由化學水解形成的泛解酸(空白)進行修正表1b
ee值指(L)-泛解酸的形成ee，對映體過量(enantiomeric excess)，corr.，ee通過減去由化學水解形成的泛解酸(空白)進行修正表2Lu5351中L-泛內酯水解酶的純化
表3aLu681中L-泛內脂水解酶的底物特異性
++ ＞50U/l+＞5U/l(+) ＞0.5U/l-＜0,5U/l
表4a在標準分析中，各種添加物對石竹伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacaryophylli)Lu681的L-泛內酯水解酶活力的影響
表5Lu681的L-泛內脂水解酶氨基酸序列同源性(按照gap4和bestfit5搜索進行)
4Needleman & Wunsch(1970)，分子生物學雜志48，443-4535Smith & Waterman(1981)，應用數學進展2，482-489
表6L-泛內酯水解酶在E.coli XL1 Blue中的表達a)XL1 Blue pKS+681和pKS+(陰性對照)
b)XL1 Blue pKK681
n.d.，未測定表.7a
表.7b
序列表<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>L-泛內酯水解酶和一種D-泛內酯的制備方法<211>810<212>DNA<213>石竹伯克霍爾德氏菌<220><221>CDS<222>(1)..(810)<223>Lu681<400>1atg tgc aac aac tgc gtg atc gag aac gta aaa aag aac atg ctt tca 48Met Cys Asn Asn Cys Val Ile Glu Asn Val Lys Lys Asn Met Leu Ser15 10 15cgg cgc ctg ctg ttc aag ggc gct gcg gca ggt ttg acg gcc atg acg 96Arg Arg Leu Leu Phe Lys Gly Ala Ala Ala Gly Leu Thr Ala Met Thr2025 30gca ggc agt ctg gct tcc ccg gcg ctt gcg caa tcg ccc cgg cag gtc 144Ala Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Gln Ser Pro Arg Gln Val35 40 45gtt gat ctc act cac acc tat gat tcc gca ttt ccc acc ttc gat ggc 192Val Asp Leu Thr His Thr Tyr Asp Ser Ala Phe Pro Thr Phe Asp Gly50 55 60aaa ccg ggc ata gaa tat gag tgg gca gcg cag atc gcc aaa gac ggc 240Lys Pro Gly Ile Glu Tyr Glu Trp Ala Ala Gln Ile Ala Lys Asp Gly65 70 75 80tat cag ctc cgc aaa ctc acc atc tac gaa cat acc ggc acc cat atc 288Tyr Gln Leu Arg Lys Leu Thr Ile Tyr Glu His Thr Gly Thr His Ile85 90 95gat gcg cct ttc cac ttc agc gcc gat ggc gcg agc gtc gac caa ctg 336Asp Ala Pro Phe His Phe Ser Ala Asp Gly Ala Ser Val Asp Gln Leu100 105 110gag ccg cag aaa ctt gtc gct ccg ctt gtc atc gtc gac atc acc gag 384Glu Pro Gln Lys Leu Val Ala Pro Leu Val Ile Val Asp Ile Thr Glu115 120 125cgc gcc aaa gag gat gcc aat tcc acc att gaa gcc gaa gac atc gag 432Arg Ala Lys Glu Asp Ala Asn Ser Thr Ile Glu Ala Glu Asp Ile Glu130 135 140cgc tgg ata tct gcg aat ggc gac atc ccg aca ggt gca atc gtg gct 480Arg Trp Ile Ser Ala Asn Gly Asp Ile Pro Thr Gly Ala Ile Val Ala145 150 155 160tta cgc tcc gga tgg gca acc aaa gtg aag agt ccc tca ttc cgc aat 528Leu Arg Ser Gly Trp Ala Thr Lys Val Lys Ser Pro Ser Phe Arg Asn165 170 175gac gaa gcc gga caa ttc gcc ttc ccc ggt ttc ggc aaa tcg gcg acc 576Asp Glu Ala Gly Gln Phe Ala Phe Pro Gly Phe Gly Lys Ser Ala Thr180 185 190gac ctt ctg ctg aag ctc gac acc gtc gcc att ggc gtc gac aca ctt 624Asp Leu Leu Leu Lys Leu Asp Thr Val Ala Ile Gly Val Asp Thr Leu195 200 205tct ctg gat ccg ggc aac tcc gca gat ttc gcg gtt cac aat tcc tgg 672Ser Leu Asp Pro Gly Asn Ser Ala Asp Phe Ala Val His Asn Ser Trp210 215 220ctg cca gca gga cgc tac ggt atc gaa gga ctg aac aac ctc gag gct 720Leu Pro Ala Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala225 230 235 240ctg ccg gtc aag gga gcg acc ata atc gtc ggc gcg ccg gca cac cgc 768Leu Pro Val Lys Gly Ala Thr Ile Ile Val Gly Ala Pro Ala His Arg245 250 255ggc gga acg ggc ggc cca gcc cgt att ctg gcc ctg gtc tga 810Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Arg Ile Leu Ala Leu Val260 265 270<210>2<211>269<212>PRT<213>石竹伯克霍爾德氏菌<400>2Met Cys Asn Asn Cys Val Ile Glu Asn Val Lys Lys Asn Met Leu Ser15 10 15Arg Arg Leu Leu Phe Lys Gly Ala Ala Ala Gly Leu Thr Ala Met Thr20 25 30Ala Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Gln Ser Pro Arg Gln Val35 40 45Val Asp Leu Thr His Thr Tyr Asp Ser Ala Phe Pro Thr Phe Asp Gly50 55 60Lys Pro Gly Ile Glu Tyr Glu Trp Ala Ala Gln Ile Ala Lys Asp Gly65 70 75 80Tyr Gln Leu Arg Lys Leu Thr Ile Tyr Glu His Thr Gly Thr His Ile85 90 95Asp Ala Pro Phe His Phe Ser Ala Asp Gly Ala Ser Val Asp Gln Leu100 105 110Glu Pro Gln Lys Leu Val Ala Pro Leu Val Ile Val Asp Ile Thr Glu115 120 125Arg Ala Lys Glu Asp Ala Asn Ser Thr Ile Glu Ala Glu Asp Ile Glu130 135 140Arg Trp Ile Ser Ala Asn Gly Asp Ile Pro Thr Gly Ala Ile Val Ala145 150 155 160Leu Arg Ser Gly Trp Ala Thr Lys Val Lys Ser Pro Ser Phe Arg Asn165 170 175Asp Glu Ala Gly Gln Phe Ala Phe Pro Gly Phe Gly Lys Ser Ala Thr180 185 190Asp Leu Leu Leu Lys Leu Asp Thr Val Ala Ile Gly Val Asp Thr Leu195 200 205Ser Leu Asp Pro Gly Asn Ser Ala Asp Phe Ala Val His Asn Ser Trp210 215 220Leu Pro Ala Gly Arg Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala225 230 235 240Leu Pro Val Lys Gly Ala Thr Ile Ile Val Gly Ala Pro Ala His Arg245 250 255Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Arg Ile Leu Ala Leu Val260 265<210>3<211>12<212>PRT<213>石竹伯克霍爾德氏菌<400>3Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala Leu15 10<210>4<211>13<212>PRT<213>石竹伯克霍爾德氏菌<400>4Ala Lys Glu Asp Ala Asn Ser Thr Ile Glu Ala Glu Asp15 10<210>5<211>13<212>PRT<213>石竹伯克霍爾德氏菌<400>5Tyr Leu Gly Ile Glu Gly Leu Asn Asn Leu Glu Ala Leu15 10<210>6<211>10<212>PRT<213>石竹伯克霍爾德氏菌<400>6Ala Lys Glu Asp Ala Val Ser Thr Ile Glu15 10
權利要求
1.一段分離的、編碼一段具有L-泛內酯水解酶活力多肽的核酸序列，選自a)具有SEQ ID NO1所示序列的核酸序列，b)由于遺傳密碼的簡并，導致從序列SEQ ID NO1中衍生的核酸序列，c)其編碼的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的SEQ ID NO1所示核酸序列的衍生物，并且該衍生物在不明顯損失該多肽酶活性的前提下，在氨基酸水平上至少應有50％的同源性，d)(a)到(c)中所提序列的功能等同物。
2.由權利要求1所述核酸序列編碼的氨基酸序列。
3.由SEQ ID NO1所示序列編碼的，權利要求2所述的氨基酸序列。
4.含有權利要求1所述核酸序列的核酸構建體，其中該核酸序列與一或多個調節(jié)信號相連。
5.含有權利要求1所述核酸序列或權利要求4所述核酸構建體的載體。
6.含有至少一個權利要求1所述核酸序列、至少一個權利要求4所述核酸構建體或權利要求5所述載體的微生物。
7.權利要求6所述的微生物，它為革蘭氏陰性菌。
8.權利要求6或7所述的微生物，它為來自α-蛋白細菌、β-蛋白細菌或γ-蛋白細菌族的細菌。
9.權利要求6到8中任何一個所述的微生物，它為來自腸桿菌科、假單胞菌科或根瘤菌科的細菌。
10.權利要求6到9中任何一個所述的微生物，它為來自土壤桿菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、沙門氏菌屬或埃希氏菌屬的細菌。
11.具有下列性質的L-泛內酯水解酶a)將L-泛內酯轉化成相應的酸，b)pH穩(wěn)定性L-泛內酯水解酶在pH 4-10范圍內穩(wěn)定，c)最適pH7.2到7.6，d)最適溫度大約70℃到75℃，e)EDTA不抑制其活性。
12.一種制備D-泛內酯的方法，它包括下列反應步驟a)在權利要求11所述的L-泛內酯水解酶或在具有權利要求2所述氨基酸序列的L-泛內酯水解酶或在權利要求6所述微生物存在時，將外消旋泛內酯轉化成D-泛內酯和L-泛解酸，b)除去D-泛內酯。
13.權利要求12所述的方法，其中，在步驟(b)得到的L-泛解酸被外消旋化并被回收至步驟(a)。
14.權利要求12或13所述的方法，其中，外消旋泛內酯的轉化在有固定化的、權利要求11所述的L-泛內酯水解酶或固定化的、具有權利要求2所述氨基酸序列的L-泛內酯水解酶存在時進行。
15.權利要求12或13所述的方法，其中，外消旋泛內酯的轉化在有生長的、休眠的或破碎的如權利要求6所述微生物存在時進行。
16.權利要求12或15所述的方法，其中，微生物為固定化的。
17.如權利要求12到16中任何一項所述的方法，其中，該方法在pH4至12之間的水反應溶液中進行。
18.如權利要求12到17中任何一項所述的方法，其中，該方法在0℃到95℃之間進行。
19.權利要求12或13所述的方法，其中，D-泛內酯通過萃取被去除。
20.如權利要求12到18中任何一項所述的方法，其中，D-泛內酯具有至少90％ee的光學純度。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有水解L－泛內酯(L－pantolactone)酶活性的蛋白。本發(fā)明也涉及編碼這些蛋白的核酸、核酸構建體、載體、遺傳改造的微生物及一種D－泛內酯的制備方法。
文檔編號C12P17/02GK1384880SQ00814937
公開日2002年12月11日 申請日期2000年10月20日 優(yōu)先權日1999年10月29日
發(fā)明者M·凱塞勒, B·豪爾, T·弗里德里希, R·瑪特斯 申請人:巴斯福股份公司